УМКД 042-18-23.1.01/03-2013 Ред. №от __ 2013г

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени ШАКАРИМА г.СЕМЕЙ Документ СМК 3 УМК УМКД уровня 042-18-23.1.01/03-2013 УМКД Редакция №______ Учебно-методические От ___________ материалы дисциплины «Микробиология и вирусология» УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ «Микробиология и вирусология» для специальности 5В070100 – «Биотехнология» УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ Семей 2013 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 2 из 118 Содержание 1 2 3 4 Глоссарий Лекции Практические и лабораторные занятия Самостоятельная работа студента 1 ГЛОССАРИЙ В настоящих УММ использованы следующие термины с соответствующими определениями: АКР – аудиторная контрольная работа ГСР – график самостоятельной работы СРС – самостоятельная работа студента СРСП – самостоятельная работа студента под руководством преподавателя ЛК – лекции ЛБ – лабораторные занятия 2 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 3 из 118 2 Лекции ЛЕКЦИЯ 1 Тема: Введение ПЛАН: 1. Предмет и задачи микробиологии 2. История развития микробиологии 1.Предмет и задачи микробиологии «МИКРОБИОЛОГИЯ» происходит от греческих слов «micro» -малый, «bios» - жизнь и «logos» - наука (учение). Таким образом, микробиология является наукой о жизни микроскопически малых существ микроорганизмов, невидимых невооруженным глазом. Микробиология – наука о мельчайших, невидимых невооруженным глазом организмах, названных микробами или микроорганизмами. Она изучает их строение, морфологию, физиологию, роль в различных процессах происходящих в природе, генетику и экологию микроорганизмов, использование микробов в тех или иных областях жизни и деятельности человека, а также изменения, вызываемые ими в организме людей, животных, растений, знакомит с методами устранения их вредного действия. Предметом изучения микробиологии являются бактерии, плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты, риккетсии, микоплазмы, вирусы (Рис.1). Но поскольку вирусы абсолютно не могут существовать без живого организма, изучением их занимается самостоятельная наука, называемая «вирусологией». Предмет микробиологии бактерии Дрожжи Плесневые грибы Актиномицеты Риккетсии 3 Микоплазмы УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 4 из 118 Рисунок 1. Предмет изучения микробиологии Вездесущность микробов. Мир микроорганизмов сложен и многообразен. Они широко распространены в природе. Естественными резервуарами микробов в природе являются почва, воздух и вода. Миллиарды микробов окружают нас. Академик В.А.Омелянский так характеризовал микробов: «Поистине они вездесущи…. Незримо они сопутствуют человеку на всем его жизненном пути, властно вторгаясь в его жизнь то в качестве врагов, то, как друзья. В громадном количестве они встречаются в пище, которую мы принимаем, в воде которую пьем, и в воздухе, которым дышим». Развитие микробиологии, как и других научных дисциплин, находится в тесной зависимости от способов производства, запросов практики, общего прогресса науки и техники. В настоящее время в соответствии с потребностями общества в микробиологии выделялись направления, различающиеся задачами исследования (Рис.2). 4 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Военная микробио логия Геологиче ская микробио логия Медицинс кая микробио логия Страница 5 из 118 Ветеринар ная микробио логия Сельскохо зяйственн ая микробио логия Общая микробио логия Космичес кая микробио логия Промышл енная микробио логия Генетичес кая микробио логия Пищевая микробио логия Рисунок 2. Направления микробиологии Фундаментом для всех перечисленных направлений является общая микробиология, которая изучает морфологию, физиологию, распространение и сохранение микробов во внешней среде, генетику микроорганизмов, вопросы систематики и классификации их, роль микробов в круговороте веществ в природе, патогенность и вирулентность, роль микробов в инфекционном процессе, вопросы иммунитета. 2.Основные этапы развития микробиологии В развитии микробиологии выделяют два этапа: 1. Морфологический – связан с именем Антона Левенгука (1632-1723), который создал первый микроскоп и описал основные формы микробов. 5 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 6 из 118 2. Физиологический – на этом этапе происходило более глубокое изучение жизнедеятельности микробов. - Луи Пастер (1822-1895) –французский ученый; - Роберт Кох (1843-1910) – немецкий ученый, - Илья Ильич Мечников(1845-1916) – русский ученый; - Пауль Эрлих (1854-1916) немецкий ученый, - Сергей Николаевич Виноградский (1856-1953); - Василий Леонидович Омелянский (1867-1928) - Дмитрий Иосифович Ивановский (1864-1920); - Н.Ф. Гамалея (1859-1949); - Г.Н.Габричевский (1860-1907); - А.Флеминг(1929г. – открыл пенициллин), - В.Н Шапошников (1884-1968) (производство молочной кислоты при помощи молочно-кислых бактерий), - Я.Я.Никитинский (1878-1941)(консервное производство) 3. Вторая половина 20 столетия – новый этап, связан с рождением молекулярной генетики и молекулярной биологии. Носитель гена – ДНК. История промышленной микробиологии Боги указывают на свою благосклонность войскам Александра и дают понять, что его победа обеспечена. Толкование мудреца так подняло дух армии, что солдаты с воодушевлением атаковали стены города и в скором времени захватили его. Схожие случаи известны и из истории Средних веков. В VI века «кровавые пятна» в хлебе появлялись во французском городе Тур. Подобные же пятна вызвали сильное волнение в 1819 г. в итальянском селе Леньяро близ Падуи. В одном из домов на кукурузных лепешках появились красные пятна. Вскоре «эпидемия» охватила всю деревню и потребовалось вмешательство властей, поскольку волнение населения приняло характер паники. Комиссия специалистов исследовала загадочный случай. Все указывало на то, что «кровавые пятна» вызванные какими-то микроорганизмами. Один из членов комиссии перенес некоторое количество «заряженного» хлеба на свежий, и пятна очень скоро появились и на этом хлебе. Это было верное доказательство того, что возбудитель «эпидемии» живой организм. После дезинфекции зараженных продуктов распространение красных пятен прекратилось. В честь мореплавателя Серрати эту «чудотворную» бактерию назвали Serrotia marcescens (marcescen) означает гниющий. Serrotia marcescens синтезирует в своих клетках кроваво-красное красящее вещество – продигиозин. 6 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 7 из 118 Человек издавна начал использовать деятельность микроорганизмов, при этом не зная о их существовании. Об этом свидетельствуют различные археологические находки, поэтические мифы и легенды. Так, в пирамидах Египта, построенных около 6000 лет назад, находили караван хлеба, что указывает на использование процессов брожения в приготовлении теста. Или, например, об изготовлении вина в античном мире свидетельствует различные легенды. При этом человек неизбежно сталкивается с процессом скисания вина – с образованием уксуса. До сих пор сохранилось много народных способов приготовления различных национальных продуктов, полученных на основе молочнокислого и спиртового брожения. Пектиновое брожение, лежащее в основе мочки льна, конопли, так же известно человеку 3-4 тысячелетия. Пиво, например, считаю что его изготавливали за 7000 лет до н.э. Технология его приготовления была высокоразвита в Вавилоне, Египте, Персии, Греции. В Армении в VI в. до н.э. умели готовить крепкое пиво. С IX в. пиво получило распространение в России, в Казахстане. Значительно позже научились получать этиловый спирт. Спирт применяли только в медицине под названием «Aguata vitae» - вода жизни. Водка вошла в быт значительно позже. Человечество кроме полезной функции м-в столкнулись и с негативными действием их. Появилась необходимость разрабатывать методы хранения продуктов. Использовали сушку, замораживание, соление, квашение, исключали доступ воздуха. Во второй половине XVв. Наметилось зарождение современного естествознания. Многие ученные пытались выяснить причину брожения. Так немецкий химик Г.Э. Шталь считал, что брожение – это процесс внутреннего движения белковых веществ, а фермент переносит это движение на сбраживаемые вещества. Французский химик А.Л. Лавуазье (1743-1794) изучал химизм брожения. Он почти точно определил весовые пропорции водорода, углерода и кислорода в исходных и конечных продуктах брожения. Именно в этих работах была изложена основная идея закона сохранения материи. Более успешное развитие микробиологии связано с созданием достаточно сильных оптических приборов. Плодотворные исследования в изучении свойств микроорганизмов были начаты в 40-х г. XIX в. Французский ботаник Ш. Каньяр-де-Латур (1837г.) высказал мысль, что брожение вызывают дрожжи. Его поддерживали немецкий ученный Т. Шванн и Ф. Кютцинг. Однако, такие ученные – химик Ю. Либих, Ф. Вёлер, И.Я. Берцелиус и др. критиковали их, т.к. было общепринятым мнение Либиха о том, что брожение – это химическое явление, вызываемое в разнообразных телах разлагающихся белковыми веществами. 7 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 8 из 118 Формирование микробиологии как науки связано с именем знаменитого французского ученого Луи Пастера (1822-1895 гг.). Его работы имели большое теоретическое значение и дали большой практический эффект. К.А. Тимирязев считал, что ни один человек за всю историю цивилизации не оказал такого влияния на практическую деятельность человека, как Пастер. Именно Пастер доказал, что процессы брожения – не простые химические явления, а результат воздействия на субстраты определенных микроорганизмов. Кроме того, он доказал, что не все микроорганизмы нуждаются в молекулярном кислороде. Так были открыты обинатные анаэробы. Велики заслуги Пастера и в познании причин болезней вин, инфекционных заболеваний шелковичных червей, домашних животных и человека, а так же в разработке способов борьбы с ними. Многие рекомендации Пастера применяются и посей день. Пастеризация. Применяется в винодельческих и молочной промышленности. Таким образом гениальный ученный, самоотверженный труженик лабораторного стола, решивший огромное количество проблем, важных для человечества, Луи Пастер, по праву считается основоположником современной микробиологии, в т.ч. промышленной. Для работы с чистыми культурами необходима была стерильная посуда и среды. Большой вклад в разработку технологий стерилизации внесли Л. Пастер, Р. Кох, Д. Тиндаль, Ш. Шамберлен и др. Большая заслуга по внедрению чистых культур в промышленность принадлежит датскому ученному Э.Х. Гансену. В 1872 г. русский врач и биохимик М.М. Манассеин отметил, что спиртовое брожение может проходить в отсутствие живых клеток. Немецкие ученные – братья Г. и Э. Бухнеры и русский ученный А.Н. Лебедев показали, что если получить из дрожжей экстракт содержащий ферменты, то в присутствии его так же происходит брожение. То есть было доказано, что причиной брожения может быть как сами живые клетки, так и ферменты, образуемые клеткой. Все это послужило стимулом для изучения ферментов микроорганизмов. С.Н. Виноградский (1856-1953) и В.Л. Фрибес выделили и изучили анаэробную бактерию. Омелянскому В.Л. (1867-1928) ученику Виноградского принадлежат классические исследования по анаэробному разложению целлюлозы и образованию микроорганизмами метана. В начале ХХ в. в России, Англии, США, Германии начались исследования промежуточных этапов процесса спиртового брожения. Это позволило влиять на ход процессов, обусловленных микроорганизмами. В 8 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 9 из 118 результате появились научные предпосылки для значительного расширения микробиологических производств. В годы первой мировой войны военные потребности оказали влияние на появление ряда производств. Так Германии необходимы были глицерин (его стали получать из сахара и мелассы). Недостаток жиров – с помощью гриба Endomyces vernalis по технологии П. Линднера. Возросла потребность в ацетоне для производства взрывчатых веществ. Х. Вайсман организовал в Англии микробиологическое производство ацетона из кукурузной муки. В Америке – получение ацетона и бутилового спирта из сахара при помощи бактерий по способу ФернбахаВайсмана. В 1923 г. было организовано первое микробиологическое промышленное производство лимонной кислоты, затем молочной, плюконовой. До 1940 г. ряд органических кислот, ацетон, бутанол, этиловый спирт получали микробиологическим путем. Затем некоторые из этих веществ начали производить химическим способом. В н.в. в связи с недостатком энергетических ресурсов, вновь возрос интерес к микробиологическим методам получения ряда таких продуктов. После революции необходимо было развивать пищевую промышленность и переходить от кустарного производства к крупному. В разработке биохимических микробиологических производств лежат в основе приготовления пищевых продуктов – приняли участие В.А. Омелянский, В.А. Николаев, Г.Л. Селибер, С.А. Королева, А.Ф. Войткевич. В 20-е годы было разработано микробиологическое производство молочной и масляной кислот, в 30-е годы – ацетона и бутилового спирта – Шапашников В.Н. В 1933 г. было организовано впервые под руководством В,С. Буткевича и С.П. Костычева производство лимонной кислоты грибами. В 30-е годы в СССР – производство некоторых ферментов (эргостерипровитамин Д2). Открытие мутагенного действия (1925г.) рентген изучен на микроорганизмы Г.А. Надсоном и Г.С. Филипповым послужило почвой для интенсивных генетических исследований. До 40-х годов технология микробиологического производства во многих странах была еще слабо выражена. В основном процессы осуществлялись поверхностным способом при котором микроорганизмы растут на поверхности среды. Лишь при производстве пекарских дрожжей (затем органических кислот) начали осуществлять аэробное глубинное культивирование микроорганизмов. Новый этап в развитии микробиологической промышленности связан с началом производства антибиотиков. Открытие антибиотиков и организация 9 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 10 из 118 их производств считаются одним из важнейших достижений биологии 20 в. необходимы были новое оборудование, что привело к резкому повышению значения технических наук в микробиологической промышленности. С открытием антибиотиков связано бурное развитие других отраслей микробиологической промышленности. В 1948 г. – был получен витамин В12, который ни жив-е, растения не синтезируют с помощью микроорганизмов. В составе витамина В12 – 4,5% кобальта, он стимулирует синтез белка, т.о. рост организма стимулирует эритро. и синтез гемоглобина. Содержится в молоке, рыбе, обрате. После второй мировой войны в производство полезных веществ стали вовлекаться многие группы микроорганизмов. Ведется поиск новых продуцентов в природе. С возникновением генной инженерии появилась возможность направленно создавать для промышленности микроорганизмы с заданными свойствами, что значительно расширяет области практического использования микроорганизмов. Так например, микробиология внедрилась в такие производства, как получение энергетического сырья (биогаз), добыча нефти, металлов. Микроорганизмы все шире используются для трансформации. Например, при трансформации стероидного сырья получают картизон, сидрокартизон, преднизолон и др. И другие открытия позволяют развивать микробиологическую промышленность. Своими достояниями промышленная микробиология обязана интеграции наук. Обогатившись методами смежных наук – химии, физики, математики, биохимии, мол. биологии и генетики, промышленная микробиология решает свои проблемы. Достижения промышленной микробиологии оказывают глубокое влияние на развитие смежных наук. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Понятийный аппарат (тезаурус) к теме №1 Аттенуация Вакцина Вирусология Микробиология Направления микробиологии (общая микробиология, ветеринарная микробиология, медицинская микробиология, сельскохозяйственная микробиология, промышленная микробиологи, пищевая микробиология) Патогенные микроорганизмы Предмет микробиологии (бактерии, плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты, риккетсии, микоплазмы) Сапрофиты 10 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 11 из 118 ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ: 1. Что изучает микробиология и вирусология? 2. Предмет микробиологии. 3. Что изучают конкретные направления микробиологии (общая, медицинская, сельскохозяйственная, ветеринарная, промышленная, пищевая генетическая и др.)? 4. Патогенные микроорганизмы. 5. Вакцина. 6. Аттенуация. 7. Морфологический этап в развитии микробиологии. 8. Физиологический этап в развитии микробиологии. 9. Полезные свойства микроорганизмов. 10. Вредные свойства микроорганизмов. 11. Вклад ученых в развитие микробиологии. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА: Основная 1. 1.Бияшев Б.К. Ветеринарная микробиология и иммунология. Алматы, 2007. – 417 с. 2. Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. – М.,1989.- 272с. Дополнительная 1. Ветеринарная микробиология и иммунология /Под ред.проф. Н.А.Радчука.-М.,1991.-С.3-10. 2. Емельяненко П.А. Ветеринарная микробиология. – М.,1982.- С.3-11. 3. Ассонов Н.Р. Микробиология.-М.1989.- С.3-18. 4. Бетина В. Путешествие в страну микробов. – М.,1976.- 272с. - С.14-98. Лекция №2 ТЕМА: 2.Морфология и строение прокариотической клетки. 1. Систематика, классификация и номенклатура микроорганизмов 2. Морфология и строение бактерий 2.1. Постоянные элементы - нуклеоид, цитоплазма, оболочка 2.2. Непостоянные элементы - спора, капсула, жгутики 1. Систематика, классификация и номенклатура бактерий. В настоящее время все микроорганизмы делятся на три царства. Царство вирусов. К ним относят возбудителей инфекционных болезней и бактериофаги 11 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 12 из 118 Вирусы Царства Микроорга низмов Прокариот ы Эукариоты Эукариоты – ядерные организмы, ядерная мембрана отграничивает ДНК от цитоплазмы. Прокариоты – безъядерные клетки, ядерные компоненты не отделены от цитоплазмы оболочкой. Рисунок 1. Царства микроорганизмов Систематика (таксономия) – наука, занимающаяся вопросами классификации, номенклатуры и идентификации микроорганизмов. Под классификацией микроорганизмов понимают распределение их по группам (таксонам) на основании общих признаков. Каждая группа имеет свое название (Рис.2). 12 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 13 из 118 царство - regnum отдел - divisio секция - section класс - ciassis порядок - ordo семейство - familia род - genus вид – species Рисунок 2. Классификация микроорганизмов Самой мелкой единицей классификации является «вид» – группа микроорганизмов, наделенная общими стабильными признаками и происходящая от общего предка. В микробиологии пользуются терминами «вид», «штамм», «клон», «культура». Вид – это совокупность особей, имеющих общее происхождение и генотип, морфологические, физиологические и др. признаки, способные в определенных условиях вызывать одинаковые процессы. Культура - это микроорганизмы, выделенные от животного, человека, растений и т.д. и выращенные на питательных средах. Культуры микробов могут быть чистыми (из одного вида микроорганизмов) или смешанными (из нескольких видов). Штамм – культура одного и того же вида, но выделенная из различных объектов и поэтому отличающаяся незначительным изменением свойств. Клон – культура микроорганизмов, выращенная из одной микробной клетки на искусственной питательной среде. Всё потомство обладает совершенно одинаковыми свойствами. Идентификация – отнесение микроорганизмов к определенному таксону (виду) на основании конкретных признаков. Номенклатура – система наименований, применяемых в определенной области знаний. Название бактериям присваивается в соответствии с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий введенного с 1 января 1980 года. Принята двойная номенклатура, предложенная еще в 18 в. К. 13 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 14 из 118 Линнеем. Название бактериям дается на латинском языке и состоит из двух слов. Первое слово обозначает род, к которому принадлежит данная бактерия, второе – название вида. Родовое название пишется с прописной буквы, видовое – со строчной. В настоящее время классификация микроорганизмов основана на комплексе следующих признаков: 1.Фенотипические признаки – внешние признаки, не связанные с наследственностью и генотипом. Фенотипические признаки определяют место микробов в классификации по их сходству по морфологическим признакам, культуральным, физиологическим, тинкториальным и др. Например, по классификации Красильникова микроорганизмы делятся на три группы (по внешнему виду): 1 – шаровидные (5 видов), 2 – палочковидные, 3 – извитые. 2. Генотипические признаки. В основе геносистематики лежит изучение нуклеотидного состава ДНК и наиболее важных характеристик генома (величина, объем, молекулярная масса и др.). Существует второй подход к систематике бактерий, преследующий практические цели, т.е. служит для идентификации бактерий – установления принадлежности к определенному виду. Для этого созданы определители, которыми пользуются при определении вида того или иного микроорганизма. К международным определителям бактерий относится «Определитель бактерий 9», вышедший в свет в 1993 году. 2.Морфология и строение бактерий К постоянным элементам микробной клетки относят: оболочку, цитоплазму и нуклеоид (ядерное вещество). К непостоянным элементам относят капсулу, спору и жгутики. Постоянные элементы. Оболочка состоит из двух слоев: наружной мембраны, клеточной стенки. Наружная мембрана – это вязкий слой слизи, состоящий из полисахаридов (у кокков) или полипептидов (у бацилл). Выполняет защитную функцию, предохраняет клетку от неблагоприятных факторов внешней среды (температуры, высушивания, давления и т.д.). Клеточная стенка – это основной слой (имеется только у бактерий), он придает клетке форму и определяет ее морфологические особенности. Отсюда кокки, палочки или извитые формы. Выполняет защитную функцию. Кроме того, через нее поступают питательные вещества внутрь клетки, т.е. участвует в обмене веществ. Основу клеточной стенки составляет пептидогликан или муреин (от лат.murus – стенка), являющийся каркасом бактериальной клетки и имеющий сетчатую структуру. Химический состав и ультраструктура клеточной стенки бактерий лежит в основе разного окрашивания бактерий по методу Грама и деления их на грамположительные 14 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 15 из 118 и грамотрицательные. Этот метод предложен в 1884 г. Х.Грамом и используется для дифференцирования бактерий. Цитоплазматическая мембрана. Полупроницаемая оболочка, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. В химическом отношении это белково-липидный комплекс, состоящий из 50-75% белков и 15-50% липидов(90% фосфолипидов). Через цитоплазматическую мембрану осуществляется поступление питательных веществ в клетку и выход продуктов метаболизма наружу – является осмотическим барьером клетки. При нарушении осмотического давления наступает кариопикноз (разбухание) или кариолизис (разрушении). Цитоплазма – безоболочечная коллоидная часть клетки с зернистой структурой. Основную массу гранул составляют рибосомы, включения. Центральную часть цитоплазмы занимает ядерный аппарат – нуклеоид. Нуклеоид - ядерное вещество, генетический аппарат микробной клетки. Представлен молекулой ДНК. Нуклеоид обеспечивает видовую принадлежность, участвует при размножении бактериальной клетки. В клетках бактерий обнаружены внехромосомные генетические элементы, называемые плазмидами. Плазмиды это небольшие ковалентнозамкнутые кольцевые молекулы ДНК, содержащие 1500-40000 пар нуклеотидов. Плазмиды играют важную роль в эволюции прокариот, так как придают им дополнительные свойства, способствующие их выживанию. Непостоянные элементы. Капсула, спора и жгутики. Капсула – слизистый слой, расположенный над клеточной стенкой бактерий. Капсула образуется при попадании патогенного микроба в организм. Она выполняет защитную функцию. Спора – это стадия покоя в жизненном цикле бактериальной клетки. Споры образуются при попадании бактерий во внешнюю среду, в условия неблагоприятные для жизнедеятельности. Споры устойчивы к физическими химическим факторам. Различают центральное (возбудитель сибирской язвы), терминальное (возбудитель столбняка) и субтерминальное (возбудитель ботулизма) расположение. Жгутики образованы белком флагелином. Являются средством передвижения. Количество жгутиков и расположение их на поверхности клетки разное. Патогенные свойства реализуются за счет адгезии – прилипания к ворсинкам кишечника. Кроме жгутиков на поверхности клеток могут быть фимбрии. Это прямые полые цилиндры, отходящие от цитоплазматической мембраны. Они образованы белком пилином. Принимают участие в конъюгации. Таким образом, непостоянные элементы микробной клетки являются дифференцирующими признаками бактерий. Понятийный аппарат (тезаурус) к теме №2 1. Адгезия 15 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 16 из 118 2. Вид, культура чистая, культура смешанная, клон, штамм 3. Систематика (таксономия): классификация микроорганизмов (грациликуты, фирмикуты, тенерикуты, мендосикуты); номенклатура, идентификация 4. Постоянные элементы бактерий (клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, нуклеоид (ядерное вещество), рибосомы, мезосомы). (Грамположительные бактерии. Грамотрицательные бактерии) 5. Непостоянные элементы бактерий (капсула, эндоспора и жгутики) 6. Формы микроорганизмов (кокки, бактерии, извитые) ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ: Систематика, классификация и номенклатура микроорганизмов. «Вид», «штамм», «клон» микроорганизмов. Постоянные (нуклеоид, цитоплазма, оболочка) и непостоянные (спора, капсула, жгутики) элементы бактерий. . РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА: Основная 1. Ветеринарная микробиология и иммунология /Под ред.проф. Н.А.Радчука.-М.,1991.-С.11--26. 2. Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. – М.,1989.- 14-17. Дополнительная 3. Емельяненко П.А. Ветеринарная микробиология. – М.,1982.- С.7-19. 4. Ассонов Н.Р. Микробиология.- М.1989.- С.19-51. 5. Бетина В. Путешествие в страну микробов. – М.,1976.- С.14-98. Лекция № 3 ТЕМА: Систематика, морфология, строение и размножение эукариотных микроорганизмов План: 1. Морфология и строение плесневых грибов. 2. Морфология и строение дрожжей. 3. Морфология и строение актиномицет. Грибы – безхлорофильные низшие эукариотические хемоорганотрофные организмы. Грибы это большая группа одно- или многоклеточных организмов, которым присущи как признаки растений, так и 16 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 17 из 118 животных. Различают грибы – паразиты, грибы – сапрофиты, грибы – симбионты. Грибы – паразиты поражают ткани человека, животных и растений. Из известных 100000 видов грибов, для человека патогенны не более 400. Для животных еще меньше. Грибы – сапрофиты питаются органическими веществами мертвых тканей или экскрементами. К сапрофитам относят дрожжевые и плесневые грибы. Дрожжевые и плесневые грибы широко используются в промышленности для получения полезных веществ (хлеба, спирта, кваса, кефира, антибиотиков и др.). Грибы – симбионты могут вступать в симбиотические отношения с корнями высших растений. Плесневые грибы имеют мицелярное строение. Мицелий состоит из ветвящихся нитей, называемых гифами. У низших одноклеточных грибов (мукор) гифы не септированы, т.е не разделены перегородками. У высших грибов (пеницилл и аспергилл) гифы септированы, они многоклеточные орагнизмы. Толщина гиф составляет 5-50 мкм и более. Клеточная стенка грибов толстая, прочная, содержит целлюлозу и хитин: цитоплазматическая мембрана может иметь стероиды. В цитоплазме содержится одно или несколько ядер с двойной мембраной, ядрышком и хромосомами, митохондрии, полисомы, лизосомы, вакуоли, включения валютина, гликогена. В клетках грибов отсутствует крахмал, одним из продуктов метаболизма является мочевина, у прокариот она невстречается. У грибов различают три типа размножения: вегетативное, бесполое, половое. Вегетативное размножение осуществляется путем отделения от мицелия его частей с последующим образованием из них новых грибниц. Бесполое размножение осуществляется с помощью спор (экзоспор и эндоспор). Эндоспоры (мукор) развиваются внутри особых клеток спорангий и называются спорангиоспорами. Экзоспоры (аспергилл, пеницилл) образуются на концах ответвлений мицелия конидионосцах и называются конидии (конидиоспоры). При созревании споры (конидии) осыпаются, спорангии лопаются и спорангиоспоры высыпаются. Попав, в благоприятные условия споры, прорастают. При половом размножении грибов спорообразованию предшествует слияние гаплоидных мужских и женских гамет, в результате возникает зигота и наступает диплоидная фаза с полным (парным) набором хромосом. Половой процесс у разных видов грибов протекает различно и имеет свои особенности. Дрожжи. Они могут принадлежать к разным классам, чаще к аскомицетам. Дрожжи – эукариоты, одноклеточные, мицелия не образуют, сферические или палочковидные, размером 5-10 мкм. Имеют двухконтурную оболочку, цитоплазму, ядро, митохондрии, включения – валютин, гликоген. Размножаются вегетативным путем (почкованием, делением), половым путем. Образование половых спор у большинства дрожжей происходит по аскомицетному типу. После копуляции двух клеток (конъюгация) и слияния 17 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 18 из 118 ядер, зигота превращается в сумку, где после 2-3 кратного деления образуются 4-8 аскоспор. Каждая из аскоспор может прорастать в новую дрожжевую клетку, размножающуюся почкованием. Аскоспоры значительно устойчивы к внешним факторам, чем дрожжевая клетка. Однако, по устойчивости они существенно уступают бактериальным спорам. Дрожжи играют важную роль в круговороте углерода в природе. Их используют в производстве хлеба, пива, вина, ценных молочнокислых продуктов, сдобренных кормов для животных. По химическому составу 50% сухого вещества составляют белковые вещества. Дрожжи используют для получения микробного белка. Актиномицеты (лучистые грибы) – длинные одноклеточные ветвящиеся микроорганизмы. Занимают промежуточное положение между грибами и бактериями. Как бактерии растут на питательных средах и красятся анилиновыми красками (грамположительные). Как грибы образуют ветвления – гифы, а образуемые ими переплетения – мицелий. В отличие от бактерий у актиномицетов имеются специальные органы размножения – спорангии. Спорангии могут быть прямыми, волнистыми или спирально закрученными веточками. Аэробы, реже анаэробы. Образуют пигменты (розовый, желтый, синий). Актиномицеты принимают участие в почвообразовательных процессах, образовании гумуса, являются основными продуцентами антибиотиков (стрептомицин, хлортетрациклин). Понятийный аппарат (тезаурус) к теме №3 1. Грибы - паразиты, симбионты, сапрофиты 2. Мицелий 3. Гифы 4. Экзоспоры 5. Эндоспоры 6. Типы размножения грибов: вегетативное, бесполое, половое. 7. Аскоспоры 8. Лучистые грибы ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ: 1. Морфология и строение микроскопических грибов 2. Отличительные признаки актиномицет от бактерий 3. Отличительные признаки актиномицет от грибов 4. Морфология и строение дрожжей РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА: Основная 1. Мишустин С.Н., Емцев В.Т.Микробиология. - М., 1987. - С.350. 18 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 19 из 118 2. Бияшев Б.К. Ветеринарная микробиология и иммунология.- Алматы,2007. – 417 с. 3. Ветеринарная микробиология и иммунология /Под ред.проф. Н.А.Радчука.-М.,1991. 4. Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. – М.,1989. Дополнительная 1. Блейм Т.Н.Сборник тестов по микробиологии. Семей,2005.-112с. 2. Сидоренко О.Д., Ванькова А.А., Войно Л.И. Микробиология: Учебник для агротехнологов. – М.:ИНФРА-М,2005.-287 с. 3. Емельяненко П.А. Ветеринарная микробиология. – М.,1982. 4. Ассонов Н.Р. Микробиология.- М.1989. ЛЕКЦИЯ №4 Тема: Влияние внешних факторов на микроорганизмы. Контроль за ростом ПЛАН: 1. Действие физических факторов на микроорганизмы 2. Действие химических факторов на микроорганизмы 3. Действие биологических факторов на микроорганизмы Литература 1. Техническая микробиология пищевых продуктов/Под ред. А.Я Панкратова.-М.,1968.-С.99-124. 2. Жвирблянская А.Ю., Бакушинская О.А. Микробиология в пищевой промышленности - М.,1975.-С.16-32. 3. Трушина Т.П. Основы микробиологии, физиологии питания и санитарии для общепита.-Ростов-на-Дону: «Феникс»,2000.-С.48-63. 1. Действие физических факторов на микроорганизмы К физическим факторам относят действие температуры, высушивания, гидростатического давления, света, электричества, ультразвука, лучистой энергии, летящих электронов. Взависимости от температуры роста все микроорганизмы распределяются на три группы. 1. Психрофилы 2. Мезофиллы 3. Термофилы 19 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Минимум Оптимум Максимум Психрофилы 0 15-20 30-35 Страница 20 из 118 Мезофилы 10 30-37 40-45 Термофилы 35 50-60 70-75 В микробиологической практике из всех перечисленных физических факторов наибольшее применение имеет температурный фактор. Большая часть микроорганизмов чувствительна к высоким температурам. Уже при температуре 56 С многие микробы погибают в течение 30 минут, при 70 С – 10-15 мин, при 80-100 С – 1мин. Однако споры характеризуются значительной устойчивостью к высокой температуре. Они сохраняют жизнеспособность даже после кипячения в течение часа и более. Высокая температура угнетает ферментативную активность бактерий, вызывает денатурацию белков, нарушение осмотического давления. В связи с этим, высокую температуру используют для уничтожения вегетативных и споровых форм бактерий. Полное уничтожение бактерий на объекте называется стерилизацией. В зависимости от стерилизуемого материала разработаны разные виды стерилизации. В лабораторной практике для сохранения микробных культур применяют метод лиофилизации. Лиофилизация – это метод получения сухих культур микроорганизмов путем высушивания из замороженного состояния (76 С) под вакуумом. Универсальным способом уничтожения вегетативных и споровых форм является сочетание высокой температуры и повышенного давления. Для этого имеется специальное оборудование – автоклавы. 2. Действие химических факторов на микроорганизмы Химические вещества, взаимодействуя с клеткой, вызывают либо остановку роста микроорганизмов (бактериостатическое действие), либо его гибель (бактерицидное действие). Бактерицидное действие химических веществ позволяет использовать их в качестве дезинфектантов. Дезинфекция – это уничтожение патогенных микроорганизмов в окружающей среде. Бактерицидным действием обладают различные химические вещества: кислоты, щелочи, спирты, поверхностно-активные вещества, фенолы и их производные, соли тяжелых металлов, окислители, группа формальдегида, газообразные вещества и др. Перечисленные группы имеют различные механизмы бактерицидного действия, обусловленные разнообразной химической структурой. 20 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 21 из 118 4. Действие биологических факторов на микроорганизмы К биологическим факторам относят антибиотики и бактериофаги. Антибиотики (греч. Анти – против, БИОС – жизнь) - это вещества микробного, животного, растительного и синтетического происхождения, подавляющие развитие и биохимическую активность чувствительных к ним микробов или даже разрушающие их. 1929г. – А.Флеминг доказал, что фильтрат бульонной культуры плесневого гриба Penicillium notatum обладает антимикробными свойствами в отношении стафилококков и др. микробов. 1940 г. – Э.Чейн, Г.Флори, Э.Эбрахем, выделили пенициллин из культуральной жидкости. 1942 г. – З.В. Ермольева получила пенициллин в СССР. 1944 г. – С.Ваксман открыл ряд антибиотиков продуцентами которых были актиномицеты, в т.ч. в 1944 г. – стрептомицин (Actinomices griseus) для лечения туберкулеза и чумы. Он более эффективен, чем пенициллин против грамотрицательных бактерий. В связи с открытием пенициллина и стрептомицина, сталдо возможным лечить большую часть бактериальных инфекций. В течение 2-х десятилетий (с 1940 по 1960 гг) были открыты все наиболее часто применяемые антибиотики: стрептомицин, хлорамфиникол, полимиксин, хлортетрациклин, бензилпенициллин, неомицин, нистатин, эритромицин, новобиоцин, олеандомицин, канамицин, леворин и др. Поиск новых и совершенствование старых антибиотиков продолжается, в т.ч. на основе биотехнологии, производящей антибиотики в огромном количестве. Если в 1943 г. Было произведено всего 13 кг пенициллина, то сейчас ежегодно – десятки тысяч тонн антибиотиков все новых и новых поколений. Одних только антибиотиков пенициллинового ряда выпускается около 100 наименований. В настоящее время известно более 5000 антибиотиков. Из них в медицине и ветеринарии используется около 200 антибиотиков. Антибиотики как продукты жизнедеятельности одних микробов обуславливают гибель других. Т.е. действие биологических факторов основано, прежде всего, на антагонизме микробов. Принципы классификация антибиотиков. В основе классификации антибиотиков лежит: 1. Механизм действия. Антибиотики обладают избирательностью и специфичностью действия. Специфичность действия заключается во влиянии на различные виды обмена веществ. По механизму действия: 1). нарушающие синтез клеточной стенки; 21 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 22 из 118 2). ингибирующие синтез белка, РНК, ДНК (группа левомицитина, тетрациклина, макролиды, аминогликозиды) 3) .нарушающие функции цитоплазматической мембраны(полиеновые антибиотики). 2. По типу действия на микроорганизмы: 1) антибиотики с бактерицидным действием (влияющие на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану); 2) антибиотики с бактериостатическтм действием (влияющие на синтез макромолекул). 3. По спектру действия (узкого и широкого спектра действия). 1) с преимущественным действием на грамположительные микроорганизмы (линкозамины, биосинтетические пенициллины, ванкомицин); 2) с преимущественным действием на грамотрицательные микроорганизмы (монобактамы, циклические полипептиды); 3)широкого спектра действия (аминогликозиды, левомицетин, тетрациклины, цефалоспорины. 4. По химическому строению (9 групп). Антрациклиновые антибиотики ( к ним относят противоопухолевые антибиотики – доксорубицин, карминомицин, рубомицин, акларубицин) 5. По происхождению (4 группы – антибиотики, выделенные из грибов, из бактерий, антибиотики животного происхождения, антибиотические вещества высших растений). 6. По направлению действия (антимикробное, противоопухолевое, противопаразитарное, противомикозные). Результаты применения антибиотиков в медицине оказались впечатляющими. Сократилась смертность среди детей, выросла продолжительность жизни людей, в с.-х. – для лечения и профилактики инфекционных заболеваний среди скота и птиц. Однако, возникла проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов. Если до 1945 г. 5-10% стафилококков, были устойчивы к пенициллину, то к 1960 гю -75-80%. Появились полусинтетические пенициллины – метициллин, ампициллин, оксациллин. Механизм появления устойчивых форм сложен. Считают, что некоторые виды микробов вырабатывают адаптивные ферменты, разрушающие химиопрепарат, например пенициллиназу, разлагающую пенициллин. Резистентность к антибиотикам может формироваться и в результате мутаций. Ко многим антибиотикам развивается аллергия. Бактериофаги (от греч. Phagos –пожирающий). – это вирусы, пожирающие клетки бактерий..Они не имеют клеточной структуры, не способны сами синтезировать нуклеиновые кислоты и белки, 22 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 23 из 118 поэтому являются облигатными внутриклеточными паразитами. В настоящее время они обнаружены более чем у 100 видов бактерий. Бактериофаги встречаются в почве, воде, сточных водах, организме животных и человека, молоке, испражнениях. Владельцами бактериофагов являются эшерихии, сальмонеллы, стафилококки и стрептококки, микобактерии, листерии, коринебактерии и др. 1. КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ Первым, кто наблюдал явление лизиса бактерий, был Н.Ф. Гамалея, который в 1898г. обрабатывая бациллы сибирской язвы, выделил вещество, которое лизировало за 6-12 часов молодую сибиреязвенную культуру. Он назвал эти вещества бактериолизинами и отнес их к группе ферментов. Наиболее полно это явление изучил Д, Эрель (1917-1926г). Первое сообщение Д. Эреля о феномене лизиса дизентерийных микробов под влиянием фильтрата испражнений дизентерийного больного было сделано в 1917 г. во Французской Академии наук. Им был проделан следующий опыт. В стерильный бульон вносили несколько капель жидких испражнений выздоравливающего от дизентерии человека. После суточного нахождения колбы в термостате в бульоне выросла смешанная культура. ЕЕ профильтровали через бактериальные свечи. Когда фильтрат добавили в свежие культуры дизентерийных палочек, бульон через несколько часов стал прозрачным, микробы из него исчезли (растворились). Д.Эрель повторил этот опыт несколько раз, и каждый раз получал одинаковый эффект. Выделенное литическое начало Д.Эрель назвал Bacteriophagum protobiosus. Название бактериофаг – получило всеобщее признание и прочно вошло в литературу. В настоящее время более чем у 100 видов бактерий обнаружены бактериофаги Бактериофаги инфицируя клетку, репродуцируются в ней, образуют потомство и вызывают лизис, сопровождающийся выходом фагов в среду обитания бактерий. Фаги различаются по форме, типу взаимодействия с микробной клеткой и специфичности. 2. СТРОЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ Структура бактериофагов различна. Большинство фагов имеют форму головастика или сперматозоида, некоторые фаги имеют кубическую или нитевидную форму. В структуре бактериофага различают головку и отросток. Белковая оболочка головки называется капсидом. Капсид состоит из морфологических единиц называемых капсомерамы. В него включена молекула ДНК или РНК. Молекула ДНК вместе с капсидом образует нуклеокапсид. У фагов нуклеокапсид имеет смешанный тип симметрии – спиральный и икосаэдрический. У большинства фагов геном – двунитевые ДНК, геном некоторых – однонитевые ДНК. Кроме того, в отличие от 23 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 24 из 118 вирусов эукариот, бактериофаги имеют хвостовой отросток, с помощью которого они прикрепляются к клетке. Но некоторые его не имеют. Размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм у нитевидных фагов. Средний размер головки 60-100 нм, длина отростка 100-200 нм. В химическом отношении фаги представлены нуклеиновыми кислотами и небольшим количеством белков.(в состав которых входят полиамины: спермин и путресцин, кислоторастворимый полипептид, содержащий аспарагиновую и глутаминовую кислоты, лизин и кислотонерастворимый белок). Фаги по сравнению с бактериями являются более устойчивыми к действию химических и физических факторов. Фаги могут существовать в двух формах: 1) внутриклеточной (это профаг, чистая ДНК); 2) внеклеточной (это вирион). Фаги, как и другие вирусы, обладают антигенными свойствами и содержат группоспецифические и типоспецифические антигены. Различают два типа взаимодействия фага с клеткой: 1) литический (продуктивная вирусная инфекция). Это тип взаимодействия, при котором происходит репродукция вируса в бактериальной клетке. Она при этом погибает. Взаимодействие фага и бактерий протекает стадийно. 1. Первая стадия – адсорбция фага на рецепторные участки клеточной стенки бактерий. К ним фаг прикрепляется концевыми нитями отростков. 2. Проникновение – на этой стадии ДНК фага через отросток проникает в клетку. При этом слои клеточной стенки разрушаются под действием фагового лизоцима. 3. Третья стадия – на этой стадии начинается биосинтез фаговой информационной РНК, белков капсида, которые участвуют в биосинтезе фаговой ДНК. Латентный период продолжается в пределах 15 минут. 4. Четвертая стадия – морфогенез фага, т.е. пустотелые фаговые капсиды заполняются нуклеиновой кислотой и формируются зрелые вирионы (частицы фага). 5. Пятая стадия – выход фаговых частиц из клетки. Это происходит благодаря лизису зараженной бактерии фаговым лизоцимом, накапливающимся в процессе репродукции фага. Количество зрелых фаговых частиц (вирионов) колеблется от единиц до нескольких тысяч. Затем фаги вновь внедряются в еще незараженные клетки и процесс повторяется. 2) лизогенный. Это умеренные фаги. При проникновении нуклеиновой кислоты в клетку идет интеграция ее в геном клетки, наблюдается длительное сожительство фага с клеткой без ее гибели. При изменении 24 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 25 из 118 внешних условий могут происходить выход фага из интегрированной формы и развитие продуктивной вирусной инфекции. Клетка, содержащая профаг в геноме, называется лизогенной и отличается от исходной наличием дополнительной генетической информации за счет генов профага. Это явление лизогенной конверсии. По признаку специфичности выделяют: i. поливалентные фаги (лизируют культуры одного семейства или рода бактерий); ii. моновалентные (лизируют культуры только одного вида бактерий); iii. Типовые (способны вызывать лизис только определенных типов (вариантов) бактериальной культуры внутри вида бактерий) Методы выделения и титрования фагов. Для выделения фага из субстрата (культуральная жидкость, гой ран, сточные воды и т.д.) суспензию фильтруют через мелкопористые фильтры. Затем фильтрат, внося в соответствующие молодые культуры бактерий. При наличии фага в испытуемом материале бактерии растворяются, жидкость просветляется, а на поверхности агара на месте нанесения фильтратов образуются «стерильные пятна», «бляшки», «негативные колонии». Бактериофаг проверяют на чистоту, специфичность, а также определяют его титр. Титром бактериофага называется то его наибольшее разведение, которое способно вызывать растворение соответствующих бактерий. 5. Применение бактериофагов 1. 2. 3. 4. Для лечения и профилактики (колибактериоз, сальмонеллез, пуллороз). Для дифференциации бактериальных культур (сибирская язва, стафилококки, рожа, сальмонеллы, эшерихии). Для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования. проводят индикацию патогенных бактерий во внешней среде (вода, выделениях животных, пищевых продуктов) с помощью реакции нарастания титра фага. Бактериофаги имеют большое значение для промышленности, которое проявляется: 1. отрицательной ролью – фаголизис; 2. положительной ролью – в генетике и селекции промышленных продуцентов. Умеренные фаги используются в качестве векторов для получения рекомбинатных ДНК в генной инженерии и биотехнологии. 25 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 26 из 118 Понятийный аппарат к лекции 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Психрофилы. мезофиллы, термофилы Стерилизация, виды стерилизации Анабиоз Осмофилы и галлофилы Алкалофилы, ацидофилы Высушивание, лиофилизация Аэробы и анаэробы (облигатные и факультативные) РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Основная 1. Егоров Н.С. Промышленная микробиология. М.,1989.-688с. 2. Ветеринарная микробиология и иммунология Н.А.Радчука.-М.,1991. /Под ред.проф. Лекция № 5: ТЕМА: Метаболизм(1) План: 2. Химический состав бактерий 3. Ферменты микроорганизмов 4. Типы питания микроорганизмов 5. Типы дыхания микроорганизмов 6. Рост и размножение микроорганизмов Физиология микроорганизмов это раздел микробиологии, изучающий химический состав, процессы питания, дыхания, роста и размножения. 1. Химический состав микроорганизмов 26 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 27 из 118 Как и все живые существа бактерии состоят из органогенов – углерода, кислорода, азота и водорода. Химические элементы микробной клетки Углерод 45-55 % Азот 8-15% кислород 30% Водород 8% В среднем бактериальная клетка содержит 80% воды и 20 % сухого вещества. Содержание воды более или менее постоянно. Вода является растворителем органических и неорганических веществ. В составе бактерий различают свободную и связанную воду. Свободная вода служит дисперсной средой для коллоидов, растворителем кристаллических веществ, источником водородных и гидроксильных ионов. Связанная вода находится в комплексах (сложные соли, гидраты). Она является структурным растворителем. При подготовки к спорообразованию количество воды уменьшается до 40%. Клетка в таком состоянии способна длительно переживать в окружающей среде. Сухое вещество содержит минеральные соли, белки, углеводы, липиды, ферменты, витамины, токсины, пигменты и антибиотики. 2. Ферменты микроорганизмов С помощью ферментов у микроорганизмов осуществляются процессы метаболизма: пищеварение, дыхания, выделения. Незначительное количество ферментов превращает большое количество субстрата, оставаясь при этом в свободном состоянии. 27 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 28 из 118 Оксидоредуктаз ы Лмгазы Гидролазы Ферменты 6 групп Изомеразы Трансферазы Лиазы Ферменты вырабатываются клетками и способны действовать, даже будучи выделенными, из нее, что имеет большое практическое значение. Для ферментов характерны термолабильность и высокая специфичность. Различают экзо- и эндоферменты. Различают 6 групп ферментов. 1.Оксидоредуктазы. 2. Трансферазы. 3.Гидролазы. 4. Лиазы. 5. Изомеразы. 6. Лигазы. В микробиологической практике ферментативную активность бактерий применяют для идентификации и дифференциации бактерий, в биотехнологии – для получения ферментов, приготовления уксусной, молочной, щавелевой, лимонной кислот, молочных продуктов (сыр, ацидофилин, кумыс), в виноделии, пивоварении, силосовании. Ферментативная активность микроорганизмов определяет патогенез и клиническую картину инфекционных заболеваний. 2. Типы питания микроорганизмов 28 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 29 из 118 Метаболизм объединяет два взаимосвязанных, но и взаимопротивоположных процесса: анаболизм и катаболизм. Анаболизм это использование микроорганизмами питательных веществ, для биосинтеза веществ собственного тела. Катаболизм это извлечение энергии из питательных веществ, которая используется микроорганизмами для своей жизнедеятельности. Под питанием понимают получение из окружающей среды источников энергии и веществ, необходимых для биосинтеза клеточных компонентов. По способам питания микроорганизмы делятся на две группы: автотрофы и гетеротрофы, что представлено в схеме. Типы питания Автотрофы Фотоавтотрофы Гетеротрофы и Хемоавтотрофы Сапрофиты Паразиты Факультативные облигатные В основе питания бактерий лежит осмотическое явление, кроме того, питание может осуществляться с помощью диффузии и стереохимического переноса питательных веществ. Понятийный аппарат к лекции 4 (Тезаурус) 1.Типы питания микроорганизмов (аутотрофные микроорганизмы, гетеротрофные микроорганизмы, метанотрофы, паратрофы, прототрофы, ауксотрофы, органотрофы, литотрофы, фотолитотрофы, фотоорганотрофные микроорганизмы, хемолитотрофные микроорганизмы, хемоорганотрофные микроорганизмы) 2. Типы дыхания микроорганизмов (облигатные (строгие, абсолютные) аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, облигатные (строгие, абсолютные) анаэробы) 3. Пермеазы 29 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 30 из 118 4. Экзоферменты 5. Эндоферменты 6. Классификация ферментов (оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы) 1. 2. 3. 4. 5. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ Механизм и источники питания микроорганизмов. Классификация ферментов. Их значение в жизни микроорганизмов. Значение ферментативной активности микробов в лабораторной практике. Механизм дыхания микроорганизмов. Понятие «рост» и «размножение» микроорганизмов. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Основная 1. Ветеринарная микробиология и иммунология /Под ред.проф. Н.А.Радчука.-М.,1991.-С.35-54. Дополнительная 2. Емельяненко П.А. Ветеринарная микробиология. – М.,1982.- С.42-49. 3. Ассонов Н.Р. Микробиология.- М.1989.- С.51-77. 4. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. – Издательство Московского университета,1978. – С.68-103. 5. Пяткин К.Д.. Кривошеин Ю.С. Микробиология.- М.,1980.-С.42-78. 6. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. М.,1983. –С.47-72. ЛЕКЦИЯ №6 (Продолжение) Тема: Метаболизм 1. Типы дыхания микроорганизмов 2. Рост и размножение микроорганизмов 1. Типы дыхания микроорганизмов Дыхание микроорганизмов это сложный биологический процесс, сопровождаемый окислением или восстановлением различных, преимущественно органических соединений с последующим выделением энергии в виде АТФ, необходимой микробам для физиологических нужд. Дыхание микроорганизмов может осуществляться как в присутствие кислорода воздуха, так и без него. В связи с этим микроорганизмы разделяют на аэробы и анаэробы. 30 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 31 из 118 Аэробы это микроорганизмы, живущие и размножающиеся за счет свободного доступа кислорода воздуха. Анаэробы это микроорганизмы, живущие и размножающие в условиях отсутствия кислорода. Имеются и промежуточные формы. По типу дыхания микроорганизмы подразделяют на 4 группы: Типы дыхания Строгие аэробы Строгие анаэробы Микроаэрофилы Факультативные анаэробы Механизм дыхания. Первым этапом дыхательных процессов является отнятие водорода от субстрата с помощью ферментов – дегидрогеназ (НАД и НАДФ). Отнимая водород от окисляемого субстрата они переходят в восстановительную форму (НАД . Н2 и НАДФ . Н2) и переносят водород на другое вещество (акцептор). СУБСТРАТ-Н2 + НАД(НАДФ) → окисленный субстрат + НАД .Н2(НАДФ .Н2) АКЦЕПТОРОМ водорода для аэробов служит кислород воздуха. АКЦЕПТОРОМ водорода для анаэробов являются другие вещества (соли азотной, серной, кислот, углекислоты). Наибольшее практическое значение из всех типов биологического окисления имеет брожение. Оно осуществляется только микроорганизмами. В промышленности с помощью брожения получают множество полезных химических веществ – спирты, молочную кислоту, щавелевую кислоту, витамин В12. Кроме химических веществ брожение дает нам ценные продукты питания – кисломолочные. Типы биологического окисления. 31 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 32 из 118 Прямое окисление Аэробное дегидрировани е Брожение Анаэробное дегидрировани е Понятийный аппарат к лекции 5 (Тезаурус) 1.Типы питания микроорганизмов (аутотрофные микроорганизмы, гетеротрофные микроорганизмы, метанотрофы, паратрофы, прототрофы, ауксотрофы, органотрофы, литотрофы, фотолитотрофы, фотоорганотрофные микроорганизмы, хемолитотрофные микроорганизмы, хемоорганотрофные микроорганизмы) 2. Типы дыхания микроорганизмов (облигатные (строгие, абсолютные) аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, облигатные (строгие, абсолютные) анаэробы) 3. Пермеазы 4. Экзоферменты 5. Эндоферменты 6. Классификация ферментов (оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы) ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 32 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 33 из 118 6. Механизм и источники питания микроорганизмов. 7. Классификация ферментов. Их значение в жизни микроорганизмов. 8. Значение ферментативной активности микробов в лабораторной практике. 9. Механизм дыхания микроорганизмов. 10.Понятие «рост» и «размножение» микроорганизмов. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Основная 7. Ветеринарная микробиология и иммунология /Под ред.проф. Н.А.Радчука.-М.,1991.-С.35-54. Дополнительная 8. Емельяненко П.А. Ветеринарная микробиология. – М.,1982.- С.42-49. 9. Ассонов Н.Р. Микробиология.- М.1989.- С.51-77. 10.Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. – Издательство Московского университета,1978. – С.68-103. 11.Пяткин К.Д.. Кривошеин Ю.С. Микробиология.- М.,1980.-С.42-78. 12.Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. М.,1983. –С.47-72. ЛЕКЦИЯ №7 Тема: Размножение и дифференциация микроорганизмов ПЛАН 1. Циклы развития (мономорфный, диморфный, полиморфный) 2. Способы размножения прокариотных и эукариотных микроорганизмов 2.1 Размножение делением. Деление палочковидных и кокковидных форм 2.2 Почкование, размножение спорами 2.3 Размножение актиномицетов и нитчатых форм бактерий 2.4 Способы размножения грибов, водорослей, простейших 3. Типы дифференцировки бактерий 3.1 Покоящиеся формы (эндоспоры, цисты, акинеты) 3.2 Структуры, служащие для репродукции (баеоциты, гормогонии, экзоспоры) 3.3 Формы со специализированными метаболическими функциями (гетероцисты, бактероиды) 33 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 34 из 118 Рост и размножение микроорганизмов Под ростом понимают увеличение массы отдельной бактериальной клетки. Под размножением - увеличение числа особей микроорганизмов. Бактерии размножаются преимущественно простым поперечным делением пополам, которое происходит в различных плоскостях. При этом образуются многообразные сочетания клеток (кисть винограда – стафилококки, цепочки - стрептококки, соединения по парам – диплококки, тюки, пакеты – сарцины др.). Процесс деления бактерии проходит ряд последовательных этапов. Сначала появляется перетяжка, состоящая из цитоплазматической мембраны, а затем происходит разъединение образовавшихся дочерних клеток. Параллельно с этим синтезируется клеточная стенка. Вместе с цитоплазмой в дочерние клетки переходит и нуклеоид, состоящий из ДНК. ДНК реплицируется в результате разрыва водородных связей, образуются две спирали ДНК, каждая из которых включается в состав новой клетки. Затем дочерние односпиральные ДНК восстанавливают водородные связи и вновь образуются двуспиральные ДНК. Грибы размножаются в основном в виде спор, дрожжи - почкованием. Большинство клеток делится через 20-30 минут. Так, у кишечной палочки новое поколение образуется через 20-30 минут, у нитрифицирующих бактерий - через 5-10 ч, а у возбудителей туберкулеза только через 18-24 ч. Микроорганизмы размножаются быстро, но не беспредельно. Это связано с нарушением оптимальных условий роста и размножения (истощение среды, неблагоприятная температура, свет, продукты жизнедеятельности). Процесс размножения микроорганизмов на не сменяемой среде (in vitro) протекает неравномерно (стадийно). Различают восемь (четыре) стадий (разные авторы по-разному). 1. Начальная фаза (лаг-фаза), или фаза покоя. Культура приспосабливается к питательной среде. 2. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза характеризуется максимальным увеличением клеток в культуре. Оно идет в геометрической прогрессии. Большинство клеток молодые и биологически активные. Питательная среда истощается, продукты обмена замедляют рост. Кривая роста постепенно принимает горизонтальное положение. 3. Стационарная фаза, или период зрелости. Кривая идет параллельно оси абсцисс. Наступает равновесие между числом вновь образованных и погибших клеток. Количество питательной среды уменьшается, плотность клеток увеличивается, токсическое действие продуктов обмена усиливается. Все это ведет к гибели клеток. 4. Фаза отмирания (фаза старости). Происходит уменьшение клеток и изменение их. Появляются деградированные формы, а также споры. 34 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 35 из 118 Через несколько недель или месяцев культура погибает, из-за ядовитого действия продуктов жизнедеятельности. Знание закономерностей развития имеет практическое значение при выращивании и сохранении культур на жидких и плотных питательных средах. Знание физиологических свойств микроорганизмов позволяет культивировать (выращивать) их на искусственных питательных средах, изучать их свойства, определять вид микроба. Понятийный аппарат к лекции 1. Циклы развития (мономорфный, диморфный, полиморфный) 2. Размножение делением, почкование, размножение спорами 3. Вегетативное, бесполое, половое размножение 4. Эндоспоры, цисты, акинеты 5. Баеоциты, гормогонии, экзоспоры 6. Гетероцисты, бактероиды РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Основная 3. Егоров Н.С. Промышленная микробиология. М.,1989.-688с. 4. Ветеринарная микробиология и иммунология Н.А.Радчука.-М.,1991. /Под ред.проф. ЛЕКЦИЯ №8 Тема: Рост и культивирование микроорганизмов ПЛАН 1. Типы сред, используемых для культивирования(по составу и физическому состоянию 2. Культивирование микроорганизмов. 2.1 Культивирование аэробных и анаэробных , фотосинтезирующих микроорганизмов 2.2 Поверхностное и глубинное выращивание. 2.3 Периодическое и непрерывное культивирование 2.4 Аппаратура для непрерывного культивирования (хемостат и турбидостат) 35 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 36 из 118 2.5 Значение метода непрерывного культивирования для изучения свойств микроорганизмов в промышленности 3. Рост микроорганизмов 3.1 Сбалансированный и несбалансированный рост 3.2 Закономерности роста популяции в периодических культурах 3.3 Кривая роста, особенности отдельных фаз. Определение скорости роста, времени генерации, урожая клеток. Диауксия. Причины лимитации роста и отмирания 3.4 Рост микроорганизмов в непрерывной культуре, математическое выражение роста 3.5 Синхронизированные культуры, способы их получения Понятийный аппарат к лекции 1. 2. 3. 4. 5. 6. Сбалансированный и несбалансированный рост Периодическая культура Непрерывная культура Кривая роста Диауксия Синхронизированные культуры РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА Основная 1. Егоров Н.С. Промышленная микробиология. М.,1989.-688с. 2. И.А. Баснакьян «Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами». – М., 1992. 3. Ветеринарная микробиология и иммунология /Под ред.проф. Н.А.Радчука.-М.,1991. Тема: свойствами. Культивирование микроорганизмов План: 1. Введение 36 с заданными УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 37 из 118 2. Классификация процессов культивирования микроорганизмов. 2.1. Периодическое культивирование 2.2. Продленный периодический процесс культивирования. 2.3. Многоциклический процесс культивирования. 2.4. Полунепрерывный процесс культивирования 2.5. Непрерывное культивирование 3. Влияние условий культивирования на жизнедеятельность микроорганизмов. Литература: 1. И.А. Баснакьян «Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами». – М., 1992. Плакаты: 1. Кривая роста микроорганизмов 2. Е. coli – рисунок 3. Классификация процессов культивирования Введение На первый взгляд представляется, что процессы культивирования просты и доступны каждому микробиологу. Ведь до недавнего времени все манипуляции связанные с выращиванием микробов осуществлялись в пробирках, на чашках, в колбах. Однако с развитием техники, автоматики, электроники и др. наук появилась возможность на новом уровне осуществлять выращивание микроорганизмов. Культивирование, ранее ограниченное лишь двумя операциями посевом и сбором урожая, превратилось в управляемый процесс, который можно подчинить задачам исследования или целям производства. Микробы культивируют для получения вакцин, анатоксинов, производства белка, витаминов, аминокислот и др. которые невозможно или трудно получить методами химической технологии. Долгое время оптимальные условия культивирования подбирались эмпирически, т.е. методом проб и ошибок. В конечном итоге устанавливали состав сред, режим культивирования, но на это уходило много времени и труда. Длительное время существовал периодический способ культивирования (засев, размножение, съем выросшей культуры и выделение нужного продукта из клеток или из среды). Позднее с появлением новых технических возможностей появились непрерывно-проточный, проточный метод (получение уксуса и спирта). 37 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 38 из 118 Изучение физиологии и биохимии микроорганизмов, развитие технологии производства способствовали и совершенствованию методов культивирования. Оказалось, что многие микробиологические процессы, так же как и химические реакции возможно осуществлять в реакторах – ферментерах со всем необходимым для этого оснащением. Существует ряд методов культивирования на лабораторном этапе разработки промышленного процесса, в укрупненном масштабе в емкостях до десятков литров, и в крупномасштабном варианте, в емкостях в сотни кубометров. Что такое система культивирования микроорганизмов? Это процесс культивирования микроорганизмов вместе с ферментерем, снабженным системой управления и контроля. Широкое распространение культивирования микроорганизмов в различных отраслях, появление новых систем и способов его осуществления вызвало необходимость постоянной их систематизации (Баснакьян И.А. и др. 1980 г.). 2. Классификация процессов культивирования микроорганизмов. 2.1. Периодическое культивирование Под периодическим культивированием понимают внесение посевного материала в питательную среду в начале процесса и получение культур (биомассы и продуктов ее жизнедеятельности) в течение определенного времени. Рост и развитие микроорганизмов во всех системах периодического культивирования происходит в замкнутой (закрытой) системе, таким образом, все фазы развития (а их 9) проходят без притока питательной среды и без оттока культуральной жидкости. Микроорганизмы достигают определенной концентрации, затем развитие их прекращается по двум причинам: 1). Из-за лимита (исчерпания) питательных веществ (субстрата); 2). Из-за угнетения продуктами жизнедеятельности. После логарифмического роста (экспоненциального роста) происходит нарушение физиологического состояния клеток из-за перечисленных причин. И это является серьезным недостатком периодического культивирования, особенно если оно применяется при изучении свойств микроорганизмов. Периодическое культивирование осуществляют на плотных, жидких питательных средах в пробирках, колбах, матрасах, бутылях. В н.в. создан аппарат для культивирования А.Ф. Шестеренко (АКМ-Ш), который позволил заменить 700-800 1,5 – литровых матрасов. 38 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 39 из 118 Жидкие среды лучше, так как: 1). Нет примеси агара при смыве культуры. 2).Увеличивается выход процесса за счет использования больших емкостей (бутыли, ферментеры). 3). Выравниваются условия роста микроорганизмов в различных частях сосуда, по сравнению с плотными питательными средами, путем перемешивания (в шуттель – аппаратах, качалка, бутыль с баработажем газа, ферментер). Таким образом, в периодическом культивировании выделяют динамические системы культивирования и статистические (стационарное культивирование). Динамическое культивирование позволило более рационально получать не только биомассу и эндометаболиты, но и экзопродукты микробного синтеза, выделяемые клеткой в окружающую среду. Для периодического культивирования применяют ферментеры с принудительной аэрацией и перемешиванием – где происходит глубинное выращивание. Ферментер представляет собой сосуд, в который загружается питательная среда и культура. Все это перемешивается, с целью постоянства условий по всему объему. Выросшая культура удаляется, а ферментер готовится для нового цикла. Этот метод использовали в производстве дрожжей и антибиотиков. В дальнейшем он зарекомендовал себя как наиболее пригодный для промышленного и лабораторного выращивания микроорганизмов. Этот метод в 70-е годы был усовершенствован разработкой системы контроля условий культивирования. Периодическое культивирование нашло применение в промышленной микробиологии при получении вторичных метаболитов и при культивировании патогенных бактерий в производстве вакцин и анатоксинов. 2.2. Периодические продленные процессы культивирования микроорганизмов. Продленный периодический процесс, как и просто периодический, предусматривает одноразовую загрузку и разгрузку ферментера. Но в чем разница? В продленном периодическом процессе цикл развития микроорганизмов удлиняется за счет длительного удержания клеток в системе (диализная культура). При этом оттока культуральной жидкости не происходит. Подпитку используют для получения продуктов биосинтеза. В периодической культуре накапливаются продукты метаболизма, которые тормозят рост. Для увеличения выхода продуктов или с целью 39 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 40 из 118 повышения концентрации биомассы применяют процесс диализа. Суть метода заключается в том, что культура развивается в пространстве, ограниченной полупроницаемой мембраной, а продукты диффундируют во внешний раствор. Например, культивирование в целлофановых мешках, погруженных в питательную среду. Этот метод был разработан для получения экзотоксинов, но не нашел широкого применения из-за сложности осуществления его в производственных масштабах. К продленному периодическому процессу относят культивирование в диализной системе с протоком среды. Проток среды удлиняет период роста и развития микроорганизмов и позволяет увеличивать биомассу до тех пор, пока культура перестанет перемешиваться. То есть диализный метод дает возможность выращивать культуру до высокой плотности биомассы. 2.3. Многоциклический процесс культивирования. Многоциклическими процессами культивирования называют такие, в которых цикл выращивания культуры повторяется многократно без многократной стерилизации емкости. Одновременно работают несколько ферментов. Поскольку культура постоянно пересевается в экспоненциальной фазе, не происходит ее старения и вырождения. Этот метод применяется как для получения биомассы, так и продуктов микробного синтеза – токсинов, антибиотиков, внеклеточных ферментов, аминокислот. 2.4. Полунепрерывный процесс культивирования Суть его заключается в том, что в процессе роста культуры, часть ее сливается, а освободившийся объем заливается свежей питательной средой. При этом полная загрузка и разгрузка ферментера осуществляется однократно. Эта система получила название сливнодоливной (отъмно-доливной). Различные варианты полунепрерывных систем используются в производстве дрожжей, водорослей, антибиотиков и лимонной кислоты. Таким образом, сущность периодической системы культивирования и ее вариантов заключается в однократной загрузке и разгрузке ферментеров, при различных модификациях. 2.5. Непрерывное культивирование. 40 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 41 из 118 В непрерывных процессах подача питательной среды, удаление биомассы и продуктов ее жизнедеятельности осуществляется непрерывно. Непрерывное культивирование характеризуется постоянством концентрации микроорганизмов и удельной скорости роста популяции. Система непрерывного культивирования способна к длительной работе в постоянном установившемся режиме. Непрерывно-проточное культивирование может осуществляться в системе полного или идеального смешивания; в системе полного вытеснения и др. системах. В системе полного смешивания микроорганизмы в каждый данный момент времени находятся в одном и том же физиологическом состоянии, так как культуральная среда по своему составу всегда постоянная. По количеству ферментеров, системы идеального смешивания могут быть одностадийными, двухстадийными и многостадийными. Непрерывное культивирование имеет технологические преимущества по сравнению с периодическим, так как его можно осуществлять длительное время. На практике этот процесс прерывают в связи с инфицированием культуры посторонней микрофлорой. Непрерывно-проточное культивирование можно контролировать путем создания такой питательной среды, в которой был бы только один желанный фактор лимитирующий (инкибирующий) рост. В этом процессе плотность популяции определяется химическим составом среды (концентрацией лимитирующего рост фактора). Такое культивирование называют хемостатным культивированием. Таким образом, хемостатное культивирование позволяет изменять плотность микроорганизмов, путем изменения концентрации лимитирующего рост фактора. Хемостатный способ культивирования является основным для изучения физиологии, биохимии и вообще всех свойств микробных клеток и культур. Известен и другой способ регулирования роста в непрерывнопроточном культивировании. Он называется турбидостат. В нем подача питательной среды осуществляется по команде фотоэлектрического элемента, регистрирующего оптическую плотность культуры. Скорость разбавления сама устанавливается в соответствии с заданной плотностью популяции. Любой параметр, который изменяется в периодической культуре и на который существует датчик, может быть использован для управления ростом по типу турбидостата. В н.в. разработаны различные варианты непрерывного культивирования, работающие по принципу тубридостата – рН- стат, 41 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 42 из 118 оксистат, СО2 – стат, теплостат, вискозистат, названия которых соответствуют задаваемого параметру. Хемостатное культивирование может осуществляться в одном ферментере (одностадийный процесс) или в двух и более ферментерах (многостадийный, многоступенчатый процесс). Многостадийные системы позволяют получать культуру при любой скорости роста – от лаг-фазы до экспоненциальной и стационарной. Многостадийные системы непрерывного культивирования применяют для получения вторичных метаболитов, накопление которых отстает от кинетики роста биомассы. Батарея ферментеров применяется так же для переработки высоких концентраций субстратов при получении как первичных, так и вторичных метаболитов. Иногда бывает недостаточно времени для полного использования субстрата клетками. Поэтому процесс продолжается в батареях, включающих до 10 ферментеров и более. Системы культивирования полного вытеснения. В открытой системе полного вытеснения культура не перемешивается в отличие от системы идеального смешения и представляет собой поток жидкости через трубку. Наиболее распространенным аппаратом является трубочный реактор. Он может иметь различную форму (прямую, S – образную, спиральную) и устанавливаться горизонтально или вертикально. Система полного вытеснения представляет собой пространственный, проточный вариант периодической культуры. Такая культура за время от посева до выгрузки проходит через все стадии периодической культуры, т.е. фазы роста распределены не во времени, а в пространстве, причем каждой части ферментера в установившемся режиме соответствует определенный отрезок кривой роста. Этот способ культивирования используется для анаэробных процессов. Засев осуществляется непрерывно на входе в ферментер одновременно с подачей среды. По такому принципу ведут стадию брожения при производстве пива. Надосадочные системы с иммобилизованными клетками (системы твердожидкостного типа) К системам твердожидкостного типа относятся многофазные системы, в которых культура растет на границе разных фаз: жидкость – твердая фаза, жидкость – твердая фаза – газ. В этих системах клетки удерживаются путем прилипания к твердой основе – наполнителю и размножаются на нем, 42 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 43 из 118 образуя пленку биомассы. Типичным примером является производство уксуса в стружечных аппаратах. Лимитирующими факторами при аэробном росте является кислород и субстрат. Клетки, прикрепленные к поверхности тонким слоем, полностью обеспечены питательной средой и размножаются с максимальной экспоненциальной скоростью. По мере образования толстой пленки биомассы рост лимитируется диффузией субстрата и кислорода внутрь этой пленки. Культивирование м-в с образованием пленки из биомассы, осуществляется в ферментере типа колонки с наполнителем. В качестве наполнителя может использоваться макроноситель (кокс, прутья, стружка, стеклянные шарики и т.д.) или микроноситель (амберлитовые свечи, частички сефадекса). Клетки, культивированные таким образом, то есть на наполнителях, называют иммобилизованными. В промышленной микробиологии системы твердожидкостного типа нашли применение в «оросительных фильтрах» при очистке сточных вод, в производстве органических растворителей и кислот и в сбраживании древесины на спирт. Культивирование на твердом носителе приобрело значение в изучении метаболической активности природных микробных популяций. При пропускании различных растворов через колонку из образца почвы, служащего носителем, были получены модели условий, близких к природным. Таким образом, для периодического культивирования характерна физиологическая нестабильность культуры, что выражается в однократном увеличении и снижении удельной скорости роста и смене факторов, ограничивающих рост микроорганизмов. Напротив, метод непрерывного культивирования позволяет стабилизировать на определенном уровне все параметры культуры. Таким образом, этот способ является основой для изучения физиологии микробов, отражающей их связь с окружающей средой, и для управляемого культивирования. Кроме того, непрерывное культивирование имеет много технологических преимуществ при промышленном использовании. . 3. Влияние условий культивирования на жизнедеятельность микроорганизмов. Рост и развитие микроорганизмов осуществляется в результате протекания большого количества биохимических реакций потребления и переработки компонентов питательной среды. Каждый из компонентов может оказывать влияние на рост и развитие микробной популяции. 43 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 44 из 118 Знание закономерностей влияния (действия) факторов внешней среды необходимо для управления процессом выращивания, таким образом можно получать культуры с заданными свойствами. Метаболизм факультивно-анаэробных микроорганизмов в большей степени зависит от окружающих условий, чем обмен веществ облигатно аэробных или анаэробных микроорганизмов. Особенно важно влияние кислорода и глюкозы на метаболизм этих микроорганизмов. 3.1. Влияние аэрации на рост и размножение микроорганизмов. Кислород может оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее воздействие на метаболические процессы в клетке. С помощью кислорода можно регулировать различные процессы. Так, лимитация роста «О2» вызывает образование спирта у дрожжей, сверхсинтез грамицидина у Bacillus brevis, усиливает брожение у факультативноаэробных бактерий. Образований пилей так же зависит от степени аэрации. Так, E.coli в аэробных условиях образует максимальное количество пилей в середине экспоненциальной фазы роста. В поздней экспоненциальной фазе пили исчезают. В анаэробных условиях E. сoli на всех стадиях роста образуют пили. Добавление метаболических ядов или голодание бактерий в аэробных условиях ведет к исчезновению пилей, в анаэробных условиях этого не наблюдается. 3.2. Влияние углерода и энергии на метаболизм факультативных анаэробных микроорганизмов. Концентрация источника углерода и энергии оказывает значительное влияние на метаболизм микроорганизмов. С повышением концентрации глюкозы увеличивается скорость её потребления клетками и возрастает выделение продуктов обмена. Высокие концентрации глюкозы подавляют развитие митохондрий у дрожжей. Однако галоктоза такого действия не оказывает. При периодическом культивировании S. сerevisiae при высоких концентрациях глюкозы дыхание клеток почти полностью подавленно. В случае адаптации S. cerevisiae к аэробным условиям в присутствие глюкозы (от 0,2 до 2 %) наблюдается слабый синтез (или репрессия) дыхательных ферментов. При исчезновении глюкозы из среды происходило резкое увеличение синтеза (или дерепрессия) этих ферментов. Существуют многочисленные данные о механизме регулирования глюкозой клеточного метаболизма. Широко известен механизм 44 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 45 из 118 ингибирования (подавления) под названием катаболитной репрессии. Под этим подразумевается репрессирование-ослабление синтеза многих ферментов, ответственных за синтез вторичных продуктов в присутствии глюкозы. Другими словами, для синтеза этих вторичных продуктов необходима лимитация роста глюкозой. Она необходима для роста, но мешает вторичному биосинтезу. Катаболитная репрессия или необходимость лимитации роста источником углерода не ограничивается только глюкозой, но распространяется на любой быстро используемый клеткой субстрат. Примерами катаболитной репрессии могут служить подавление глюкозой синтеза α– аспарагиназы у E. coli, ингибирование уксусной кислотой синтеза холинэстеразы культурой Arthrobacter simplex, репрессия кетоглютаратдегидрогеназы у Asp. niger, что приводило к накоплению лимонной кислоты; типичное проявление катаболитной репрессии на физиологическом уровне – увеличение биомассы Bacillus licheniformes 28 КА и подавление синтеза продукта – б-а-цитрацина при увеличении концентрации глюкозы, подавление глюкозой синтеза олеандомицина и образования энтеротоксина А Staphylococcus aureus. В н.в. известно, что лимитация роста глюкозой необходима для синтеза пенициллина, цефалоспорина, хлорамфиникола, липаз, гибберилиновой кислоты, многих ферментов для спорообразования. Приведённые данные свидетельствуют о том, что различные концентрации основного источника углерода и энергии оказывают разнообразное воздействие на жизнедеятельность микроорганизмов. 3.2. На метаболизм микробов влияют и другие компоненты питательной среды. 1. Соотношение углерода и азота при лимитации роста микроорганизмов азотом в биомассе содержится меньше белка, чем при лимитации роста углеродом. 2. При лимитации фосфатом роста бацилл у них происходят изменения в составе клеточной стенки. В ней становится меньше фосфорсодержащей тейхоевой кислоты, но клетка продолжает нормально развиваться и вместо тейхоевой кислоты синтезируется тейхуроновая, не содержащая фосфор. 3. Немаловажное значение в жизнедеятельности микроорганизмов имеют микроэлементы- Zn, Cu, Co, Mo, Cd в зависимости от концентрации стимулируют или ингибируют рост и развитие бактерий в процессе их культивирования. Так, Zn подавляет конъюгацию бактерий, влияет на экспрессию и репрессию бактериальных генов, участвует в метаболизме ферментов нуклеиновых кислот и белков. 45 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 46 из 118 Со, Сd, As подавляют литическую активность бактериофагов или способствует развитию фагорезистентности. Р. Галиева (1975) продемонстрировала стимулирующие влияния СО2+ на выход витамина В12. Соли магния, марганца и железа способствовали увеличению биомассы дрожжей и биосинтеза витамина В1. Вывод. Согласно V. Edwards (1970), зависимость метаболической активности микроорганизмов от содержания в среде любого из ее составляющих можно представить следующим образом. Если питательное вещество является обязательным для роста клетки, то первоначальные значения физиологических параметров при низких его концентрациях могут быть равны нулю или даже принимать отрицательные значения. При повышении концентрации питательного субстрата происходит нарастание величины данного показателя в результате стимуляции метаболизма. Возможно, что после достижения определенной концентрации дальнейшее ее увеличение не влияет на физиологическую активность клетки. Это можно объяснить тем, что в указанных условиях достигается предел физиологической активности микроорганизма. Однако в данном случае нельзя исключить и лимитирующего влияния другого питательного вещества. Дальнейшее повышение концентрации изучаемого компонента может быть причиной снижения физиологической активности вследствие ингибирования субстратом, если нет лимита за счет его растворимости. Таким образом, зависимостью Эдварс обобщат все разнообразие влияния субстрата на проявление жизнедеятельности микроорганизмов. Выбор процесса культивирования Различают следующие процессы культивирования: 1. По состоянию питательной среды - на поверхностные и глубинные; 2. По наличию и отсутствию перемешивания – на динамические или статистические; 3. По содержанию кислорода – на аэробные и анаэробные; 4. По способу действия – на закрытые (чаще периодические) и открытые (чаще неправильные); 5. По количеству ферментеров – на одно-, двух- и многостадийные; 6. По способу управления – на хемостатные, турбидостатные, оксистатные, рН – статные. 46 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 47 из 118 Современный способ культивирования микроорганизмов - управляемое культивированные, когда процесс культивирования является объектом управления. Управление – это целенаправленное воздействие для изменения состояния объекта. Средствами управления или управляющими воздействиями являются: скорость разбавления, концентрация субстрата, рН среды, содержание растворимого в среде кислорода, температура Т, скорость вращения мешалки, подача газа, пеногашение и др. Управляемое культивирование – это процесс, подвергающийся целенаправленному воздействию для получения культур с заданными свойствами. Лекция №9 Тема: Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе ПЛАН: 1. Превращения азотсодержащих веществ (гниение; практическое значение процессов гниения) 1.1 Нитрификация, фазы процесса. Автотрофная и гетеротрофная нитрификация. 1.2 Микроорганизм, вызывающие гниение (аммонификаторы), окисляющие углеводороды, уробактерии, уксуснокислые бактерии 2 Превращения безазотистых органических веществ (спиртовое брожение, молочнокислое брожение, пропионовокислое брожение, маслянокислое брожение, уксуснокислое брожение, лимоннокислое брожение) 3 Окисление молекулярного водорода 4 Окисление соединений серы, железа, марганца, сурьмы и др. элементов. Значение этих процессов В процессе обмена веществ микроорганизмы осуществляют разнообразные химические реакции, в результате которых образуются спирты, кислоты, эфиры, витамины, ферменты и др. Эти продукты жизнедеятельности микробов используют в медицине, промышленности, 47 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 48 из 118 быту. Многие биохимические процессы, вызываемые микроорганизмами, применяются в пищевой и легкой промышленности, велика роль их в круговороте веществ в природе. Многие микробы способны к дыханию в среде, не содержащей свободного кислорода. Такой тип дыхания называется брожением. Именно брожения наиболее важны в практическом отношении. По субстрату, на который воздействуют хемоорганотрофные микроорганизмы. Все процессы можно разделить на две основные группы: превращение органических веществ, не содержащих азота (различные виды брожения и окисления); превращения органических веществ, содержащих азот (гниение). 1.Превращения азотсодержащих веществ (гниение; практическое значение процессов гниения). Два процесса в природе происходят при активном участии микробов: - синтез из минеральных веществ сложных органических соединений; - разложение органических веществ до минеральных. В круговороте азота с участием микроорганизмов различают следующие этапы: 1) усвоение атмосферного азота 2) аммонификация (гниение) 3) нитрификация 4) денитрификация Различают две формы микроорганизмов способных усваивать атмосферный азот: свободно живущие азотфиксаторы (азотобактер) и клубеньковые бактерии. Аммонификация (или минерализация азота) – это микробиологический процесс, в результате которого происходит гидролиз азотсодержащих органических веществ с образованием конечных продуктов (аммиака, сероводорода, углекислого газа и метана). Этот процесс является процессом гниения, в котором участвуют микроорганизмы, обладающие протеолитическими свойствами. В результате аммонификации почва очищается от останков животного и растительного мира – с одной стороны, и с другой стороны ведет к обогащению почвы азотистыми продуктами. Аммонификацию осуществляют бактерии, бациллы, клостридии, актиномицеты, плесневые грибы. Следующий этап в превращении азота называется нитрификацией. В процессе нитрификации происходит окисление аммиака сначала в азотистую, а затем в азотную кислоту. Образовавшаяся азотная кислота в почве вступает в соединение со щелочами (гидроксид кальция), образуется селитра (нитрат кальция). 48 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 49 из 118 Это минеральное удобрение. Селитры хорошо растворяются водой и усваиваются растениями. Денитрификация – это процесс восстановления нитратов с образованием молекулярного азота, возвращающегося из почвы в атмосферу. 2. Превращения безазотистых органических веществ Процесс разложения органических безазотистых соединений называется брожением. Существует много типов брожения, которые вызываются определенными видами микробов (дрожжами, молочнокислыми стрептококками, ацетобактерами, глюконобактерами, клостридиями и др.). Наибольшее значение в промышленности имеют следующие виды брожений: спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, маслянокислое, уксуснокислое, ацетонобутиловое брожения. Понятийный аппарат к лекции 9 (Тезаурус) 1. Аммонификация 2. Нитрификация 3. Денитрификация 4. Азотобактеры (свободноживущие азотфиксаторы) 5. Брожение (спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, маслянокислое, уксуснокислое, ацетонобутиловое) Литература основная 1. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. – Издательство «Колос», 1987.- 368с. 2.Радчук М. «Ветеринарная микробиология и иммунология». Москва, 1991.-. 383с. 2. Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. – М.,1989.- 272с. 3. Блейм Т.Н. Сборник тестов по микробиологии. Учебное пособие. – Семипалатинск: СГУ имени Шакарима,2005. – 112 с. Литература дополнительная: 1. Сидоренко О.Д., Борисенко Е.Г., Ванькова А.А., Войно Л.И. Микробиология: Учебник для агротехнологов. – М.: ИНФА-М,2005. – 287с. 2. Трушина Т.П. Основы микробиологии, физиологии питания и санитарии для общепита.-Ростов-на-Дону: «Феникс»,2000.- 384с. 3. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. – Издательство «Колос», 1978 г. с. 368. Лекция № 10 Тема: Генетика микроорганизмов 49 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 50 из 118 План: 1. Структура и функции генома микроорганизмов 2. Формы изменчивости у микроорганизмов 3. Генетические взаимодействия (самостоятельно) 4. Генная инженерия Ключевые слова: генетика, геном микробной клетки, фенотипическая изменчивость, генотипическая изменчивость, мутации, рекомбинативная изменчивость. Генетика – наука о наследственности и изменчивости организмов. 1. Структура и функции генома микроорганизмов Геном – носитель генетической информации. Геном прокариотной клетки находится в нуклеоиде в виде одной хромосомы, представленой громадной 2-х спиральной молекулой ДНК, включающей в зависимости от вида и размера микробной клетки от 50 до 2-3 тысяч генов. В среднем каждый ген состоит из 1000 пар нуклеотидов. Геном вируса гепатита В имеет самое маленькое число генов. Геном состоит из 4 генов и имеет молекулярную массу 1,6 Д. Геном вируса – возбудителя СПИДа представлен молекулой РНК, который состоит из 9213 нуклеотидов, образующих 9 генов. Геном бактериофагов – из 9-200 генов, у хламидий – из 400-600 генов, у риккетсий – из 1000 генов. E.coli имеет молекулярную массу 2,8 х 10 (9) Д и содержит 2500-3000 генов. ДНК большинства растений и животных состоит из нескольких миллиардов пар нуклеотитов. Геном человека составляет 3,5 х 10 (9) пар нуклеотидов – 3,5 х 10 (6) пар генов. Молекула ДНК является носителем генетической информации и состоит из генов, которые располагаются линейно вдоль хромосомы. Каждый ген представлен определенным участком молекулы ДНК. Специфическая информация, содержащаяся в гене, определяется последовательностью оснований в цепи ДНК. «Алфавит», с помощью которого записана эта информация ДНК, вкдючает четыре «буквы» основания: аденин, гуанин, тимин и цитозин. Гены являются функциональной единицей наследственности. В генах записана информация относительно всех свойств, присущих клетке. Каждый ген может существовать в виде ряда структурных форм – аллелей. Совокупность аллелей всех генов клетки составляет генотип. В настоящее время созданы генетические карты микроорганизмов, отражающие расположение генов на хромосоме. Бактерии гаплоидны, т.е. имеют один набор хромосом. Возникает вопрос, каким же образом сохраняется наследственная информация при росте и размножении бактерий. Перед делением клетки происходит репликация генов (удвоение) и на каждой цепи по принципу комплементарности осуществляется синтез двух новых цепей. Таким 50 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 51 из 118 образом, две новые цепи содержат одну родительскую и одну вновь синтезированную. Эта точная репликация ДНК гарантирует сохранение генетической информации. ДНК, будучи носителем генетической информации, тем не менее не служит матрицей для синтеза полипептидов. Биосинтез белков происходит на рибосомах, которые свободно располагаются в цитоплазме и не никак не контактируют с ДНК. Синтез белка идет в два этапа: - на первом этапе происходит переписывание (транскрипция) информации с ДНК на РНК, которую именуют матричная или информационная РНК. иРНК представляет точную копию ДНК с той лишь разницей, что тимин ДНК заменен в РНК на уроцил. - на втором этапе на рибосомах осуществляется соединение аминокислот в полипептидную цепь в порядке, определяемом триплетами мРНК (трансляция (перевод)). В этом процессе кроме мРНК и рибосом принимают участие тРНК, ряд ферментов и др.факторы. тРНК подносит триплеты (колоны), каждый из которых кодирует одну аминокислоту и таким образом осуществляется синтез определенной нуклеотидной последовательности, определяющей структуру специфического белка. К мРНК как правило присоединяется несколько рибосом и такой комплекс мРНК и рибосом называется полисомами. Кроме того, некоторая часть генетической информации содержится вне хромосомы в цитоплазме в виде так называемой плазмиды (замкнутая в кольцо цепь нуклеиновой кислоты, состоящей не более чем из 40 триплетов и составляющую примерно 1/100 длины ДНК хромосомной). Плазмиды разнообразны по генетическим свойствам и молекулярным размерам. М.м. плазмид от 4,5 х 10 (6) до 9,4 х 10(6). Плазмиды придают бактериям дополнительные свойства, но не обязательные. Бактерии могут терять плазмиды, но потеря не влияет на основные свойства клетки. Плазмиды имеются у многих бактерий. Наиболее изученными являются: - половой фактор (F); - фактор множественной лекарственной устойчивости (R); -фактор бактериоциногении (Col); - плазмиды, контролирующие у E.coli синтез энтеротоксина (Hly); - плазмиды, детерминирующие синтез поверхностных антигенов (К88, К99); - известны плазмиды, контролирующие метаболические процессы, ферментацию углеводов, образование H2S, резистентность к действию тяжелых металлов (ртути) и др. Например: плазмида бактериоциногении контролирует( детерминирует) синтез белковых веществ колицинов (антибиотических 51 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 52 из 118 веществ), которые подавляют рост и размножение чувствительных к ним бактерий (близкородственных). Впервые способность выделять колицины установлена в 1925 г. Gratta у штамма E.coli, поэтому феномен получил название колициногении и плазмида – Col. Другие многие бактерии также выделяют белклвоподобные вещества, летальные для близких видов. Вещества эти называют – бактериоцины, феномен – бактериоциногении (туберкулоцины, пестицины, вибриоцины). Колицины, адсорбируются на чувствительных клетках (лишенных –Col-фактора), не проникают внутрь клетки, вызывают нарушение метаболизма, приводят клетку к гибели. У бактерий может быть одновременно до 4 плазмид. Плазмиды (F-фактор) способные интегрировать в хромосому и реплицировать вместе с ней получили название эписом. Практическое применение плазмид. Плазмиды обладают способностью передаваться от бактерий при конъюгации. Их называют конъюгативными. Внедряясь в клетку реципиента, коньюгативные плазмиды сообщают ей свойства донора. Это свойство применяется при создании новых штаммов – продуцентов полезных веществ. Таким образом, геном и плазмида обуславливают все фено- и генотипические свойства микроорганизмов. Функции генома – сохранение генетического постоянства ДНК, проявление внешних признаков. 2.Типы изменчивости у микроорганизмов. Наследственность бактерий – свойство микробов, обуславливающее воспроизводства одних и тех же морфологических и других свойств в ряде поколений, а также обуславливает специфический характер индивидуального развития. Изменчивость – свойство противоположное наследственности. У бактерий она может осуществляться путем изменения генотипа ( мутации генов, различным сочетанием генов двух бактерий при рекомбинациях) и фенотипа (различным проявлением признаков, зависящих от внешних условий - модификационная изменчивость). У бактерий различают фенотипическую и генотипическую изменчивость. К фенотипическим изменениям относят адаптацию и модификацию. Адаптация – приспособление микроорганизмов к условиям среды. Приспособленные клетки размножаются (при действии антибиотиков), а остальные погибают, то есть происходит естественный отбор. В геноме бактерий всегда имеются запасные возможности, т.е.гены, определяющие выработку адаптивных ферментов. Например, кишечная палочка, растущая на среде, не содержащей углевод лактозу, не вырабатывает фермент лактазу, но если пересеять культуру на среду с лактозой, то она начнет вырабатывать этот фермент. Адаптивные ферменты 52 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 53 из 118 позволяют микробам приспосабливаться к определенным условиям существования. Модификации – изменение микроорганизмов под влиянием условий среды. Изменяются только внешние (фенотипические) признаки клетки (форма, размеры). Так, добавление в среду глицерина и аланина вызывает полиморфизм у холерного вибриона. При добавлении среду кальция хлорида клетки кишечной палочки сильно укорачиваются. После удаления этого вещества из среды палочки вновь принимают исходную форму. Изменениям подвержен и генотип. Генотипическая изменчивость играет большую роль в эволюции микроорганизмов. Если бы клетки не обладали способностью к изменению генотипа, то любое неблагоприятное изменение условий среды привело бы к вымиранию вида. Например, появление бактериофагов в культуре вызвало бы полную гибель ее, если бы гены, определяющие фагочувствительность, не подвергались изменениям и клетки в силу этого не приобрели свойство фагорезистентности. В основе генетической изменчивости лежат мутации и рекомбинации. Они происходят в генетическом аппарате клетки - в ДНК и проявляются стабильностью изменения каких-либо свойств. Мутации (mutacio – изменение) характеризуются изменением последовательности нуклеотидов в ДНК, возникающие под влиянием эндогенных факторов или при действии химических и физических факторов (мутантов). Измененнные бактерии называются мутантами. Мутации 53 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 54 из 118 приводят к стойким передающимся по наследству изменениям свойств бактерий. Мутации делятся на две группы: 1. Мутации спонтанные 2. Мутации индуцированные Мутации спонтанные – происходят в природе, независимо от воли и деятельности человека. Например от действия радиоактивных элементов. Примером спонтанным мутаций возникающих при культивировании бактерий может быть феномен диссоциации, т.е. разъединение бактерий и возникновение S- и R- форм. Есть и переходные формы: М-(слизистая) и О(переходная) формы. Следует отметить, что большинство патогенных бактерий имеют S-форму, R-формы являются слабовирулентными. Однако такие бактерии как возбудители сибирской язвы и туберкулеза патогенны в R-форме. Свойства клеток колоний S- и R-форм S-форма Колонии прозрачные, с гладкой блестящей поверхностью, круглые, с ровными краями, выпуклые Подвижные виды имеют жгутики У капсульных видов хорошо видна капсула или слизистый слой Биохимически более активны У патогенных видов выражены вирулентные свойства Полноценны в антигеном отношении R-форма Колонии шероховатые, неправильные с неровными краями, часто морщинистые Жгутики часто отсутствуют Капсулы или слизистый слой отсутствуют Биохимически менее активны Слабовирулентные или авирулентные Неполноценны в антигеном отношении Чувствительны к фагу Слабочувствительны к фагу Взвесь клеток в физиологическом Взвесь быстро оседает. Осадок растворе гомогенная, стойкая. Клетки крошковидный, клетки нормальных размеров полиморфные. Мутации индуцированные - такие изменения генотипа, которые происходят путем определенных воздействий на бактерию различными мутагенами, для получения клеток с заранее заданными свойствами. ПРИМЕРЫ. Одним и з первых, кто изучал изменчивость у бактерий основных при знаков был Л.Пастер. Он показал как можно ослабить вирулентные свойства у микробов под влиянием физических, химических и биологических факторов. 54 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 55 из 118 Так Луи Пастер в 1881 г. приготовил вакцину против сибирской язвы. Он выращивал возбудителя при температуре -42,5С (вместо 37С) в течение 12 и 24 дней, что привело к снижению патогенности. Таким же образом была получена вакцина против бешенства в 1885 г. путем 133 последовательных заражений кроликов интрацеребрально. Тем самым он ослабил вирус для людей. При подкожном введении предупреждал у покусанных бешество (фиксированный вирус – virus fixe). Мутация при пассаже на кроликах. Пассаж самая распространенная форма индуцированной мутации применяемой на практике для получения вакцин. (Пассаж – это многократные пересевы микробов. Мутации при пассажи –пересев в системах культивирования не свойственных данному микроорганизму в природе). Путем мутации при пассаже на искусственной питательной среде была получена вакцина против туберкулеза. Кальмет и Герен во Франции в 1919 г. путем длительных пассажей на картофельной среде с желчью и глицерином, при Т-38 С значительно снизили патогенные свойства возбудителя туберкулеза бычьего вида. Таким образом полученный штамм был назван вакциной БЦЖ (BCG – от фр.: Bacilla Calmet –Geren)/ Мутации могут быть точечными, которые затрагивают только одну пару нуклеотидов и могут быть мутации-абберации – они затрагивают изменение двух и более пар нуклеотидов в структуре генома. Точечные мутации могут происходить в результате: замены пары нуклеотидов, в результате выпадения (делеции) пары нуклеотидов, или в результате вставки пары нуклеотидов. Самая легкая мутация это замена. Изменения происходят только в одном триплете, т.е. изменяется кодировка только одной аминокислоты. Мутация замены не всегда приводит к изменением фенотипа бактерий. Это обусловлено эффектом вырожденности генетического кода, когда одна и та же аминокислота может кодироваться не одним, а несколькими триплетами. Генотип изменяется. Делеция и вставка – это сложные мутации, так как одновременно меняется кодировка всех последующих аминокислот. Образуются другие белки. (Плакат) Мутации абберации – занимают большое место. Они могут происходить в результате замены, вставки и выпадения двух и более пар нуклеотидов, а также в результате инверсии. Это такая мутация, когда часть нуклеотидной последовательности в составе нуклеиновой кислоты разворачивается на 180С. Мутации могут иметь различные последствия для бактерий. В некоторых случаях меняется генотип, фенотипические свойства. В других случаях, когда нарушатся синтез жизненно важного белка, мутация является летальной. Мутация может быть условно летальной, если жизненноважный 55 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 56 из 118 белок сохраняет свою функцию только при определенных условиях внегней среды (температура 37-40С). Мутации по механизму действия могут быть прямыми и обратимыми. Прямые мутации изменяют фенотип, а обратимые мутации (реверсии) востанавливают его до такого состояния, каким он был перед прямой мутацией (L-формы бактерий – утрачивают клеточную стенку под воздействием различных факторов). Мутагены – факторы, ведущие к проявлению мутации. Они бывают физической, химической, биологической природы. 1. Физические мутагены. 1.1 Повышенная температура до 40-50 С. Она способствует удалению пуринового основания – гуанина из цепочки ДНК. На его место может встать любое азотистое основание. 1.2 УФО, рентгеновские лучи способствуют изменению химической структуры пиримидиновых оснований (аденин, тимин). Под воздействием этих лучей увеличивается внутримолекулярная энергия пиримидиновых оснований и между двумя соседними молекулами пиримидиновых оснований образуются мостики – ковалентные связи. Образуется димер, который не может играть никакой информативной роли. 2. Химические мутагены. 2.1 Первая группа – это вещества, которые реагируют с нуклеиновой кислотой только во время ее репликации. Такие химические веществ, а по своей структуре сходны с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, но не несут никакой информации и если в момент репликации ДНК такие вещества окажутся в нуклеоиде, они могут встать в структуру ДНК на место нуклеотидов. 2.2 Вторая группа – это такие химические вещества, которые вступают в реакцию с покоящейся молекулой ДНК, но для проявления мутации необходима последующая репликация ДНК. Таким образом мутации классифицируются: По локализации различают мутации: 1. Генные (точечные) 2. Хромосомные 3. Плазмидные. По происхождению мутации могут быть: 1. спонтанными ( образующиеся самопроизвольно и без видимого внешнего воздействия); 2. индуцированными (проявляющиеся в результате обработки микробной популяции мутагенными агентами). По направлению мутационного изменения мутации подразделяются на: 1. Прямые (возникают в геноме «дикого типа» у бактерий в естественных условиях обитания. Образовавшиеся особи являются мутантами). 56 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 57 из 118 2. Обратные (завершающиеся возвратом от мутантного типа к дикому). 3. Одной из форм мутации является диссоциация (мутация, в результате которой в популяции микроорганизмов возникают особи, отличающиеся от исходных внешним видом и структурой колоний, так называемые –S-формы и R-формы). 3. Генетические взаимодействия (самостоятельно) Генетические рекомбинации возникают в результате обмена генетичеким материалом между бактериями. Получаются рекомбинанты, обладающие свойствами обоих родителей. Рекомбинации осуществляются путем трансформации, трансдукции, коньюгации. Трансформация – вставка в струкрупу генома реуипиентной бактерии свободного участка ДНК из среды, целого генома или части генома другой бактерии (донорной) из среды. В результате трансформации образуется полиплоидная бактерия. Коньюгация – замена участка генома одной бактерии соответствующим участком генома другой бактерии при непосредственном контакте (половое разхмножение у бактерий). Трансдукция – вставка в геном бактерий чужеродной генетической информации, главным образом вирусов (бактериофагов). 4. Генетическая инженерия Изучение генетики микроорганизмов позволило конструировать рекомбинантные молекулы ДНК вне живой клетки (70-е г.20ст.) Молекулярная генетика (50-60г.20ст) Биотехнология –на стыке микробиологии, генетики и молекулярной биологии. Биотехнология использует методы генетической и клеточной инженении для получения биологических веществ с заданными свойствами по производству антибиотиков, витаминов, вакцин, моноклональных антител, диагностикумов. Заключение Генетическая система бактерий имеет четыре особенности, присущие только им. 1. Хромосомы бактерий, располагаются свободно в цитоплазме, не имеющие мембран, но связаны с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Хромосома у E.coli мм, т.е. во много раз превышает длину бактериальной клетки (1,5-3мкм в среднем).ДНК компактным образом упакована, в виде спирали свернута. 2. Бактерии являются гаплоидными организмами, т.е. имеют один набор генов, которые определяют все основные свойства организма. 57 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 58 из 118 Содержание ДНК у них не постоянно (при благоприятных условиях ДНК по массе может соответствовать 2, 4, 6 – 8 хромосомам). У всех других живых существ содержание ДНК постоянное, и оно удваивается перед делением. 3. У бактерий в естественных условиях передача генетической информации происходит не только по вертикали, т.е. от родительской клетки дочерним, но и по горизонтали с помощью различных механизмов: конъюгации, сексдукции, трансдукции, трансформации. Практическое применение. 4. У бактерий кроме хромосомного генома имеется дополнительный плазмидный геном, наделяющий их важными биологическими свойствами, нередко – специфическими (приобретенными) иммунитетом к различным антибиотикам и др. химиопрепаратом. Понятийный аппарат (тезаурус) 1. Геном 2. Плазмида 3. Фенотипическая изменчивость (адаптация, модификация) 4. Генотипическая изменчивость (мутации, рекомбинации) 5. Мутации (спонтанные, индуцированные, прямые, обратные (реверсионные), генные (точечные), хромосомные (мутацииабберации), плазмидные, диссоциация) 6. Пассаж 7. Рекомбинативная изменчивость (трансформация, трансдукция, конъюгация) 8. Генетическая инженерия ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ 1. Сформулируйте цели и задачи генетики микроорганизмов. 2. Что вы понимаете под термином «ген»? 3. Что вы понимаете под термином «диссоциация культуры»? 4. Что означает термин «фенотипическая изменчивость»? 5. Что означает термин «генотипическая изменчивость»? 6.Что вы понимаете под термином «мутация»? 7.Что такое трансформация, трансдукция, конъюгация? 8. Что такое колицины (бактериоцины)? 9. Что такое «плазмиды»? 10. Назовите задачи, которые решает генетическая инженерия. РЕКОМЕНДУЕМАЯ литература 1. Ветеринарная микробиология и иммунология /Под ред. проф. Н.А.Радчука.-М.,1991.-С.94-104. 2. Емельяненко П.А. Ветеринарная микробиология. – М.,1982.- С.42-49. 58 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 59 из 118 3. Гусев М.В., Минеева Л.А. Микробиология. – Издательство Московского университета,1978. – С.103-142. 4. Пяткин К.Д.. Кривошеин Ю.С. Микробиология.- М.,1980.-С.109-133. 5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. М.,1983. –С.94-122. Лекция № 11 Тема: Основные свойства вирусов. Бактериофаги План: 1. Природа вирусов 2. Гипотезы происхождения вирусов 3. Основные свойства вирусов и их прикладное значение 1. Природа вирусов. Вирусология – биологическая наука, занимающаяся изучением мельчайших организмов вирусов, а также заболеваний, вызываемых у любых других. Вирусы, вызывающие болезни у растений называются фитофагами, у бактерий – бактериофагами. Первооткрывателем вирусов был русский ботаник Д.И. Ивановский, который изучал мозаичную болезнь табака. Готовил суспензию из пораженных листьев табака, пропускал через фильтр и фильтратом заражал здоровые растения. Растения заболевали. Ученый предположил, что в фильтрате был мельчайший организм. Долгое время шли споры, вирусы живые или неживые вещества? Вирусы способны выпадать в осадок в виде правильной формы (кристаллизуемость вирусов) – неживые; но вирусы способны воспроизводить себе подобных и передавать генетическую информацию потомкам, что свидетельствует о том, что вирусы – живые. Вирусы стоят ближе к существам, чем к веществам. Вирусы своеобразная и неоднородная группа существ, обладающая некоторыми основными признаками живых организмов: 1. Воспроизводство себе подобных 2. Паразитизм 3. Инфекционность 4. Трансмиссивность 5. Изменчивость 6. Приспособляемость к условиям внешней среды Вирусы занимают особое место в биосфере и находятся на границе живого и неживого. 2. Гипотезы происхождения вирусов 59 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 60 из 118 1.Эволюционная гипотеза – вирусы являются потомками древних доклеточных форм жизни. Первичный мировой океан – вода + соли + температура, молекулы сталкивались и образовывались органические вещества, затем появились одноклеточные, рептилии. Предполагают, что молекулы могли столкнуться и образоваться вирусы. 2. Реэволюционная – вирусы произошли от бактерий, в результате регресса, т.е. освобождения от ставших ненужными органоидов. Вирусы строгие паразиты. Например. Круглые черви – аскариды всасывают питательные вещества через кутикулу всей поверхностью. Потому что в кишечнике все готовое. У аскарид регрессировала пищеварительная система. Так и у вирусов им не нужен аппарат Гольджи, клеточная стенка и т.д. . т.е. в результате отбрасывания ненужных органоидов получился вирус. Это характерно для крупных вирусов – вирус герпеса, вирус оспы – у них имеются остатки органоидов. 3.Вирусы являются «сбежавшими» органоидами клетки, а именно таких где есть нуклеиновая кислота. Нуклеиновая кислота имеется в ядре и вне ядра (плазмиды, митохондрии, пластиды). Преоны и вироиды – замкнутые в кольцо нуклеиновые кислоты. 4.Вирусы из космоса 3. Основные свойства вирусов и их прикладное значение. Вирусы могут существовать в двух формах 1. клеточной и 2. внеклеточной. Вне клеток вирусные частицы (вирионы) не обнаруживают никаких признаков жизни. Попав в организм вирусы проникают в чувствительные клетки и переходят в активную репродуктивную форму. Начинается сложное, многообразное взаимодействие вируса и клетки, всегда заканчивающееся гибелью клетки и выходом из нее многочисленного вирусного потомства. Основные свойства вирусов 1. Вирусы имеют малые размеры. Их величина колеблется от 8нм до 400 нм ( бактерии имеют размеры 0,3 до 5 мкм). Вирусы не видны в световой микроскоп. Только крупные вирусы, такие как вирус оспы при окрашивании по методу Морозова, увеличивается в размере (белковая субстанция обволакивается азотнокислым серебром), после окрашивания вирус виден в световой микроскоп. 2. Вирусы легко проникают через мелкопористые фильтры. Вирусы и бактерии в смеси в жидкой фракции можно разделить, пропуская через мелкопористые фильтры. В процессе приготовления вируссодержащей суспензии из патологического материала, свободной от бактерий, взвесь пропускают через специальные фильтры. 60 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 61 из 118 3. ОСНОВНОЕ СВОЙСТВО. Вирусы являются облигатными строгими внутриклеточными паразитами. Это проявляется неспособностью воспроизводить себе подобных вне живой клетки. Чтобы накопить вирусы используют клеточные субстраты – живые: куриные эмбрионы, культуры клеток, лабораторных животных. 4. Вирусы не растут на искусственных питательных средах. 5. Вирусы не имеют собственных белоксинтезирующих и энергообразующих систем. Для воспроизводства вирусы приспосабливают эти системы, поражаемой ими клетки. Вирусы рассматривают как биологические образования, несущие генетическую информацию, которую они могут реализовывать только в клетках животного или растительного происхождения. 6. На вирусы не действуют антибиотики и сульфаниламидные препараты. Антибиотики, действуя на бактерию прерывают синтез клеточной стенки, ферментных систем. Поэтому у вирусов им не на что действовать ( у вирусов есть ДНК или РНК и белковая оболочка). При некоторых вирусных инфекциях назначают антибиотики. Так как вирусы ослабляют организм и на этом фоне безобидные сапрофитные микробы активизируются. Например, псевдомонасы при ослаблении организма вирусами могут вызывать пневмонию, поэтому назначают антибиотики. 7. Вирусы имеют разобщенный во времени и пространстве дизъюнктивный способ размножения. Попав в клетку вирус включает органоиды клетки на выработку сырья. Отдельные компоненты вирусных частиц синтезируются в разных местах и в разное время в клетке, и только затем происходит самосборка вирусных частиц. 8.Вирусы имеют в своем составе только один тип нуклеиновой кислоты, или ДНК, или РНК. (у бактерий ДНК отвечает за наследственность, РНК – за перенос инфекции). У вирусов может быть одноили двухнитчатая спираль РНК или ДНК. Свойства вирусов не всегда являются абсолютными. Например. У вируса оспы и гриппа на определенном этапе развития возникает промежуточная форма РНК. Понятийный аппарат (тезаурус) 1. Вирусология 2. Вирусы (клеточные формы) нм (нанометр) 3. Преоны и вироиды 4. Абсолютный паразитизм (облигатный паразитизм) 61 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 62 из 118 5. Свойства вирусов 6. Вирионы (внеклеточные формы) 7. Дизъюнктивный способ размножения НЕОБХОДИМО ЗНАТЬ: основные свойства вирусов и их прикладное значение. Литература 1. Сюрин В.Н. Ветеринарная вирусология.-М.,1991.-С.3-12, 209-221. 2. Троценко Н.И. и др.Практикум по ветеринарной вирусологии.-М.,1989.С.3-15. БАКТЕРИОФАГИ ПЛАН 1. История открытия бактериофагов 2. Строение бактериофагов. Принципы и методы классификации фагов. 3. Основные свойства бактериофагов 4. Стадии взаимодействия бактериофага и бактерий 5. Применение бактериофагов Для усвоения лекции следует знать следующие понятия: 1. Недефектные фаги – бактериофаги, индуцирование клеток которыми завершается образованием жизнеспособного потомства. 2. Дефектные фаги – неспособны осуществлять полноценный цикл продуктивной инфекции с образованием живого фага – потомства. 3. Внеклеточный фаг – это такое состояние фага, обеспечивающее сохранение фага в период между инфекциями. 4. Вегетативный фаг – активное состояние фага, возникает после инфекции (внедрения) чувствительных бактерий или после индукции профага. 5. Профаг представляет собой геном вируса, связанный с бактериальной хромосомой. 6. Истинно-вирулентные фаги – фаги ведущие к гибели, разрушению и освобождению потомства фага. 7. Умеренные фаги – фаги которые не вызывают лизиса (гибели), а остаются в клетке в состоянии лизогении. 8. Лизогения – это явление, при котором микробная клетка после контакта с фагом не лизируется и становится носителем бактериофага. 9. Лизогенные бактерии – бактерии, обладающие свойством лизогении. 10. Конверсия – изменение свойств бактериальной культуры под влиянием фага. 62 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 63 из 118 ВВЕДЕНИЕ У бактерий, как и у других живых существ, есть свои паразиты, получившие название бактериофаги. Под действием их бактерии погибают или изменяют свои морфологические и физиологические свойства. Микробиологическое производство, использующее бактериипродуценты может при определенных условиях оказаться зависимым от бактериофагов. Бактериофаги, попавшие в ферментеры, вызывают лизис бактерий, что уменьшает выход конечного продукта или ухудшает его качество и тем самым приносит экономический ущерб. Фаголизис может стать причиной генетического загрязнения внешней среды, т.е. «производственные» фаги могут взаимодействовать в «природными» фагами, что может привести к появлению генетически новых вариантов фагов. Последние могут быть более активными. Таким образом, нарушаются сложившиеся биоценотические отношения. Изучение генетики бактериофагов внесло существенный вклад в возникновение молекулярной биологии, молекулярной генетики, новой методологии генетики – генной инженерии, и вместе с ней – биотехнологии. В изучаемой теме обсуждаются вопросы структуры, основных свойств, классификации фагов, особенности взаимодействия фага с клеткой. Рассматривается вопрос по применению фагов на практике. Роль фагов в микробиологических производствах, меры профилактики и борьбы с фаголизисом на производстве будут рассматриваться в следующем семестре. 2. КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ Бактериофаги это вирусы, пожирающие бактерий (от греч. Phagos – пожирающий). Первым, кто наблюдал явление лизиса бактерий, был Н.Ф. Гамалея, который в 1898г. обрабатывая бациллы сибирской язвы, выделил вещество, которое лизировало за 6-12 часов молодую сибиреязвенную культуру. Он назвал эти вещества бактериолизинами и отнес их к группе ферментов. Наиболее полно это явление изучил Д, Эрель (1917-1926г). Первое сообщение Д. Эреля о феномене лизиса дизентерийных микробов под влиянием фильтрата испражнений дизентерийного больного было сделано в 1917 г. во Французской Академии наук. Им был проделан следующий опыт. В стерильный бульон вносили несколько капель жидкиъх испражнений выздоравливающего от дизентерии человека. После суточного нахождения колбы в термостате в бульоне выросла смешанная культура. ЕЕ профильтровали через бактериальные свечи. Когда фильтрат добавили в свежие культуры дизентерийных палочек. Бульон через несколько часов стал прозрачным, микробы из него исчезли (растворились). Д.Эрель повторил 63 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 64 из 118 этот опыт несколько раз и каждый раз получал одинаковый эффект. Выделенное литическое начало Д.Эрель назвал Bacteriophagum protobiosus. Название бактериофаг – получило всеобщее признание и прочно вошло в литературу. В настоящее время более чем у 100 видов бактерий обнаружены бактериофаги. Они встречаются в почве, воде, сточных водах, организме животных и человека, молоке, испражнениях. Владельцами бактериофагов являются эшерихии, сальмонеллы, стафилококки и стрептококки. Микобактерии, листерии, коринебактерии и др. Бактериофаги инфицируя клетку, репродуцируются в ней, образуют потомство и вызывают лизис, сопровождающийся выходом фагов в среду обитания бактерий. 2. СТРОЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ Структура бактериофагов различна. В структуре бактериофага различают головку и отросток. Белковая оболочка головки называется капсидом. Капсид состоит из морфологических единиц называемых капсомерамы. В него включена молекула ДНК или РНК. Молекула ДНК вместе с капсидом образует нуклеокапсид. У фагов нуклеокапсид имеет смешанный тип симметрии – спиральный и икосаэдрический. У большинства фагов геном – двунитевые ДНК, геном некоторых – однонитевые ДНК. На концах молекул ДНК некоторых фагов присутствуют «липкие участки» (однонитевые комплементарные последовательности нуклеотидов), у других фагов липкие участки отсутствуют. У некоторых фагов последовательности генов в молекулах ДНК уникальны, тогда как у других выявлены пермутации генов. У одних фагов ДНК линейная, у других – замкнутая в кольцо. У некоторых – на концах молекулы ДНК имеются концевые повторы нескольких генов, у других – короткие повторы. У некоторых фагов геном представлен набором из нескольких фрагментов нуклеиновой кислоты. Кроме того, в отличие от вирусов эукариот, бактериофаги имеют хвостовой отросток, с помощью которого они прикрепляются к клетке. Но некоторые его не имеют. Размеры фагов колеблются от 20 до 200 нм. Средний размер головки 60-100 нм, длина отростка 100-200 нм. В химическом отношении фаги представлены нуклеиновыми кислотами и небольшим количеством белков, в состав которых входят полиамины: спермин и путресцин, кислоторастворимый полипептид, содержащий аспарагиновую и глутаминовую кислоты, лизин и кислотонерастворимый белок. Несмотря на столь разные типы генетического материала, бактериофаги проявляют общность во многих отношениях с чувствительными бактериями. 64 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 65 из 118 ПРИНЦИПЫ И МЕТОДЫ КЛАССИФИКАЦИИ БАКТЕРИОФАГОВ В основу классификации бактериофагов положены: 1. Общая морфология частицы (морфотипы) и 2. Свойства генетического материала. Известна классификация по морфотипам – это классификация А. Бредли. Цель этой классификации – создать удобство для описания морфологии частицы вновь выделенного фага. Аккерман Г. – в классификацию по морфотипам вел использование морфологических подтипов. В которых учитываются: 1. относительные размеры головки; 2. относительные размеры хвостового отростка; 3. форма головки; 4. наличие специфических образований. Такая классификация недостаточна, т.к. встречаются фаги, которые родственны по генотипу, но по морфологии не сходны и наоборот. Международный комитет по таксономии вирусов предлагает при классификации использовать свойства вириона и его нуклеиновой кислоты: 1. Морфология и размеры вириона; 2. молекулярная масса частицы, седиментационные свойства, ее плавучая плотность; 3. тип, молекулярная масса, относительная доля, конформация и состав нуклеиновой кислоты; 4. серологические свойства и данные и гибридизации нуклеиновой кислоты; 5. физиологические тесты и тесты на спектр литической активности 3. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОФАГОВ 1. Бактериофаги проходят через фильтры задерживающие бактерии. 2. Бактериофаги лизируют бактерии только в период роста (лизируют молодые культуры, старые культуры бактериофаг не лизирует). 3. В местах оседания бактериофага образуются «окна», «пустоты», «негативные колонии». 4. Бактериофаги обладают большой активностью. В разведении 10 -12 и выше. 5. Бактериофаги выделяются из фекалий животных и человека, а также из почвы, воды и других мест, загрязненных фекалиями. Место обычного обитания бактериофага – кишечный тракт человека и животных. 6. Большинство бактериофагов выдерживают нагревание при 60 град. в течение 1ч. При повышении температуры и увеличении экспозиции литическая способность ослабевает, и они погибают. 65 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 66 из 118 7. Бактериофаги устойчивы к рН. РН 2,5-8,5 являются границами кислотности и щелочности среды. В глицерине или бульоне бактериофаг сохраняется в течение 2 лет. 8. Бактериофаги по своему действию строго специфичны. 4.СТАДИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФАГА С КЛЕТКОЙ Для взаимодействия фага с бактериальной клеткой необходимо: 1. наличие рецепторов на клетках, на которых может фиксироваться фаг; 2. наличие в клеточной оболочке и цитоплазме ферментов, способствующих проникновению нуклеиновой кислоты, вещества, из которого строятся гены; 3. наличие в клетке ферментов, материалов и энергетических ресурсов, обеспечивающих синтез компонентов фага и формирование частиц фага. В зависимости от этого процесс взаимодействия фага с клеткой протекает по типу продуктивной инфекции, или лизогении. В зависимости от этого различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги при проникновении в клетку бактерий размножаются в ней и вызывают лизис, Умеренные фаги не вызывают лизис, а остаются в состоянии лизогении. По степени специфичности фаги разделяют на три группы: полифаги – лизируют родственные бактерии, монофаги – бактерии одного вида, а фаговары – только определенные варианты данного вида бактерий. Взаимодействие фага и бактерий протекает стадийно. 1. первая стадия – адсорбция фага на рецепторные участки клеточной стенки бактерий. К ним фаг прикрепляется концевыми нитями отростков. 2. Проникновение – на этой стадии ДНК фага через отросток проникает в клетку. При этом слои клеточной стенки разрушаютя под действием фагового лизоцима. 3. Третья стадия – на этой стадии начинается биосинтез фаговой информационной РНК, белков капсида, которые участвуют в биосинтезе фаговой ДНК. Латентный период продолжается в пределах 15 минут. 4. Четвертая стадия – морфогенез фага, т.е. пустотелые фаговые капсиды заполняются нуклеиновой кислотой и формируются зрелые вирионы (частицы фага). 5. Пятая стадия – выход фаговых частиц из клетки. Это происходит благодаря лизису зараженной бактерии фаговым лизоцимом, накапливающимся в процессе репродукции фага. Количество зрелых фаговых частиц (вирионов) колеблется от единиц до нескольких тысяч. Затем фаги вновь внедряются в еще незараженные клетки и процесс повторяется. Методы выделения и титрования фагов. Для выделения фага из субстрата (культуральная жидкость, гой ран, сточные воды и т.д.) 66 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 67 из 118 суспензию фильтруют через мелкопористые фильтры. Затем фильтрат, внося в соответствующие молодые культуры бактерий. При наличии фага в испытуемом материале бактерии растворяются, жидкость просветляется, а на поверхности агара на месте нанесения фильтратов образуются «стерильные пятна», «бляшки», «негативные колонии». Бактериофаг проверяют на чистоту, специфичность, а также определяют его титр. Титром бактериофага называется то его наибольшее разведение, которое способно вызывать растворение соответствующих бактерий. 6. Применение бактериофагов Бактериофаги имеют большое значение для промышленности, которое проявляется: 1. отрицательной ролью – фаголизис; 2. положительной ролью – в генетике и селекции промышленных продуцентов. Положительная роль. 1. Трансдукция – ценный метод изучения генетического контроля разных признаков в том числе и промышленно важных. Разработка методов генетического анализа промышленных бактериальных продуцентов начинается с поиска трансдуцирующих бактериофагов. При применении генетической трансформации также пытаются обнаружить фагообразование после обработки бактерий выделенной ДНК бактериофага (трансфекция). 2. Бактериофаги широко используются в качестве векторов для клонирования фрагментов ДНК и введения определенных генов в промышленные бактерии. 3. Бактериофаги могут служить зондами для испытания возможности и эффективности выражения генетического материала в гетерологических условиях. 4. Токсигенность некоторых бактерий обусловлена присутствием профага. Этим объясняется возможность использовать клонирование фаговых генов, обеспечивающих повышение продукции токсина и его качества. 5. Бактериофаги обладают генами, контролирующими синтез ферментов, разрушающих клеточную оболочку бактерий, слизистые капсулы. Эти ферменты представляют прекрасный инструмент в химии углеводов и могут использоваться в промышленных целях. 6. Распыление бактериофагов в садах может способствовать уменьшению поражаемости плодовых деревьев весенними заморозками: способствуют ликвидации центров кристаллизации льда, которыми являются обычно фитопатогенные бактерии определенных видов. 67 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 68 из 118 7. Некоторые бактериофаги дают высокий конечный выход и поэтому могут представлять интерес как источники выделения чистой, гомогенной по составу и размерам ДНК. ДНК ряда бактериофагов, используется в молекулярной биологии в качестве стандарта молекулярной массы. 8. Бактериофаги используются в терапии ранений, ожоговых и некоторых кишечных инфекций; эти фаги также получают в промышленных масштабах. 9. В микробиологической практике бактериофаги используют для дифференциации бактериальных культур (сибиреязвенных, стафилококковых, рожистых, сальмонеллезных, колибактериозных). 10. С помощью фага возможна индикация патогенных бактерий во внешней среде (вода, выделения животных, пищевые продукты и и др. субстраты) с помощью реакций нарастания титра фага. Заключение СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИОФАГОВ 1. Образование негативных колоний (НК) как признака первичной идентификации вновь выделенного фага. Негативная колония, стерильное пятно, бляшки – зона лизиса бактерий, Вид НК – признак чрезвычайно специфичный для данного фага, иногда для группы родственных фагов. Отличия: размер зоны центрального лизиса, характер края. 2.Спектр литической активности – признак идентификации вновь выделенного фага. Это круг хозяев бактериофага, их характеристика, имеющая специфическое и важное значение и при идентификации. И в классификации бактериофага. 3. Использование антифаговых сывороток – ценнейшее средство в идентификации и классификации фагов. 4. Физико-химические свойства фаговых частиц в певичной идентификации фага. А) морфология, размер частиц, размер генома; Б) устойчивость фагов к инактивирующим факторам. Чувствительность к хлороформу отражает наличие липидных компонентов в структуре капсида, присущим всем фагам; В) чувствительность к прогреванию, УФ-облучению. Все перечисленные способы идентификации позволяют с достаточной уверенностью сделать вывод относительно возможной принадлежности вновь выделенного фага к уже известной или новой группе фагов. И в 68 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 69 из 118 результате начать полноценную работу по борьбе с фаголизисом, не дожидаясь результатов окончательной классификации фага. Понятийный аппарат (тезаурус) 1. Недефектные фаги – бактериофаги, индуцирование клеток которыми завершается образованием жизнеспособного потомства. 2. Дефектные фаги – неспособны осуществлять полноценный цикл продуктивной инфекции с образованием живого фага – потомства. 3. Внеклеточный фаг – это такое состояние фага, обеспечивающее сохранение фага в период между инфекциями. 4. Вегетативный фаг – активное состояние фага, возникает после инфекции (внедрения) чувствительных бактерий или после индукции профага. 5. Профаг представляет собой геном вируса, связанный с бактериальной хромосомой. 6. Истинно-вирулентные фаги – фаги ведущие к гибели, разрушению и освобождению потомства фага. 7. Умеренные фаги – фаги которые не вызывают лизиса (гибели), а остаются в клетке в состоянии лизогении. 8. Лизогения – это явление, при котором микробная клетка после контакта с фагом не лизируется и становится носителем бактериофага. 9. Лизогенные бактерии – бактерии, обладающие свойством лизогении. 10. Конверсия – изменение свойств бактериальной культуры под влиянием фага. Лекция №12 Тема: Химический состав и архитектура вирусов План: 1. Структура вирусов 2. Химический состав вирусов 3. Классификация вирусов Литература основная 1. Сюрин В.Н. Ветеринарная вирусология.-М.,1991.-С.13-54. 2. Троценко Н.И. и др.Практикум по ветеринарной вирусологии.-М.,1989.С.15-26. 69 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 70 из 118 ЦЕЛЬ лекции: Изучить физическую и химическую структуру вирусов. Ознакомиться с основами систематики вирусов 1.. Структура вирусов. Вирусы имеют определенный тип симметрии. Тип симметрии зависит от положения центральной части нуклеиновой кислоты и расположения на ее поверхности белковых частиц. Различают три типа симметрии: 1. Кубическая, или икосаэдрическая 2. Спиральная 3. Смешанный тип симметрии При кубической симметрии нуклеиновая кислота располагается в центре в виде клубка, вокруг которого белковая оболочка образует правильный многогранник (так видно под электронным микроскопом). При спиральном типе симметрии нуклеиновая кислота закручена в спираль, вокруг которой белковые единицы также образуют спираль. Смешанный тип симметрии характерен для бактериофагов. Головка бактериофага имеет кубический тип симметрии, отросток – спиральный, в целом смешанный тип симметрии. Синоним вирусной частицы – вирион присущ внеклеточной форме. Внутриклеточная форма или вегетативная обладает способностью к репродукции. Центральная часть вируса состоит из нуклеиновой кислоты – нуклеоида, которая в большинстве случаев окружена белковой оболочкой, называемой капсидом. В совокупности нуклеоид и белковая оболочка получили название – нуклеокапсид. Капсид каждого вируса состоит из строго определенных молекул белка. Он является образованием нескольких белковых субъединиц, которые называются капсомерами. Вирус определенного вида состоит из строго определенного числа капсомеров, расположенных в определенном порядке. От расположения капсомеров определяется тип симметрии. Число капсомеров различно у разных видов и колеблется минимум от 12 до нескольких сотен. Капсид предохраняет нуклеиновую кислоту от неблагоприятных факторов внешней среды, обеспечивает присоединение вириона к клетке, притом присоединение избирательное. Вирион присоединяется к той клетке, в которой может репродуцироваться. Капсид вируса обуславливает иммуногенные и антигенные свойства вируса. 70 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 71 из 118 В наиболее простых вирусах имеется только нуклеокапсид (вирус ящура, парвовирусного энтерита). У сложных вирусов, кроме капсида имеется еще одна внешняя оболочка. она называется суперкапсидной. В состав суперкапсидной оболочки входят белки, липиды, углеводы, иногда ферменты. Образуется суперкапсидная оболочка при выходе из пораженной клетки с включением в состав суперкапсида компонентов клеток хозяина. Например, вирус герпеса, гриппа. Еще более сложные вирусы – оспенные (Poxviride), между капсидом и суперкапсидной оболочкой имеют два боковых тельца, являющихся остатками рибосом пораженной клетки. 2. Химический состав вирусов. Основными компонентами вирусов являются белки и нуклеиновые кислоты. Сложные вирусы имеют липиды и углеводы, а некоторые и ферменты. По массе химические вещества составляют: белок -50-90%; нуклеиновая кислота – 1-40%; углеводы – 0-22%; липиды – 0-50%. Отличие химического строения от бактерий заключается в том, что у вирусов нет воды, поэтому и нет собственного обмена веществ – вирусы паразиты. Белки вирусов по элементарному и аминокислотному составу принципиально не отличаются от белков многоклеточных организмов. В их составе различают 16-18 аминокислот. У разных видов вирусов имеется разное количество белков от 1 до 20 белков (у сложных вирусов – вирус оспы). Одна из существенных особенностей вирусных белков заключается в том, что белковые субъединицы-капсомеры активно взаимодействуют между собой без участия химических и физических реакций. Поэтому вирусные белки способны к самосборке,в результате которой в клетке из отдельно синтезированных нуклеиновых кислот и вирусных белков конструируется полноценная вирусная частица. Ферменты вирусов. Вирусы лишены ферментов. Они имеются лишь у сложных вирусов ( вируса герпеса, миксовирусов, вируса гриппа, чумы КРС). В состав суперкапсидной оболочки этих вирусов включен фермент нейроминидаза. Он вырабатывается в пораженной клетке и в процессе самосборки включается в состав оболочки. Этот фермент обеспечивает проникновение таких крупных вирусов в клетку. Больше других вирусов с ферментами нет. Нуклеиновые кислоты. В составе вирусов только одна нуклеиновая кислота – РНК или ДНК. РНК – геном у 80% вирусов Они могут быть как одноцепочечные, так и двухцепочечные. Количество нуклеотидов в вирусной нуклеиновой кислоте от 15 (у мелких вироидов) до 500 тыс. нуклеотидов. Например: в РНК вируса табаичной мозаики содержится 6230 нуклеотидов, в ДНК кишечной палочки около 20 млн, в ДНК всех 46 хромосом человека – около 9 млрд. нуклеотидов. ДНК и РНК можно измерить с помощью 71 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 72 из 118 электронного микроскопа. ДНК мелких вирусов равна 0,0016-0,0052мм, вируса оспы – 0,093 мм (для сравнения ДНК бактерии кишечной палочки – 1,53 мм, человека -2,0мм, дрожжей – 61,2 мм). Вирусные нуклеиновые кислоты отличаются и в функциональном и в структурном отношении от нуклеиновых кислот в клетках. В структурном отношении, вирусы могут быть одно- и двухцепочечными. По составу азотистых оснований – вместо цитозина – оксиметилцитозин. Вместо урацила – оксиметилурацил. В вирусных ДНК может находиться уроцил. В клеточной ДНК – нет. В сахарном компоненте ДНК – может встречаться глюкоза. Главное отличие вирусных нуклеиновых кислот от клеточных заключается в том, что они обладают инфекционными свойствами. Если отдельно взятой вирусной нуклеиновой кислотой заразить клетку, клетка будет синтезировать полноценные вирусные частицы. Липиды и сахара находятся в суперкапсидной оболочке вируса. Состав и количество этих соединений зависит от состава клеток хозяина. 3. Классификация вирусов. Вирусы могут развиваться только в определенных клетках. Тропизм вирусов – это преимущественные системы органов и тканей организма, в клетках которых вирусы способны к репродукции. По тропизму вирусы подразделяются на: 1. Пантропные (в разных органах и тканях организма) 2. Нейротропные (в нервных клетках – вирус бешенства) 3. Дерматотропные (в клетках кожи – вирус оспы) 4. Эпителиотропные (вирус диареи. Ящура в эпителиальных клетках) 5. Пневмотромные (в клетках дыхательных путей, вирус гриппа, аденовирусы) 6. Гематотропные (в клетках крови, вирус лейкоза) Современная классификация вирусов основана на фундаментальных (основных) свойствах вирионов, главными из которых являются: 1. тип нуклеиновой кислоты 2. морфология вириона 3. стратегия вирусного генома 4. антигенные свойства белков вируса 1, 2, 4 свойства внешне заметные свойства. Стратегия вирусного генома (3) (нуклеиновая кислота0 это обусловленный особенностями вирусного генетического материала, способ вирусной репродукции. Способ репродукции зависит от вирусного генома. На основании различных признаков вирусы делятся на: семейства, подсемейства, роды и типы. Причем в основе разделения на семейства лежат два признака: 1. тип нуклеиновой кислоты 72 УМКД 042-18-23.1.01/03- Ред. №____от _______ 2013г. 2013 Страница 73 из 118 2. наличие суперкапсидной оболочки. Существуют: 7 семейств ДНК-содержащих вирусов, 13 семейств РНК содержащих вирусов. Названия вирусов. Терминология латинская. Семейство заканчивается на ….viridae, подсемейство заканчивается на …… virinae, род – на ……virus, тип – применительно к каждому вирусу. Например: Сем. Paramyxoviridae Род Morbilivirus Тип Caninae Вироиды это агенты, вызывающие болезни растений. Небольшая молекула РНК замкнутая в кольцо (плазмида). РНК может быть в плазмидах. Плазмиды и вироиды совпадают. Отсюда теория, что вирусы являются сбежавшими органоидами (плазмидами). Преоны – возбудители некоторых медленных инфекций человека и животных, не содержащих нуклеиновых кислот, только белковые частицы. ЗНАТЬ значение следующих 2. Род терминов : 3. Тип 1. Капсид 2. Суперкапсид 3. Нуклеоид 4. Нуклеокапсид 5. Капсомеры 6. Вироиды 7. Преоны 8. Тропизм вирусов УМЕТЬ объяснить следующие понятия: 1.Спиральный тип симметрии 2. Кубический тип симметрии 3. Смешанный тип симметрии 4. Пантропные вирусы 5. Нейротропные вирусы 6. Дерматотропные вирусы 7. Эпителиотропные вирусы 8. Гематотропные вирусы 9. Пневмотропные вирусы ВЛАДЕТЬ основами классификации вирусов: 1. Семейство 73 ЛЕКЦИЯ № 13 ТЕМА: Культивирование вирусов. Репродукция вирусов ПЛАН: 1. Общее представление о репродукции вирусов 2. Этапы репродукции вирусов 2.1. Начальный период (первая фаза) 2.1.1 Адсорбция вируса на клетках 2.1.2 Проникновение вируса в клетку 2.1.3 Раздевание вируса в клетке (депротеинизация) 2.2. Средний период (вторая фаза) 2.2.1. Транскрипция 2.2.2. Трансляция иРНК 2.2.3. Репликация генома 2.3. Заключительный период (третья фаза) 2.3.1. Самосборка вирусных компонентов 2.3.2. Выход вируса из клетки 1. Общее представление о репродукции вирусов РЕПРОДУКЦИЯ, Reproductio (лат., re - снова, producere - производить, создавать) – 1. воспроизводство, восстановление, репродукция, регенерация; 2. умножение, размножение. РЕПРОДУКЦИЯ вирусов это образование рутем репликации, протекающей по принципу комплементарности, многочисленных копий вирусных нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) и индуцирование молекулами последних биосинтеза вирусных белков с последующей самоорганизацией этих компонентов в зрелые вирусные частицы (В.И.Товарницкий,1978). Репликацию нуклеиновых кислот вирусов осуществляют ферменты – полимеразы (ДНК-полимеразы или РНК-полимеразы). В процессе репродукции вирусов копируются молекулы нуклеиновых кислот и, согласно, заключенной в них генетической информации, синтезируются вирусные белки. Каковы же биологические и генетические особенности механизмов репродукции вирусов? Особенности репродукции вирусов. 1.Принципиальная особенность. Геномы вирусов представлены РНК или ДНК (одно- или двухспиральные) 2. Вирусы имеют большое разнообразие структуры и формы геномов. Геномы РНК-содержащих вирусов могут иметь до 12 различных молекул РНК. Такие геномы называют фрагментированными. 3. Вирусные РНК способны реплицироваться независимо от ДНК клетки, тогда как клеточные РНК (иРНК, тРНК) синтезируются на матрице клеточной ДНК. 4. Вирусы имеют разобщенный во времени и пространстве способ синтеза нуклеиновых кислот и белков – дизъюнктивный. 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 75 из 118 5. Вирусы не имеют собственных белоксинтезирующих и энергообразующих систем, а используют системы поражаемой клетки, т.е. используют в «наем». 6. Механизмы репликации вирусных нуклеиновых кислот у различных вирусов могут осуществляться пятью различными способами, что зависит от строения самой вирусной нуклеиновой кислоты. Общими признаками репродукции для всех вирусов являются: 1. Источником мономеров для синтеза вирусных нуклеиновых кислот служат нуклеотиды клеток (аденозинтрифосфат, дезоксирибонуклеозидтрифосфотазы, рибонуклеозидтрифосфотазы). 2. Источником мономеров для синтеза вирусных белков служат клеточные аминокислоты. 3. Синтез всех вирусных белков осуществляется на рибосомах клетки. 4. Источником энергии для репликации вирусов служит АТФ, вырабатываемая в клеточных митохондриях. 2. Этапы репродукции вирусов Начальный период (первая фаза) Адсорбция вируса на клетке Проникновение вируса в клетку Раздевание вируса в клетке (депротеинизация) 2.2.Средний период (вторая фаза) 2.2.1. Транскрипция Трансляция иРНК Репликация генома Синтез вирусных белков Заключительный период (третья фаза) Самосборка вирусных компонентов Выход вируса из клетки 1.1. Начальный период (первая фаза) 1.1.1. Адсорбция вируса на клетке В основе адсорбции вируса на клетку лежат два механизма: первый механизм обусловлен физико-химическими силами, возникающими между разноименно заряженными группами. Вирусы несут отрицательный заряд. Клетка – положительный заряд. Идет притягивание. На этом этапе вирус можно удалить путем изменения электрического заряда при добавлении солей Начальный контакт вируса с клеткой происходит в результате случайного столкновения по типу броуновского движения. Второй этап адсорбции заключается во взаимодействии комплементарных друг другу рецепторов, находящихся на поверхности вирусной частицы и клеточной оболочке. Количество рецепторов на одной клетке составляет 10 в 4 степени – 10 в 5 степени. Вирусы используют 75 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 76 из 118 клеточные рецепторы, предназначенные для прохождения в клетку необходимых для ее жизнедеятельности веществ: питательных веществ, гормонов, факторов роста. Вирус встраивает в свою структуру компоненты клеточной стенки. На этом этапе вирус удалить не возможно. Вирусы обладают тропизмом, поэтому рецепторы для их прикрепления имеются не на всех клетках. Адсорбированные на поверхности клетки вирусы имеют разную судьбу. Большинство вирусов с клетки элюируются (смываются) и повреждаются и неспособны к дальнейшему развитию, реадсорбции другими клетками и не инфицируют их. Другая часть вирусов проникает внутрь клетки и претерпевает следующие стадии репродукции. Вывод: 1. Адсорбция вируса осуществляется за счет разности зарядов. 2. Комплементарности рецепторов клеточных и вирусных. 1.1.2. Проникновение вируса в клетку Существуют два механизма проникновения вируса в клетку. Первый механизм называется механизмом виропексиса (эндоцитоза). Сопровождаемый образованием пищевой вакуоли (Амебы охватывают пищу). Клеточная стенка ввячивается и вирус проваливается в клетку. Термин виропексис предложил в 1948 г. Фазекас де Сен Гро. Почему клетка «проглатывает» вирусную частицу? Потому что каждая клетка обладает способностью к фагоцитозу. Второй механизм происходит за счет объединения вирусной и клеточной оболочек. Данный механизм присущ вирусам, у которых в составе суперкапсидной оболочки имеются ферменты. Под действием ферментов вирусов растворяется клеточная стенка в месте соприкосновения и как бы содержимое вируса оказывается под одной оболочкой с клеточной цитоплазмой. 1.1.3. Раздевание вируса в клетке (депротеинизация) Для того чтобы включилсь механизмы репродукции вирусов внутри клетки, вирусная нуклеиновая кислота должна освободиться от белковых оболочек (раздевание вирусов). Этап депротеинизации вирусов нужен в том случае, если проникновение вирусов идет виропексисом. Раздевание випуса идет в специальных участках клетки – в лизосомах, в структурах аппарата Гольджи и околоядерном пространстве. В лизосомах имеется фермент растворяющий липиды, углеводы в суперкапсидной оболочке, в аппарате Гольджи – если только капсидная оболочка. Раздевание вируса – ферментативный процесс клеточного пищеварения. Таким образом, первый этап – начальный период заканчивается освобождением вирусного генома. 2.2.Средний период (вторая фаза) 2.2.1. Транскрипция 76 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 77 из 118 Транскрипция – переписывание информации с ДНК на РНК по законам генетического кода. Образуется иРНК. Клеточная ДНК. Клеточная ДНК обладает информацией, но подойти к рибосомам не может. Поэтому идет запись информации с ДНК на РНК. Транскрипция осуществляется с помощью специального фермента ДНК-зависимой РНК-полимеразы. ДНК → транскрипция и РНК → трансляция →рибосомы → белок: так в клетке. Транскрипция у двунитчатых(1), однонитчатых ДНК(2), двунитчатых(3), однонитчатых(4) РНК идет по разному. 1.Если вирусная ДНК двунитчатая, то синтез белка осуществляется точно по такой же схеме. 2.ДНК – однонитчатая. Если ДНК одноцепочечная, то на первом этапе при помощи фермента ДНК-полимеразы осуществляется синтез второй цепи ДНК гомологичной первой цепи. Первая цепочка имеет (-), вторая (+). На вторую цепь и образуется иРНК, которая участвует в процессе трансляции. ДНК(+)→ (ДНК-) →иРНК → белок 3. РНК –двунитчатая – (+) нитевые вирусы. Функцию иРНК выполняет сама РНК. Передача генетической информации осуществляется по наиболее простой формуле. РНК → белок Это: пикорна-, тога-, коронавирусы 4. РНК – одноцепочечная – (-) нитевой вирус. Такие вирусы функцию иРНК выполнять не могут. В клетке на матрице исходной РНК синтезируется комплементарная ей противоположная нить. Она будет выполнять роль иРНК при помощи РНК зависисмой РНК полимеразы. РНК → РНК (иРНК) → белок 2.2.2. Трансляция иРНК Трансляция иРНК осуществляется по тем же самым механизмам, по которым осуществляется синтез любого белка в клетке.(3 этапа – инициация, элангация, терминация). После образования вирусных белков, в некоторых случаях происходит их модификация. Почему клетка начинает продуцировать вирусные частицы? Потому что рибосомам все равно, какой белок синтезировать. 2.2.3.Репликация генома вируса – увеличение количества нуклеиновых кислот, которое происходит в ядре клетки. Механизмы репликации различны. 1. Двухцепочечная ДНК – аналог клеточной ДНК. Развертывание двух цепей происходит с помощью лигазы, с помощью полимеразы происходит считывание. 2. Если ДНК одноцепочечная, то синтез ДНК происходит по принципу комплементарности. При помощи фермента синтетазы образуется другая 77 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 78 из 118 (-)цепь но с обратной стороны. Образовавшаяся (-) нить является матрицей для дочерних ДНК(+). ДНК(+)------ДНК зависимая ДНК полимераза ----ДНК(-)------дочерниеДНК(+) Комплементарная Матрицей являются (-) нити. 3. РНК содержащие вирусы. Если вирус содержит одну нить РНК то синтез РНК аналогичен однонитчатым ДНК. РНК(+) -------РНК(-) -------дочерние РНК(+) 4. Если РНК двухцепочечная, то в составе таких вирусов есть фермент РНК зависимая РНК полимераза. При помощи этого фермента на (-) нити синтезируется гомологичная ей (+) нить, которая вначале уходит к рибосомам для синтеза белка, в т.ч. и фермент РНК зависимая РНКполимераза. Затем полимераза связывается с этими же (+) нитями РНК и синтезирует на них (-) нити РНК. Особенность заключается в том, что одна и та же РНК служит матрицей для синтеза и комплементарной РНК и белка. 2.2.3. Синтез вирусных белков У большинства вирусов синтез белков осуществляется в цитоплазме. Вирусные белки могут синтезироваться в одних структурах, а накапливаться в других. Механизмы миграции вирусных белков в ядро не выяснены. Стандартная вирусная частица содержит одну молекулу РНК и до 10 тыс. молекул белка. Синтез вирусных белков аналогичен синтезу клеточных белков. На первой стадии синтезируются ранние вирусные белки. Это белки блокирующие синтез клеточных компонентов. В основном это интерфероны. 2.3.Заключительный период (третья фаза) 2.3.1. Самосборка вирусных компонентов осуществляется после достижения максимального количества компонентов, в результате физикохимических процессов. Иногда белков бывает больше, чем нуклеиновых кислот, тогда образуются пустая вирусная частица – незрелая (без нуклеиновой кислоты). Могут быть свободными и нуклеиновые кислоты. В основе самосборки лежит специфическое белок-нуклеиновое и белокбелковое узнавание, которое может происходить в результате гидрофобных ионных и водородных связей, а также стерического соответствия. Белокнуклеиновое узнавание ограничено небольшим участком молекулы нуклеиновой кислоты и определяется уникальными полследовательностями нуклеотидов в некодирующей части вирусного генома. С этого узнавания участка генома вирусными капсидными белками начинается процесс сборки вирусной частицы. Присоединение остальных белковых молекул осуществляется за счет специфических белок-белковых взаимодействий или неспецифических белок-нуклеиновых взаимодействий. 2.3.3. Выход вируса из клетки - Взрывной. Связан с деструкцией клетки, нарушением ее целостности. 78 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 79 из 118 - Постепенный (путем почкования). По мере созревания вирусные частицы подходят к клеточной стенке и отпочковываются. В данном случае клетка погибает, если клеточные механизмы истощены. - Нуклеиновая кислота разденется и войдет в хромосомы и там остается до неблагоприятных факторов (латентные вирусы – вирус СПИДа). ЛЕКЦИЯ № 14 ТЕМА: Особенности противовирусного иммунитета ПЛАН: Противовирусный иммунитет Отличие вирусного иммунитета от иммунитета при бактериальных инфекциях. Интерферон 1.2. Естественная видовая резистентность 1.3. Неспецифические клеточные и общефизиологические реакции в противовирусном иммунитете 1.4. Специфические факторы иммунитета Литература основная Сюрин В.Н. Ветеринарная вирусология. - М.,1991.-С.249-305, 335-349. 1. 1.1. 1. Противовирусный иммунитет В понимание противовирусного иммунитета входят три категории: 1. Естественная видовая резистентность. 2. Неспецифические клеточные и общефизиологические реакции – участие интерферона, неспецифических ингибиторов, веществ, сдерживающих репродукцию вирусов, температурный фактор, пиноцитоз вирусных частиц и фагоцитоз зараженных вирусом клеток. 3. Специфические факторы иммунитета - приобретенный иммунитет, возникающий после вакцинации или переболевания. Приобретенный иммунитет связан с образованием антител. Исходя из особенностей структуры и функций вирусов, защитные механизмы направлены на 2 формы существования вирусов – покоящиеся и репродуцирующиеся. Защитная реакция на внеклеточную форму вирусов мало чем отличается от иммунных реакций в отношении бактерий. Эта форма вирусов, также как и другой чужеродный агент подвергаются действию специфических и неспецифических клеточных и гуморальных факторов иммунитета. Защитные реакции в отношении внутриклеточных форм вирусов отличаются от механизма иммунитета в отношении любых других форм вирусов. Они представляют собой уничтожение, фагоцитоз пораженных вирусом клеток, но самое главное отличие 79 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 80 из 118 заключается в том, что защитные реакции проявляются в виде синтеза пораженной клеткой неспецифических противовирусных белков – главным образом, интерферонов. 1.1.Отличие вирусного иммунитета от иммунитета при бактериальных инфекциях. Завершенный фагоцитоз, когда инородное тело уничтожается. Незавершенный фагоцитоз – инородное тело не уничтожается. В отношении вирусов завершенный фагоцитоз явление крайне редкое. Внутри фагоцитов вырабатываются протеолитические ферменты, которые разрушают клеточную стенку у бактерий и они погибают. Протеолитические ферменты фагоцитов действуют на вирусы таким образом, что при этом высвобождается нуклеиновая кислота, а это первая фаза репродукции вирусов (депротеинизация вирусов – раздевание вирусов). Раздетая нуклеиновая кислота может оказать свое патогенное действие. Внутри пораженной клетки вырабатывается интерферон. Информация о синтезе интерферона закодирована в любом геноме клетки, но она находится в ней в рециссивном состоянии (не рабочее состояние). Вирус, попав в клетку, активизирует этот ген, что приводит к синтезу и выделению из клетки интерферона. Все вирусы в клетках одного и того же вида животного (человека) индуцирует образование одного вида интерферона. Белок (интерферон), выработанный в клетке, не означает, что он приведет к гибели вирусов в клетке. Интерферон, выработанный в обреченной клетке, выходит за ее пределы и вступает во взаимоотношения с соседними клетками, которые еще не подвергались действию вирусов. В таких клетках возникает соответствующая перестройка. Существует два механизма действия интерферона: 1. интерферон, воздействуя на геном (ДНК) еще незараженной вирусом клетки активизирует выработку противовирусных белков, которые препятствуют трансляции вирусной информации на рибосомы. 2. интерферон блокирует клеточные рецепторы, и вирус не может адсорбироваться на клетках. Противовирусное действие интерферона заключается в снижении питательного материала, в результате чего вирусная инфекция быстро приостанавливается. В настоящее время с помощью метода генной инженерии синтезирован интерферон. Искусственным путем был синтезирован ген, где закодирована информация о нуклеотидной последовательности интерферона и введен в микробную клетку, которая и производила синтез интерферона. 1.2. Врожденный видовой иммунитет Врожденный видовой иммунитет присущ человеку передается по наследству, как и другие генетические ветряной оспы человека – животные не чувствительны к различная степень напряженности иммунитета: 80 или животному и признаки. Вирус нему. Существует от абсолютной 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 81 из 118 резистентности до относительной невосприимчивости, которая может быть преодолена при помощи различных воздействий. Видовой иммунитет зависит от возраста. Новорожденные более восприимчивы, чем взрослые животные. Тканевые культуры, культуры клеток чаще готовят из органов и тканей новорожденных крольчат, мышей-сосунов, так как некоторые вирусы могут развиваться только в клетках молодых животных (вирус ящура – в органах крольчат, вирус Коксаки – только на органах новорожденных мышей –сосунов). Другие вирусы могут развиваться , напротив только в органах зрелых животных. Около 15 лет назад по всему миру была панзоотия вирусной геморрагической болезни кроликов – вирус развивался только в органах зрелых кроликов, а у крольчат не развивался. На естественную резистентность к вирусам существенное влияние оказывают и гормональные факторы. Под действием гормона кортизон, взрослые мыши становятся также чувствительными к вирусу Коксаки (как и сосуны). Тестостерон. Видовой иммунитет к определенному вирусу генетически детерминирован и передается из поколения в поколения. Видовой иммунитет является специфичным, потому что он направлен в отношении определенного вида вируса. В основе видового иммунитета лежит отсутствие в организме данного вида животного (человека), чувствительных к определенному вирусу клеток, поэтому репродукция его становится не возможной. От чего зависит, чувствительна клетка или нет к вирусу? – От наличия соответствующих рецепторов. У отдельных животных (человека) отсутствуют рецепторы в клетках к данному вирусу. Видовой иммунитет можно преодолеть. Главным образом, путем обеспечения многократного пассирования вируса через нечувствительные к нему клеточные системы. Пример. Пастер готовил вакцину – проводил вирус через мозг овцы. Вирус начинает так выстраивать свои рецепторы, что они могу прикрепляться к ранее нечувствительным клеткам. Так готовят живые аттенуированные вакцины. Аттенуирование можно проводить в живом организме, культуре клеток. Одним из факторов видового иммунитета является нормальная температура тела теплокровных животных. Особенно в отношении тех вирусов, которые обладают термолабильными свойствами. У КРС – Т -3739,5, у свиней -40,5, у человека – 36-37. Есть вирусы, которые могут развиваться только при температуре 37-38 град., то у свиней они развиваться не будут. Вирус эфемерной лихорадки КРС развивается при температуре 3435 град. Одним из факторов врожденного видового иммунитета является термолабильность, гуморальные неспецифические факторы, а именно сывороточные ингибиторы вирусов. Основным сывороточным ингибитором является комплемент. Эти ингибиторы обладают широким диапазоном 81 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 82 из 118 действия. Одни подавляют гемагглютинирующее действие, другие – ЦПД вирусов, третьи – блокируют вирусную инфекционную активность. Таким образом, видовой иммунитет определяется двумя основными факторами: 1. природой организма и особенностями его защитных реакций; 2. природой вируса – определенной степенью его вирулентности. Видовой иммунитет по отношению к определенному виду вируса зависит не только от высокой напряженности защитных реакций организма, но и от неспособности вируса паразитировать в нем. 1.3. Неспецифические клеточные и общефизиологические реакции в противовирусном иммунитете. Неспецифические клеточные защитные факторы К числу неспецифических защитных факторов клетки относят усиление их секреторно-выделительной функции, что в некоторой мере способствует выведение вируса из клетки, а вне ее вирус становится быстрой добычей антител. Клеточной защитной реакцией является образование внутри пораженной клетки внутрицитоплазматических телец-включений, которые в отличие от базофильных телец-включений, окружены плотной оболочкой. Оксифильные тельца-включения будут представлять скопление вирионов, которые не могут выбраться за пределы оболочки. Внутри таких телец-включений резко снижается рН среды, образуется очаг местного внутриклеточного воспаления, поэтому в таких тельцах образуются условно сдерживающие процессы репродукции вирусов. Тельца-включения оксифильные имеют более плотные оболочки, вирусы как бы в комке – вирусные болезни протекают легче. Тельца включения базофильные – вирусные болезни протекают тяжелее. Местные и общефизические факторы противовирусного иммунитета Самым главным общефизическим фактором противовирусного иммунитета является повышение местной и общей температуры тела. Это оказывает губительное действие на вирусы. При температуре выше температуры нормальной на 0,5 град С, вирусы инактивируются в течение 14 суток. Например, вирус гриппа при температуре 37,2 град. Повышение температуры тела действует на вирус и опосредованно. Повышение температуры ведет к повреждению некоторых функций клетки, от которых зависит нормальный цикл репродукции вирусов. При повышении температуры тела усиливаются процессы иммуногенеза, ускоряются процессы обмена веществ, что тоже способствует инактивации вирусов. Другой общефизической реакцией организма является усиление секреторно-выделительной функции организма. При вирусных инфекциях часто повышается саливация, обильное истечение из носовой полости и из глаз, учащенное мочеиспускание и диарея. При помощи этих естественных 82 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 83 из 118 секретов, вирус обильно выделяется во внешнюю среду. Если репродукция завершена, то выделение способствует быстрому восстановлению естественной среды организма. 1.4. Специфические факторы иммунитета. Приобретенный иммунитет к вирусам В отличие от факторов обуславливающих врожденный иммунитет, организм может приобретать новые защитные факторы, механизмы в результате инфекции или иммунизации. Приобретенный иммунитет по наследству не передается и одной из главных особенностей этого иммунитета является его строгая специфичность. Различают искусственный и естественный иммунитет. Иммунитет может быть активным и пассивным. Активный иммунитет возникает после переболевания (естественный приобретенный иммунитет) или после вакцинации (искусственный приобретенный иммунитет). Пассивный иммунитет естественный передается с молоком матери переболевшей после естественного заражения (колостральный иммунитет). Пассивный иммунитет искусственный возникает при введении гипериммунных сывороток, содержащих готовые антитела. Среди факторов приобретенного иммунитета антителам принадлежит наиболее важный приоритет. Но не только антитела являются факторами приобретенного противовирусного иммунитета. Клетки (лимфоциты) могут становиться специфическими защитниками после повторного контакта их с вирусами. Одним из факторов приобретенного иммунитета является фагоцитарная реакция, усиливающаяся в результате инфекции или вакцинации. При этом происходит специфическая перестройка макрофагов, которые в совместном действии с антителами, способствуют поглощению вирусов фагоцитами. Вируснейтрализующие антитела, комплементсвязывающие антитела, преципитирующие антитела связывают вирусы в конгломераты, вес которых велик, чтобы фагоциты поглатили их. Студенты должны иметь представление : 1. об естественной видовой резистентности организма 2. о неспецифических клеточных реакциях на вирус 3. об общефизиологических реакциях на вирус 4. о специфических реакциях организма на вирус 5. об интерфероне и механизме его действия ЛЕКЦИЯ № 15 Тема: Практическое применение микроорганизмов План: 83 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 84 из 118 1. Биотехнология. История развития промышленной микробиологии 2. Характеристика основных групп микроорганизмов продуцентов ферментов, витаминов, антибиотиков, белка. 3. Принципиальная схема производства полезных веществ Литература: 1. Промышленная микробиология. Под ред. Н.С.Егорова. – М.,1989. 2. Сассон «Биотехнология. Свершения и надежды». 1. Биотехнология. История развития промышленной микробиологии. В процессе обогащения и развития микробиологии от нее отпочковались новые научные дисциплины, такие как микология, вирусология. В дальнейшем в зависимости от экологии микроорганизмов и практических потребностей человека в микробиологии выделялись направления различающиеся задачами исследования: - общая микробиология - промышленная (техническая) микробиология - геологическая микробиология - сельскохозяйственная микробиология - медицинская микробиология - ветеринарная микробиология. Общая микробиология является базовой для всех других отраслевых разделов микробиологии. Промышленная микробиология – это наука о важнейших микробиологических процессах и их практическом применении для получения индустриальным способом ценных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, их биомассы как важнейшего белкового продукта, о получении отдельных полезных веществ (препаратов), используемых в различных отраслях народного хозяйства и медицине. В основе этой науки лежит микробиологическая технология (биотехнология), являющаяся воплощением результатов фундаментальных исследований физиологии, биохимии и генетики микроорганизмов в практику. Биотехнология – складывается из двух слов «биология» и «технология». Т.е. дословно можно расшифровать этот термин как применение биологических знаний в практической деятельности. Определение по Валихановой Г.Ж. Биотехнология – новая отрасль науки и производства, основанная на использовании биологических процессов и объектов для производства экономически важных веществ и создания высокопродуктивных сортов растений, пород животных и штаммов микроорганизмов. Что же является биологическим объектом в биотехнологии? – Объектом промышленной биотехнологии является микробная клетка – 84 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 85 из 118 бактериальная, дрожжевая клетка, клетка плесени, актиномицета. В биотехнологии растений ( которая является самостоятельной дисциплиной) объектом являются отдельные клетки, органы, изолированные из целого растения. И микроорганизмы и клетки растений в биотехнологии выращиваются вне организма (in vitro) на искусственных питательных средах в условиях асептики. Клетки выращенные in vitro – называются культурой клеток. В связи с этом существует другое определение понятия «биотехнология» по Альберу Сассону ( это марокканский ученый, биолог и популяризатор науки. Он автор ряда учебников и научно-популярных книг по биологии, охране окружающей среды, экологии). Биотехнология - ,в сущности, не что иное, как использование культур клеток бактерий, дрожжей, животных или растений, метаболизм и биосинтетические возможности которых обеспечивают выработку специфических веществ. 2. Характеристика микроорганизмов – продуцентов полезных веществ. Продуцентами полезных веществ могут быть бактерии, плесневые грибы, актиномицеты, дрожжи. Микроорганизмами принято называть мельчайшие живые существа, размеры которых меньше или немногим превышают разрешаюшую способность человеческого глаза (0,2мм). Большинство микроорганизмов в отличие от макроорганизмов одноклеточные, а имеющиеся многоклеточные формы сравнительно мало дифференцированы. В систематическом отношении микроорганизмы не представляют собой единой группы. На основании организации генетического аппарата, микроорганизмы подразделяются на эукариот и прокариот. У эукариот есть ядра, окруженные мембраной, содержащие набор хромосом, в которых находится ДНК, несущая основную генетическую информацию. К эукариотам относят многие водоросли, грибы, простейшие. К прокариотным микроорганизмам относят бактерий ( эти термины рассматриваются как равнозначные). Ядро бактерий, называемое нуклеоидом не окружено мембраной и представлено одной молекулой ДНК свернутой в спираль. Эндоплазматический ретикулум, митохондрии у бактерий отсутствуют, а выполняют их функции клеточная мембрана и внутриклеточные мембраны, которые из нее образуются. Большинство бактерий, также как и водоросли и грибы имеют ригидную клеточную стенку. Но состав ее иной, чем у эукариот. Типичным компонентом клеточной стенки бактерий является пептидогликан (муреин), состоящий из N – ацетилглюкозамина и N – ацетилмурамовой кислоты. Ни у одного из эукариот такой полимер не обнаружен. Имеются различия в строении жгутиков, которые обуславливают подвижность ряда эукариот и прокариот, в составе липидов и некоторых других компонентов. 85 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 86 из 118 Размножение бактерий чаще происходит путем бинарного деления, реже почкованием, образованием экзоспор или другими бесполыми способами. У ряда бактерий установлена способность к коньюгации. Но в отличие от полового процесса у эукариот при этом происходит, как правило, лишь частичная передача ДНК из одной клетки в другую. У эукариот установлено вегетативное, бесполое и половое размножение. Следует отметить, что в клетках микроорганизмов могут быть дополнительные элементы, несущие генетическую информацию. К ним относят – плазмиды, распространенные у бактерий. Они представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, определяющие устойчивость содержащих их штаммов к лекарственным препаратам и т.д. Микроорганизмам принадлежит важная роль в природных процессах, а также в практической деятельности человека. Объясняется это рядом причин. 1. Микроорганизмы быстро распространяются с током воздуха, по воде и др. и поэтому встречаются в самых разных местах, где другие формы жизни иногда отсутствуют. 2. Микроорганизмы способны очень быстро размножаться. Известны бактерии, которые делятся каждые 30-60 мин и даже через 8-10 мин. В результате из одной клетки массой около 2,5 . 10 -12 г за 2-4 сут в условиях, обеспечивающих активный рост, могла бы образоваться биомасса порядка 10 10 т и более. В действительности этого не происходит, так как действуют разные ограничивающие факторы. Но возможности микроорганизмов к быстрому размножению намного превосходят и растения и животных. 3. Разнообразие физиологических и биохимических свойств. В результате некоторые из них могут расти в экстремальных условиях, которые для большинства других организмов неблагоприятны или вообще не поддерживают рост. Особенно разнообразны по свойствам бактерии. Мезофиллы, психрофилы, термофилы. Спорообразование. Споры способны прорастать после кипячения. Барофилы. Ацидофилы. Алкалофилы. Галлофилы. Аэробы. Анаэробы. Факультативные анаэробы. Автотрофы.Гетеротрофы. Ауксотрофы. Метилотрофы (использующие в качестве энергии и углерода метан, метанол и др.). Микроорганизмы могут фиксировать молекулярный азот (можно готовить бактериальные препараты типа азотобактерин). Зная свойства микроорганизмов можно управлять ими и использовать для получения самых разных веществ. Бактерии широко используются для получения молочнокислых продуктов (стрептококки, лактобактерии). Для получения кумыса в качестве закваски используют чистые культуры болгарской палочки и дрожжи. Болгарская палочка сбраживает лактозу до молочной кислоты, а дрожжи образуют спирт. Т.е. получение очень полезных для человека 86 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 87 из 118 молочно-кислых продуктов основано на ферментативной активности микроорганизмов. Бактерии – продуценты ферментов.Среди бактерий большое количество протеолитических ферментов образуют бациллы subtilis megatherium, brevis и т.д. Продуцентами ферментов могут быть также микроскопические грибы и дрожжи – аспергиллы, пенициллы, ризопус. Продуцентами пектиназы могут быть строгие анаэробы из рода клостридиум. В экспериментальных исследованиях и для генной инженерии большую роль играют рестриктазы. Их выделяют из бактерий, в которых они выполняют защитную роль, разрушая чужеродную ДНК. Следовательно рестриктазы приобретают важное значение в технологии рекомбинантных ДНК. Из более чем 3000 выделенных ферментов только около 20 внедрены в производство. Амилазы применят в хлебопекарне и текстильной промышленности, пептидазы – в мясомолочной и кожевенной промышленности, ряд полиферментных ферментов используют в сельском хозяйстве (глюкаваморин, пектаваморин); в здравоохранении. Бактерии также используют в качестве продуцентов витаминов. Это следующие бактерии: а) пропионовокислые бактерии (витамин В12 – в процессах кроветворения, в обменных процессах, влияет на функции нервной системы); б) микобактерии и ацетонобутиловые бактерии (витамин В2 рибофлавин – применят для лечения дистрофии сетчатки глаза, при заболеваниях печени и поджелудочной железы); Витамины синтезируют и грибы – аспергиллы, актиномицеты, пеницилл, дрожжеподобные грибы (сахаромицеты, кандида) – продуценты эргостерина, предшественника витамина D2, обладающего антирахитическим действием. В организме человека витамины D2 и D3 регулируют усвоение кальция и фосфора из пищи и отложению их в костной ткани. В промышленности микроорганизмы используют для получения антибиотиков. Антибиотики синтезируют бактерии (bacillus – полимиксины, грамицидины, streptococcus – низин, диплококцин, lactobakterium – ацидофилин, лактофилин, бревин). Антибиотики, синтезируемые актиномицетами – стрептомицин, неомицин, гентамицин, каномицин, тетрациклин и др. Антибиотики, синтезируемые мицеллиальными грибами: гриб пеницилл, аспиргилл – пенициллины. Микроорганизмы широко применяются для производства белка. Одним из главных продуцентов белка являются дрожжи – кандида, торулопсис, родоторула. Они содержат от 40 до 80% белка от сухого 87 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 88 из 118 остатка. Первое производство пищевых дрожжей на мелассе возникло в Германии в первую мировую войну. Сырьем для получения дрожжей являются гидролизаты древисины, отходы растительного с.-х. сырья, углдеводороды нефти, н-алканы, барда гидролизно-спиртовых заводов. 3. Принципиальная схема производства полезных веществ Любое микробиологическое производство представляет собой ряд последовательно технологических стадий. Общими для всех производств являются следующие стадии: 1) подготовка питательной среды 2) получение посевного материала 3) выращивание производственной культуры (биосинтез) 4) выделение конечного продукта В каждом конкретном микробиологическом производстве есть свои отличительные особенности на каждой стадии. Сущность принципиальной схемы получения продуктов микробиологического синтеза заключается в разделении культуральной жидкости на микробную массу и фильтрат. Затем из фильтрата путём некоторых манипуляций получают биологически активные вещества различной степени очистки. Если полезное вещество содержится и в микробной массе, то её разрушают (дезинтегрируют) и отделяют клеточную суспензию, т.е. полученный фильтрат обрабатывают также как и первичный фильтрат. При подготовке питательной среды необходимо учесть содержание источников азота и углерода. Это м.б. сахароза, глюкоза, мальтоза. Жиры и масла – источники углерода. Аммонийные соли, нитраты, белки, полипептиды, аминокислоты - источники азо 3 Лабораторные занятия ТЕМА №1: Микробиологическая лаборатория, ее задачи. Устройство микроскопа. Иммерсионная система. Материальное обеспечение: микроскоп для каждого студента; окрашенные препараты различных форм бактерий; иммерсионное масло. Учебные пособия: Таблицы: ход лучей в микроскопе; основные формы бактерий; непостоянные элементы микробной клетки. Учебники: 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.5-21 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.М.,1989.-С.5-21. Целевая установка: ознакомить студентов с морфологией бактерий Основные вопросы по теме лабораторной работы: 88 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 89 из 118 1. Строение бактериальной клетки 2. Формы микроорганизмов 3. Ход лучей в иммерсионной системе 4. Строение микроскопа 5. Правила работы в микробиологической лаборатории Краткое содержание занятия: знакомство со студентами группы, закрепление рабочих мест, назначение дежурного студента. Знакомство с правилами работы в бактериологической лаборатории. Знакомство с учебно-методическим комплексом дисциплины «Микробиология и вирусология». Продемонстрировать основные части микроскопа. По плакату разобрать ход лучей в иммерсионной и сухой системах микроскопа. Демонстрация работы с иммерсионной системой микроскопа. Знакомство с морфологией бактерий. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. После демонстрации преподавателя, дежурный студент раздает каждому студенту по одному готовому (окрашенному) бактериальному препарату. На бактериальный препарат нанести иммерсионное масло . Затем на препарат навести иммерсионный объектив (с черной полосой, увеличение 90) микроскопа, поворачивая револьвер до щелчка, и погрузить его в иммерсионное масло с помощью макрометрического винта. Винт можно поднимать или опускать до появления изображения, не выходя из иммерсионного масла. Увиденную форму бактерий зарисовать в рабочей тетради и обозначить русским и латинским названием. Используя плакат «Основные формы бактерий» зарисовать в тетради основные формы бактерий с обозначением названий на русском и латинском языках. ТЕМА №2: Основные формы микроорганизмов Материальное обеспечение: микроскоп для каждого студента; окрашенные препараты различных форм бактерий; иммерсионное масло. Учебные пособия: Таблицы: ход лучей в микроскопе; основные формы бактерий; непостоянные элементы микробной клетки. Учебники: 1.Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.5-21 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.М.,1989.-С.14-17. Целевая установка: ознакомить студентов с морфологией бактерий Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Строение бактериальной клетки 2. Формы микроорганизмов 3. Ход лучей в иммерсионной системе 4. Строение микроскопа 5. Правила работы в микробиологической лаборатории Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Дежурный студент раздает каждому студенту по четыре готовых (окрашенных) бактериальных препарата под номерами. Задача студента определить форму бактерий. На каждый бактериальный препарат нанести иммерсионное масло (по очереди). Затем на препарат навести иммерсионный объектив (с черной полосой, увеличение 90) микроскопа, 89 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 90 из 118 поворачивая револьвер до щелчка, и погрузить его в иммерсионное масло с помощью макрометрического винта. Винт можно поднимать или опускать до появления изображения, не выходя из иммерсионного масла. Резкость контролируется с помощью микрометрического винта. Увиденные формы бактерий зарисовать в рабочей тетради, определить форму (морфологию), обозначить русскими и латинскими названиями. Студент в обязательном порядке отчитывается перед преподавателем по всем четырем препаратам. ТЕМА №3-4: Краски и красящие растворы. Приготовление бактерийных препаратов. Простой способ окрашивания. Материальное обеспечение: микроскоп для каждого студента; иммерсионное масло, бактериальные петли, предметные стекла, спиртовки, спички, фильтровальная бумага, карандаши по стеклу, краски в растворах, пробирки с культурой на МПА, сенным настоем и капустным (огуречным) рассолом. Демонстрация: краски сухие, реактивы для химической фиксации, фиксажница с водой. Учебные пособия: Таблицы: основные формы бактерий; анатомия микробной клетки. 1.Нецепляев С.В., Панкратов А.Я. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.21-29. 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.21-28. Целевая установка: ознакомиться с красками и методами приготовления их растворов. Научиться готовить и окрашивать бактериальные препараты простым методом. Убедиться в вездесущности микроорганизмов. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Строение бактериальной клетки 2. Формы микроорганизмов 3. Краски, применяемые для окраски бактерий. Техника приготовления. 4. Техника приготовления мазка из культуры выращенной на плотной питательной среде. 5. Сущность простого метода окрашивания бактериальных препаратов. По 3,4,5 вопросам составить конспекты. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия. Беседа о вездесущности микроорганизмов. Ознакомление с техникой приготовления бактерийных препаратов, методами их фиксации и окраски. Демонстрация техники приготовления препаратов, фиксации химическим и физическим способами, техники окраски простым способом. Демонстрация сопровождается беседой о цели и методах фиксации, о принципах приготовления красящих растворов, цели простого метода окраска. Проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. 1-час. Приготовить насыщенный спиртовый раствор фуксина. Для этого краску залить 96% раствором спирта в соотношении 1:10. Для насыщения спиртовый раствор поместить в термостат и выдержать до полного растворения. Затем из насыщенного раствора приготовить карболовый фуксин (Циля). Взять 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 100 мл 5% водного раствора фенола. Второй раствор при постоянном взбалтывании постепенно прилить к первому (а не наоборот). Готовый раствор профильтровать через бумажный фильтр в бутыль из темного стекла. Краску использовать для окрашивания бактериальных препаратов, приготовленных самостоятельно. 90 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 91 из 118 2-час. АКР. После демонстрации техники приготовления и окраски бактериального препарата каждый студент получает культуру, выращенную на плотной питательной среде (МПА), из которой готовит бактериальный препарат, сушит его, фиксирует над пламенем горелки и окрашивает одним из красителей. Приготовленные препараты микроскопировать. Определить морфологию бактерий и зарисовать в рабочую тетрадь и обозначить форму. В тетрадь записать схему: мазок – сушка – фиксация – окраска. ТЕМА №5-6: Сложные методы окраски. Окраска по методу Грама, Циля-Нильсена Материальное обеспечение: микроскоп для каждого студента; иммерсионное масло, бактериальные петли, предметные стекла, спиртовки, спички, фильтровальная бумага, карандаши по стеклу, пробирки со смесью (смыв) культур кишечной палочки и стафилококка, стерильные тампоны (спички) для приготовления мазков из зубного налета. Краски для метода Грама. Препарат, окрашенный по методу Циля-Нильсена для демонстрации. Учебные пособия: Таблицы: окраска по методу Грама; окраска по методу Циля-Нильсена; химический состав бактерий; анатомия клетки. Учебники: 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.29-31, 34-35. 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.26-27,29-31. Целевая установка: уяснить сущность дифференциальных методов окраски. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Строение бактериальной клетки. 2. Химический состав микробной клетки. 3. Сущность сложных методов окраски бактериальных препаратов. 4. Строение клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных бактерий. 5. Техника окраски по методу Грама. 6. Сущность окраски по методу Циля-Нильсена. По 3,4,5,6 вопросам составить конспект в рабочей тетради для лабораторных занятий. 1 и 2 вопросы повторить. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, опрос по текущей теме, проверка конспектов; демонстрация техники окраски по методу Грама, выяснение сущности и значения этого метода при определении вида микроорганизмов, диагностике инфекционных болезней, по демонстрационному препарату - разбор сущности и техники окраски препаратов по методу Циля-Нильсена; проведение аудиторной контрольной работы по усвоению метода Грама.. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. 1. Приготовить бактерийные препараты из смеси культур, зубного налета и окрасить по методу Грама. Окрашенные препараты просмотреть под микроскопом, микроскопическую картину зарисовать в рабочую тетрадь (рисунки должны быть цветными) и подписать. Подчеркнуть значение этого метода при определении вида микроорганизмов. 2. Изучить демонстрационный препарат, окрашенный по методу Циля-Нильсена. Микроскопировать. Зарисовать и обозначить. Подчеркнуть значение этого метода. 91 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 92 из 118 ТЕМА №7: Сложные методы окраски. Методы выявления спор, капсул. Материальное обеспечение: микроскоп для каждого студента; иммерсионное масло, бактериальные петли, предметные стекла, спиртовки, спички, фильтровальная бумага, карандаши по стеклу. Демонстрационный мазок с окрашенными спорами. Набор красок для окраски спор по методу Виртца (бумага пропитанная малахитовой зеленью и сафранином). Препараты, приготовленные из органов мышки павшей от сибирской язвы и окрашенные по методу Ольта. Учебные пособия: Таблицы: непостоянные элементы микробной клетки; окраска спор и капсул; анатомия микробной клетки. Учебники: 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.31-34. 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.27-28,31-31. Целевая установка: уяснить сущность и значение окраски спор, капсул. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Строение бактериальной клетки 2. Сущность методов окраски спор 3. Сущность методов окраски капсул 4. Значение непостоянных элементов в лабораторной практике Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, опрос по текущей теме, проверка конспектов, демонстрация техники окраски спор и капсул; выяснение сущности окраски спор и капсул и значения при определении вида микроорганизмов, диагностике инфекционных болезней. Проведение аудиторной контрольной работы по усвоению методов обнаружения спор и капсул. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Изучить готовые бактериальные препараты, окрашенные по методу Ольта с целью обнаружения капсул. Микроскопировать и зарисовать 1. Готовые препараты окрасить по методу Виртца, для обнаружения спор. Микроскопировать, зарисовать. Обозначить. Окраска по методу Виртца. На мазок положить бумагу, пропитанную малахитовой зеленью. Смочить дистиллированной водой. Нагревать 3-4 раза в течение 7 минут до появления паров периодически снимая с огня. Краску смыть и нанести на препарат бумагу, пропитанную раствором сафранина. Смочить дистиллированной водой и красить 45 секунд. Смыть водой. Просушить фильтровальной бумагой. ТЕМА №8: Определение подвижности бактерий Материальное обеспечение: микроскоп для каждого студента; иммерсионное масло,бактериальные петли, предметные стекла, предметные стекла с луночками, покровные стекла, вазелин спиртовки, спички, фильтровальная бумага, карандаши по 92 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 93 из 118 стеклу, краски в растворах. Смыв с бульонной культуры кишечной палочки. Демонстрация подвижности бактерий в «темном поле» микроскопа. Готовые препараты окрашенные по методу Морозова. Учебные пособия: Таблицы: непостоянные элементы микробной клетки; анатомия микробной клетки. Учебники: 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.39-42. 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.32-34. Целевая установка: освоить технику определения подвижности микробов. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. На какие группы делятся микроорганизмы в зависимости от расположения и количества жгутиков? Зарисовать. 2. Методы обнаружения подвижности микробов: метод «висячая капля»; метод «раздавленная капля»; прямые методы обнаружения жгутиков (окраска по Морозову). 3. Функции жгутиков. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, изучение демонстрационного препарата, приготовленного по методу «раздавленная капля»; демонстрация метода «висячая капля»; проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. 1. Изучить подвижность микроорганизмов методом «раздавленная капля» в темном поле микроскопа по демонстрационному препарату. 2. Изучить мазок, окрашенный по методу Морозова. Микроскопировать. Зарисовать. 3. Приготовить препарат «висячая капля». Микроскопировать. ТЕМА №9: Морфология плесневых грибов Материальное обеспечение: ДЛЯ ДЕМОНСТРАЦИИ – микроскопы с готовыми препаратами плесневых грибов, дрожжей и актиномицет; три вида плесневых грибов (пеницилл, аспергилл, мукор) на хлебе. Микроскопы, предметные стекла, покровные стекла, препаровальные иглы, бактериальные петли, спиртовки, спички, физраствор, иммерсионное масло. Учебные пособия: Таблицы: морфология плесневых грибов, актиномицет и дрожжей; строение дрожжевой клетки, актиномикоз у крупного рогатого скота. Учебники: 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.42-53. 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.34-43. 93 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 94 из 118 Целевая установка: ознакомится с морфологией грибов и техникой их микроскопического исследования. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Основные виды плесневых грибов (аскомицеты, мукоровые грибы), их строение и морфология, способы размножения. 2. Несовершенные грибы (кладоспориум, молочная плесень, альтернария, катенулярия, фома), их строение и морфология, способы размножения. 3. Практическое значение плесневых грибов, несовершенных грибов, в биотехнологии. Использование продуктов жизнедеятельности. В рабочей тетради дать письменные ответы на поставленные вопросы и сделать схематические зарисовки морфологии плесневых грибов (пеницилл, аспергилл, мукор), несовершенных грибов (кладоспориум, молочная плесень, альтернария, катенулярия, фома)– представителей многоклеточных и одноклеточных организмов Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, опрос по текущей теме, проверка конспектов, изучение морфологии плесневых грибов по демонстрационным препаратам, изучение готовых препаратов актиномицет и дрожжей, демонстрация преподавателем техники приготовления препаратов из плесневых грибов, самостоятельное приготовление препаратов из плесневых грибов, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: Ход выполнения АКР. 1 час. Изучить демонстрационные препараты плесневых грибов, расположенных под номерами (№1, №2, №3), приготовленные лаборантом, сопоставить с табличным материалом. В процессе дискуссии определить принадлежность гриба к определенному роду. Дежурный студент раздает по два готовых бактериальных препарата каждому студенту, где они изучают морфологию дрожжей и актиномицет. Делают зарисовки увиденной картины. Препараты можно смотреть под объективом на 40. 2 час. Рассмотреть три вида плесневых грибов, выращенных на хлебе. Изучить культуральные свойства грибов. Затем из каждого гриба приготовить с помощью бактериальных игл препараты на предметном стекле, накрыть покровным стеклом и рассматривать под объективом на 40 в затемненном поле микроскопа. Зарисовать. Для того чтобы определить род гриба необходимо найти плодоносящую часть гриба и сопоставить с табличным материалом. ТЕМА №10: Морфология дрожжей и актиномицет Материальное обеспечение: ДЛЯ ДЕМОНСТРАЦИИ – микроскопы с готовыми препаратами плесневых грибов, дрожжей и актиномицет; три вида плесневых грибов (пеницилл, аспергилл, мукор) на хлебе. Микроскопы, предметные стекла, покровные стекла, препаровальные иглы, бактериальные петли, спиртовки, спички, физраствор, иммерсионное масло. Учебные пособия: Таблицы: морфология плесневых грибов, актиномицет и дрожжей; строение дрожжевой клетки, актиномикоз у крупного рогатого скота. Учебники: 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.42-53. 94 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 95 из 118 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.34-43. Целевая установка: ознакомится с морфологией грибов и техникой их микроскопического исследования. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Строение и морфология дрожжей, способы размножения. 2. Строение и морфология актиномицет, способы размножения. 3. Практическое значение плесневых дрожжей, актиномицет в биотехнологии. Использование продуктов жизнедеятельности. В рабочей тетради дать письменные ответы на поставленные вопросы и сделать схематические зарисовки морфологии дрожжей и актиномицет – представителей многоклеточных и одноклеточных организмов Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, опрос по текущей теме, проверка конспектов, изучение морфологии плесневых грибов по демонстрационным препаратам, изучение готовых препаратов актиномицет и дрожжей, демонстрация преподавателем техники приготовления препаратов из плесневых грибов, самостоятельное приготовление препаратов из плесневых грибов, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: Ход выполнения АКР. 1 час. Изучить демонстрационные препараты плесневых грибов, расположенных под номерами (№1, №2, №3), приготовленные лаборантом, сопоставить с табличным материалом. В процессе дискуссии определить принадлежность гриба к определенному роду. Дежурный студент раздает по два готовых бактериальных препарата каждому студенту, где они изучают морфологию дрожжей и актиномицет. Делают зарисовки увиденной картины. Препараты можно смотреть под объективом на 40. 2 час. Рассмотреть три вида плесневых грибов, выращенных на хлебе. Изучить культуральные свойства грибов. Затем из каждого гриба приготовить с помощью бактериальных игл препараты на предметном стекле, накрыть покровным стеклом и рассматривать под объективом на 40 в затемненном поле микроскопа. Зарисовать. Для того чтобы определить род гриба необходимо найти плодоносящую часть гриба и сопоставить с табличным материалом. ТЕМА № 11 Лабораторная аппаратура. Методы стерилизации Материальное обеспечение: автоклавы, стерилизатор со шприцами и инструментами, печь Пастера, аппарат Коха, фильтры зейтца, ручной насос Комовского, лабораторная посуда( пипетки градуированные и пастеровские, чашки Петри, ступки, пестики, бюксы, пробирк, вата, марля,бумага, нарезанная для завкртывания чашек Петри и пипеток. Учебные пособия: Таблицы: мезофиллы, психрофилы, термофилы Учебники: 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.53-67. 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.43-52. 95 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 96 из 118 Целевая установка: разобрать методы стерилизации (сухим жаром, влажным жаром). Ознакомиться с устройством и правиламит работы основных приборов, используемых для «горячей» и «холодной» стерилизации. Уяснить понятия «дезинфекция», «асептика» и «антисептика». Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Понятия «стерилизация», «дезинфекция», «асептика», «антисептика», «пастеризация». 2. Методы влажной стерилизации (кипячении, стерилизация паром под давлением, дробная стерилизация – текучим паром и тиндализация). 3. Устройство автоклава и правила работы с ним. 4. методы сухой стерилизации ( прокаливание на огне, стерилизация в печах Пастера). 5. Механическая стерилизация (фильтрование – фильтры Зейтца, свечи Шамберлана, свечи Беркефельда). Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, разбор методов стерилизации. Демонстрация оборудования, используемого для стерилизации (автоклавы, сушильные шкафы, УФЛ) – экскурсия в лабораторию кафедры. Проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Подготовить посуду к стерилизации – пипетки, чашки Петри, предметные стекла, колбы. Приготовить ватно-марлевые пробки. Провести стерилизацию пинцетов и ножниц методом кипячения. ТЕМА №: 12 Антибиотики и бактериофаги Материальное обеспечение: посевы на скошенный МПА с прошлого занятия, чашка Петри с МПА, пастеровская пипетка, стакан с дезраствором, карандаш по стеклу, краски в растворах. Набор дисков с антибиотиками, пинцеты. Чашка с демонстрацией действия антибиотиков. Учебные пособия: Таблицы: Метод диффузии в агар, метод серийных разведений. Учебники: Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.80-88. Целевая установка: уяснить механизм действия антибиотиков на микроорганизмы, ознакомиться с методами определения активности антибиотиков, чувствительности и устойчивости к ним (метод диффузии в агар и метод серийных разведений) микробов. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1.Классификация антибиотиков. Общая характеристика каждой группы. 2. Механизм действия антибиотиков на микроорганизмы. Единица действия антибиотиков. 3. Методы определения активности антибиотиков. 4. Селекция антибиотикоустойчивых штаммов. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, беседа по вопросам темы, разбор демонстрационного материала, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. 96 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 97 из 118 Проверить чистоту выделенной культуры на МПА. Для этого приготовить мазок, окрасить по методу Грама, микроскопировать. Затем приготовить смыв культур, путем добавления в пробирку 2 мл физраствора. Пастеровской пипеткой(или обычной градуированной) провести посев культуры на МПА в чашке Петри. После чего на поверхность посева разложить диски с антибиотиками. Ход работы зафиксировать в рабочей тетради. Бактериофаги Материальное обеспечение: Чистые культуры, по две пробирки с МПБ, пастеровские пипетки, сальмонеллезный фаг (колифаг), одна чашка с посевом на МПА для демонстрации действия фага. Микроскоп для каждого студента; иммерсионное масло, бактериальные петли, предметные стекла, спиртовки, спички, фильтровальная бумага, карандаши по стеклу, краски в растворах. Учебные пособия: Таблицы: строение фага, механизм действия фага. Учебники: Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.80-88. Целевая установка: уяснить механизм действия бактериофагов на бактерии. Усвоить методику определения их активности. практическое использование фага, диагностическое значение реакции нарастания титра фага Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Строение бактериофага. 2. Механизм действия бактериофага, специфичность его действия. 3. Определить понятия «умеренный фаг», «лизогенный фаг». 4. Практическое использование бактериофагов. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, опрос по вопросам темы, изучение демонстрационного препарата, демонстрация преподавателем определения вида микроба с помощью бактериофага на плотной (методом дорожки) и жидкой среде, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Посеять чистую культуру (при наличии достаточного времени сделать мазок и окрасить по методу Грама) на две пробирки с МПБ, затем в первую пробирку внести фаг (соответствующий), вторая пробирка останется контрольной. Учет результатов на следующем занятии. Тема № 13: Коллоквиум по лекционному материалу Вопросы для коллоквиума 1.Предмет и задачи микробиологии и вирусологии. 2.Роль ученых в развитии микробиологической науки. 3.Строение бактериальной клетки. 4.Строение актиномицет и их практическое значение. 5.Строение плесневых грибов, их практическая значимость. 6.Характеристика непостоянных компонентов бактерий: спора, капсула, жгутики, пили. 7.Принципы классификации и таксономии микроорганизмов. Понятие: вид, штамм, клон, культура, чистая культура. 8.Строение дрожжей, их практическая значимость. 97 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 98 из 118 9. Полезные и вредные свойства микроорганизмов. 10. Химический состав микробной клетки. 11. Способы размножения плесневых и дрожжевых грибов. 12. Действие физических факторов на микроорганизмы. 13. Действие химических веществ на микроорганизмы. бактериостатическом и бактерицидном действии. Дезинфекция. Понятие о ТЕМА № 14: Коллоквиум по темам лабораторных занятий Вопросы для коллоквиума 1. Морфология прокариот. Размеры и единицы измерения. 2. Методы обнаружения непостоянных компонентов бактерий: спор, капсул, жгутиков. 3. Тинкториальные свойства микроорганизмов. Окраска по методу Грама. Сущность метода. 4. Окраска по методу Циля-Нильсена. Сущность метода. 5. Питательные среды и требования, предъявляемые к ним. Классификация питательных сред. 6. Порядок приготовления питательных сред – МПА, МПБ, МПЖ.. 7. Культивирование аэробов и анаэробов. 8. Методы выделения чистой культуры. 9. Стерилизация. Методы стерилизации. 10. Устройство автоклава и принцип его работы. ТЕМА № 15: Приготовление питательных сред Материальное обеспечение: образцы питательных сред: плотные, жидкие, полужидкие. Обычные, специальные, дифференциальные (Эндо, среды Гисса). Ингредиенты питательных сред (МПА, МПБ, Эндо) – мясная вода, пептон, сухой агар. Колбы, пробирки с пробками, чашки Петри стерильные, дистиллированная вода, рН – метр, весы, разновесы Учебные пособия: Таблицы: классификация питательных сред. Требования, предъявляемые к питательным средам. Учебники: Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.М.,1989.-С.52-60. Целевая установка. Разобрать технику приготовления МПА, МПБ, МПЖ. Самостоятельно приготовить агар Эндо и МПБ из сухих питательных сред. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Характеристика и классификация питательных сред. 2. Требования, предъявляемые к питательным средам. 3. Техника приготовления питательных сред (МПА, МПБ, МПЖ). Их стерилизация. 4. Среды, применяемые для культивирования дрожжей и плесневых грибов, анаэробов, молочно-кислых бактерий. 5. Среды для исследования объектов внешней среды. 98 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 99 из 118 6. Механизм и источники питания микроорганизмов. Первые пять вопросов конспектировать. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, беседа по вопросам темы занятия, демонстрация ингредиентов и готовых питательных сред, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Приготовить 100 мл мясо-пептонного бульона и 100 мл агара Эндо из сухих сред и с помощью преподавателя определить рН среды. Разлить МПБ в пробирки, агар Эндо – в чашки Петри. Нарисовать схему приготовления питательных сред. ТЕМА № 16: Методы получения чистой культуры. Культивирование аэробов и анаэробов Материальное обеспечение: Чашки Петри с МПА для каждого студента, пробирки с бактериальной куьтурой для посева, пробирка со стерильным физраствором и ватным тампоном на палочке, бактериологические петли, спиртовки, стерильные пастеровские пипетки, стерильный шпатель, карандаши по стеклу, взвесь смешанных культур микроорганизмов. Среда Китта-Тароццы. Учебные пособия: Таблицы: характер роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. Учебники: 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.68-86, 86-93. 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.43-52,67-70. Целевая установка. Уяснить понятия «чистая культура», «микробная культура», «аэробы», «анаэробы», «микроаэрофилы», «факультативные анаэробы». Разобрать основные методы получения чистых культур и способы создания анаэробных условий для культивирования анаэробов. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Понятия «чистая культура», «микробная культура», «аэробы», «анаэробы», «микроаэрофилы», «факультативные анаэробы». 2. Методы выделения чистой культуры (механические, физические, химические, биологические). Их преимущества и недостатки. 3. Культивирование аэробов (термостат, принцип его работы). 4. Культивирование анаэробов. Методы создания анаэробных условий. Все вопросы конспектировать. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия. Беседа по вопросам темы, где преподаватель акцентирует внимание на необходимость выделения культур микробов одного вида, демонстрирует способы создания анаэробных условий. Проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР . Задание 1.Одна группа студентов готовит смывы с объектов внешней среды, другая – с поверхности кожи и делают посевы на МПА в чашках Петри. Третья группа производит посевы на МПА в чашках Петри из воздуха. Задание 2. Из микробной и чистой культур приготовить мазки. Окрасить по методу Грама. Микроскопировать. Зарисовать. ТЕМА № 17: 99 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 100 из 118 Культуральные свойства микроорганизмов Материальное обеспечение: микроскоп для каждого студента; иммерсионное масло, бактериальные петли, предметные стекла, спиртовки, спички, фильтровальная бумага, карандаши по стеклу, краски в растворах, каждрму студенту чашка Петри со своими посевами с прошлого занятия. Пробирки с МПА, МПБ. Демонстрация роста микробов на различных питательных средах. Учебные пособия: Таблицы: колонии разных видов микробов; свойства культур из R - и S - колоний Учебники: 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.94-97. 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.70-74. Целевая установка: изучить рост микроорганизмов на плотных (МПА), жидких (МПБ), полужидких (МПЖ) питательных средах Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Характер роста бактерий на плотных питательных средах 2. Характер роста бактерий на жидких питательных средах 3. Характер роста бактерий на полужидких средах 4. Что такое «колония», «чистая культура», «смешанная культура», «вид», R - и Sформы бактерий? Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, беседа по основным вопросам темы, демонстрация роста различных видов микробов на МПА, МПБ, агаре Эндо и техники пересева изолированной колонии на скошенный МПА, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Студенты получают посевы на чашках Петри с предыдущего занятия и изучают характер роста микробов, выделенных из разных объектов, на МПА. Выбирают отдельно выросшую колонию и описывают ее свойства. Желательно выбрать две колонии R- и Sформы и указать на различия в их свойствах. Затем из описанной колонии делают посевы на скошенный МПА и МПБ и готовят бактерийный препарат. Препарат окрашивают по методу Грама, Микроскопируют, определяют морфологию и тинкториальные свойства, зарисовывают ТЕМА № 18: Ферментативные свойства микроорганизмов. Определение вида микроорганизмов Материальное обеспечение: микроскоп для каждого студента; иммерсионное масло, бактериальные петли, предметные стекла, спиртовки, спички, фильтровальная бумага, карандаши по стеклу, краски в растворах, набор сред для определения сахаролитических (пестрый ряд) и протеолитических (МПБ, индикаторные бумаги на индол и сероводород) свойств. Демонстрация посевов микробов, обладающих протеолитическими, сахаролитическими, гемолитическими и редуцирующими свойствами. Чистые культуры на скошенном МПА, выделенные студентами на предыдущем занятии. Учебные пособия: Таблицы: рост микробов (E. coli, Salmonella) на средах Гиса, агаре Эндо. Классификация микробных ферментов Учебники: 100 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 101 из 118 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.97-103. 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.74-80. Целевая установка: изучить сахаролитические, протеолитические, гемолитические, редуцирующие свойства микроорганизмов. Ознакомиться с питательными средами для изучения перечисленных свойств и учетом результатов. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Классификация ферментов. Их значение в жизни микроорганизмов. 2. Значение ферментативной активности микробов в лабораторной практике. 3. Определение сахаролитических свойств. Питательные среды. Учет результатов. 4. Определение протеолитических свойств. Питательные среды. Учет результатов. 5. Определение гемолитических свойств. Питательные среды. Учет результатов. 6. Определение редуцирующих свойств. Питательные среды. Учет результатов. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, беседа по основным вопросам темы (акцентировать внимание на роль микробных ферментов при определении вида и ферментах как факторах вирулентности микроорганизмов), демонстрация ферментативной активности различных микроорганизмов, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР . Из чистых культур микроорганизмов произвести посев на пестрый ряд (среды Гисса) и МПБ для определения ферментативных свойств. В пробирку с МПБ под пробку вставить индикаторные бумажки на индол и сероводород. На втором занятии в ходе АКР студенты анализируют результаты посевов на пестрый ряд и МПБ. Определяют сахаролитические и протеолитические свойства микробов. Самостоятельно изучают редуцирующие и гемолитические свойства микробов на метиленовом и лакмусовом молоке и на агаре с кровью, соответственно. Результаты заносят в тетрадь в виде таблицы (С.102 – Нецепляев С.В.) и делают заключение о ходе определения вида микроорганизма. ТЕМА №: 19-20 Характеристика микроорганизмов, вызывающих разные типы брожений Целевая установка: ознакомиться с возбудителями спиртового, молочнокислого брожения, уксуснокислого, маслянокислого и ацетонобутилового брожений. Материальное обеспечение:. дрожжевые культуры (суточная, двухсуточная, недельная), пробы молочнокислых продуктов (сметана, йогурт, сметана, творог), сок квашеной капусты. центрифуга, пипетки, предметные стекла, красители для метода Грама, бактериальные петли, микроскоп. Плакаты: строение дрожжевой клетки, спиртовое брожение Учебные пособия: Таблицы: виды брожений Учебники: 101 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 102 из 118 1.Жвирблянская А.Ю. Микробиология в пищевой промышленности. – М.,1975. – С. 114-122, 122-123. 2. Промышленная микробиология. Под ред. Н.С.Егорова. – М.,1989. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Брожение. Определение понятия. Брожение в спирт, молочную, пропионовую, масляную кислоту, ацетон. Двухфазность брожений. 2. Характеристика микроорганизмов, вызывающих разные типы брожений (спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое, маслянокислое и ацетоно-бутиловое брожения). 3. Использование возбудителей брожений в народном хозяйстве Краткое содержание занятия: Назначение дежурного, опрос по вопросам темы, приготовление мазков из культур дрожжей и молочнокислых продуктов. Микроскопия. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. ЗАДАНИЕ. Приготовить мазки из суточной, двухсуточной и недельной дрожжевых культур. Окрасить простым способом. Микроскопировать и зарисовать. Обратить внимание на наличие делящихся дрожжевых клеток в зависимости от срока культивирования. Сделать выводы. ЗАДАНИЕ. Приготовить от двух до четырех мазков из молочнокислых продуктов и капустного сока. Окрасить по методу Грама. Микроскопировать. Изучить морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов. Зарисовать. Сделать заключение о возбудителе молочнокислого брожения того или иного продукта и качестве продукта. Результаты занести в таблицу. ЗАДАНИЕ. По готовым препаратам и учебным пособиям изучить морфологию и тинкториальные свойства возбудителей уксуснокислого, маслянокислого и ацетонобутилового брожений. Зарисовать в тетради. Вид брожения Название возбудителя Морфология Тинкториальные свойства Спиртовое Молочнокислое Уксуснокислое Маслянокислое ТЕМА №: 21 Хранение промышленных культур Целевая установка: ознакомиться с методами хранения микробных культур Материальное обеспечение:.музей микробных культур в микробиологической лаборатории. Учебные пособия: Таблицы: методы выделения чистых культур Учебники: 102 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 103 из 118 1. Промышленная микробиология. Под ред. Н.С.Егорова. – М.,1989. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. 2. 3. 4. 5. Метод субкультур или пересева. Метод замораживания. Метод лиофилизации. Хранение под вазелиновым маслом. Хранение отдельных групп микроорганизмов. Краткое содержание занятия: Назначение дежурного, опрос по вопросам темы. Преподаватель для закрепления материала по методам хранения микроорганизмов показывает, каким образом хранятся микробные культуры в условиях учебной микробиологической лаборатории. 1. Большинство бактериальных культур сохраняются методом субкультур или пересева – один раз в три месяца. 2. Микроскопические грибы – методом замораживания. 3. Анаэробные микроорганизмы – под маслом. 4. Вакцины, сыворотки – в лиофилизированном состоянии. Самостоятельная работа: ход выполнения Осваить один из самых распространенных методов хранения микробных культур – метод субкультур или периодического пересева. Для этого студенты получают одну или две музейные культуры, которые они самостоятельно пересевают на скошенный мясо-пептонный агар. ТЕМА № 22-23: Микробиологическое исследование воды, воздуха и почвы Материальное обеспечение: микроскоп для каждого студента; иммерсионное масло, бактериальные петли, предметные стекла, спиртовки, спички, фильтровальная бумага, карандаши по стеклу, краски в растворах. Посевы почвы в чашке на полосках фильтровальной бумаги со стеклом (Среда Виноградского) на наличие азотобактера. Аппарат Кротова и одна чашка с МПА. Набор среды Булира. Один набор с посевом, второй стерильный, пипетки стерильные на 1.2,5 мл и мензурки. Фильтр Зейтца, стерильные нитроцеллюлозные фильтры. Чашка Петри со средой Эндо. Вода речная в колбе. Цилиндры для взятия проб воды водопроводной. Для каждого студента чашка Петри с МПА. Насос Камовского. Учебные пособия: Таблицы: санитарная оценка воды, почвы, воздуха. Учебники: 1. Нецепляев С.В. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения. – М.,1990. – С.103-121. 2. Костенко Т.С. и др. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии.- М.,1989.-С.99-104. 103 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 104 из 118 3. Санитарная микробиология/Под.ред.С.Я.Любашенко. – М.,1980.- С.134-136, 147148, 152-153. Целевая установка: усвоить правила отбора проб воды, почвы и овладеть бактериологическими методами определения микрофлоры воды, воздуха и почвы. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Микрофлора воды, воздуха и почвы. 2. Санитарно-показательные микроорганизмы. Требования, предъявляемые к ним. 3. Характеристика санитарно-показательных микроорганизмов (кишечная палочка, гемолитический стрептококк) 4. Определение ОМЧ, коли-титра, коли-индекса. 5. Методы санитарно-бактериологической оценки воды, почвы, воздуха. 6. Нормативы по содержанию микробов в 1мл воды, в 1г почвы, в 1м воздуха. Коли-индекс, коли-титр воды, почвы. Содержание гемолитических стрептококков в 1 м воздуха. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, беседа со студентами о микроорганизмах почвы. воды и воздуха, о санитарном значении микробов и методах санитарно-бактериологической оценки почвы, воздуха и воды. Преподаватель демонстрирует определение коли-титра методом Булира и коли-индекса методом мембранных фильтров на среде Эндо, а также производит посев из воздуха с помощью аппарата Кротова. Проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. 1. Дежурному студенту продемонстрировать порядок взятия проб водопроводной воды. Из водопроводной (речной) воды приготовить разведения 1:10, 1:100, 1:1000 и произвести посев на чашки Петри с МПА. Посевы поместить в термостат для культивирования на 24 ч. Общее микробное число посчитать на следующее занятие по формуле: ОМЧ=число выросших колоний Х на степень разведения. 2. Приготовить мазки из посевов почвы для определения азотобактера, окрасить простым способом, микроскопировать, зарисовать. 3. Каждому студенту сделать посев из воздуха на чашки Петри С МПА для определения ОМЧ воздуха. Посевы поместить в термостат для культивирования на 48 ч при температуре 37 С. ОМЧ воздуха определяют по формуле. ОМЧ=число выросших колоний х 100 : 78,5 х 100, где 78,5 –площадь чашки Петри 4. Под контролем преподавателя студенты осваивают метод мембранных фильтров для определения коли-индекса. ТЕМА № 24: Техника безопасности и правила работы с вируссодержащим материалом. Методы индикации вирусов Материальное обеспечение: помещение вирусологической лаборатории, люминесцентный микроскоп, центрифуги, журнал регистрации студентов, получивших инструктаж по технике безопасности при работе в вирусологической лаборатории. Пипетки, груши, стаканы для слива, пробирки под резиновыми пробками , пробирки, матрасы вируссодержащим материалом. Емкость с дезинфицирующим раствором для отработанных пипеток. Учебные пособия: Таблицы: основные свойства вирусов; строение вирусов. Учебники: Троценко Н.И. и др. Практикум по ветеринарной вирусологии. - М.,1989.-С.3-15. 104 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 105 из 118 Целевая установка: Ознакомиться с природой вирусов и их основными свойствами. Значение вирусов в медицине, ветеринарии, биотехнологии. Ознакомить студентов с правилами и техникой безопасности при работе с вирусологическим материалом. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Устройство и оснащение вирусологической лаборатории. 2. Техника безопасности и правила работы в вирусологической лаборатории. 3. Хранение вирусов (консервирование) и других материалов, учет и этикировка их в лаборатории 4. Основные свойства вирусов. Значение вирусов. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, знакомство с вирусологической лабораторией и правилами работы в ней, методами консервирования вирусов, основными свойствами вирусов и их практическом значении, демонстрация работы с пипеткой и грушей, отработка навыков работы с пипеткой и грушей, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Студенты отрабатывают навыки работы с пипеткой и грушей, путем набирания вируссодержащей суспензии из одной пробирки и переноса ее в другую. Далее письменно отвечают на вопрос об основных свойствах вирусов. Обратить внимание на градуировку пипеток. Бывают пипетки на 1 мл, 2мл, 5 мл, 10 мл. Работать с вируссодержащим материалом можно только с помощью груши, соединенной резиновым шлангом с пипеткой. Брать пипетку в рот нельзя!!! Работать, переносить вируссодержащий материал следует над пламенем горелки. По окончании работы вымыть руки с мылом. Раздаточный материал для усвоения темы Техника безопасности в вирусологической лаборатории 1.В лаборатории разрешается работать только в специальной одежде – халате и шапочке. При работе с особо опасным материалом дополнительно одевают резиновые перчатки, марлевую маску и защитные очки. В боксе работают в стерильном халате, маске, шапочке, при необходимости надевают резиновые перчатки и очки. Обязательно меняют обувь. В виварии во время мытья посуды и уборки на халаты надевают передник, а на ноги – резиновые сапоги. 2. Запрещается выходить за пределы лаборатории в халатах или надевать верхнюю одежду на халат. 3. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу. 4. Не допускается хождение, разговоры во время работы. 5. Весь материал, поступающий в лабораторию на анализ, должен рассматриваться как инфицированный. 6. При распоковке материала необходимо соблюдать осторожность – банки следует обтирать снаружи дезинфицирующим раствором и ставить их на подносы или в кюветы. 7. переливание жидкостей, содержащих вирусы, производят над сосудом, наполненным дезинфицирующим раствором. 8. В случае попадания заразного материала на халат, руки, стол, обувь и т.д. надо сообщить об этом заведующему лабораторией (в учебных помещениях – преподавателю) и немедленно произвести под его контролем дезинфекцию. При подозрении на заражение необходимо обратиться к врачу. 9. Зараженный материал подлежит обязательному уничтожению (автоклавирование, сжигание) по возможности в тот же день. Инструменты, а также поверхность рабочего стола после работы сразу же дезинфицируют. 105 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 106 из 118 10. При работе с пипетками (разлив жидкого инфицированного материала) пользуются резиновыми баллончиками (грушами) небольшого объема. 11. В журнале регистрации ежедневно делают записи относительно использованного заразного материала и его уничтожения. 12. Запрещается выносить из лаборатории оборудование, инвентарь, материалы без предварительной дезинфекции их на месте. 13. Пипетки, предметные и покровные стекла и другую посуду, бывшую в употреблении, обеззараживают, погружая в 5% раствор лизола, фенола или серной кислоты, которые всегда должны быть на столах. 14. Запрещается оставлять на рабочих местах бактериологические чашки, пробирки и другую посуду с заразным материалом. 15. По окончании работы рабочее место приводят в порядок и тщательно дезинфицируют. Вируссодержащий материал, необходимый для дальнейшей работы, ставят на хранение в сейф-холодильник и опечатывают. Руки тщательно дезинфицируют (мыльный спирт, 70-ный спирт). Лаборатории закрывают и опечатывают. Правила работы с вируссодержащим материалом и техникой безопасности (при работе студентов на кафедре) При работе с вируссодержащим материалом необходимо обеспечить выполнение следующих требований: - не допускать рассеивания вирусов во внешней среде; - предотвратить контаминацию (загрязнение) вируссодержащего материала посторонней микрофлорой; -обеспечить личную безопасность. Для выполнения этих требований необходимо соблюдать следующие правила работы: 1) необходимо быть очень внимательными, собранными и аккуратными; 2) входить в помещение лаборатории и выходить из него только в халате, переодеваясь в гардеробе; 3) работать только в халате с застегнутыми манжетами, шапочке и марлевой маске; 4) в лаборатории строго соблюдать чистоту и порядок. На рабочем столе не должно быть никаких посторонних предметов. Запрещается курить и принимать пищу. 5) Материалы и инструменты для работы дежурный по группе получает у лаборанта кафедры и раздает студентам; 6) Пользоваться только стерильными инструментами и посудой; 7) Открывать и закрывать сосуды (пробирки, флаконы чашки и т.д.) у пламени горелки; 8) Не брать пипеток в рот; 9) Отработанные инструменты, включая шприцы (в разобранном виде), складывать в стерилизатор для последующего обезвреживания и кипячения; 10) отработанные пипетки собирать в сосуд с дезинфицирующим раствором; 11) твердые и жидкие отходы (вата, бумага) собирать в специально приспособленные контейнеры для последующей стерилизации; 12) запрещается выливать или сбрасывать отходы в унитазы и раковины; 13) если студент случайно разольет вируссодержащий материал, он обязан немедленно сообщить об этом преподавателю и вместе с ним обеззаразить рабочее место; 14) в конце занятия студент должен привести в порядок свое рабочее место, сдать дежурному весь материал и инструменты, вымыть руки с мылом. Методы прямого обнаружения вирусов в патологическом материале. 106 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 107 из 118 Материальное обеспечение: микроскоп для каждого студента; иммерсионное масло,бактериальные петли, предметные стекла, спиртовки, спички, фильтровальная бумага, карандаши по стеклу, краски по методу Морозова, готовые мазки для каждого студента, демонстрационные препараты – тельца Бабеша-Негри, элементарные тельца. Учебные пособия: Таблицы: схема окраски по методу Морозова; тельца Бабеша- Негри в нейронах, тельца включения при оспе. Учебники: Троценко Н.И. и др. Практикум по ветеринарной вирусологии. - М.,1989.-С.315. Целевая установка: Ознакомиться с методами прямого обнаружения вирусов в патологическом материале (электронная, люминесцентная микроскопия, обнаружение телец-включений, окрашивание препаратов по методу Морозова). Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Что такое вирионы и как их обнаружить? Сущность электронной и люминесцентной микроскопии. 2. Структура и форма вирионов. 3. Что такое вирусные тельца-включения и как их обнаружить? 4. Классификация телец-включений. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, беседа по вопросам темы, демонстрация окраски по методу Морозова для обнаружения элементарных частиц, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Для окраски элементарных телец студенты осваивают метод Морозова М.А.(существуют и другие методы по Пашену, Гербцергу Муровцеву, Романовскому_Гимза). Окрашивают готовые препараты из оспенного материала, Микроскопируют, картину зарисовывают. Окраска по Морозову применяется в процессе диагностики оспы, эктимы овец. Окраска по Морозову Реактив №1 (фиксатор-жидкость Руге): 2 мл 40% формальдегида, продажный формалин), 1 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды. Реактив №2 (протравитель): 5 г танина, 2 мл жидкого фенола; 100 мл дистиллированной воды. Реактив №3 (краситель): 5 г азотно-кислого серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, затем осторожно по каплям добавляют раствор аммиака (25%) до появления легкой опалесценции. Перед применением его разводят дистиллированной водой 1:10. Готовые препараты высушивают на воздухе, 2-3 минуты отмывают дистиллированной водой в вертикальном положении. Затем на них наносят реактив 3!, через минуту его сливают, мазок промывают и наносят реактив №2 на 1-2 мин, проводя препарат над пламенем спиртовки до появления паров. Далее мазок тщательно промывают дистиллированной водой и наносят реактив №3 на 1-2 мин., прогревая препарат на огне, пока он не станет темно-коричневым. После этого препарат снова тщательно промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют. При рассмотрении под микроскопом с помощью иммерсионной системы элементарные тельца представляют в виде мелких (200-300 нм) округлых образований темно-коричневого или черного цвета, расположенных поодиночке, парами, короткими цепочками и в виде скоплений. Присутствие характерных телец в массовом количестве считается положительным результатом. 107 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 108 из 118 ТЕМА № 25: Лабораторные животные как объекты для культивирования микроорганизмов Материальное обеспечение: лабораторные животные (кролики, белые мыши, морские свинки), шприцы, инструменты для заражения животных, вируссодержащий материал, трупы лабораторных животных, инструменты для вскрытия, раствор Хенкса, пенициллин и стрептомицин, пробки резиновые, пенициллиновые флаконы, стерильные марлевые салфетки, колбы с бусами, стерильные пробирки, колбочки на 50 мл, стерильные воронки, центрифуга, пробирки центрифужные, физиологический раствор, штативы. Учебные пособия: Таблицы: порядок приготовления вируссодержащей суспензии. Учебники: Троценко Н.И. и др. Практикум по ветеринарной вирусологии. - М.,1989.-С.3755. Целевая установка: Ознакомиться с целями использования лабораторных животных в вирусологии, требованиями к лабораторным животным, методами экспериментального заражения лабораторных животных и методикой вскрытия трупов лабораторных животных и взятия от них патматериала. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Что понимают под культивированием вирусов? Методы культивирования. 2. Виды лабораторных животных и с какой целью их нужно использовать в лабораторной практике? 3. Методы заражения лабораторных животных. 4. Порядок вскрытия лабораторных животных 5. На чем основан выбор органа, извлекаемого в качестве вируссодержащего материала при вскрытии? Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, беседа по вопросам темы, акцентирование внимание на цели использования лабораторных животных в вирусологической практике, демонстрация вскрытия лабораторного животного и техники взятия патологического материала, демонстрация техники приготовления вируссодержащего материала, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Под контролем преподавателя приготовить из отобранных органов (сердце, печень, почки, селезенка) и крови мазки – отпечатки. Затем окрасить их одним из методов (по Романовскому – Гимзе) с целью обнаружения телец-включений. Микроскопировать. Картину зарисовать. 1. Подготовить вируссодержащий материал для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток путем обработки антибиотиками и центрифугированием. 2. Проверить полученный материал на стерильность путем посева на МПА, МПБ, среду Чапека. Выделение вируса из органов и тканей производится следующим образом. Из любого из отобранных органов мышки (печень) можно приготовить вируссодержащий материал. Для этого кусочек, например печени, растирают в ступке со стерильным песком или стеклом и суспензируют в фосфатно-буферном растворе или растворе Хенкса (1:10). Полученную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10-15 мин.; надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и добавляют антибиотики (пенициллина – 1000 ЕД, стрептомицина – 500 ЕД, нистатин – 30 ЕД, тетрациклина – 100 мкг на 1 мл). После 30-60 минутного контакта с ними при комнатной температуре материал проверяют на стерильность (наличие бактерий, грибов – 108 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 109 из 118 до 10 суток) и используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов и культур клеток. Для освобождения вируссодержащего материала от бактерий, кроме антибиотиков, можно применять стерилизующее фильтрование. Бактерийный фильтр впервые был создан Шамберланом в лаборатории Пастера в 1884 г. В настоящее время применяют бактерийные фильтры и других марок: Беркефельда (1891), Мандлера, Крамера (США), советские фильтры ГИКИ (1938). Чаще всего используют асбестовые пластинки, керамические свечи, коллодийные мембраны и стеклянные фильтры. Фарфоровые свечи Шамберлана состоят из каолина и кварцевого песка; фильтры Мандлера – из инфузорий земли, асбеста игипса; фильтровальные пластинки Зейтца готовят из прессованного асбеста в виде кружков диаметром 35, 140 и 350 мм. Ффильтрующие взвешенные частицы, пропускающие некоторые бактерии, и СФ – стерилизующие пластины, задерживающие виды бактерий, но пропускающие вирусы. Для фильтрации вирусов используют фильтры с диаметром 100-400 нм. В зависимости от степени порозности фильтра различают их разные марки и номера. Подготовка материала к фильтрации. Суспензию, содержащую вирус, перед фильтрованием необходимо освободить от грубой взвеси. Для этого ее вначале центрифугируют в течение 10-15 мин. При 1500-2000 об/мин или фильтруют через бумажный фильтр большой порозности (800 нм). Суспензия, подлежащая стерилизующему (заключительному) фильтрованию, должна быть прозрачной и лишь слегка опалесцирующей. В приемном сосуде (колбе) создают разрежение при помощи насоса Камовского. Фильтрат проверяют на стерильность (наличие бактерий, грибов) путем посева на ПМА, МПБ (сахарные), среду Чапека или Сабура. В настоящее время для освобождения от бактерийной флоры и грибов исследуемый вируссодержащий материал не фильтруют, а центрифугируют и обрабатывают антибиотиками. ТЕМА №26: Заражение куриных эмбрионов Материальное обеспечение: куриные эмбрионы 9-12 дневного возраста, вируссодержащий материал (вирус осповакцины), шприцы, иглы (короткие и длинные), подставка для эмбрионов, овоскопы, пробойники и глазные пипетки в стерилизаторе, вата, 0,5%-ная настойка йода, стерильный парафин в пастеровских пипетках, лейкопластырь, чашка Петри, спиртовки, простые карандаши, стерильные тампоны. Учебные пособия: Таблицы: строение куриного эмбриона; методы заражения куриных эмбрионов. Учебники: Троценко Н.И. и др. Практикум по ветеринарной вирусологии. - М.,1989.-С.5969. Целевая установка: Изучить строение куриного эмбриона, подготовку куриного эмбриона к заражению. Ознакомиться с методами экспериментального заражения куриных эмбрионов. Заразить куриные эмбрионы вирусом оспы (вакцинный штамм). Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Строение куриного эмбриона. 2. Функции органов куриного эмбриона. 3. Правила отбора куриных эмбрионов для вирусологических исследований. 4. Правила подготовки куриных эмбрионов к заражению. 109 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 110 из 118 5. Цель и методы заражения куриных эмбрионов (заражение в аллантоисную полость, на хорионаллантоисную оболочку, в желточный мешок, в амниотическую полость в тело зародыша, в кровеносные сосуды). По всем вопросам составить конспект. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, беседа по вопросам темы, демонстрация подготовки куриных эмбрионов к заражению и демонстрация основных методов заражения, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. 1. Подготовить куриные эмбрионы к заражению. 2. Заразить куриные эмбрионы вирусом оспы. В зависимости от наличия эмбрионов каждому студенту или группе студентов (3-4 человека) выдается куриный эмбрион для усвоения основных методов заражения. Перед заражением инкубационные яйца просветить на овоскопе, погибшие эмбрионы отделить. На скорлупе яиц с живыми эмбрионами отметить границу пуги и место заражения. Эмбрионы заражать при помощи специальных игл и стерильного шприца емкостью 1 мл. Место заражения на яйце залить парафином. ТЕМА № 27: Вскрытие куриного эмбриона и получение вируссодержащего материала Материальное обеспечение: зараженные куриные эмбрионы, металлические подставки для эмбрионов, овоскопы, ножницы и пинцеты в стерилизаторе, вата, 0,5%-ная настойка йода, чашки Петри, спиртовки, стерильные тампоны, стерильные пенициллиновые флаконы и резиновые пробки, предметные стекла, стерильные пипетки. Учебные пособия: Таблицы: строение куриного эмбриона; методы заражения куриных эмбрионов. Учебники: Троценко Н.И. и др. Практикум по ветеринарной вирусологии. М.,1989.-С.69-75. Целевая установка: Ознакомиться с порядком вскрытия зараженных куриных эмбрионов. Изучить изменения, видимые визуально. Получить харионаллантоисную оболочку и аллантоисную жидкость. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Методы вскрытия куриных эмбрионов, отбор вирусологического материала. 2. Патологоанатомические изменения в зараженных куриных эмбрионах. 3. Что понимают под гемагглютинирующими свойствами вирусов? Их использование. Механизм гемагглютинации. Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Проовоскопировать зараженные и контрольные куриные эмбрионы. 1. Вскрыть зараженные куриные эмбрионы, изучить патологоанатомические изменения на теле эмбриона, хорионаллантоисной оболочке, оболочке желточного мешка. 2. Из эмбриона получить вируссодержащую суспензию (см. занятие № 26). ТЕМА № 28: Культуры клеток как объекты для культивирования вирусов. Заражение культур клеток 110 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 111 из 118 Материальное обеспечение:0,5 % гидролизат лактальальбумина, 0,25 % раствор трипсина, раствор Хенкса, среда 199, 0,5 5 гемогидролизат, раствор версена, бычья сыворотка и др. среды, смонтированная и стерильная посуда, пипетки, резиновые пробки, магнитная мешалка, 10-12 дневные куриные эмбрионы, овоскоп, стерильные маникюрные ножницы, пинцеты, камера Горяева. Учебные пособия: Таблицы: Порядок приготовления культуры клеток из куриного эмбриона. Учебники: Троценко Н.И. и др. Практикум по ветеринарной вирусологии. М.,1989.-С. 79116. Целевая установка: Ознакомиться с основными видами культур клеток и методикой получения культуры клеток. Ознакомиться с растворами, питательными средами, посудой, применяемыми для получения культур клеток. Ознакомиться с методикой заражения культур клеток вирусами. Основные вопросы по теме лабораторной работы: 1. Что называют культурой клеток? Виды культур клеток (КК). 2. Какие культуры называют первичными и однослойными (монослойными). 3. С какой целью проводят трипсинизацию? Сущность этого метода. Техника его проведения. 4. Какими способами обеспечивают бактерийную стерильность при получении клеточных культур? С какой целью и какие антибиотики добавляют к питательным средам и солевым растворам? 5. Какие растворы и питательные среды применяются для культивирования клеток? 6. Почему посуду с посевами клеток закрывают резиновыми пробками? 7. Для чего взвесь клеток в трипсине помещают в тающий лед? 8. Как клетки отделить от раствора трипсина? 9. Как используются культуры клеток в вирусологии? 10. В чем преимущество культур клеток перед другими лабораторными системами? Краткое содержание занятия: назначение дежурного, закрепление теоретического материала прошлого занятия, беседа по вопросам темы, демонстрация растворов используемых для приготовления культур клеток, посуды применяемой при культивировании клеток, демонстрация техники получения культур клеток, проведение аудиторной контрольной работы. Самостоятельная работа: ход выполнения АКР. Задание 1. Получить первичную культуру клеток из куриного эмбриона. На первом этапе работы провести овоскопию, на скорлупе отметить границу воздушной камеры. Поверхность скорлупы воздушной камеры обработать спиртом и обжечь. Стерильными ножницами срезать скорлупу по намеченной границе; разорвать подскорлупную и хорионаллантоисную оболочку, асептически извлечь эмбрион и поместить его в чашку Петри. Затем у эмбриона удалить лапки, крылья, головку и внутренние органы. Оставшуюся часть (кожно-мышечный мешок) промыть буферным раствором Хенкса. После трехкратного отмывания эмбрион измельчить ножницами на кусочки размером 2-3 мм в стерильном стаканчике. Измельченную ткань три раза отмыть в растворе Хенкса от слизи и крови, перенести в колбу для трипсинизации и залить двойным объемом 0,25% раствора трипсина, подогретого до 37 град. В колбу внести стерильный магнитик и поставить ее на магнитную мешалку. После воздействия трипсина и механического перемешивания в течения 3-5 мин. Начинают отделяться свободные клетки, которые переходят в раствор. Отделившиеся клетки вместе с трипсином слить в центрифужные пробирки и поместить в кювету со льдом, чтобы прекратить дальнейшее воздействие трипсина на клетки. К оставшейся ткани добавить вторую порцию трипсина. 111 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 112 из 118 Трипсинизацию провести три-четыре раза до полного истощения ткани, которое определяют по беловатому оттенку кусочков и их разбуханию. После окончания трипсинизации полученную взвесь клеток подвергнуть центрифугированию при 1000 об/мин 10-15 мин. Надосадочную жидкость слить, а осадок клеток ресуспендировать в питательной среде (1:10), подогретой до 37 град. и слить в колбу через три-четыре слоя марлевого фильтра. Колбу с суспензией клеток поместить в холодильник при 4-5 град. С до следующего занятия. Суспензию клеток, хранившуюся в холодильнике, некоторое время выдержать при комнатной температуре, а затем тщательно перемешать и взять 1 мл для подсчета клеток. К 1 мл клеточной взвеси добавить равное количество краски (0,1-0,2 % раствор кристаллвиолета в 0,1-молярном растворе лимонной кислоты) и тщательно перемешать. Окрашенную клеточную взвесь набрать пипеткой Пастера и, опустив одну-две капли в сливную шашку, наносят одну каплю на стекло камеры Горяева – на границе с покровным. В силу капиллярности взвесь клеток заполняет камеру. После заполнения камеры под малым увеличением микроскопа в слегка затемненном поле производится подсчет. Число клеток в 1 мл взвеси подсчитать по формуле: Х = а х 250 х 1000 х б Где х – искомое число, а – среднее число клеток в одном квадрате, 250 – количество объемов над большим квадратом в 1 мм3, 1000 – количество мм3 в 1 мл, б – степень разведения взвеси. Если необходимо посеять клетки в матрац Ру с полезной площадью 180 см 2 по 25000 – 30000 клеток на 1 см2, то в матрац вносят 1 мл клеточной взвеси, 10 мл сыворотки крупного рогатого скота и 100 мл питательной среды. Посуду с посеянными клетками закрывают стерильными резиновыми пробками (для поддержания постоянства газовой среды) и помещают в термостат при температуре 37 град. при чем, пробирки укладывают наклонно под углом в 5-6 град. Клетки фиксируются на внутренней поверхности пробирки. Через 24-28 ч. образуется сплошной слой клеток, располагающихся в один ряд (монослой). Задание 2. Просмотреть под малым увеличением микроскопа в слегка затемненном поле зрения полученные культуры клеток; микроскопическую картину зарисовать. Заражение культуры клеток вируссодержащим материалом. Заражение клеточных культур вирусом проводят в стерильном боксе. Перед заражением все клеточные культуры микроскопируют и отбирают пробирки или матрацы только с неполным монослоем, с признаками дегенерации клеток или с нетипичным клеточным ростом бракуют. В качестве вируссодержащего материала для заражения клеток используют фильтраты (прошедшие через бактериальный фильтр) или свежевзятый (в стерильных условиях) нативный материал с добавлением антибиотиков. Из отобранных клеточных культур отсасывают или сливают питательную среду. Часть культур (не менее четырех) оставляют в качестве контроля; в них вносят по 0,2 мл свежей питательной среды 199 без сыворотки. В другие четыре пробирки с клеточным монослоем вносят по -,2 мл свежей питательной среды 199 без сыворотки. В другие четыре пробирки с клеточным монослоем вносят по 0,2 мл вируссодержащего материала. Все пробирки с культурами (контрольные и опытные) помещают в термостат и выдерживают при температуре 37 град. 20-30 мин. После контакта вируса с клетками в пробирки контрольные и опытные вносят по 1,8 мл питательной среды без сыворотки, ставят в термостат и ежедневно наблюдают за ними, сравнивая под микроскопом опытные культуры клеток с контрольными. 112 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 113 из 118 Необходимо иметь в виду, что при внесении вируса и при последующем его выращивании пробирки выдерживают в термостате под углом в 5-6 град. так, чтобы клеточный слой был покрыт питательной средой. Поэтому на пробирках принято делать продольные линии цветным карандашом. Пробирки укладывают всегда линией кверху. ТЕМА № 29: Итоговое занятие. Коллоквиум по лекционному материалу Вопросы коллоквиума 1. Типы питания микроорганизмов. 2. Классификация микроорганизмов по типу дыхания. 1. Механизм аэробного и анаэробного дыхания. 2. Типы биологического окисления. 3. Механизм обмена веществ в бактериальной клетке. 4. Характеристика микроорганизмов – продуцентов антибиотиков. Механизм их действия на микробную клетку. 5. Бактериофаги. Строение. Механизм взаимодействия с микробной клеткой. Применение бактериофагов. 6. Ферменты микроорганизмов, их классификация. 7. Микрофлора воды. Микробиологические показатели. 8. Микрофлора почвы. Микробиологические показатели. 9. Микрофлора воздуха. Микробиологические показатели. 10. Роль микроорганизмов в круговороте азота в природе: аммонификация, нитрификация. 11. Роль микроорганизмов в круговороте углерода в природе. 12. Роль микроорганизмов в превращении соединений фосфора, серы, железа. 13. Фенотипическая изменчивость микробов (модификация, диссоциация). 14. Генотипическая изменчивость бактерий. Классификация. Спонтанные и индуцированные мутации 15. Историческая справка о научных открытиях по генетике микроорганизмов. 16. Основные свойства генетического кода. Особенности генетики бактерий. 17. Рекомбинативная изменчивость бактерий. Трансформация, конъюгация, трансдукция. 18. Инфекция, инфекционный процесс, инфекционная болезнь. 19. Понятие о патогенности и вирулентности бактерий, методы ослабления и усиления вирулентности. 20. Факторы вирулентности микроорганизмов. Инвазивные и токсигенные свойства микроорганизмов. 21. Определение понятия иммунитет. Иммунная система и ее функции. 22. Виды иммунитета. 23. Неспецифические факторы защиты. 24. Антигены бактериальной клетки, их основные свойства 25. Антитела. Природа и функции антител. 26. Понятие о росте и размножении бактерий, бесполое и половое размножение. ТЕМА № 30: Итоговое занятие. Коллоквиум по лабораторным занятиям Вопросы коллоквиума 113 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 114 из 118 1.Определение сахаролитической активности микроорганизмов. 2.Определение протеолитической активности микроорганизмов 3. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. 1.Методы микробиологической оценки воды, почвы, воздуха. 2.Характер роста микроорганизмов на плотных, жидких, полужидких питательных средах. 6. Природа вирусов. 7. Гипотезы происхождения вирусов. 8. Основные свойства вирусов и их прикладное значение. 9.Архитектура вирусов. 10. Химический состав вирусов. 11. Классификация вирусов. 12. Общее представление о репродукции вирусов. 13. Культивирование вирусов на лабораторных животных. 14. Культивирование вирусов на куриных эмбрионах. 15. Культивирование вирусов в культурах клеток. 16. Методы заражения лабораторных животных. 4 Самостоятельная работа студента План самостоятельной работы студентов (СРС) № темы 1 2 3 4 5 Наименование темы Содержание История микробиологии вирусологии развития Морфологический и физиологический периоды в и развитии микробиологии. Открытие микроорганизмов А.ван Левенгуком. Роль Л.Пастера в формировании микробиологии. Значение работ Клюйвера, Коха, Флеминга. Шапошникова, Иерусалимского. Открытие вирусов и бактериофагов. Работы Ивановского, Гамалеи. Морфология и строение Краткая характеристика риккетсий, риккетсий, микоплазм, микоплазм, хламидий, водорослей хламидий, водорослей и и простейших. простейших. Морфология и особенности строения перечисленных клеток. Антимикробные факторы Радиация, характер действия на микроорганизмы. физической природы Устойчивость микробов к ультрафиолетовым лучам и ионизирующему излучению. Применение ультразвука и токов высокой частоты.. Биологическая фиксация Открытие микроорганизмов, фиксирующих молекулярного азота молекулярный азот. Свободноживущие и симбиотические азотфиксаторы. Фиксация молекулярного азота, механизм процесса. Генетические рекомбинации Рекомбинации. Генетическая рекомбинация у прокариот: трансформация, трансдукция, конъюгация. Плазмиды: классификация, 114 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 115 из 118 биологическая роль, интеграция. Рекомбинации эукариотных микроорганизмов. Половой и парасексуальный процессы. Основы гибридологического анализа.Тетрадный анализ грибов. Анализ митотического расщепления на примере мицелиальных грибов. Цитоплазматическая наследственность. Рекомбинация и генетический анализ у фагов. Типы мутантов бактериофагов. Селекция микроорганизмов Методы аутоселекции. Мутационная селекция. Зависимость выхода полезных мутаций от воздействующего фактора и дозы. Сверхсинтез аминокислот и других азотсодержащих соединений. Мутасинтез. Методы генной инженерии. Использование в сельском Использование продуктов микробного синтеза хозяйстве белка, нитрагинов, для кормления животных, для защиты растении пестицидов й, удобрения земли. 6 7 ВОПРОСЫ ЭКЗАМЕНА Предмет и задачи микробиологии и вирусологии. Роль ученых в развитии микробиологической науки. Строение бактериальной клетки. Строение клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий 5. Морфология прокариот. Размеры и единицы измерения. 6. Строение актиномицет и их практическое значение. 7. Строение плесневых грибов, их практическая значимость. 8. Спора как непостоянный компонент бактерий. Устойчивость. Образование споры. 9. Жгутики и пили бактерий. Характеристика. Строение жгутиков. 10. Капсулы. Характеристика. Значение в микробиологической практике. 11.Принципы классификации и таксономии микроорганизмов. Понятие: вид, штамм, клон, культура. 12.Строение дрожжей, их практическая значимость. 13.Полезные и вредные свойства микроорганизмов. 14.Химический состав микробной клетки. 15.Тинкториальные свойства микроорганизмов. 16.Типы питания микроорганизмов. 1. 2. 3. 4. 115 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 116 из 118 17.Классификация микроорганизмов по типу дыхания. 18.Механизм аэробного и анаэробного дыхания. 19.Типы биологического окисления. 20.Механизм обмена веществ в бактериальной клетке. 21.Способы размножения плесневых и дрожжевых грибов. 22.Фазность размножения бактерий. 23.Питательные среды и требования, предъявляемые к ним. Классификация питательных сред. 24.Порядок приготовления питательных сред. 25.Культивирование аэробов и анаэробов. 26.Чистые культуры и методы их получения. 27.Стерилизация. Методы стерилизации (сухим жаром). 28.Стерилизация. Методы стерилизации (влажным жаром). 29.«Дезинфекция», «асептика» и «антисептика». Практическое применение. 30.Устройство автоклава и принцип его работы. 31.Действие физических факторов на микроорганизмы. 32.Действие химических веществ на микроорганизмы. Понятие о бактериостатическом и бактерицидном действии. Дезинфекция. 33.Характеристика микроорганизмов – продуцентов антибиотиков. Механизм их действия на микробную клетку. 34.Бактериофаги. Строение. Механизм взаимодействия с микробной клеткой. Применение бактериофагов. 35.Ферменты микроорганизмов, их классификация. 36.Определение сахаролитической активности микроорганизмов. 37.Определение протеолитической активности микроорганизмов. 38.Антибиотико-резистентность микроорганизмов, методы определения чувствительности к антибиотикам. 39.Микрофлора воды. Микробиологические показатели. 40.Микрофлора почвы. Микробиологические показатели. 41.Микрофлора воздуха. Микробиологические показатели. 42.Методы микробиологической оценки воды, почвы, воздуха. 43.Роль микроорганизмов в круговороте азота в природе: аммонификация, нитрификация. 44.Роль микроорганизмов в круговороте углерода в природе. 45.Роль микроорганизмов в превращении соединений фосфора, серы, железа. 46.Фенотипическая изменчивость микробов (модификация, диссоциация). 47.Генотипическая изменчивость бактерий. Классификация. Спонтанные и индуцированные мутации. 48.Историческая справка о научных открытиях по генетике микроорганизмов. 116 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 117 из 118 49.Основные свойства генетического кода. Особенности генетики бактерий. 50.Рекомбинативная изменчивость бактерий. Трансформация, конъюгация, трансдукция. 51.Применение мутантов микроорганизмов в научных исследованиях и в практических целях. 52.Плазмиды, классификация, биологическая роль, интеграция в хромосому. Понятие о транспозонах и IS-элементах. Использование вирусов и плазмид в генной инженерии 53.Инфекция, инфекционный процесс, инфекционная болезнь. 54.Понятие о патогенности и вирулентности бактерий, методы ослабления и усиления вирулентности. 55.Факторы вирулентности микроорганизмов. Инвазивные и токсигенные свойства микроорганизмов. 56.Определение понятия иммунитет. Иммунная система и ее функции. 57.Виды иммунитета. 58.Неспецифические факторы защиты. 59.Антигены бактериальной клетки, их основные свойства. 60.Антитела. Природа и функции антител. 61.Понятие о росте и размножении бактерий, бесполое и половое размножение. 62.Характер роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. 63.Природа вирусов. 64.Гипотезы происхождения вирусов. 65.Основные свойства вирусов и их прикладное значение. 66.Архитектура вирусов. 67.Химический состав вирусов. 68.Классификация вирусов. 69.Общее представление о репродукции вирусов. 70.Культивирование вирусов на лабораторных животных. 71.Культивирование вирусов на куриных эмбрионах. 72.Культивирование вирусов в культурах клеток. 73.Морфология и строение риккетсий, микоплазм, хламидий 74. Нормальная микрофлора человека, ее роль. 75. Микрофлора тела животных 76.Гнотобионты, получение и значение в научных исследованиях 77.Микроорганизмы, патогенные для человека и животных. 78.Влияние на микроорганизмы света, ультрафиолетовых лучей, ионизирующего излучения, радиоволн, ультразвука. 79.Действие на микроорганизмы высокой и низкой температуры. Механизм действия. Психрофилы. Мезофилы. Термофилы. 117 042-14-4-03.01.20.01/03-2012 Редакция №2 стр. 118 из 118 80.Лиофилизация и высушивание. Применение в микробиологической практике. 81.Влияние на микроорганизмы гидростатического давления. 82.Действие осмотического давления на микроорганизмы. 83.Краткая характеристика дезинфицирующих веществ. Кислоты, щелочи. Спирты. Поверхностно-активные вещества. Красители. Фенол. Окислители. Формальдегид и др. 84.Классификация антибиотиков. Устойчивость микробов к антибиотикам. 85. Брожение клетчатки. Анаэробное и аэробное брожение клетчатки. 86. Спиртовое брожение. Возбудители брожения. Их характеристика. 87. Молочнокислое брожение. Возбудители брожения. Гомоферментативное и гетероферментативное молочнокислое брожение. 88. Уксуснокислое брожение. Возбудители брожения. Их характеристика. 89.Взаимоотношения микроорганизмов между собой и с высшими организмами. Симбиоз, метабиоз, сателлизм, синергизм, вирогения, антагонизм, мутуализм, паразитизм, комменсализм, нейтрализм, хищничество. 90. Ризосферная и эпифитная микрофлора растений. 91. Симбиотическая азотфиксация. Микоризы. Фитопатогенные микроорганизмы (головня, спорынья, фузариозы злаков). 92.Использование микроорганизмов в пищевой промышленности, сельском хозяйстве, ветеринарии, медицине, биотехнологии. 93. Устройство микроскопа. Иммерсионная система. 94. Правила работы в микробиологической лаборатории. 95.Сложные методы окраски. Сущность окраски по методу ЦиляНильсена. 96.Использование серологических реакций в микробиологии и вирусологии. 118

УМКД 042-18-23.1.01/03-2013 Ред. №от __ 2013г

Похожие документы

Разделы

Поддержка

УМКД 042-18-23.1.01/03-2013 Ред. №____от ______ 2013г

Похожие документы

Добавить этот документ в коллекции

Добавить этот документ в сохраненные

Предложите, как улучшить StudyLib

УМКД 042-18-23.1.01/03-2013 Ред. №от __ 2013г