Сравнительная оценка степени фиксации различных стандартных культур клеток и фибробластов кожи на полипропиленовых сетчатых эндопротезах, используемых в хирургии грыж брюшной стенки Чижов Д.В.1, Егиев В.Н.2, Сологуб В.К.3 Коромыслова И.А.3 1 12 ГКБ г. Москва 2 Кафедра хирургии и онкологии ФПКМР РУДН 3 МНИИМЭ г. Москва Положительный эффект применения фибробластов у пациентов указывает на высокий восстановительный потенциал использования аутогенных фибробластов в герниологии. Проведенные исследования позволили установить, что степень фиксации фибробластов на различных типах полипропиленовых эндопротезов достоверно отличается. Причем в последующем применение различных полипропиленовых сеток с фиксированными на них аутофибробластами у экспериментальных животных показало различную тканевую реакцию на их имплантацию. Результаты эксперимента позволяют предложить, что степень фиксации фибробластов на сетчатых полипропиленовых эндопротезах является критерием биосовместимости полипропиленовых сеток. В тоже время культура клеток мышиных фибробластов не является стандартной и предполагает различные результаты фиксации клеток к сетчатым эндопротезам при использовании культуры клеток фибробластов от различных экспериментальных животных. В связи с этим обстоятельством возникла необходимость использования стандартной культуры клеток для оценки степени фиксации клеток на различных полипропиленовых эндопротезах. Цели и задачи исследования: сравнительная оценка степени фиксации стандартных культур клеток и фибробластов кожи на различных синтетических полипропиленовых сетчатых эндопротезах, используемых для пластики дефектов передней брюшной стенки. Материалы и методы: в исследовании полипропиленовые сетчатые эндопротезы использовались следующие для восстановительной хирургии: Surgipro mesh (SPMM) Covidien, Prolene (Ethicon), Ultrapro (Ethicon), Эсфил стандартный (Линтекс), Эсфил легкий (Линтекс), Эсфил усиленный (Линтекс). Выбранные культуры клеток отличались по способности прикрепляться к субстрату: от практически не снимаемых макрофагов до снимаемых трипсином клеток МДВК и фибробластов, и легко стряхиваемых со стекла версеном без трипсина, клеток ВНК-21. Клетки культивировали в среде RPMI-1640/ DMEM (Sigma) 1/1 c 10 % фетальной сыворотки к.р.с. ( ПанЭко ) в СО2 инкубаторе при 37о С. Фибробласты кожи мыши готовили трипсинизацией фрагментов кожи эмбрионов мыши и использовали после 5 – 10 пассажей, 1:4, каждые 5-7 дней. Перитонеальные макрофаги получали, промывая средой брюшную полость мыши, и высевали в концентрации 100 тыс. клеток / мл. Перевиваемая линия клеток почки сирийского хомячка - ВНК-21 получена из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС ССL 10) и перевивалась 1:10 после снятия раствором версена каждые 3 дня. Перевиваемая линия клеток почки коровы МДВК получена из Американской Коллекции Типовых Культур ( АТСС ССL 22) , перевивалась один раз в 5 дней 1:5 после снятия клеток раствором версена с 0,5 %; трипсина. Для культивирования полистироловые клеток на сетках использовали 24 луночные культуральные планшеты ( Nunk ). Сетки нарезали на квадраты размером на 1-2 мм больше чем диаметр лунок, так чтобы они фиксировались на дне лунок. В лунки с сетками вносили по 2 мл питательной среды с 200 – 500 тыс. клеток. Планшеты помещали в СО2 инкубатор и инкубировали 1 – 4 дня, оценивая прикрепление и рост клеток в инвертированном микроскопе. После заполнения всего дна лунок делящимися клетками сетки извлекали и оценивали фиксацию клеток на сетках качественно и количественно. Для качественной оценки сетки с клетками фиксировали формалином и метанолом и окрашивали раствором Гимза. Количественную оценку фиксации клеток проводили, измеряя концентрацию белка в ультрафиолете при 280 нм в лизате клеток спектрофотометром Genezis 10 UV (Thermo). Сетки с клетками промывали раствором Хенкса и затем клетки лизировали двух кратным замораживанием - оттаиванием ( -20оС - +25 о С ) в 2 мл раствора. Оптическая плотность полученного таким образом лизата отмытых от среды 100 тыс. клеток была 0,130 , и для 10 тыс. клеток - 0.010 ед. Это показывает, что оптическая плотность при 280 нм может служить адекватным критерием наличия клеток на сетках. Окрашивание препаратов фиксация - 7% р-р формальдегида на PBS pH 7,2 в течение 1 часа, обезвоживание метанолом, окрашивание по Гимза. Световая микроскопия в проходящем свете в инвертированном микроскопе Nikon объективы10х/0,25 и 4х/0,25. Результаты исследования приведены в таблице 1. Таблица 1. Сравнительная оценка концентрация белка в ультрафиолете при 280 нм в лизате клеток, фиксированных на различных полипропиленовых носителях Название сетки Surgipro mesh (SPMM) Covidien Prolene (Ethicon) Ultrapro (Ethicon) Эсфил стандартный (Линтекс) Эсфил легкая (Линтекс) Эсфил усиленный (Линтекс) Оптическая плотность пробы BHK-21 МДВК Перитонеальные Фибробласты макрофаги кожи 0,0152 ± 0,0145± 0,00375± 0,014± 0,00356 0,00238 0,001518 0,00497 0,019± 0,03125± 0,008± 0,01375± 0,00821 0,01044 0,00294 0,00479 0,0358± 0,036± 0,008± 0,02475± 0,01681 0,01008 0,00374 0,0067 0,01325± 0,04117± 0,007± 0,01475± 0,00171 0,0083 0,00141 0,00222 0,022± 0,03183± 0,0075± 0,02425± 0,00689 0,00697 0,00404 0,0067 0,0386± 0,03267± 0,005± 0,0235± 0,01557 0,01282 0,00271 0,00597 Выводы: Различные стандартные культуры клеток достоверно отличаются по степени их фиксации к различным типам сетчатых полипропиленовых эндопротезов Принципиально возможно использовать стандартные культуры клеток для оценки биосовместимости различных полипропиленовых сетчатых эндопротезов Наиболее близкими по способности фиксации в ряду различных эндопротезов к культуре клеток фибробластов является культура клеток BHK-21