Москва – 2008
реклама
На правах рукописи Дубова Елена Алексеевна МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТКАНЕВОЙ РЕАКЦИИ ПРИ ИМПЛАНТАЦИИ СЕТЧАТЫХ ЭНДОПРОТЕЗОВ 14.00.15 – патологическая анатомия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2008 Работа выполнена в ФГУ «Институт хирургии имени А.В.Вишневского Росмедтехнологий» Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Щёголев Александр Иванович Научный консультант: доктор биологических наук Чекмарёва Ирина Александровна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Смольянникова Вера Анатольевна Московский государственный медико-стоматологический университет доктор медицинских наук, профессор Туманов Владимир Павлович Российский государственный медицинский университет Ведущая организация: НИИ морфологии человека РАМН Защита состоится «16» июня 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.04 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997 Москва, ул. Островитянова, д. 1. Автореферат разослан «4 мая» 2008 г. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета (117997 Москва, ул. Островитянова, д. 1) Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор 3 Щеголев А.И. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Проблема хирургического лечения наружных грыж различных локализаций остается весьма актуальной. По статистическим данным 2-4% населения имеют грыжи передней брюшной стенки, послеоперационные грыжи возникают у 4-11% больных, подвергшихся лапаротомии [Heniford B.T., 2003]. Ежегодно в мире выполняется более 20 миллионов операций грыжесечения, что составляет 10-15% от всех оперативных вмешательств [Адамян А.А., 2003; Жебровский В.В. и др., 2004; Егиев В.Н., 2006; Schumpelick V. et al., 1999]. В России пластика брюшной стенки по поводу грыжевых дефектов проводится примерно у 180 тысяч больных, в Германии – у 280 тысяч, в США - более чем у 500 тысяч [Федоров В.Д. и др., 2000; Klinge U., 2002; Peiper C. et al., 2006]. Существует большое количество методик операций при грыжах, большинство которых представляет пластику собственными тканями. Однако, все эти методы герниопластики, к сожалению, в той или иной степени не удовлетворяют хирургов. Причины этого довольно банальны: необходимость широкой лапаротомии, продолжительные сроки госпитализации, длительное ограничение физической активности пациента, необходимость длительного ношения бандажа [Фёдоров В.Д. и др., 2000; Жебровский В.В. и др., 2004; Cornell R.B. et al., 1994]. Кроме того, при этих методах пластики частота рецидивов колеблется от 10-15% [Cornell R.B. et al., 1994] до 40% [Anthony T. et al., 2000; Berger D. et al., 2002; Macintyre I.M., 2003]. В связи с этим для пластики послеоперационных грыжевых дефектов все чаще используются синтетические имплантаты. В отличие от традиционных способов пластики эта методика позволяет избежать натяжения тканей и значительно снизить число не только ранних, но и поздних послеоперационных осложнений и рецидивов [Белоконев В.И. и др.. 2003; Соловьев Н.А. и др. 2004; Сурков Н.А., 2007; Burger J.W.A. et al., 2004]. Ежегодно в мире производится около 1 миллиона имплантаций сетчатых протезов. В некоторых странах более 90% всех оперативных вмешательств по поводу грыж выполняется с использованием сетчатых протезов [Schumpelick V., 1999, Heniford B.T., 2003]. При этом наиболее часто используются имплантаты из полипропилена по причине относительной их дешевизны, простоте изготовления и практически неизменной со временем прочности [Винник Ю.С. и др., 2004; Гогия Б.Ш., 2006; Klosterhafen B. et al., 2002]. Они мало восприимчивы к инфекции, а в тех случаях, когда инфекционные осложнения все-таки развиваются, они хорошо поддаются лечению с использованием антибиотиков и адекватного дренирования, при этом эндопротез не удаляется [Нетяга А.А. и др., 2006; Van't Riet M. et al., 2007]. Полипропилен вызывает развитие выраженной и продолжительной воспалительной реакции, что обеспечивает его хорошую интеграцию в окружающие ткани брюшной стенки [Van't Riet M. et al., 2004], однако именно развитие хронического воспалительного процесса по типу реакции на инородное тело часто ведет к возникновению феномена сморщивания и уплотнения имплантата, результатом которого становится развитие болевого синдрома, подвижности имплантата и в итоге рецидива грыжи [Leber G.E. et al., 1998; Agrawal A.et al., 2005; Shin D. et al., 2005]. После оптимизма первого опыта применения синтетических материалов наступило время серьезного изучения механизмов фунцкционирования сетчатых эндопротезов и исследования причин рецидивов вентральных грыж при их использовании [Печеров А.А., 2001; Белоконев В.И. и др, 2004]. Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению взаимодействия полипропиленовых сеток с тканями организма, проблема возникновения рецидивов грыж и раневых осложнений продолжает оставаться актуальной. Доказаны различия в формировании воспалительного ответа на внедрение синтетических имплантатов, которые проявляются в различном соотношении лимфоцитов и макрофагов. Выяснено, что основная роль в ответной реакции принадлежит макрофагам, влияние и ответ других клеток находится в стадии изучения [Bellon J.M., 1998, Jansen P.L. et al., 2007]. В последнее время появляются сведения о том, что от количества полипропилена может зависеть степень выраженности фиброза в зоне имплантации [Klinge U. Et al., 2002; Cobb W.S. et al., 2005; Weyhe D. et al., 2006, 2007]. Рациональный выбор биоматериала должен быть основан на знании достоинств каждого из них. Будущие биоматериалы должны отвечать трём основным требованиям идеального протеза: а) они должны быть устойчивы к инфекции, б) должны предотвращать образование сращений с внутренними органами, в) должны вести себя в теле человека, как собственная ткань (хорошо фиксироваться и быть прочными, выдерживать длительное натяжение, без глубокого рубцевания и инкапсулирования) [Федоров И.В., 2004; Dinsmore R.C. et al., 2000; Zieren J. et al., 2003]. В этой связи изучение проблем воспаления и репаративной регенерации является одной из фундаментальных задач современной патологии. Морфологическое изучение особенностей ответной реакции тканей на имплантацию полипропиленовых сеток позволяет дать адекватную оценку использованным эндопротезам в зависимости от варианта их плетения, величины ячеек, структуры и физико-химических свойств. Цель исследования: при помощи морфологических методов изучить особенности тканевой реакции при имплантации различных видов полипропиленовых эндопротезов. Задачи исследования: 5 1. Изучить морфологические изменения в зоне имплантации сетчатых эндопротезов у больных с рецидивами грыж. 2. При помощи гистологических и иммуногистохимических методов изучить динамику морфологических изменений в зоне имплантации полипропиленовых эндопротезов в эксперименте у мышей. 3. С помощью электронно-микроскопического исследования изучить ультраструктурные особенности клеток в области расположения полипропиленовых имплантатов. 4. Выявить морфологические особенности изменений тканей в зависимости от физических и механических свойств имплантируемых эндопротезов. 5. Провести сравнительный морфологический анализ тканевой реакции при имплантации интактных и покрытых фибробластами полипропиленовых эндопротезов. Научная новизна На операционном материале, полученном от больных с рецидивами грыж, изучены патологогистологические изменения в области имплантации сетчатых эндопротезов. На большом экспериментальном материале проведено изучение тканевой реакции на ранних сроках в зоне имплантации различных видов полипропиленовых эндопротезов. Выявлены особенности тканевой реакции в зависимости от физикохимических свойств эндопротезов. Впервые в эксперименте на животных проведено сравнительное изучение тканевой реакции на имплантацию облегчённых и тяжелых полипропиленовых эндопротезов, покрытых фибробластами. Результаты исследований могут быть использованы как основа для научной разработки применения полипропиленовых эндопротезов, покрытых фибробластами, в эксперименте и клинике. Практическая значимость Выявленные при изучении операционного материала больных признаки хронического воспаления с наличием гигантских многоядерных клеток инородных тел в области имплантации эндопротезов из полиэтилентерефталата могут лежать в основе развития послеоперационных осложнений и рецидивов грыж. Использованные в работе критерии оценки репаративного процесса в области эндопротезов могут быть использованы при разработке новых имплантатов. На основании экспериментальных исследований получены данные о морфологических особенностях тканевой реакции на ранних сроках в зоне имплантации полипропиленовых эндопротезов, использующихся для устранения дефектов передней брюшной стенки. 6 Установлено, что имплантация полипропиленовых сеток, покрытых фибробластами, характеризуется более быстрой инкорпорацией эндопротеза в ткани организма. Реализация результатов работы Результаты исследования используются в практической работе отдела патологической анатомии Института хирургии имени А.В. Вишневского Росмедтехнологий. Полученные данные о морфологических особенностях репарации тканей в зависимости от физических и механических свойств имплантируемых эндопротезов используются в учебном процессе на кафедре патологической анатомии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета. Апробация работы Основные положения работы доложены и обсуждены на V-ой международной конференции «Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных, шовных материалов и полимерных имплантатов» (Москва, 2006); XXVIII-ой итоговой конференции молодых ученых МГМСУ (Москва, 2006); заседании Московского общества хирургов (Москва, 2006); юбилейной конференции «Актуальные вопросы герниологии», посвященной пятой годовщине со дня образования «Общества герниологов» (Москва, 2007); Третьем международном хирургическом конгрессе «Научные исследования в реализации программы «Здоровье населения России» (Москва, 2008). Публикации По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Опубликованные работы содержат полный объем информации, касающейся темы диссертации. Объем и структура работы Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами, 23 графиками и 67 рисунками. Работа состоит из введения, двух глав обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 74 отечественных и 134 зарубежных авторов. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Работа основана на морфологическом изучении операционного материала больных с рецидивирующими грыжами и экспериментальных животных. Операционный материал получен от 32 больных, оперированных в Институте хирургии имени А.В.Вишневского в 1997-2007 годах по поводу рецидива грыжи (26), наличия очага гнойного воспаления в области 7 эндопротеза (2) или рецидива грыжи в сочетании с хронической инфекцией с гнойным отделяемым (4) (исследование проведено совместно с доктором мед. наук Б.Ш.Гогия). Мужчин было – 10, женщин – 22. Возраст больных колебался от 39 до 74 лет (в среднем 57,6±1,2 года). Промежуток времени между имплантацией сетчатого эндопротеза и повторной операцией варьировал от 8 месяцев до 35 лет. Все образцы в зависимости от исходного материала сетчатого эндопротеза были разделены на две группы: из полипропилена (21 наблюдение) и полиэтилентерефталата (лавсана) (11 наблюдений). Промежуток времени между имплантацией сетчатого эндопротеза из полиэтилентерефталата и повторной операцией (настоящим исследованием) составил по 1 наблюдению – 8 месяцев, 4 года, 5 лет, 6 лет, 7 лет, 9 лет, 19 и 35 лет, и 3 наблюдения – через 2 года. Промежуток времени между имплантацией полипропиленового эндопротеза и повторной операцией в 3 наблюдениях составил 1 год, в 12 наблюдениях – 2 года, в 6 наблюдениях – 3 года. Исследуемый полипропиленовый эндопротез был представлен имплантатом «Эсфил» в 8 наблюдениях, «Prolene» - в 10 наблюдениях и «Surgimesh» - в 2 наблюдениях и «Vypro» - в 1 наблюдении. Экспериментальное исследование проведено на 320 беспородных белых мышах-самцах массой 150 г, которым под кожу спины имплантировали различные сетчатые эндопротезы (эксперименты проведены на кафедре хирургии и онкологии факультета повышения квалификации медицинских работников (зав. – проф. В.Н.Егиев) Российского университета дружбы народов совместно с кандидатом мед. наук Д.В.Чижовым). Все животные были разделены на контрольную и 15 опытных групп (по 5 мышей на каждый срок). В настоящем исследовании нами было проведено сравнительное изучение тканевой реакции на имплантацию различных полипропиленовых сеток: тяжелых и облегченных как интактных, так и покрытых фибробластами. Основные характеристики изученных эндопротезов приведены в таблице 1. Получение фибробластов и покрытие ими эндопротезов осуществлялось осуществлялось кбн В.К.Сологубом и кмн Д.В.Чижовым по принятой методике [Егиев В.Н. и др., 2006]. Первичные культуры фибробластов получали из биопсийного материала кожи мышей. Клетки культивировали на среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной сывороткой к.р.с. в стеклянных или пластиковых матрасах объемом 25-250 мл. Клетки перевивали по достижению монослоя на 5-7 день с помощью стандартного метода с помощью раствора Версен-трипсин. Для экспериментов использовали активно растущие клетки на уровне 5-15 пассажей. После этого примерно 1 см² каждой сетки помещали в лунки 24-луночных культуральных планшетов так, чтобы они были фиксированы на дне лунки. В лунки с сетками вносили по 2 мл клеточной суспензии с концентрацией 8 100000 клеток на 1 мл. Планшеты помещали в СО2 инкубатор и культивировали в течение недели. 9 Таблица 1. Характеристика полипропиленовых эндопротезов Толщина Диаметр Плотность Размер Эндопротез сетки нити сетки ячеек (мм) (мм) (г/м²) (мм) 0,56- Свойства монофиламентный Prolene 0,6 0,15 95,9 Эсфил 0,47 0,10 65,0 0,5-0,6 монофиламентный 0,58 0,14 96,6 0,4-0,6 монофиламентный 0,6 - 100,0 - монофиламентный 0,25 - 35,0 - Ultrapro 0,5 - 28,0 3-4 Vypro 0,39 - 25,0 3-4 Vypro II 0,39 - 30,0 3-4 0,63 Surgipro Mesh SPMМ Biomesh P1 Mesh Biomesh NK 2 Mesh монофиламентный, нетканный монофиламентный, композитный мультифиламентный, композитный мультифиламентный, композитный Имплантацию полипропиленовых сетчатых эндопротезов под кожу на мышцы спины проводили в стерильных условиях и под общим обезболиванием (введение предбрюшинно 0,5 мл тиопентала натрия в разведении 1:10). При этом фиксации имплантанта не производилось, а на кожу накладывали отдельные узловые швы нитью Biosin 4/0. Животным контрольной группы имплантации сетчатых эндопротезов не 10 производилось. На 3, 7, 14, 28 сутки после операции животных выводили из опыта и брали материал (ткань из области имплантации вместе с эндопротезом) для морфологического исследования. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с “Правилами проведения работы с использованием экспериментальных животных”. Полученные кусочки ткани с имплантантом фиксировали в 10% нейтральном формалине. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином, по Ван Гизон. Иммуногистохимическое исследование экспрессии K-67 (BioGenex, 1:30) проводили по общепринятой методике на депарафинированных срезах толщиной 3 мкм, расположенных на стеклах, покрытых L-полилизином. Предварительную демаскировку антигена проводили путем кипячения образцов в растворе цитратного буфера рН 6,0. Блокирование эндогенной пероксидазы проводили путем обработки срезов 0,3% раствором перекиси водорода в течение 15 мин. В качестве фонового красителя использовали гематоксилин. Количественную оценку клеточного состава проводили при помощи телевизионного анализатора изображения “МЕКОС-Ц”. Статистическую обработку количественных данных проводили при помощи ЭВМ с использованием программы “Statistica”. Для электронно-микроскопического исследования вырезали кусочки ткани размером приблизительно 1 мм3, фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида и 1% растворе четырехокиси осмия. Затем материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50, 70, 96 и 100%), после чего пропитывали в смеси окись пропилена – эпон-аралдитовая смола. После пропитки материал помещали в капсулы и заливали эпонаралдитовой смесью, затем помещали в термостат при температуре 60оС на двое суток. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1,5–2 мкм. После этого срезы окрашивали толуидиновым синим. После предварительного светомикроскопического изучения полутонких срезов вырезали пирамидки с таким расчетом, чтобы поверхность среза приходилась на интересующий нас участок. Ультратонкие срезы толщиной 100-120 нм получали на ультратоме фирмы LKB (Швеция). Ультраструктурное изучение препаратов проводили при помощи электронного микроскопа Philips CM 10 (Нидерланды). Результаты собственных исследований и их обсуждение При морфологическом изучении операционного материала больных с рецидивирующими грыжами установлено, что во всех исследованных наблюдениях (даже спустя 19 и 35 лет) в области эндопротезов имелись признаки хронического воспаления. В наблюдениях, когда эндопротез был удален в связи с рецидивом грыжи и не осложнялся развитием свищей и гнойного воспаления, вокруг синтетического материала отмечалось разрастание коллагеновых волокон с воспалительной инфильтрацией, 11 содержащей гигантские многоядерные клетки типа инородных тел. Наиболее выраженная воспалительная реакция отмечалась при использовании эндопротеза из полиэтилентерефталата по сравнению с имплантатами из полипропилена. На сроках 4 года, 6, 7, 9, 19 и 35 лет после имплантации эндопротеза из полиэтилентерефталата (лавсана) выявлялась соединительная ткань различной степени зрелости. Коллагеновые волокна ориентировались вокруг полифиламентных нитей сетчатого эндопротеза, а также врастали между волокнами, составляющими полифиламентную нить. Клеточная инфильтрация носила очаговый характер и была представлена преимущественно лимфоцитами, макрофагами. Выявлялись гигантские многоядерные клетки типа инородных тел. Следует отметить, что на сроках 19 и 35 лет гигантских клеток не наблюдалось. Наряду с этим, в образцах, взятых через 19 и 35 лет после имплантации сеток, мы выявили деструкцию полифиламентных нитей эндопротеза из полиэтилентерефталата, что, видимо, и явилось причиной рецидива грыжи. Кроме того, на этих сроках имелись явления выраженного гиалиноза тканей в зоне имплантации. Сетчатые имплантаты, состоящие из полифиламентных нитей полиэтилентерефталата и полипропиленовых мононитей, после выделения из операционного материала значительно отличаются по внешнему виду и по микроскопической картине. Изученные нами разновидности полипропиленовых монофиламентных эндопротезов мало чем отличаются друг от друга, кроме характера плетения. Вероятно, поэтому и микроскопическая картина в прилежащих тканях после имплантации в целом идентична. Во всех наблюдениях нам удалось по микроскопической картине определить полимерную основу эндопротеза, при этом марку эндопротеза удалось уточнить лишь по выписке об использованном во время предыдущей операции эндопротезе. Сложность идентификации марки эндопротеза также обусловлена исследованием преимущественно поперечных срезов эндопротезов. В то же время разница между полифиламентными нитями из полиэтилентерефталата и полипропиленовыми мононитями была очевидной. В процессе исследования мы не выявили четких отличий в тканевой реакции на два различных по природе типа эндопротезов. Тем не менее, сетчатые эндопротезы из полиэтилентетрафталата вызывали образование более плотной соединительной ткани и более выраженную инфильтрацию многоядерными гигантскими клетками. Нити полипропилена окружены менее плотной соединительной тканью. Они биологически более инертны и вызывают, как правило, менее выраженную гигантоклеточную реакцию. Возможно, эта разница обусловлена больше структурными особенностями нитей, составляющих эндопротез, поскольку суммарная поверхность полимера при полифиламентной нити значительно больше поверхности 12 монофиламентной нити при той же длине. Соответственно, при большей поверхности интенсивнее образуется соединительная ткань и более выражена реакция тканей. Кроме того, благодаря фитильным свойствам полифиламентной нити в ней и вокруг нее задерживается больше тканевой жидкости, фибрина, стимулирующих формирование более плотной соединительнотканной капсулы по сравнению с мононитями. Гистологические признаки острого воспаления, такие, как нейтрофильные гранулоциты и некроз, выявлялись лишь на небольших участках сетчатого протеза. Коллагеновые волокна, прилежащие к сетчатому эндопротезу, были в основном, ориентированы параллельно нитям имплантата и в то же время прорастали в ячейки эндопротеза. В результате сетчатый эндопротез и соединительная ткань образовывали единое целое. По данным B. Klosterhalfen с соавт. [1999] сетчатые эндопротезы из полиэтилентерефталата через несколько лет после имплантации разрушаются, что нами также отмечено на сроках 19 и 35 лет. Однако в других наблюдениях, когда сетчатые эндопротезы из полиэтилентетрафталата пришлось удалить в связи с хронической инфекцией или рецидивом грыжи, мы наблюдали структуру сетки, инкорпорированную в ткани. B. Klosterhalfen с соавт. [1999] считают, что имплантация аллопластических материалов, таких как дакроновые сосудистые протезы, повышает риск развития сарком. Однако случаев возникновения злокачественных новообразований, обусловленных использованием синтетических полимерных материалов для пластики брюшной стенки, не описано. Мы также среди оперированных больных не наблюдали признаков опухолевого роста в зоне имплантата. Согласно данным литературы [Сурков Н.А. и др., 2004; Klinge U. et al, 1999; Novitsky Y.W. et al., 2008; Weyhe D. et al., 2008] выраженность тканевой реакции главным образом зависит от веса имплантируемого материала и размера его пор. Существующее разделение имплантатов на легкие (облегченные) и тяжелые основано на существенной разнице в их массе. Широкий диапазон современных сетчатых эндопротезов включает как простые сетки с пониженным содержанием полипропилена, куда входят рассасывающиеся волокна полиглактина или полиглекапрона, а также сетки с уменьшенным содержанием полипропилена с различными дополнительными покрытиями. Установлено, что для обеспечения лучшего прорастания тканями эндопротеза размер его пор должен составлять 75-100 µм или больше, так как крупные поры препятствуют возникновению и персистированию инфекции [Amid P.K. et al., 2001, Weyhe D. et al, 2007]. Преимущества сеток с крупными размерами пор заключаются в их влиянии на процесс образования коллагена. В эксперименте на животных при денситометрическом анализе установлено, что увеличение размера пор 13 на 12 µм сопровождается образованием большего количества коллагена 1 типа [Greca F.H. et al., 2005]. Такое увеличение образования коллагена приводит к лучшим механическим результатам, а также лучшей организации и васкуляризации соединительной ткани, по сравнению с результатами, полученными при использовании сеток с малым размером пор. Учитывая вышеизложенное, мы в экспериментах на животных проанализировали динамику тканевой реакции на тяжелые и облегченные композитные эндопротезы и установили, что имплантация мышам полипропиленовых эндопротезов сопровождается развитием преимущественно экссудативной воспалительной (через 3 и 7 суток) и затем фибропластической (через 14 и 28 суток) реакций. При этом при иммуногистохимическом и электронномикроскопическом исследованиях на ранних сроках эксперимента (3 и 7 суток) установлено повышение индекса пролиферации и преобладание клеток (макрофагов и фибробластов) в функционально активном состоянии в области расположения эндопротеза. Среди тяжелых полипропиленовых сеток наиболее выраженная воспалительная реакция отмечается при имплантации эндопротезов «Эсфил» и «Biomesh P1 Mesh». При этом формирование соединительнотканной капсулы вокруг сеток происходило в одинаковые сроки. При использовании тяжелых полипропиленовых сеток отмечается более выраженная воспалительная реакция по сравнению с облегченными полипропиленовыми сетками. Имплантация облегченных композитных полипропиленовых сеток с более крупным размером пор характеризуется более выраженной фибропластической реакцией и более ранним формированием соединительнотканной капсулы вокруг эндопротеза по сравнению с тяжелыми полипропиленовыми сетками. Согласно данным литературы, в аналогичных экспериментах на животных показано, что имплантаты с меньшим количеством синтетического материала сочетаются с лучшей интеграцией в ткани организма и меньшей реакцией на инородное тело [Сурков Н.А., 2007]. Имеются также указания, что выраженность процессов апоптоза и воспаления после имплантации облегченных сеток значительно ниже, чем при имплантации традиционных сеток [Junge K. et al., 2005]. При этом воспалительная и фибропластическая реакции наиболее выражены в ранние, а не отдаленные, сроки после имплантации сетки [Rosch R. et al., 2003]. По данным других исследователей, при изучении имплантатиндуцированного фиброза и образования внутрибрюшных сращений не выявлено различий между тяжелой полипропиленовой сеткой и облегченной сеткой Vypro II [Goldenberg A. et al., 2005]. Фактически фиброз был более выражен при использовании Vypro II, но его 14 возникновение авторы интерпретируют с лучшей интеграцией в ткани организма. В других исследованиях на животных показано, что размер пор и структура сетки являются наиболее важными факторами для развития адекватной реакции тканей на их имплантацию [Weyhe D. et al., 2006]. Это означает, что сетки с крупными порами оказывают положительный эффект на васкуляризацию и характер вживления имплантата, что подтверждает результаты некоторых пионерских исследований о том, что крупные поры имплантата препятствуют развитию инфекции [Taylor D.F. et al., 1972]. В экспериментах на мышах нами выявлены определенные различия в динамике тканевой реакции на имплантацию сетчатого «Biomesh P1 2 Mesh» и нетканого «Biomesh NK2 Mesh» полипропиленовых эндопротезов. При имплантации нетканого эндопротеза выявлена более выраженная воспалительная реакция тканей. На основании морфометрического анализа нами установлено, что на 3-и сутки после имплантации нетканого эндопротеза количество нейтрофильных гранулоцитов было в 2,7 раза (р<0,05) больше, чем при использовании сетчатого протеза, при этом количество фибробластов было заметно больше при применении сетки (рис. 1). При этом врастание компонентов соединительной ткани между волокнами нетканого эндопротеза практически полностью отсутствует до середины второй недели после операции. Тем не менее, через 2 недели эксперимента вокруг нетканого эндопротеза на фоне умеренного содержания клеток воспаления уже формировалась соединительнотканная капсула с практически тотальным прорастанием имплантата компонентами соединительной ткани, в то время как при использовании сетчатого эндопротеза имелись лишь начальные признаки врастания соединительной ткани между волокнами имплантата. К концу эксперимента (28 суток) вокруг обоих эндопротезов преобладали фибробласты. Вокруг сетчатого имплантата нами отмечена широкая соединительнотканная капсула, большая часть ячеек которого также замещена соединительной тканью. В случае нетканого протеза соединительнотканная капсула заметно тоньше, а компоненты соединительной ткани тотально прорастали имплантат. Таким образом, несмотря на более выраженную воспалительную реакцию полное прорастание нетканого эндопротеза компонентами соединительной ткани и формирование фиброзной капсулы вокруг протеза возникает на более ранних сроках эксперимента, чем при использовании сетчатого эндопротеза. Выявленные отличия в тканевой реакции, на наш взгляд, связаны с различным типом имплантируемых эндопротезов. Так, сетчатый эндопротез «Biomesh P1 Mesh» является вязаным тяжелым полипропиленовым имплантатом с поверхностной плотностью 100 г/м² и толщиной волокон 0,6 мм. Волокна нетканого эндопротеза «Cousin» («Biomesh NK 2 Mesh») соединены между собой особым образом в условиях 15 термической обработки, не образуя переплетений и узлов, в отличие от сетчатого имплантата, волокна которого в процессе вязания сетки образуют узловые соединения. Такая структура нетканого протеза обеспечивает лучшее врастание компонентов соединительной ткани между волокнами имплантата и резистент- 16 60 100 50 80 40 60 30 40 20 20 10 0 0 3 7 14 28 3 а) нейтрофильные гранулоциты 25 100 20 80 7 14 28 б) макрофаги 60 15 40 10 20 5 0 3 0 3 7 14 28 в) лимфоциты 7 14 28 Prolene Surgipro Mesh SPMM Эсфил Biomesh P1 Mesh г) фибробласты 100 120 100 80 80 60 60 40 40 20 20 0 0 3 7 14 28 3 д) нейтрофильные гранулоциты 7 14 28 е) макрофаги 160 60 50 120 40 80 30 20 40 10 0 3 0 3 7 14 Vypro 28 ж) лимфоциты 7 Vypro II 14 Ultrapro 28 Biomesh NK2 Mesh з) фибробласты Рис. 1. Динамика изменения клеточных элементов в области имплантации тяжелых (а,б,в,г) и облегченных (д,е,ж,з) полипропиленовых сеток. По оси абсцисс – длительность эксперимента (сутки), по оси ординат – количество клеток в 10 полях зрения. 17 ность его к растяжению и деформации. Кроме того, количество полипропилена при изготовлении нетканого эндопротеза снижено до 35 г/м² а толщина его волокон составляет всего 0,25 мм, что также влияет на характер тканевой реакции. Имплантация большинства сетчатых эндопротезов вызывает развитие острого или подострого воспаления с умеренным отеком и инфильтрацией полиморфноядерными лейкоцитами и макрофагами в течение 1-3 недель [Klosterhalfen B. et al., 2002]. В наибольшей степени эти изменения выражены через 14–21 день, затем они переходят в более или менее выраженное хроническое воспаление, окружающее инородное тело. Одновременно с этим формируется богатая коллагеновыми волокнами рубцовая ткань, образующая трехмерную структуру вокруг и внутри сетчатого имплантата. При этом число фибробластов и уровень васкуляризации обратно коррелируют с длительностью воспалительной реакции, тогда как выраженное острое воспаление на начальных этапах имплантации вызывает образование значительного количества фиброзной ткани [Саркисов Д.С. и др., 1989]. По мнению R. Rosch с соавт. [2003] наиболее важными факторами, влияющими на биосовместимость с инородными материалами, являются интенсивность и продолжительность воспалительной реакции и процессов заживления, зависящие в свою очередь от типа материала. Выраженность воспалительной реакции в ответ на внедрение биоматериала в организм влияет в итоге на «вживление» эндопротеза в зоне имплантации. Другим важным параметром полипропиленовых сеток является структура их волокон. Сетки могут быть подразделены на монофиламентные и мульти(поли)филаментные, с наличием или без рассасывающегося компонента, имеющие дополнительное покрытие или нет. В результате проведенного нами сравнительного исследования установлено, что имплантация мультифиламентных сеток «Vypro» и «Vypro II» сопровождается более выраженной и длительной воспалительной реакцией с большим содержанием нейтрофильных гранулоцитов в отличие от монофиламентной облегченной композитной сетки «Ultrapro». Так на 3-и сутки эксперимента количество нейтрофильных гранулоцитов при использовании сеток «Vypro» было в 2,8 раза больше, а в случае с сеткой «Vypro II» в 3,6 раза по сравнению с исследованиями эндопротеза «Ultrapro» (p<0,05). Степень же выраженности фибропластической реакции при использовании этих сеток практически одинакова. В литературе имеются указания, что со временем между волокнами мультифиламентных сеток проникает большое количество микроорганизмов [Amid P.K. et al., 1994]. В то же время, в исследованиях in vitro показано увеличение роста фибробластов человека при их 18 инкубации в присутствии мультифиламентной сетки [Langer C. et al., 2005]. Таким образом, менее выраженные воспалительная реакция и фиброз, микроскопические признаки нормального заживления и лучшая интеграция в окружающие ткани отмечаются при имплантации эндопротезов с бóльшим размером пор, меньшим объемом полипропиленового компонента и монофиламентными волокнами. В нашем исследовании такими характеристиками обладала сетка «Ultrapro». Анализируя данные литературы по изучаемой проблеме, следует отметить, что в последние время все большее внимание придается использованию полипропиленовых эндопротезов с различными покрытиями с целью предотвращения развития осложнений. В основном эти покрытия используют для предотвращения развития спаечного процесса. Так, имеются указания на то, что предварительное покрытие полипропиленовых эндопротезов коллагеном [Duffy A. J. et al., 2004, Van't Riet M. et al., 2004], β-глюканом [Barrat C. et al., 2004], коллагеном карбокси-метилцеллюлозой [Yelimlies B. et al., 2003] сопровождается значительно менее выраженным спайкообразованием и лучшей интеграцией имплантата в ткани брюшной стенки. Однако при этом более часто развиваются инфекционные осложнения. Показано, что титановое покрытие оказывает положительный иммунологический эффект на процесс заживления ран и интеграцию имплантата в ткани [Junge K. et al., 2005]. В этой связи нами проведено сравнительное изучение тканевой реакции на имплантацию интактных и покрытых фибробластами полипропиленовых сеток. При сравнительном изучении динамики клеточной реакции на имплантацию полипропиленовых сетчатых эндопротезов «Prolene», «Эсфил», «Surgipro Mesh SPMМ» и «Biomesh P1 Mesh», покрытых фибробластами выявлено, что на ранних сроках эксперимента наиболее выраженная воспалительная реакция отмечается в зоне имплантации сеток «Surgipro Mesh SPMМ» и «Biomesh P1 Mesh». При этом клеточная реакция носила нейтрофильно-макрофагальный характер, при использовании эндопротеза «Prolene» – макрофагально-лимфоцитарный, а при применении сетки «Эсфил» – лимфоцитарно-макрофагальный характер воспаления. В результате проведенного нами морфометрического анализа препаратов установлено, что на 3-и сутки эксперимента наименьшее количество нейтрофильных гранулоцитов отмечается при использовании сетки «Эсфил» (рис. 2). В случае с эндопротезом «Prolene» их было больше в 1,5 раза (р<0,05), при применении сетки «Biomesh P1 Mesh» – в 3 раза (р<0,01), при имплантации протеза «Surgipro Mesh SPMМ» – в 5 раз больше (р<0,01). В целом на этом сроке наименее выраженная 19 воспалительная реакция выявлена при имплантации сетчатого эндопротеза «Prolene», а наиболее выраженная - при использовании эндопротезов «Эсфил» и «Surgipro Mesh SPMМ». К концу первой недели эксперимента воспалительная инфильтрация заметно уменьшается, начинает формироваться грануляционная ткань. Наименьшее количество нейтрофильных гранулоцитов установлено в зоне имплантации эндоротеза «Prolene», а наибольшее в случае с сеткой «Biomesh P1 Mesh» – в 6,5 раз больше чем при использовании сетки «Prolene» (р<0,05). Макрофагально-лимфоцитарная инфильтрация на этом сроке менее выражена при использовании эндопротезов «Prolen» и «Эсфил», в то время как в зоне имплантации сеток «Surgipro Mesh SPMМ» и «Biomesh P1 Mesh» она усиливается. Вблизи имплантатов выявляются коллагеновые волокна которые местами врастают в ячейки эндопротезов. При этом наиболее заметное увеличение количества фибробластов происходит в зоне расположения сетки «Prolene» и «Biomesh P1 Mesh». На последующих сроках количество фибробластов продолжает увеличиваться во всех случаях. Вокруг эндопротезов выявляется соединительнотканная капсула. Коллагеновые волокна прорастают в ячейки эндопротезов. При этом сохраняется довольно выраженная воспалительная инфильтрация соединительнотканной капсулы, особенно при использовании сетки «Biomesh P1 Mesh». При изучении клеточной реакции в зоне имплантации облегченных полипропиленовых сеток «Vypro», «Vypro II» и «Ultrapro», покрытых фибробластами нами установлено, что в ранние сроки (3-и сутки послеоперационного периода) в зоне имплантации выявляется большое количество клеток воспаления. Следует отметить, что количество нейтрофилов было наибольшим при применении сетки «Vypro», а при использовании сеток «Vypro II» и «Ultrapro» их было в 3 раза меньше (р<0,01). Число макрофагов было больше в зоне иплантации эндопротеза «Vypro II», а лимфоцитов вокруг эндопротеза «Ultrapro». Уже на этом сроке выявлялось достаточно много фибробластов, коллагеновых фибрилл и коллагеновых волокон, что особенно заметно при использовании сеток «Vypro II» и «Ultrapro». Через неделю эксперимента количество нейтрофильных гранулоцитов в области расположения эндопротезов уменьшалось более чем в половину. Была хорошо выражена макрофагальная реакция, причем клетки находятся в функционально активном состоянии. Фибропластическая реакция наиболее выражена при применении эндопротеза «Ultrapro»: в 2,8 раза больше чем при использовании сетки «Vypro» и в 2,1 раза больше чем при имплантации сетки «Vypro II» (р<0,05), а коллагеновые волокна формируют толстые пучки, которые врастают в имплантат и замещают большее количество ячеек эндопротеза. На более поздних сроках эксперимента вокруг эндопротезов формируется соединительнотканная капсула, при этом 20 плотность коллагеновых волокон выше в случае использования эндопротеза «Ultrapro». Компоненты соединительной ткани полностью прорастают волокна имплантатов. Сохраняется умеренно выраженная макрофагально- 21 60 80 50 60 40 30 40 20 20 10 0 0 3 7 14 28 3 а) нейтрофильные гранулоциты 40 7 14 28 б) макрофаги 160 120 30 80 20 40 10 0 3 0 3 7 14 28 в) лимфоциты 7 14 28 Prolene Surgipro Mesh SPMM Эсфил Biomesh P1 Mesh г) фибробласты 80 100 80 60 60 40 40 20 20 0 0 3 7 14 28 3 7 д) нейтрофильные гранулоциты 14 28 е) макрофаги 160 40 120 30 80 20 40 10 0 3 0 3 7 14 7 Vypro 28 ж) лимфоциты 14 Vypro II 28 Ultrapro з) фибробласты Рис. 2. Динамика изменения клеточных элементов в области имплантации тяжелых (а,б,в,г) и облегченных (д,е,ж,з) полипропиленовых сеток, покрытых фибробластами. По оси абсцисс – длительность эксперимента (сутки), по оси ординат – количество клеток в 10 полях зрения. 22 лимфоцитарная инфильтрация в зоне имплантации, особенно при использовании эндопротезов «Vypro» и «Vypro II». В доступной литературе мы не нашли указаний на подобные эксперименты на животных с использованием сетчатых эндопротезов, покрытых фибробластами. Тем не менее, были проведены экспериментальные исследования in vitro. M. Kapischke с соавт. [2005] указывают на возможность культивирования фибробластов с сетчатыми эндопротезами, и последущим их использованием в хирургическом лечении грыж. Они установили, что фибробласты колонизируют имплантат в течение 4-6 недель, при этом клетки характеризуются высокой пролиферативной активностью и высоким уровнем метаболизма. C. Langer с соавт. [Langer C. et al., 2005] производили инкубацию фибробластов человека с различными видами сетчатых эндопротезов и установили, что фибробласты растут преимущественно на облегченных сетках, вокруг тонких волокон и узлов сетки. Тяжелые сетки способствуют дегенеративным изменениям клеток. Полиглактин способствует клеточной пролиферации, в то время как прессованная поверхность нетканого эндопротеза без пор препятствует врастанию фибробластов. В аналогичном исследовании Егиева В.Н. с соавт. [2006] при инкубации различных вариантов тяжелых и облегченных полипропиленовых сеток с фибробластами также было установлено, что различные типы синтетических протезов, используемых в герниологии, обладают различной степенью фиксации фибробластов на своей поверхности. При этом наибольшее количество фибробластов на поверхности сеток отмечено в группах облегченных полипропиленовых сеток. Такие особенности могут быть связаны с различными эффектами, оказываемыми волокнами, входящими в состав сеток. Так, в экспериментах с использованием культивированных фибробластов человека показано, что ингибирующий эффект на рост фибробластов оказывает контакт с полипропиленом [Duchrow M. et al., 2002]. В более поздних исследованиях с использованием культур клеток человека была выявлена стимуляция клеточной реакции при использовании полиглактина («Vicryl») [Langer C. et al., 2005]. Кроме того, было выявлено, что пролиферация в ранней фазе заживления раны стимулируется трансформирующим фактором роста бета -1 (TGF-β1), а компоненты рассасывающихся эндопротезов значительно больше стимулируют пролиферацию, чем чистый полипропилен [Weyhe D. et al., 2006]. В результате проведенного эксперимента нами установлено, что имплантация полипропиленовых сеток, покрытых фибробластами, характеризуется более выраженной клеточной (как воспалительной, так и фибробластической) реакцией и более ранней инкорпорацией эндопротеза в ткани организма. При этом данный процесс наиболее четко выражен при 23 использовании облегченных полипропиленовых сеток, покрытых фибробластами. Таким образом, все изученные нами полипропиленовые эндопротезы характеризуются выраженной интеграцией с окружающими тканями в зоне имплантации, что позволяет их рекомендовать для дальнейшего исследования с целью внедрения в клиническую практику. Вместе с тем, следует отметить, что эксперименты на животных, особенно на мышах, имеют свои особенности, и результаты их не могут быть перенесены на ситуацию с человеком. Более благоприятный эффект использования новых сеток должен быть выявлен в рандомизированном исследовании в человеческой популяции. 1. 2. 3. 4. 5. 6. ВЫВОДЫ При морфологическом изучении операционного материала больных с рецидивами грыж установлено, что все исследованные эндопротезы даже спустя много лет (до 35) характеризовались стойкой хронической воспалительной реакцией на границе полимера и тканей реципиента. Более выраженные изменения, в том числе инфильтрация гигантскими многоядерными клетками инородных тел, выявлены при использовании эндопротезов из полиэтилентерефталата по сравнению с имплантатами из полипропилена. Имплантация полипропиленовых эндопротезов экспериментальным животным сопровождается развитием преимущественно экссудативной воспалительной (через 3 и 7 суток) и затем преимущественно фибропластической (через 14 и 28 суток) реакций. При иммуногистохимическом и электронномикроскопическом исследовании на ранних сроках эксперимента (3 и 7 суток) установлено повышение индекса пролиферации и преобладание клеток (макрофагов и фибробластов) в функционально активном состоянии в области расположения эндопротеза. Динамика морфологических изменений тканей зависит от физических и механических свойств имплантируемых эндопротезов: имплантация тяжелых полипропиленовых сеток сопровождается более выраженной воспалительной реакцией по сравнению с облегченными эндопротезами. Среди тяжелых полипропиленовых сеток наиболее выраженная воспалительная реакция отмечается при имплантации эндопротезов «Эсфил» и «Biomesh P1 Mesh». Формирование соединительнотканной капсулы вокруг сеток происходило в одинаковые сроки. Среди облегченных полипропиленовых эндопротезов наиболее выраженная воспалительная (в том числе нейтрофильная) и фибропластическая реакции наблюдаются при использовании 24 7. композитных мультифиламентных сеток («Vypro» и «Vypro II») и нетканого микропористого эндопротеза «Biomesh NK2 Mesh». При имплантации полипропиленовых эндопротезов, покрытых фибробластами, выявлены более выраженная клеточная (как воспалительная, так и фибропластическая) реакция и более ранний процесс инкорпорации материала в ткани организма. Формирование соединительнотканной капсулы наиболее четко выражено при использовании облегченных полипропиленовых сеток, покрытых фибробластами. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Выявленные при изучении операционного материала больных признаки хронического воспаления с наличием гигантских многоядерных клеток инородных тел в области имплантации эндопротезов из полиэтилентерефталата могут лежать в основе развития послеоперационных осложнений и рецидивов грыж. Изученные в эксперименте на животных полипропиленовые эндопротезы характеризуются выраженной интеграцией с окружающими тканями в зоне имплантации, что позволяет их рекомендовать для дальнейшего исследования с целью внедрения в клиническую практику. Полученные в работе количественные характеристики тканевой реакции в области имплантации сеток могут быть использованы при разработке новых эндопротезов. 1. 2. 3. 4. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Филаткина Н.В., Дубова Е.А. Характеристика полипропиленовых имплантатов // Материалы науч. конф. молодых ученых, посвященной 60-летию Института хирургии им. А.В.Вишневского. М., 2005. - С. 464465. Дубова Е.А., Филаткина Н.В., Чижов Д.В., Щеголев А.И. Морфологическая характеристика тканевой реакции в зоне имплантации сетчатых эндопротезов PROLEN и VIPRO // Герниология. - 2005. - № 4. - С. 30-34. Дубова Е.А., Филаткина Н.В., Чижов Д.В., Егиев В.Н.. Тканевая реакция на имплантацию полипропиленовых сеток // Материалы V международной конференции «Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных, шовных материалов и полимерных имплантатов». М., 2006. - С. 113-114. Щеголев А.И., Гогия Б.Ш., Дубова Е.А. Реакция тканей на эндопротезы, используемые для пластики брюшной стенки // Материалы V международной конференции «Современные подходы к разработке и 25 клиническому применению эффективных перевязочных, шовных материалов и полимерных имплантатов». М., 2006. - С. 222-223. 5. Дубова Е.А.. Особенности тканевой реакции на имплантацию сетки Prolen, покрытой фибробластами // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2006. - № 2. - С. 363364. 6. Константинова Н.Б., Дубова Е.А. Ультраструктурная характеристика реакции тканей на имплантацию полипропиленовых эндопротезов // Вестник Российского государственного медицинского университета. 2006. - № 2. - С. 384. 7. Дубова Е.А., Филаткина Н.В. Динамика тканевой реакции в зоне имплантации нетканного полипропиленового эндопротеза, покрытого фибробластами // Сборник трудов XXVIII конференции Общества молодых ученых МГМСУ. М., 2006. - С.102-103. 8. Дубова Е.А., А.И.Щеголев, Н.В.Филаткина, Д.В.Чижов, В.Н. Егиев. Морфологическая характеристика биологической совместимости эндопротезов // Материалы 2-ой международной научной конференции «Актуальные проблемы спортивной морфологии и интегративной антропологии». М., 2006. - С. 71-73. 9. Егиев В.Н., Дубова Е.А., Филаткина Н.В., Чижов Д.В., Щеголев А.И. Морфологическая характеристика тканевой реакции на полипропиленовые эндопротезы // Медицинский Вестник Эребуни. 2006. - № 1. - С. 27-28. 10. Щеголев А.И., Дубова Е.А., Чекмарева И.А., Втюрин Б.В. Характеристика ангиогенеза при имплантации полипропиленовых сеток // Ангиология и сосудистая хирургия. - 2006. - Приложение. - С. 61-62. 11. Дубова Е.А., Чекмарева И.А., Щеголев А.И., Филаткина Н.В., Чижов Д.В. Морфологические изменения в зоне имплантации сетчатых эндопротезов “PROLEN”и “ЭСФИЛ” // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - № 5. - С. 590-595. 12. Дубова Е.А., Щеголев А.И.. Количественная характеристика клеточной реакции на полипропиленовые эндопротезы // Верхневолжский медицинский журнал. - 2006. - Спецвыпуск. - С 24-25. 13. Егиев В.Н., Щеголев А.И., Чижов Д.В., Дубова Е.А., Филаткина Н.В. Сравнительная оценка тканевой реакции на имплантацию «облегченных» сеток, применяемых для пластики передней брюшной стенки // Герниология.- 2006. - № 3. - С. 15. 14. Егиев В.Н., Щеголев А.И., Дубова Е.А., Чижов Д.В., Филаткина Н.В. Сравнительная оценка тканевой реакции на имплантацию «тяжелых» и «облегченных» сеток, применяемых в герниологии // Герниология. 2006. - № 3. - С. 16. 15. Егиев В.Н., Щеголев А.И., Дубова Е.А., Чижов Д.В., Филаткина Н.В. Сравнительная оценка тканевой реакции на имплантацию «тяжелых» 26 сеток, используемых в герниологии // Герниология. - 2006. - № 3. - С. 16. 16. Дубова Е.А., Щеголев А.И., Филаткина Н.В., Чижов Д.В., Егиев В.Н. Морфологическая характеристика биологической совместимости сетки ЭСФИЛ, покрытой фибробластами // Журнал Российской ассоциации по спортивной медицине и реабилитации больных и инвалидов. - 2006. № 3. - С. 18-19. 17. Дубова Е.А., Щеголев А.И., Чекмарева И.А., Филаткина Н.В., Чижов Д.В., Егиев В.Н. Тканевая реакция на имплантацию облегченных полипропиленовых сеток // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - № 12. - С. 687-692. 18. Дубова Е.А., Щеголев А.И., Филаткина Н.В., Чижов Д.В., Егиев В.Н.. Экспериментальное изучение динамики тканевой реакции в зоне имплантации полипропиленовых сетчатых эндопротезов, покрытых фибробластами // Герниология. – 2007. - № 4. – С. 35-40. 19. Дубова Е.А., Щеголев А.И., Чекмарева И.А., Филаткина Н.В., Чижов Д.В., Егиев В.Н.. Морфологическая характеристика тканевой реакции в зоне имплантации нетканого полипропиленового эндопротеза Cousin // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - № 5. - С. 590-595. 27
