Полиморфизм генов репарации ДНК при алкогольной болезни

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ
УДК: 616.36-002.2
Л.И. ЛУКМАНОВА
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН
Лаборатория экологической генетики
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ РЕПАРАЦИИ ДНК
ПРИ АЛКОГОЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПЕЧЕНИ
Научный руководитель - профессор Т.В. Викторова
Представлены результаты исследования полиморфизма генов репарации ДНК XRCC1
(rs25487), XPD (rs13181), XRCC3 (rs861539) у больных алкогольной болезнью печени.
Объект исследования – образцы ДНК (N=83), выделенные из лейкоцитов крови у лиц,
проживающих в Республике Башкортостан и страдающих хроническим алкоголизмом с проявлениями алкогольной болезни печени. Генетические варианты G28152A
(Arg399Gln) гена XRCC1, A35931C (Lys751Gln) гена XPD, C18067T (Thr241Met) гена XRCC3
изучены методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов
полимеразной цепной реакции синтеза ДНК. Результаты исследований показали, что у
больных алкогольной болезнью печени чаще, чем среди здоровых лиц, встречается генотип AC (Lys/Gln) гена XPD (OR=1,71; р=0,03) и генотип TT (Met/Met) гена XRCC3 (OR=2,46;
p=0,03). Эти генотипы были рекомендованы в качестве маркеров предрасположенности
к алкогольному гепатиту. Менее восприимчивы к заболеванию печени лица с генотипом
AA (Lys/Lys) гена XPD (OR=0,60; р=0,04) и CT (Thr/Met) гена XRCC3 (OR=0,50; p=0,02).
Ключевые слова: алкогольная болезнь печени, генетическая предрасположенность,
гены репарации ДНК
The results of the research of polymorphic loci of DNA repair system genes XRCC1 (rs25487),
XPD (rs13181), XRCC3 (rs861539) of patients with alcoholic liver disease are presented. The
object of study DNA samples (N = 82), isolated from blood leukocytes from populations of
Bashkortostan Republic suffering from chronic alcoholism with manifestations of alcoholic
liver disease. Polymorphic variants G28152A (Arg399Gln) of the XRCC1 gene, A35931C
(Lys751Gln) of the XPD gene, C18067T (Thr241Met) of the XRCC3 gene were studied by analysis
of restriction fragment length polymorphism products of polymerase chain reaction. We
observed the significant increase frequencies both alcoholic liver disease genotype AC (Lys/
Gln) gene XPD (OR=1,71; р=0,03) polymorphic locus, and genotype TT (Met/Met) XRCC3 gene
(OR=2,46; p=0,03) polymorphic locus in hepatitis as compare to the healthy. We supposed
that these genotypes may be used as genetic markers of predisposition to alcoholic hepatitis.
Less susceptible to the liver disease persons with genotype AA (Lys/Lys) gene XPD (OR=0,60;
р=0,04) and CT (Thr/Met) gene XRCC3 (OR=0,50; p=0,02).
Key words: alcoholic liver disease, genetic predisposition, DNAreparation genes
Одной из наиболее значимых причин
развития печеночной недостаточности
является гепатит. В этиологии гепатита
ведущими факторами часто становятся инфекции (вирусный гепатит) и интоксикации
(токсический гепатит). К токсическим гепатитам относятся: лекарственная, профессиональная и алкогольная болезни печени.
Основными и общими для всех токсических
гепатитов звеньями патогенеза являются
повреждения мембран гепатоцитов, стимуляция иммунопатологических процессов,
развитие воспаления и активация свободнорадикальных реакций1, которая может
вызвать мутацию. Специфичность изменений при разных по этиологии гепатитах
довольно трудно бывает определить. На
сегодняшний день используют ряд лабораторных анализов, позволяющих установить
признаки токсического поражения печени.
В частности, к индикаторам гепатитов отно1
Патофизиология: Учебник. – 4-е изд., испр. и доп. – М.:
ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 496 с
сят повышение в плазме крови активности
аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), трансферазы
гамма-глутаминовой кислоты (ТГГК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Однако уровень активности этих ферментов может определяться
целым рядом неспецифических факторов, в
частности, характером питания, наличием
инфекционного процесса. Чувствительность, специфичность и разрешающая
способность биохимических исследований
часто бывает недостаточна для выявления
характера развития патологии печени, особенно на ранних стадиях болезни.
Алкогольный гепатит – это пример многофакторного заболевания, возникновение
которого определяется сочетанием наследственной предрасположенности и влияния
алкоголя. На сегодняшний день прямой
корреляции между степенью поражения печени и количеством, видом принимаемого
алкоголя не выявлено. Только у 20-30% лиц
Àñïèðàíòñêèé âåñòíèê Ïîâîëæüÿ ¹ 5-6, 2011
247
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ
длительно продолжающееся злоупотребление алкоголем приводит к гепатиту1. О значении генетических факторов в патогенезе
алкогольной болезни печени (АБП) свидетельствуют исследования, проведенные
близнецовым методом [Цит. по: 1].
К настоящему времени проведены ассоциативные исследования генетических
полиморфизмов с хроническими гепатитами различной этиологии, включающие
320 генов2. Среди них гены системы HLA
(HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DQB1, HLADQА1), иммунного ответа (TNF, IL10, TGFB1,
IFNG), биотрансформации ксенобиотиков
и антиоксидантной защиты (GSTM1, GSTT1,
GSTP1, CYP1A1) и другие.
В последнее десятилетие активно изучается роль полиморфных вариантов генов,
контролирующих систему репарации ДНК,
в патогенезе заболеваний человека. Наиболее изучены среди них гены, экспрессирующие во многих органах: XPD, XRCC1, XRCC3.
Доказаны ассоциации полиморфных
аллелей этих генов с повышенным риском
развития рака груди, легких, кожи, прямой
кишки, мочевого пузыря, желудка3. Однако
работ, посвященных изучению роли генов
репарации ДНК в патогенезе гепатитов
недостаточно.
В связи с вышеизложенным цель работы заключалась в выявлении ассоциации
полиморфных вариантов генов репарации
ДНК XRCC1, XPD, XRCC3 с развитием алкогольной болезни печени.
Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования была
сформирована выборка из 83 пациентов
в возрасте от 24 до 63 лет, страдающих
хроническим алкоголизмом (со стажем
злоупотребления алкоголем от 5 и более
лет) с проявлениями алкогольной болезни
печени и проходившие курс стационарной
терапии в Республиканской психиатричес1
Антонян А.А., Кашкина Е.И., Лякишева Р.В. Современные представления об алкогольной болезни печени //
Саратовский научно-медицинский журнал. – 2010. - Т.
6, №2. – С. 317-321.
2
Гончарова И.А., Х. Гамаль Абд Ель-Азиз Наср, Белобородова
Е.В. и др. Полиморфизм генов модификаторов иммунного
ответа при заболеваниях печени различной этиологии. //
Медицинская генетика. – 2010. - №12. – С. 20-23.
3
Han S., Zhang H.-T., Wang Z., et al. DNA repair gene XRCC3
polymorphisms and cancer risk: a meta-analysis of 48 casecontrol studies // European journal of human genetics.
- 2006. - Vol. 14. - P. 1136-1144.; Krajinovic M., Labuda D.,
Mathonnet G. et al. Polymorphisms in genes coding drugs
and xenobiotic metabolizing enzymes, DNA repair enzymes,
and response to treatment of childhood acute lymphoblastic
leukemia // Clinical. Cancer. Research. - 2002. - Vol. 8. - P.
802-810.; Stern M.C., Siegmund K.D., Conti D.V., et al. XRCC1,
XRCC3, and XPD Polymorphisms as Modifiers of the Effect
of Smoking and Alcohol on Colorectal Adenoma Risk //
Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2006. - Vol. 15(12).
- P. 2384–90.; Cima M.F., Arriaga P.G., Garca-Castro L., et al.
Polymorphisms in XPC, XPD, XRCC1, and XRCC3 DNA repair
genes and lung cancer risk in a population of Northern Spain
// BMC Cancer. – 2007. - Vol. 7. - P.162.
248
кой больнице №2 (г. Уфа) в 2009-2010 гг.
Диагноз АБП устанавливали врачи отделения на основании данных анамнеза,
клинического обследования, изменений
белковообразующей функции печени, признаков диффузного процесса на УЗИ печени, нарушений со стороны центральной и
вегетативной нервной системы. Контрольная группа была сформирована случайным
образом из 197 практически здоровых лиц.
Группы больных АБП и контроля состояли
из жителей Республики Башкортостан и
были сопоставимы по возрасту, полу, этнической принадлежности.
Отсутствие маркеров вирусных гепатитов и других поражений печени являлось
обязательным условием отбора в группы.
Материалом для молекулярно-генетических исследований служили образцы
ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции по Mathew
(1984). Изучали полиморфизм гена XRCC1
(rs25487), картированного в локусе q13.2
хромосомы 19; гена XPD (rs13181), картированного в локусе q13.3 хромосомы 19
и гена XRCC3 (rs861539), картированного
в локусе q32.2 хромосомы 14 [8; 9]. Генетические варианты G28152A (Arg399Gln)
гена XRCC1, A35931C (Lys751Gln) гена XPD,
C18067T (Thr241Met) гена XRCC3 выявляли
методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции синтеза ДНК4.
Использовали стандартные методы
статистического анализа: разницу в распределении частот генотипов и аллелей генов
между группами рассчитывали с использованием критерия χ2 с поправкой Йетса
на непрерывность с помощью программы
RxC-статистика. Статистически значимыми
считали различия при р<0,05. Для количественной оценки относительного риска
заболевания по конкретному аллелю или
генотипу вычисляли показатель отношения
шансов (odds ratio - OR).
Результаты и их обсуждение
Проведенный сравнительный анализ
выявил значительные различия в распределении частот генотипов XPD у пациентов с
алкогольной болезнью печени и контроля.
Продукт гена XPD (xeroderma
pigmentosum group) функционирует на
начальном этапе синтеза всех белков клетки в качестве субъединицы комплексного
4
Stern M.C., Siegmund K.D., Conti D.V., et al. XRCC1,
XRCC3, and XPD Polymorphisms as Modifiers of the Effect
of Smoking and Alcohol on Colorectal Adenoma Risk //
Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2006. - Vol. 15(12).
- P. 2384–90.; Cima M.F., Arriaga P.G., Garca-Castro L., et al.
Polymorphisms in XPC, XPD, XRCC1, and XRCC3 DNA repair
genes and lung cancer risk in a population of Northern Spain
// BMC Cancer. – 2007. - Vol. 7. - P.162.
Íàó÷íî-èíôîðìàöèîííûé ìåæâóçîâñêèé æóðíàë
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ
белка TFIIH – вспомогательного фактора
РНК-полимеразы II1. Белок XPD является
необходимым участником в процессе
эксцизионной репарации нуклеотидов и
важным компонентом ферментов с хеликазной активностью2. Изменения функций
белка XPD могут быть вызваны мутацией
в кодирующем его гене. Наиболее часто
встречается у людей полиморфизм, связанный с транзицией аденина на цитозин
в позиции А35931С экзона 23 гена XPD,
приводящий к замене аминокислоты лизин
на глутамин (Lys751Gln) в 751 кодоне [Цит.
по: 3]. Конформационное состояние этого
района белка XPD влияет на стабильность
TFIIH, на хеликазную активность [Цит. по: 3;
5]. Согласно данных литературы, у носителей мутантного генотипа СС (Gln/Gln) гена
XPD наблюдается пониженная способность
к репарации и это приводит к неполноценному восстановлению повреждений
ДНК при ультрафиолетовых облучениях и
действии химических мутагенов3.
Исследования показали, что в группе
больных АБП частота генотипа АА (Lys/Lys)
составляла 35,4%; АС (Lys/Gln) - 52,4% и СС
(Gln/Gln) – 12,2%. Результаты представлены
на рис. 1.
(по данным M.C. Stern, et al. (2006) частота
гомозиготных генотипов АА и СС гена XPD у
европейцев составляет соответственно 43%
и 13%; у азиатов - 76% и 6% 4).
Статистический анализ показал, что в
группе больных АБП значительно чаще
наблюдался гетерозиготный генотип АС
(Lys/Gln), чем в контроле (χ2=4.86; р=0.03;
OR=1.71; CI, 1.1-2.8). Гомозиготный генотип АА (Lys/Lys) статистически достоверно
реже встречался среди больных АБП, чем в
контроле (χ2=4.03; р=0.04; OR=0.60; CI, 0.40.9). Анализ распределения аллелей гена
XPD не обнаружил значимых различий: у
больных АБП частота мутантного аллеля
С (751Gln) составляла 38,4%; в контроле
- 32,7% (χ2=1.93; р=0.17; OR=1,28; CI, 0.91.8). Частота нормального аллеля 35931А
(751Lys) равнялась 61,6%; в контроле - 67,3%.
Таким образом была установлена ассоциация генотипа АС гена XPD с повышенным
риском развития АБП, а у генотипа АА был
выявлен протективный эффект.
Проведенный сравнительный анализ
распределения частот генотипов полиморфного сайта G28152A (Arg399Gln) гена
XRCC1 у пациентов с АБП выявил незначительные различия от контроля.
Ген репарации XRCC1 (X–ray-repair
cross-complementing group) кодирует полипептид, участвующий в системе эксцизионной репарации азотистых оснований
ДНК. Продукт гена XRCC1 не обладает
каталитической активностью, но служит
как структурный белок и в комплексе с
ДНК-полимеразой участвует в восстановлении одноцепочечных разрывов5. У гена
XRCC1 обнаружено несколько вариабельных сайтов. Среди них наиболее часто
встречается полиморфизм, связанный с
транзицией гуанина на аденин в позиции
G28152А экзона 10, который приводит к
замене аминокислоты лизин на глутамин
Рис. 1. Распределение частот генотипов
(Arg399Gln) в 399 кодоне [Цит. по: 3; 8].
полиформного варианта A35931C гена
XPD у больных АБП (1 столбик)
Согласно данных литературы индивиды,
и в контроле (2 столбик)
несущие полиморфный вариант -399Gln
гена XRCC1, обладают более низкой споВ контроле соответственно генотип собностью к репарации повреждений ДНК6.
АА составлял 47,7%; АС - 39,2% и СС - 13,1%. Zindy P., et al. (2005) в своей работе показали
Распределение частот генотипов XPD в наличие ассоциации мутантного варианта
контроле ближе к европейской популяции 4 Stern M.C., Siegmund K.D., Conti D.V., et al. XRCC1, XRCC3,
1
Казначеев К.С., Белявская В.А., Ляхович В.В., Поспелова
Т.И. Варианты полиморфных изменений генов p53,
XRCC1 и XPD у детей с острым лимфобластным лейкозом // Бюлл. Сибирской медицины. - 2008. - Приложение.
– С. 247-252.
2
Там же.
3
Казначеев К.С., Белявская В.А., Ляхович В.В., Поспелова
Т.И. Варианты полиморфных изменений генов p53,
XRCC1 и XPD у детей с острым лимфобластным лейкозом // Бюлл. Сибирской медицины. - 2008. - Приложение.
– С. 247-252.; Benhamou S., Sarasin A. ERCC2/XPD gene
polymorphisms and lung cancer // American journal of
epidemiology. – 2005. - Vol. 161, №1. - P. 1-14.
and XPD Polymorphisms as Modifiers of the Effect of Smoking
and Alcohol on Colorectal Adenoma Risk // Cancer Epidemiol.
Biomarkers Prev. – 2006. - Vol. 15(12). - P. 2384–90.
5
Казначеев К.С., Белявская В.А., Ляхович В.В., Поспелова Т.И.
Варианты полиморфных изменений генов p53, XRCC1
и XPD у детей с острым лимфобластным лейкозом //
Бюлл. Сибирской медицины. - 2008. - Приложение. – С.
247-252.
6
Krajinovic M., Labuda D., Mathonnet G. et al. Polymorphisms
in genes coding drugs and xenobiotic metabolizing enzymes,
DNA repair enzymes, and response to treatment of childhood
acute lymphoblastic leukemia // Clinical. Cancer. Research.
- 2002. - Vol. 8. - P. 802-810.
Àñïèðàíòñêèé âåñòíèê Ïîâîëæüÿ ¹ 5-6, 2011
249
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ
гена XRCC1 с повышенным риском развития алкогольного цирроза1.
Исследования показали, что в группе
больных АБП частота носителей генотипа
GG (Arg/Arg) гена XRCC1 составляла 32,5%;
гетерозиготного генотипа GА (Arg/Gln)
- 50,0% и гомозиготного генотипа АА (Gln/
Gln) – 17,5%. В контроле соответственно
генотип GG составлял 36,9%; GА - 48,6%;
АА - 14,5%. Статистически достоверных
различий по распределению частот генотипов между больными АБП и контроля не
обнаружено (p=0,51-0,89).
Анализ распределения аллелей гена
XRCC1 не выявил значимых различий: у
больных АБП частота мутантного аллеля
А составляла 42,5%; в контроле - 38,8%
(χ2=0.69; р=0.41; OR=1,16; CI, 0.8-1.6). Частота нормального аллеля 28152G (399Arg)
равнялась 57,5%; в контроле - 61,2%.
Проведенный сравнительный анализ полиморфного варианта C18067T
(Thr241Met) гена XRCC3 у пациентов с алкогольной болезнью печени и в контроле
выявил значительные различия по распределению частот генотипов.
Продукт гена XRCC3 участвует в процессе пострепликативной репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Такие повреждения являются наиболее генотоксичными и
они часто обнаруживаются в опухолевых
клетках 2. Наиболее изученным является
полиморфный вариант XRCC3, связанный
с транзицией цитозина на тимин в позиции
С18067Т экзона 7, что приводит к замене
аминокислоты треонин на метионин в 241
кодоне (Thr241Met). В результате такой
замены не формируется комплекс, участвующий в поддержании стабильности
хромосом и нарушается способность воссоединять концы разрывов цепочек ДНК
[Цит. по: 3].
На основании проведенного анализа
распределения частот генотипов XRCC3
установлено, что среди больных АБП носители гомозиготного генотипа СС (Thr/Thr)
составляли 53,1%; гетерозиготного генотипа СТ (Thr/Met) – 30,1%; гомозиготы ТТ
(Met/Met) – 16,8%. Результаты представлены
на рис. 2.
1
Zindy P, Andrieux L, Bonnier D, Musso O. Upregulation of DNA
repair genes in active cirrhosis associated with hepatocellular
carcinoma. // FEBS Lett. – 2005. - Vol. 579(1). - P. 95-9.
2
Han S., Zhang H.-T., Wang Z., et al. DNA repair gene XRCC3
polymorphisms and cancer risk: a meta-analysis of 48 casecontrol studies // European journal of human genetics. - 2006.
- Vol. 14. - P. 1136-1144.; Stern M.C., Siegmund K.D., Conti D.V.,
et al. XRCC1, XRCC3, and XPD Polymorphisms as Modifiers
of the Effect of Smoking and Alcohol on Colorectal Adenoma
Risk // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2006. - Vol.
15(12). - P. 2384–90.; Cima M.F., Arriaga P.G., Garca-Castro L.,
et al. Polymorphisms in XPC, XPD, XRCC1, and XRCC3 DNA
repair genes and lung cancer risk in a population of Northern
Spain // BMC Cancer. – 2007. - Vol. 7. - P.162.
250
Рис. 2. Распределение частот генотипов
полиформного варианта C18067T ген:
XRCC3 у больных АБП (1 столбик)
и в контроле (2 столбик)
В контроле соответственно носители
гомозиготного генотипа СС (Thr/Thr) гена
XRCC3 составили 46,2%; гетерозиготы СТ
- 46,2%; гомозиготы ТТ (Met/Met) – 7,6%.
Среди больных АБП статистически достоверно чаще, чем в контроле, прослеживался генотип ТТ (χ2=4.43; р=0.03; OR=2.46;
CI, 1.1-5.7). Гетерозиготный генотип СТ
значительно реже встречался среди пациентов с АБП, чем в контроле (χ2=5.57; р=0.02;
OR=0.50; CI, 0.3-0.9).
Таким образом, высокий показатель
отношения шансов позволяет считать,
что у носителей генотипа ТТ (Met241Met),
страдающих хроническим алкоголизмом,
значительно повышен риск развития АБП.
Проведен сравнительный анализ распределения частот аллелей гена XRCC3.
Выявлено, что среди больных АБП частота
нормального аллеля 18067С (241Thr) составляла 68,1%; мутантного аллеля 18067Т
(Met) – 31,9%. В контроле соответственно
частота аллеля 18067С составляла 69,3%;
аллеля 18067Т - 30,7%. Статистически
достоверного различия в распределении
частоты аллеля 18067Т (Met) у больных АБП
и контроля не обнаружено (χ2=0.03; р=0.85;
OR=1.06; CI, 0.7-1.6).
Заключение
Таким образом, повышенный риск
развития АБП у лиц, злоупотребляющих
алкоголем, ассоциирован с гетерозиготным
генотипом АС (Lys751Gln) гена XPD (р=0.03;
OR=1,71) и гомозиготным генотипом ТТ
(Met241Met) гена XRCC3 (р=0.03; OR=2.46).
Высокое значение показателя отношения шансов позволяет рекомендовать
эти генотипы в качестве генетических
маркеров для прогнозирования развития
алкогольной болезни печени.
Íàó÷íî-èíôîðìàöèîííûé ìåæâóçîâñêèé æóðíàë