Курсовая работа-2005: Участие белка Keap1 в
реклама
Московский государственный университет Участие белка Keap1 в процессе импорта в ядро транскрипционного фактора Nrf2. Галимов Евгений Рафаэлевич студент 3-ого курса факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ Научные руководители: аспирант второго года обучения Химического факультета МГУ Филонов Г.С. аспирант первого года обучения Химического факультета МГУ Мельников С.В. Москва 2004 1. Введение ......................................................................................................................... 3 2. Обзор литературы .......................................................................................................... 4 2.1 Роль транскрипционных факторов в процессах клеточной адаптации ............. 4 2.2 Действие транскрипционного фактора Nrf2 в условиях окислительного стресса ............................................................................................................................ 4 2.3. Регуляция активности транскрипционного фактора Nrf2. ................................ 6 2.4. Регуляция активности индуцируемых транскрипционных факторов на уровне ядерно-цитоплазматического транспорта. ..................................................... 9 3. Исследование способности к ядерному импорту Nrf2 и его делеционных мутантов Nrf2 (результаты и обсуждение) .................................................................. 14 3.1 Детекция внутриклеточной локализации исследуемых белков с помощью GFP и окрашиванием клеток флуоресцентно меченными антителами ................. 15 3.2 Биоинформатический поиск сигнала ядерной локализации в структуре Nrf2. ....................................................................................................................................... 16 3.3 Получение рекомбинантных ДНК и исследование внутриклеточной локализации химерных белков и их делеционных мутантов ................................. 17 4. Материалы и методы ................................................................................................... 23 4.1 Используемые штаммы микроорганизмов, клеточные линии и реактивы ..... 23 4.2 Используемые приборы ........................................................................................ 24 4.3 Методы ................................................................................................................... 24 4.3.1 Приготовление компетентных клеток E.сoli ............................................... 24 4.3.2 Трансформация E.coli и манипуляции с плазмидной ДНК ....................... 24 4.3.3 Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле ..................................... 25 4.3.4 Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля ............................................. 25 4.3.5 Конструирование плазмид, используемых в настоящей работе ............... 25 4.3.6 Трансфекция клеток линии HeLa и изучение внутриклеточной локализации белков. ............................................................................................... 26 5. Выводы ......................................................................................................................... 28 6. Список литературы...................................................................................................... 29 2 1. Введение В эукариотических клетках вследствие сложного устройства генома ДНК была изолирована в особую органеллу – ядро, главной функцией которого стало хранение генетической информации. В результате этой обособленности огромное количество белков, участвующих в хранении и обслуживании ДНК были наделены транспортными последовательностями, позволяющими им перемещаться в ядро или из него. При этом выделилась группа белков – транскрипционных факторов, с помощью которых осуществляется управление работой генетического аппарата. Активность этих белков главным образом регулируется на уровне ядерно-цитоплазматического транспорта. Характерным примером транскрипционных факторов, для которых такой способ регуляции представляется наиболее характерным, являются белки-челноки, постоянно перемещающиеся между ядром и цитоплазмой. При этом их локализация в клетке отражает результат установившегося динамического равновесия между процессами импорта и экспорта. Модель ядерно-цитоплазматического транспорта как динамического равновесного процесса дает ясное представление о том, как сенсорные системы клетки чувствуют малейшие изменения гомеостатических условий и как осуществляется ранний ответ на эти изменения. Реагируя даже на слабые стимулы, клеточные сенсоры передают сигналы, смещающие равновесие в сторону цитоплазматической или ядерной локализации транскрипционного фактора. Вследствие этого запускается транскрипция подконтрольных ему генов, кодирующих белки, реализующие адаптацию к возникшим стимулам. В данной работе в рамках приведенной модели изучается ядерно- цитоплазматический транспорт транскрипционного фактора Nrf2 и его репрессора, белкачелнока Keap1 являющихся ключевым звеном в регуляции адаптации клетки к окислительному стрессу. 3 2. Обзор литературы 2.1 Роль транскрипционных факторов в процессах клеточной адаптации Разнообразие клеток в составе многоклеточного организма, их состояния в течение клеточного цикла, а также адаптационных приспособлений к различным условиям определяется степенью и специфичностью экспрессии содержащихся в них генов. Прежде всего, уровень экспрессии гена определяется частотой инициации транскрипции, которая в свою очередь зависит от наличия и активности тех или иных транскрипционных факторов. Транскрипционные факторы – это белки, которые, взаимодействуя со специфическими участками ДНК в окрестности гена, регулируют процесс инициации транскрипции. Несмотря на все многообразие транскрипционных факторов высших эукариот, их можно разделить на две основные группы. Первую из них составляют факторы, активность которых постоянна и без которых, как правило, не обходится ни один процесс инициации транскрипции. В эту группу входят основные факторы, которые опосредуют взаимодействие РНК-полимеразы с промотором, тем самым определяя точку старта транскрипции (SL1 etc.), и вспомогательные факторы, которые обеспечивают адекватный базальный уровень экспрессии гена. Вторую группу образуют транскрипционные факторы с индуцируемой активностью. Их действие проявляется лишь в определенных типах клеток или при некоторых воздействиях внешней для клетки среды и перестройках в ее собственном метаболизме. Эти белки связываются с небольшими, характерными только для подконтрольных генов последовательностями нуклеотидов, регулируя активность их транскрипции. Участки узнавания индуцируемых транскрипционных факторов носят название элементов ответа (response elements) и, как правило, одинаковые элементы ответа содержаться в структуре фланкирующих участков генов, кодирующих функционально близкие белки. Благодаря этому распределению элементов ответа и активации индуцируемых транскрипционных факторов в условиях того или иного воздействия в клетке происходит согласованная перестройка экспрессии целой группы генов, которая приводит к повышению внутриклеточного количества белков, противодействующих воздействию среды [1]. Таким образом, кондиционная активация этой группы транскрипционных факторов максимально смягчает эффект воздействия на клетку среды и тем самым лежит в основе явления клеточной адаптации. 2.2 Действие транскрипционного фактора Nrf2 в условиях окислительного стресса Одним из неблагоприятных воздействий на клетку окружающей среды является проникновение в нее чужеродных веществ, нарушающих восстановленное состояние цитозоля и ядра. Однако уже на самых ранних стадиях проникновения в клетку электрофилов 4 или оксидантов, когда токсическое действие этих соединений проявлено лишь в малой степени, их присутствие в цитозоле индуцирует мощный адаптационный ответ, направленный на защиту внутриклеточной среды. Благодаря высокой чувствительности к изменениям своего состава, за короткий промежуток времени клетка успевает перестроить свой метаболизм так, что она оказывается подготовленной к воздействию чужеродных веществ и дальнейшее их попадание во внутриклеточную среду оказывается не столь опасным и в конечном счете преодолевается их обезвреживанием и выведением. Этот адаптационный механизм носит название окислительного стресса, и помимо накопления в клетке токсичных ксенобиотиков, он развивается под действием ионизирующей радиации, облучения ультрафиолетом, в процессе нормального протекания фагоцитоза и в воспалительных процессах. Результатом длительного существования клеток в подобных условиях могут быть различные патологии, такие как рак, нейродегенеративные заболевания, старение. В основе эффективного протекания окислительного стресса лежит активация группы транскрипционных факторов, одним из которых является белок Nrf2. Nrf2 активируется в условиях окислительного стресса, вызванного проникновением в клетку электрофилов или оксидантов, и, в комплексе со вспомогательными белками, он взаимодействует с последовательностями ARE (antioxidant response element) [2]. Это взаимодействие приводит к согласованному усилению транскрипции всех генов, которые в своих промоторных или энхансерных участках содержат данные регуляторные последовательности. На сегодняшний день ARE охарактеризованы в 5΄-фланкирующих участках генов, кодирующих ферменты биосинтеза антиоксидантов (гемоксигеназа 1, каталитическая и регуляторная субъединицы γглутамил-цистеин-синтетазы etc.) ферменты, участвующие в детоксификации чужеродных веществ (НАД(Ф)Н-хинон оксидоредуктаза, глутатион-трансфераза etc.), а также в энхансерах генов тиоридоксина, восстанавливающего окисленные до дисульфидов остатки цистеина белков цитозоля и ядра, нескольких субъединиц протеасомы и легкой цепи ферритина. Таким образом, активация Nrf2 в условиях окислительного стресса приводит к усилению работы ферментативных систем, благодаря которым чужеродные соединения с высокой и неспецифической химической активностью эффективно обезвреживается и выводятся из клетки, а поврежденные их действием молекулы – репарируются или заменяются новыми [3]. Способность Nrf2 осуществлять трансактивирующее действие основана на взаиодействии с коактиватором транскрипции гистонацетилтрансферазной гистонацетилтрансферазы. активностью, Кроме того, Комплекс CBP/p300. а также CPB/p300 CBP/p300 привлекает взаимодействует обладает дополнительные с компонентами комплекса РНК-полимеразы II. Ацетилирование гистонов делает структуру хроматина более 5 открытой для взаимодействия с комплексом РНК полимеразы II, а взаимодействие CPB/p300 с комплексом РНК-полимеразы II приводит к более частой инициации транскрипции в этом участке. Nrf2 связывает CBP/p300 с помощью двух транскактивирующих доменов NEH4, NEH5 (Nrf2–ECH homology, ECH – куриный гомолог Nrf2 человека). Стоит отметить, что и NEH4, и NEH5 имеют участки связывания CBP/p300 и способны связывать коактиватор транскрипции и по отдельности. Их одновременное присутствие в структуре Nrf2 усиливает способность друг друга взаимодействовать с CBP/p300, т.е. связывание имеет кооперативный характер [4]. Рис.1 Nrf2 взаимодействует с ARE и комплексом CBP/p300. ДНК-связывающий участок Nrf2 NEH1 представляет собой домен bZip (basic region and leucine zipper), который отвечает за димеризацию Nrf2 и связывание с ARE. Структурные особенности bZip-домена Nrf2 таковы, что он не может образовывать гомодимеры, и поэтому для связывания Nrf2 с ARE необходимы вспомогательные белки-партнеры, содержащие подходящий bZip-домен [5]. Из них наиболее изученными к настоящему времени являются белки семейства малых Maf. Эти белки состоят из одного единственного домена и их роль в регуляции активности Nrf2 еще не ясна. Известно, что помимо димерзации с малыми Maf, Nrf2 может образовывать функционально активные димеры с транскрипционными факторами ATF4 и с-Jun. На N-конце Nrf2 содержит NEH2 домен. NEH2 не играет роли в функционировании Nrf2 как транскрипционного фактора, но играет важную регуляторную роль, позволяющую Nrf2 активно функционировать только в условиях окислительного стресса и быть неактивным в нормальных условиях. 2.3. Регуляция активности транскрипционного фактора Nrf2. Когда организм находится вне угрозы токсического действия электрофилов и оксидантов, активность Nrf2 существенно снижена. Во-первых, функционирующие в нормальных условиях клетки содержат в несколько раз меньшее количество самого транскрипционного 6 фактора, нежели в условиях окислительного стресса. Во-вторых, практически все оставшееся количество Nrf2 исключено из ядра и локализуется в цитоплазме. Ключевым звеном регуляции активности Nrf2 является его взаимодействие со специфическим белком-репрессором Keap1. Механизм действия Keap1 состоит в том, что его С-концевой участок - Kelch-домен, - взаимодействует с NEH2 доменом Nrf2, тогда как Nконцевой домен BTB связывается с компонентами убиквитин-лигазного комплекса Cul3 [6]. Рис.2 Keap1 направляет Nrf2 на деградацию. Keap1 выступает в роли адаптора между убиквитин-лигазным комплексом и Nrf2 и опосредует процесс переноса на транскрипционный фактор убиквитина, что в конечном счете приводит к деградации Nrf2 комплексом 26S протеасомы и многократному снижению его внутриклеточного уровня. Более того, благодаря цитоплазматической локализации Keap1 оставшаяся часть Nrf2 оказывается связанной в цитозоле клетки и недоступной для взаимодействия с ARE. Рис.3 Оставшаяся часть Nrf2 удерживается Keap1 в цитоплазме Детальные механизмы переноса убиквитина на Nrf2 неизвестны. Известно, что для процесса Keap1-зависимого убиквитинилирования Nrf2 в структуре Keap1 необходимы два остатка цистеина (273 и 288 а.к.о.), расположенные в области, соединяющей два домена Keap1. Точечная мутация любого из этих остатков полностью нарушает процесс переноса убиквитина на Nrf2 [7]. В структуре Nrf2 необходимыми для этого процесса оказываются два участка NEH2-домена: участок ETGE (79-82 а.к.о.), важный для взаимодействия с Kelchдоменом Keap1 и участок DIDLID (17-32 а.к.о.), который по-видимому отвечает за взаимодействие с убиквитин-лигазой. 7 Взаимодействие Keap1-Nrf2 регулируется каскадами MAPK, PIK3, протеинкиназой эндоплазматического ретикулума PERK, а также in vitro протеинкиназой С. В условиях окислительного стресса репрессия функционирования Nrf2 снимается. Механизм активации Nrf2 окончательно не выяснен. Известно, что помимо активности протеинкиназ, для дерепрессии функций Nrf2 критически необходимым оказывается остаток цистеина в BTB-домене Keap1 (151 а.к.о.). Точечная мутация этого остатка делает Keap1 конститутивным репрессором Nrf2. В условиях окислительного стресса к этому остатку ковалентно присоединяется множество разных высокомолекулярных соединений, образующих устойчивые к действию восстановителей модификации Keap1 [7]. Одна из общепринятых на сегодняшний день гипотез, объясняющая кондиционную активацию Nrf2 в условиях окислительного стресса состоит в том, что действие каскадов вышеупомянутых протеинкиназ ослабляет взаимодействие Keap1 c Nrf2, а под действием электрофилов и оксидантов происходит окисление или модификация остатков цистеина 273 и 288, что приводит к нарушению переноса убиквитина на Nrf2 и его стабилизации. Таким образом Nrf2 приобретает возможность накапливаться в ядре, в то время как Keap1 не изменяет своей внутриклеточной локализации и остается цитоплазматическим. Стоит отметить, что Nrf2 убиквитинируется и в условиях окислительного стресса, но время его полужизни – существенно больше. За деградацию Nrf2 в условиях окислительного стресса отвечает NEH6 домен и процесс убиквитинилирования протекает по-видимому в ядре. Механизм терминации Nrf2-зависимой активации транскрипции остается не выясненным. Одно из возможных объяснений терминации действия Nrf2 в нормализовавшихся условиях состоит в том, что Nrf2 просто прекращает поступать из цитоплазмы благодаря реактивации Keap1, а оставшаяся его часть в ядре постепенно деградирует, покуда не исчезает вовсе. На сегодняшний день существует множество интересных экспериментальных наблюдений относительно деталей поведения Keap1 и Nrf2, физиологический смысл которых остается невыясненным. В частности, известно, нокаут гена Nrf2 в организме мыши не только нарушает усиление работы генов защитных белков в условиях окислительного стресса, но также приводит к падению уровня транскрипции некоторых (но не всех) из этих генов в нормальных условиях. Таким образом, Nrf2 каким-то образом участвует в поддержании базального уровня транскрипции некоторых из своих генов-мишеней [8] Еще одно наблюдение состоит в том, что Nrf2 каким-то образом подавляет транскрипцию некоторых генов, активность которых в условиях окислительного стресса оказывается нежелательной. Большая часть этих генов кодирует белки семейства цитохромов P450, одной из функций которых является одноэлектронное восстановление чужеродных веществ. В ряде случаев этот процесс может привести к повышению реакционной способность превращаемого соединения и тем самым увеличивать его токсичность, и поэтому он является 8 крайне нежелательным в условиях большого содержания этих веществ в клетке. Интересно, что репрессирующие действие Nrf2 сохраняется на протяжении всего времени воздействия ксенобиотиков на клетки (на протяжении недели), тогда транскрипция большинства генов, кодирующих защитные белки, спадает к своему базальному уровню [9]. Существенным дополнением к пониманию картины функционирования Nrf2-зависимого пути активации транскрипции генов явилось открытие в структуре Keap1 сигнала экспорта из ядра. Оказалось, что цитоплазматическая локализация этого белка, а также его комплекса с Nrf2 в нормальных условиях, является результатом динамического равновесия процессов его транспорта в ядро и из ядра в цитоплазму, при преобладании последнего, а белки непрерывно перемещается между ядром и цитоплазмой [10]. В свете этого, возможным объяснением терминации является то, что Keap1, непрерывно перемещающийся между ядром и цитоплазмой, как в норме, так и в условиях окислительного стресса, может обратно связывать Nrf2, в свою очередь связанного с ARE, и в комплексе с транскрипционным фактором транспортироваться из ядра в цитоплазму. Так же остается непонятным проникают ли Keap1 и Nrf2 в ядро независимо друг от друга или импорт этих белков взаимосвязан и они транспортируются в ядро в комплексе друг с другом? Однако прежде чем перейти к выяснению ответа на этот вопрос, следует рассмотреть ту роль, которую ядерно-цитоплазматический транспорт играет в функционировании ряда исследованных к настоящему времени транскрипционных факторов с индуцируемой активностью. 2.4. Регуляция активности индуцируемых транскрипционных факторов на уровне ядерноцитоплазматического транспорта. Так как синтез белка протекает в цитоплазме, транскрипционные факторы нуждаются в специальных средствах, обеспечивающих их транспорт в ядро. Транспорт белков между ядром и цитоплазмой осуществляется через ядерную пору - специальный канал в ядерной мембране, образованный белками нуклеопоринами, часть из которых, образующая внутренний канал поры, содержит множественные повторы типа FxFG или GxFG (FGповторы). В большинстве случаев ядерные белки содержат в своей структуре сигнальный пептид сигнал ядерной локализации, - который чаще всего представляет собой короткий, экспонированный на поверхность белка участок полипептидной цепи, обогащенный остатками положительно заряженных аминокислот (лизина и аргинина) и наличие которого в структуре белка обеспечивает его активный транспорт в ядро. Последовательность сигнала ядерной локализации в большинстве случаев укладывается в один из видов: 9 BBBB, PBBB, PxxBBB или BBx10BBB, где В – остаток положительно-заряженной аминокислоты. В цитоплазме сигнал ядерной локализации узнается специальными белками- переносчиками – импортинами, - приобретают при этом способность взаимодействовать с FG-повторами нуклеопоринов, тем самым доставляя транспортируемый белок к ядерной поре. Рис.4 Транспорт белков в ядро Благодаря особой пространственной организации FG-повторов, при которой повтор, характеризующийся более сильным взаимодействием с импортином, находится в более близкой к ядру части поры, импортин в комплексе с переносимым белком транслоцируется через канал, оказываясь на другой его стороне, по сути – в ядре. Под действием вспомогательного белка, связывающего импортин, транспортируемый белок высвобождается в кариоплазму, а импортины возвращаются в цитозоль и осуществляется транспорт новых молекул [11]. Экспорт белков также зачастую опосредован наличием в их структуре сигнальной последовательности – сигнала экспорта из ядра. Классический сигнал экспорта из ядра представляет собой участок полипептидной цепи, обогащенный остатками гидрофобных алифатических аминокислот. Последовательность сигнала экспорта из ядра в большинстве случаев укладывается в общий вид: Lx2,3(F/I/L/V/M)x1-3Lx(I/V/L) Этот мотив узнается белком-экспортином Crm1, который в комплексе со вспомогательным белком транслоцируется через канал поры по градиенту связывания с FGповторами, который для Crm1 оказывается направленным в противоположную, чем для импортинов сторону – в сторону цитоплазмы. 10 Рис.5 Транспорт белков в цитоплазму В цитозоле транспортируемый белок высвобождается, а Crm1 возвращается в ядро готовым начать новый цикл экспорта [11]. Стоит отметить, что для транспорта через ядерную пору белок может и не иметь сигнала ядерной локализации или экспорта из ядра, но взаимодействовать с другим белком, имеющим такой сигнальный пептид. В ряде случаев этот принцип имеет регуляторное значение. В структуре Keap1 и Nrf2 хорошо охарактеризованным является лишь один транспортный сигнал – сигнал экспорта из ядра Keap1, локализованный в участке между BTB и kelchдоменами. Помимо этого в литературе имеется упоминание о сигнале ядерной локализации, расположенного в близи от NEH1 домена, и сигнале экспорта из ядра Nrf2 [6,7]. Известно, что Keap1 и в норме и в условиях окислительного стресса непрерывно перемещается между ядром и цитоплазмой (шаттлирует) и опосредует экспорт из ядра Nrf2 в нормально функционирующей клетке. Такое поведение системы Keap1/Nrf2 напоминает поведение белка p53 и его репрессора MDM2. Онкосупрессор р53 является транскрипционным фактором, переключающим активность работы ряда генов в различных стрессовых состояниях клетки, результатом чего является аррест клеточного цикла или апоптоз. Р53 содержит С-концевой сигнал ядерной локализации и два сигнала экспорта из ядра, расположенных соответственно в N- и Cконцевых участках белка, благодаря чему он постоянно шаттлирует между ядром и цитоплазмой. Активность р53 регулируется его взаимодействием с белком-репрессором MDM2, обладающим активностью убиквитин-лигазы. Помимо деградации р53 комплексом 26S протеасомы, взаимодействие MDM2 и р53 приводит к усиленному экспорту р53 из ядра. Таким образом, как и в случае системы Nrf2/Keap1 взаимодействие p53 c репрессором приводит к снижению количества транскрипционного фактора в клетке и изменению его внутриклеточной локализации. В условиях стресса происходит фосфорилирвание р53, уменьшающее его сродство к MDM2, в результате чего уровень белка в клетке возрастает и 11 он становится преимущественно ядерным. Помимо фосфорилирования, взаимодействие p53 и MDM2 белком p19ARF, который под действием определенных стимулов удерживает MDM2 в цитоплазме, предотвращая MDM2-зависимый экспорт p53 из ядра. Однако несмотря на видимые сходства, механизм репрессии p53 белком MDM2 имеет ряд принципиальных отличий. Во-первых, в условиях окислительного стресса Keap1 не утрачивает способности проникать в ядро. Во-вторых, несмотря на то, что MDM2 содержит сигнал экспорта из ядра, активность этого сигнала не является необходимой для эффективного экспорта p53 из ядра. Дело в том, что сигнал ядерной локализации и один из сигналов экспорта из ядра р53 локализованы в пределах домена, отвечающего за тетрамеризацию p53, благодаря чему образование тетрамерного комплекса отражается на динамике ядерно-цитоплазматического транспорта транскрипционного фактора. Причина усиления экспорта р53 из ядра под действием MDM2 заключается, по-видимому, в том, что убиквитинилирование р53 приводит к конформационным изменениям в его структуре при которых происходит демаскирование основного сигнала экспорта из ядра. Тогда как в случае Keap1 показано, что мутация его сигнала экспорта из ядра приводит к тому, что оба белка – и Keap1, и Nrf2, - перераспределяются в ядро. Эта ситуация напоминает регуляцию ядерно-цитоплазматического транспорта NF-kB его репрессором I-kBα. Транскрипционный фактор NF-kB состоит из двух субъединиц – p50 и р65, одна из которых, р50, содержит сигнал ядерной локализации. Связывание с NF-kB c IkBα приводит к частичному маскированию сигнального пептида в структуре р50 и, следовательно, к ослаблению импорта NF-kB в ядро. Кроме того, I-kBα содержит лейцинбогатый сигнал экспорта из ядра, благодаря активности которого и способности I-kBα связывать NF-kB осуществляется эффективный экспорт транскрипционного фактора из ядра. Под действием активирующих NF-kB стимулов I-kBα начинает деградировать через комплекс 26 S протеасомы и его уровень в клетке падает, что приводит к перераспределению NF-kB в ядро. Однако помимо активации транскрипции основных генов-мишеней, NF-kB усиливает транскрипцию гена I-kBα. Тем самым длительная активность NF-kB ограничивается параллельно возрастающим количеством белка-репрессора. Интересно, что сродство сигнала экспорта из ядра I-kBα к Сrm1 невелика для того, чтобы обеспечить адекватный уровень транспорта этого белка в цитоплазму, но она существенно возрастает при связывании I-kBα с NF-kB. Таким образом, попав в ядро, I-kBα может выйти из него только в связанной с NF-kB форме. Это явление лежит в основе процесса терминации NF-kB-зависимой активации транскрипции. Еще одной системой, напоминающей поведение белков Keap1/Nrf2, является белок βкатенин и регулирующий его активность белок-репрессор APC. β-катенин обладает способностью непосредственно взаимодействовать с белками ядерной поры, и таким образом 12 перемещаться между ядром и цитоплазмой без участие импортинов и экспортинов. Участие β-катенина в регуляции транскрипции основано на его способности взаимодействовать с транскрипционным фактором LEF-1 и входящим в состав одного из основных факторов транскрипции белком TBP. Интересной деталью функционирования этой системы является то, что LEF-1 несет только ДНК-связывающую функцию, тогда как непосредственно за активацию транскрипции отвечает β-катенин. Активность β-катенина регулируется путем его фосфорилирования протеинкиназой взаимодействию с белком APC. GSK3, которое делает β-катенин способным к В своей структуре АPC содержит как сигнал ядерной локализации, так и сигнал экспорта из ядра, и благодаря конкуренции с TFC/LEF-1 за связывание β-катенина он разрушает активный комплекс LEF-1/ β-катенин. Более того, взаимодействие APC и β-катенина приводит к убиквитинилированию последнего и его быстрой деградации через комплекс 26 S протеасомы. Однако как и случае р53 и Mdm2, несмотря на наличие в структуре APC сигнала экспорта из ядра, экспорт из ядра β-катенина не требует активности этого сигнального пептида [12]. Подобные детали ядерно-цитоплазматического транспорта для белков Keap1 и Nrf2 в настоящее время неизвестны. Неизвестно регулируется ли активность сигналов ядерноцитоплазматического транспорта в структуре этих белков, так же неидентифицированным в структуре Keap1 остается сигнал ядерной локализации. Несмотря на то, что установлен факт способности проникать в ядро как Nrf2, так и Keap1 – остается невыясненным транспортируются ли эти белки в ядро в виде комплекса, или их импорт независим, и как эта ситуация изменяется в условиях окислительного стресса. Решение этих вопросов может пролить свет на картину регуляции активности транскрипционного фактора Nrf2 как в условиях окислительного стресса, так и в нормальных условиях, а так же выяснить механизмы активации и терминации Nrf2-зависимого ответа на стимулы, вызывающие окислительный стресс. 13 3. Исследование способности к ядерному импорту Nrf2 и его делеционных мутантов Nrf2 (результаты и обсуждение) Известно, что Keap1 имеет сигнал экспорта из ядра (сокр. NES – nuclear export signal) и предположительно сигнал ядерной локализации (сокр. NLS - nuclear localization signal) в своей C-концевой половине, что позволяет ему шаттлировать между ядром и цитоплазмой. Транскрипционный фактор Nrf2, регулируемый Keap1, по-видимому также имеет NLS, поскольку при его сверхэкспрессии в клетке он накапливается в ядре. Более того, в одной из последних статей указывалась локализация NLS в С-концевой половине Nrf2 [6]. Репрессия Nrf2 осуществляется через его взаимодействие с Keap1, который, благодаря силе своего NES вытаскивает Nrf2 из ядра и локализует в цитоплазме, разобщая тем самым транскрипционный фактор и его гены-мишени. Нами было решено продолжить изучение комплекса Nrf2/Keap1 и уточнить предложенную в нашей лаборатории модель регуляции транскрипционного фактора Nrf2 шаттлирующим репрессором Keap1, а именно: исследовать участвует ли Keap1 в импорте Nrf2 в ядро или эти два белка проходят сквозь ядерные поры независимо. Цель работы: исследование согласованности импорта в ядро Keap1 и Nrf2. Для решения этой задачи было предложено использовать делеционные мутанты Nrf2: N-концевая половина Nrf2 wt (Nrf2 wt – wild type Nrf2), N- концевая половина Nrf2∆ETGE (делеционный мутант, который не взаимодействует с Keap1, вследствие удаления из NEH2-домена необходимого для этого тетрапептида ETGE). Предполагалось исследовать их локализацию отдельно, в присутствии Keap1, неспособного выходить из ядра за счет мутации в его сигнале ядерного экспорта, (Keap1NES), а также вместе с Keap1 wt после обработки клеток лептомицином Б (LMB). Идея этих экспериментов заключается в следующем: если не содержащая NLS Nконцевая половина Nrf2 wt перераспределяется в ядро в условиях нарушенного экспорта Keap1 (под действием лептомицина B или путем мутации его NES) то импорт в ядро Nrf2 хотя бы частично происходит за счет взаимодействия с Keap1. В качестве контроля используется N-концевая половина Nrf2∆ETGE, которая не способна взаимодействовать с Keap1, и следовательно, не попадет в ядро ни при каких обстоятельствах. Таким образом наша задача сводилась к следующему: 1. Выбрать метод наблюдения за локализацией Nrf2 и его мутантов в присутствии и в отсутствии Keap1 14 2. Подтвердить нахождение NLS в структуре белка Nrf2 3. Создать плазмиды, кодирующие полноразмерные Nrf2 и Nrf2∆ETGE и их делеционные мутанты и исследовать локализации полученных белков 4. Изучить локализацию полученных мутантов совместно с Keap1 wt (в присутствии и отсутствии LMB) и c Keap1NES 3.1 Детекция внутриклеточной локализации исследуемых белков с помощью GFP и окрашиванием клеток флуоресцентно меченными антителами Для наблюдения за локализацией Nrf2 и его мутантов было предложено создание химерных конструкций с EGFP (enhanced green fluorescent protein – яркий зеленый флуоресцирующий белок) положение которых в клетке можно отслеживать при помощи метода флуоресцентной микроскопии. Для этого белок-кодирующую часть кДНК Nrf2 и его мутантов с помощью генноинженерных манипуляций встроили в одной рамке считывания с EGFP в плазмидный вектор, направляющий транскрипцию и трансляцию гена химерного белка в клетках млекопитающих. При трансфекции клеток такой плазмидой в них начинает синтезироваться химерный белок, за распределением которого можно следить по флуоресценции EGFP. GFP – это белок массой около 28 кДа из организма медузы A.victoria. GFP способен флуоресцировать светло-зеленым светом и широко применяется в качестве метки для определения внутриклеточной локализации слитых с ним белков. Максимум возбуждения белка приходится на длину волны 395 нм, а максимум флуоресценции соответствует длине волны 508 нм. Образование хромофора GFP происходит посттрансляционно в результате взаимодействия полипептидной цепи с молекулярным кислородом и не зависит от типа клеток, синтезировавших белок. Важно также, что GFP является биологически инертным и, как правило, не влияет на свойства слитых с ним белков. Кроме того, он не содержит каких-либо сигнальных последовательностей, что делает его удобным маркером для изучения локализации и транспорта в клетке слитых с ним белков. Использование химерных белков на основе GFP дает нам одно неоспоримое преимущество по сравнению с другими методами - мы можем наблюдать локализацию белков непосредственно в живых клетках. Остальные способы ее изучения - окрашивание клеток антителами к белку или измерение его количества в фракциях клеточных органелл - требуют предварительной обработки клеточной культуры (фиксация и фракционирование соответственно). EGFP – это генетически модифицированный GFP дикого типа с увеличенной яркостью флуоресценции и кДНК, измененной с учетом частоты встречаемости кодонов у млекопитающих. Именно его кДНК мы выбрали для создания конструкций, кодирующих белки-химеры. 15 Локализация Keap1 wt наблюдалась с помощью окрашивания фиксированных и пермеабилизованных клеток сначала моноклональными антителами к этому белку, а затем вторичными антителами, конъюгированными с хромофором. 3.2 Биоинформатический поиск сигнала ядерной локализации в структуре Nrf2. Первоначально целью нашей работы был поиск NLS Nrf2. Но в упоминавшейся выше статье, появившейся в мае этого года авторы утверждали, что они нашли NLS и указали его местонахождение – в C-концевой половине белка слева от домена bZIP. Тем не менее они не привели аминокислотной последовательности этого сигнала. Воспользовавшись программами PSORT и PredictNLS Online нами действительно были обнаружены участки в С-концевой половине Nrf2, удовлетворяющие консенсусу канонического NLS. Результаты анализа программой PSORT 2 (http://psort.nibb.ac.jp/form2.html) pat4: RKRK (5) at 515 (515 значит номер первой а.о. в сигнальной последовательности авт.) pat7: PKSKKPD (5) at 595 bipartite: RRRGKNKVAAQNCRKRK at 502 bipartite: RRGKNKVAAQNCRKRKL at 503 content of basic residues: NLS Score: 9.3% 1.59 Результаты анализа программой PredictNLS (http://cubic.bioc.columbia.edu/cgi/var/nair/resonline.pl) RRRGKNKVAAQNCRKRK 501 (501 значит номер аминокислотного остатка, после которого идет последовательность сигнала авт.) RKRKLENIVELEQDLDHLKDEKEKLLKEK 514 Ниже представлена аминокислотная последовательность Nrf2 человека из NCBI Protein (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=20149576) с отмеченным предполагаемым NLS, который нашли обе программы. 1 MMDLELPPPGLPSQQDMDLIDILWRQDIDLGVSREVFDFSQRRKEYELEKQKKLEKERQE QLQKEQEKAFFAQLQLDEETGEFLPIQPAQHIQSETSGSANYSQVAHIPKSDALYFDDCM QLLAQTFPFVDDNEVSSATFQSLVPDIPGHIESPVFIATNQAQSPETSVAQVAPVDLDGM QQDIEQVWEELLSIPELQCLNIENDKLVETTMVPSPEAKLTEVDNYHFYSSIPSMEKEVG NCSPHFLNAFEDSFSSILSTEDPNQLTVNSLNSDATVNTDFGDEFYSAFIAEPSISNSMP 16 SPATLSHSLSELLNGPIDVSDLSLCKAFNQNHPESTAEFNDSDSGISLNTSPSVASPEHS VESSSYGDTLLGLSDSEVEELDSAPGSVKQNGPKTPVHSSGDMVQPLSPSQGQSTHVHDA QCENTPEKELPVSPGHRKTPFTKDKHSSRLEAHLTRDELRAKALHIPFPVEKIINLPVVD FNEMMSKEQFNEAQLALIRDIRRRGKNKVAAQNCRKRKLENIVELEQDLDHLKDEKEKLL KEKGENDKSLHLLKKQLSTLYLEVFSMLRDEDGKPYSPSEYSLQQTRDGNVFLVPKSKKP DVKKN 605 Обозначения: NNNNNNN – N-концевая половина Nrf2, используемая в нашей работе (2-327 аминокислотные остатки) NNNNNNN - C-концевая половина Nrf2, используемая в нашей работе (327-605 аминокислотные остатки) N – перекрывающийся для С-концевой и N- концевой половин аминокислотный остаток NNNNNNN – предполагаемый NLS, найденный программами PSORT и PredictNLS Online. Таким образом, проведенное нами исследование последовательности Nrf2 биоинформатическими методами при помощи двух различных программ подтвердило возможное существование NLS в С-концевой половине белка, как и указывалось в статье [6], и исходя из этих данных мы могли приступить непосредственно к эксперименту. 3.3 Получение рекомбинантных ДНК и исследование внутриклеточной локализации химерных белков и их делеционных мутантов В первую очередь было решено проверить, аналогично ли поведение химерного белка EGFP-Nrf2 и поведение белка без искусственных довесков (Nrf2 wt). Для этого предполагалось клонировать полноразмерную кДНК Nrf2 (как wt, так и с делетированным тетрапептидом ETGE, ответственным за взаимодействие с Keap1) в вектор pEGFPC2 (Clontech), содержащий ген EGFP. Поскольку в этом случае EGFP соединялся непосредственно с NEH2-доменом Nrf2, что могло воспрепятствовать его репрессии белком Keap1, было решено сделать два простых клонирования, целью которых было создание линкера из примерно 20 аминокислотных остатков между EGFP и Nrf2. Таким образом, мы разделили в пространстве EGFP и регуляторный NEH2-домен, чтобы не нарушить функцию последнего. Сначала кДНК гена Nrf2 была клонирована в вектор pBlueScriptSK+, из которого уже по другим сайтам рестрикции была вырезана кДНК Nrf2 c линкером в 63 нуклеотида перед 5’ концом и лигирована в pEGFPC2 по липким концам. То же было сделано и для кДНК Nrf2∆ETGE (кДНК этого белка была ранее получена в 17 нашей лаборатории). Таким образом, были сконструированы две плазмиды (pEGFP-Nrf2 и pEGFP-Nrf2∆ETGE), кодирующие химерные белки EGFP-Nrf2 и EGFP-Nrf2∆ETGE. С помощью этих плазмид предполагалось убедиться, что EGFP-Nrf2 и EGFP-Nrf2∆ETGE обладают свойствами аналогичными Nrf2 wt, за исключением способности связываться с Keap1: предполагалось, что у EGFP-Nrf2∆ETGE она будет нарушена. Т.е. необходимо было увидеть, что: а) локализация EGFP-Nrf2 и EGFP-Nrf2∆ETGE ядерная б) одновременный синтез в клетке Keap1 вызывает перераспределение в цитоплазму EGFP-Nrf2 и не влияет на распределение EGFP-Nrf2∆ETGE Для выяснения этого были сделаны трансфекции плазмид, кодирующих EGFP-Nrf2 и EGFP-Nrf2∆ETGE, в клетки линии HeLa. За положением белков в клетке следили при помощи флуоресцентной микроскопии (рис. 3.1 A и Б). Как видно, локализация EGFP преимущественно ядерная, что полностью совпадает с распределением в клетке Nrf2 wt. Так же положение EGFP-Nrf2 и EGFP-Nrf2∆ETGE в клетке было подтверждено окрашиванием клеток антителами на Nrf2 (рис. 3.1 б). А Б Рис. 3.1 Локализация в клетках линии HeLa химерных белков EGFP-Nrf2 (A) и EGFP-Nrf2∆ETGE (Б). Зеленый канал – флуоресценция EGFP, красный – дополнительное окрашивание белка антителами на Nrf2. Здесь и далее: нижняя левая четверть панели – фазовый контраст, нижняя правая - наложение двух каналов. Далее EGFP-Nrf2 и EGFP-Nrf2∆ETGE были синтезированы в клетках совместно с Keap1 (рис. 3.2 A и Б). Как и ожидалось, в этих условиях Nrf2 дикого типа перераспределялся в цитоплазму, в то время как мутант оставался преимущественно ядерным. Стоит отметить, что одновременный синтез в клетках Nrf2 дикого типа и его репрессора представляет определенную сложность, возможно связанную с фундаментальной природой исследуемых объектов: большинство клеток содержат в себе 18 либо Nrf2, локализованный преимущественно в ядре, либо Keap1, находящийся в цитоплазме. Клетки, содержащие оба белка в сопоставимых количествах, и собственно представленные на микрофотографии, составляют небольшую часть от общего числа трансфицированных клеток. В случае Nrf2, содержащего мутацию, подобная проблема не возникала. Б A Рис. 3.2. Локализация в клетках линии HeLa белков EGFP-Nrf2 и Keap1 wt (A), и EGFP-Nrf2∆ETGE и Keap1 wt (Б). Зеленый канал – флуоресценция EGFP, красный – окрашивание белка Keap1 антителами. Т.о. свойства EGFP-Nrf2 совпадают со свойствами Nrf2 wt, что позволило нам рассматривать локализацию химерного белка EGFP-Nrf2 как адекватно отражающего поведение Nrf2 без искусственных довесков. Кроме того, в качестве контроля в наших экспериментах мы могли использовать Nrf2 без тетрапептида ETGE, поскольку взаимодействие этого белка с Keap1 оказалось нарушенным. Нашим следующим шагом было убедиться в том, что NLS исследуемого нами Nrf2 действительно находится в С-концевой половине белка. Для этого была исследована внутриклеточная локализация следующих делеционных мутантов: EGFP-N-end-HalfNrf2 (N-концевая половина соединенная с EGFP), EGFP-N-end-HalfNrf2∆ETGE (соединенная с EGFP N-концевая половина Nrf2 c делетированным тетрапептидом ETGE), EGFP-C-end-HalfNrf2 (C-концевая половина Nrf2 соединенная с EGFP). Плазмиды, кодирующие эти белки были получены на основе плазмиды pEGFP-Nrf2 и pEGFP-Nrf2∆ETGE, а так же клонированием кДНК С-концевой половины Nrf2 в вектор pEGFPC1. Если C-концевая половина содержит классический NLS, что следует из литературных данных и из проведенного анализа аминокислотной последовательности 19 белка, то ее локализация останется ядерной, в отличие от положения в клетке N-концевой половины (дикого типа и мутантной), которое должно изменится. Так оно и оказалось (рис. 3.3 A, Б и В), причем одновременный синтез Кеар1 в клетках, содержащих EGFP-Cend-HalfNrf2 никаким образом не влиял на локализацию этого химерного белка. A Б В Рис. 3.3 Локализация в клетках линии HeLa химерных белков С-end-Half-Nrf2 и Keap1 wt (A), N-end-Half-Nrf2 (Б), N-end-Half-Nrf2∆ETGE (В) Зеленый канал – флуоресценция EGFP, красный – (A) - окрашивание белка Keap1 антителами, (Б) и (В) дополнительное окрашивание делеционных мутантов Nrf2 антителами. Как и в предыдущем случае, положение химерных белков в клетке было подтверждено окрашиванием антителами. Исключение составила С-концевая половина Nrf2, поскольку область узнавания используемых антител находилась в области N-конца. Необходимо отметить, что свечение EGFP и окрашивание того же белка антителами в случае EGFP-N-end-HalfNrf2 и EGFP-N-end-HalfNrf2∆ETGE дают немного отличающуюся картину локализации. Природа подобного различия нам неизвестна, однако это не влияет существенным образом на наши выводы о внутриклеточном распределении белков. Как можно заключить из представленных фотографий, литературные данные верны и в дальнейшем можно на основе компьютерного анализа экспериментально картировать последовательность NLS. Далее нами было проверено, как влияет на распределение в клетках N-концевой половины Nrf2 (как дикого типа, так и мутантной) присутствие Keap1. Поскольку локализация этих делеционных мутантов поодиночке была в большей степени цитоплазматическая, то можно было предположить, что одновременный синтез репрессора приведет к еще большей перелокализации в цитоплазму EGFP-N-end-HalfNrf2, в то время как положение EGFP-N-end-HalfNrf2∆ETGE останется практически без 20 изменений. Изучение клеток, трансфицированных соответствующими плазмидами подтвердило наши предположения (рис. 3.4 A и Б). А Б Рис. 3.4. Локализация в клетках линии HeLa белков EGFP-N-end-HalfNrf2 и Keap1 wt (A), и EGFP-N-end-HalfNrf2∆ETGE и Keap1 wt (Б). Зеленый канал – флуоресценция EGFP, красный –окрашивание белка Keap1 антителами. Как видно из приведенных микрофотографий Keap1 в незначительной степени перемещал N-end-HalfNrf2 в цитоплазму и не влиял на распределение белка EGFP-N-endHalfNrf2∆ETGE. Синтез описанных белков в трансфицированных клетках также необходимо проверить с помощью иммуноблоттинга, что и является одной из наших ближайших целей. 4) Таким образом, были получены все необходимые средства для решения поставленной нами задачи. Мы убедились, что соединение хромофора с исследуемым нами Nrf2 существенно не влияет на его свойства. Делеция тетрапептида в составе NEH2домена Nrf2 нарушила его способность к взаимодействию с репрессором, что позволяет использовать подобный мутант как контроль в дальнейших экспериментах. Делеционный анализ белка показал, что NLS находится в его С-концевой половине, что с одной стороны подтверждает данные описываемой выше статьи и проведенного нами биоинформатического исследования, а с другой – дает нам в руки фрагмент Nrf2 (как взаимодействующий, так и невзаимодействующий с Keap1), неспособный к активному транспорту в ядро. Дальнейшие эксперименты заключаются в синтезе в клетках следующих пар белков: А)EGFP-N-end-HalfNrf2 и Keap1NES, Б)EGFP-N-end-HalfNrf2∆ETGE и Keap1NES, 21 В)EGFP-N-end-HalfNrf2 и Keap1 + LMB, Г)EGFP-N-end-HalfNrf2∆ETGE и Keap1 + LMB. Если импорт в ядро Keap1 влияет на импорт Nrf2, то нарушение экспорта Keap1 в присутствии лептомицина B или в результате мутации его NES (эксперименты А и В) должно привести к перераспределению N-концевой половины Nrf2 в ядро. В контрольных экспериментах, где взаимодействие N-концевой половины Nrf2 с Keap1 нарушено в результате делеции ETGE (Б и Г) локализация EGFP-N-end-HalfNrf2∆ETGE не должна измениться. В настоящее время работа находится на стадии экспериментов по изучению внутриклеточной локализации белков и их делеционных мутантов в присутствие LMB, которые могут дать окончательный ответ на вопрос о влиянии процессов импорта в ядро Keap1 и Nrf2. 22 4. Материалы и методы 4.1 Используемые штаммы микроорганизмов, клеточные линии и реактивы В работе использовались следующие штаммы и линии: Е.coli JM109 с генотипом: endA1, recA1, gyrA96, thi, hsd R17 (rk-, mk+), relA1, supE44, 1 (lac-proAB), [F`, traD36, proAB, lacZ M15] HeLa (эпителиальные клетки карциномы шейки матки человека) Использовались следующие Difco препараты:Бактотриптон Difco Дрожжевой экстракт Бактоагар Среда DMEM, Версен Difco Ин-т полиомиелита и вирусных энцефалитов, г.Москва Fetal Clone III HyClone Lipofectamine2000 Invitrogen Вторичные антитела, NGS SantaCruzBiotechnology ПЭГ-4000 Sigma ПЭГ-6000 Loba Feinchemie Додецилсульфат натрия Serva ЭДТА Sigma Этидий бромид Merck Агароза Sigma, Chemapol TritonX100 Ferak Глицерин Serva Ампициллин Sigma Канамицин Fermentas, New England Biolabs, Ферменты Сибэнзим, Boehringer mannheim Все остальные неорганические соли - квалификации ЧДА, ХЧ и ОСЧ. 23 4.2 Используемые приборы Центрифугирование препаратов проводилось на центрифуге 5415С фирмы Eppendorf. Образцы высушивали на приборе ``Speed-Vac Concentrator`` (Savant). Электрофорез проводился с использованием источников постоянной мощности: LKB-2297, ИПЭ-2000-0.2 и Эльф-8. Оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра HITACHI 200-20. В экспериментах по изучению локализации белков в клетках использовался флуоресцентный микроскоп Zeiss Axiovert200М, оборудованный конфокальной лазерной сканирующей приставкой LSM510. 4.3 Методы 4.3.1 Приготовление компетентных клеток E.сoli В 250 мл среды SOB скалывали 10-12 колоний E.сoli штамма JM109 с чашки Петри (SOB+агар). Клетки растили при 18С до А600 ~0.6. Инкубировали их 10 мин во льду, центрифугировали при 2500 об/мин в течение 10 мин при 4С, суспендировали в 80 мл буфера ТВ, охлажденном до 0С, и инкубировали 10 мин во льду. После центрифугирования при 2500 об/мин в течение 10 мин при 4С, клетки суспендировали в 20 мл ТВ (0С). Добавляли ДМСО до 7%, инкубировали во льду 10 мин. Разносили аликвоты в стерильные пробирки, замораживали в жидком азоте и хранили при -70С. Составы среды и буфера, использующихся при приготовлении компетентных клеток E.coli штамма JM-109 SOB: ТВ: бактотриптон 20 г/л дрожжевой экстракт 5 г/л NaCl 580 мг/л KCl 190 мг/л MgSO4 10мM MgCl2 10мM PIPES рН 6.7 (KOH) 10мМ CaCl2 15мМ KCl 250мМ MnCl2 55мМ 4.3.2 Трансформация E.coli и манипуляции с плазмидной ДНК Трансформация клеток E.coli осуществлялось по методике [13], для выделения плазмид использовалась методика [13].Все стандартные манипуляции с плазмидной ДНК осуществлялись в соответствии с руководством [13]. Рестрикция, лигирование и 24 остальные ферментативные обработки фрагментов ДНК проводилось при соответствующих температурах в стандартных буферах. Составы сред, использующихся при трансформации и культивировании клеток E.coli штамма JM109: LB: бактотриптон 10 г/л дрожжевой экстракт 5 г/л NaCl 10 г/л, рН 7.5 LB + 1,5% бактоагар LB-агар: 4.3.3 Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле Анализ фрагментов ДНК проводили в 0,8-2,3% агарозных гелях. Гели и электродный буфер TBE содержали 1 мкг/мл бромистого этидия. Образцы наносили на гель в растворе, содержащем 0,05% BPB и 5% глицерина. В качестве маркеров длин фрагментов ДНК использовали гидролизаты pUC19/MspI и ДНК фага λ/PstI. Фрагменты ДНК детектировали в геле при его облучении УФ светом с длиной волны 302 нм. TBE: Трис-борат 50 мМ ЭДТА 1 мМ pH 8,2-8,3 4.3.4 Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля Элюцию фрагментов ДНК из агарозных гелей проводили с помощью набора фирмы QIAGEN в соответствии с методикой производителя. 4.3.5 Конструирование плазмид, используемых в настоящей работе В качестве источника белок-кодирующей части кДНК белков Nrf2, Nrf2∆ETGE мы использовали плазмидные конструкции, ранее полученные в нашей лаборатории: pcDNA4/HisMaxB-Nrf2 и pBlueScriptSK+-Nrf2∆ETGE. С помощью кДНК взятой из этих плазмид были сконструированы плазмиды, кодирующие: белок EGFP-Nrf2 – плазмида pEGFP-C2-Nrf2, белок EGFP-Nrf2∆ETGE – плазмида pEGFP-C2-Nrf2∆ETGE. Конструкция pEGFP-C2-Nrf2 была получена следующим образом. Плазмиду pcDNA4/HisMaxB-Nrf2 гидролизовали ферментами BamHI и XhoI. Полученный фрагмент размером 1777 п.н. лигировали в вектор pBlueScriptSK+, предварительно обработанный рестриктазами XhoI и BamHI, что дало нам плазмиду pBlueScriptSK+-Nrf2. Из получившейся плазмиды кДНК Nrf2 была вырезана с помощью ферментов XhoI и SacI, так 25 что перед N-концом Nrf2 получился довесок в 63 п.н. кДНК Nrf2 с довеском, вырезанную по сайтам SacI и XhoI, встроили в вектор pEGFP-C2 по сайтам SacI и SalI. Для получения pEGFP-C2-Nrf2∆ETGE плазмиды гидролизовали плазмиду pBlueScriptSK+-Nrf2∆ETGE рестриктазами XhoI и SacI и выделили кДНК Nrf2∆ETGE c аналогичным довеском, как и в предыдущем случае. Полученный фрагмент был лигирован в вектор pEGFPC2 обработанный рестриктазами SacI и SalI. Таким образом, мы получили две плазмиды - pEGFP-C2-Nrf2 и pEGFP-C2Nrf2∆ETGE, различающиеся только тем, что в последней в кДНК Nrf2 была делетирована нуклеотидная последовательность, кодирующая тетрапептид ETGE в NEH2-домене. На основе этих двух плазмид были получены плазмиды, кодирующие следующие делеционные мутанты: EGFP-N-end-HalfNrf2 – плазмида pEGFP-C2-N-end-HalfNrf2, EGFP-N-end-HalfNrf2∆ETGE - плазмида pEGFP-C2-N-end-HalfNrf2∆ETGE, EGFP-C-end-HalfNrf2 - плазмида pEGFP-C1-С-end-HalfNrf2. Конструкция pEGFP-C2-N-end-HalfNrf2 была получена гидролизом плазмиды pEGFP-C2-Nrf2 ферментами HindIII и SmaI, последующим заполнением 5'-выступающего конца фрагментом Кленова и лигированием получившихся тупых концов. Плазмида pEGFP-C2-N-end-HalfNrf2∆ETGE была сконструирована аналогичным путем на основе pEGFP-C2-Nrf2∆ETGE. Для получения плазмиды pEGFP-C1-С-end-HalfNrf2 конструкцию pBlueScriptSK+Nrf2 (план изготовления был рассмотрен выше) обработали ферментами HindIII и XhoI, и получившийся фрагмент был встроен в вектор pEGFPC1, предварительно гидролизованный ферментами HindIII и SalI. 4.3.6 Трансфекция клеток линии HeLa и изучение внутриклеточной локализации белков. Клетки лини HeLa выращивали на покровных стеклах в среде DMEM, содержавшей 10% сыворотки (Fetal Clone Ш). Трансфекцию клеток проводили через 18 часов после рассева клеток на чашки с использованием LF2000 по методике производителя, на чашку диаметром 35мм добавляли 4 мкг ДНК. Локализацию химерных белков изучали в фиксированных клетках на следующий день после трансфекции. Для получения пермеабилизованных фиксированных клеток, их промывали буфером PBS, обрабатывали 4% ПФА/PBS в течение 10 минут, после чего дополнительно обрабатывали 0,2%TritonX100/ 4%ПФА/ PBS в течение 10 минут и трижды промывали PBS. При изучении локализации белков при помощи хромофора EGFP, после этого стекло с клетками помещали в каплю глицерин/ 1МTris (9:1) рН 8.9 на предметное стекло. 26 При необходимости окрашивания клеток антителами (для дополнительной локализации химерных белков и Keap1 wt), пермеабилизованные клетки обрабатывали 0,5М NH4Cl/ PBS 10 мин при комнатной температуре, снова промывали 2 раза PBS и блокировали клетки 2% NGS (normal goat serum)/ PBS в течение часа, после чего промывали холодным PBS. Инкубировали с первичными антителами в 2%NGS/PBS в течение часа, промывали дважды PBS и инкубировали со вторичными антителами/ PBS в течение часа, а затем также переносили клетки на предметное стекло. Первичные моноклональные антитела к Keap1 wt (клон 2H5) разводили в 150 раз. Первичные поликлональные антитела к химерным белкам, содержащим Nrf2, (клон H300) разводили в 300 раз. Вторичные антитела, конъюгированные с родамином разводили в 400 раз. Все снимки внутриклеточной локализации белков с помощью конфокальной лазерной сканирующей приставкой LSM510. PBS: KCl 200 мг/л KH2PO4 200 мг/л NaCl 8 г/л Na2HPO4 1.15 г/л 27 5. Выводы 1. Предложена схема экспериментов для выяснения взаимного влияния процессов импорта в ядро белков Nrf2 и Keap1. 2. Сконструированы плазмиды, полноразмерным Nrf2 (дикий кодирующие EGFP, соединенный с тип и мутант, неспособный к взаимодействию с Keap1) и его делеционными мутантами. 3. Исследована локализация химерного белка EGFP-Nrf2 и его делеционных мутантов в клетках линии HeLa. 4. Биоинформатическими методами идентифицирован последовательность, удовлетворяющая консенсусу классического сигнала ядерной локализации в C-концевой половине транскрипционного фактора Nrf2. 5. Получен согласующийся с литературными данными результат относительно того, что NLS белка Nrf2 находится в его С-концевой половине. 28 6. Список литературы 1. Б. Льюин, Гены, М. Мир, 1987 2. Owuor ED, Kong AN. Antioxidants and oxidants regulated signal transduction pathways. Biochem Pharmacol. 2002 Sep;64(5-6):765-70. 3. Lee JM, Johnson JA. An important role of Nrf2-ARE pathway in the cellular defense mechanism. J Biochem Mol Biol. 2004 Mar 31;37(2):139-43. 4. Katoh Y, Itoh K, Yoshida E, Miyagishi M, Fukamizu A, Yamamoto M. Two domains of Nrf2 cooperatively bind CBP, a CREB binding protein, and synergistically activate transcription. Genes Cells. 2001 Oct;6(10):857-68. 5. Moi P, Chan K, Asunis I, Cao A, Kan YW.Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2), a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NFE2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Oct 11;91(21):9926-30. 6. Kobayashi A, Kang MI, Okawa H, Ohtsuji M, Zenke Y, Chiba T, Igarashi K, Yamamoto M. Oxidative stress sensor Keap1 functions as an adaptor for Cul3-based E3 ligase to regulate proteasomal degradation of Nrf2. Mol Cell Biol. 2004 Aug;24(16):7130-9. 7. Zhang DD, Hannink M. Distinct cysteine residues in Keap1 are required for Keap1dependent ubiquitination of Nrf2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress. Mol Cell Biol. 2003 Nov;23(22):8137-51. 8. Hayes JD, Chanas SA, Henderson CJ, McMahon M, Sun C, Moffat GJ, Wolf CR, Yamamoto M. The Nrf2 transcription factor contributes both to the basal expression of glutathione S-transferases in mouse liver and to their induction by the chemopreventive synthetic antioxidants, butylated hydroxyanisole and ethoxyquin. Biochem Soc Trans. 2000 Feb;28(2):33-41. 9. Thimmulappa RK, Mai KH, Srisuma S, Kensler TW, Yamamoto M, Biswal S. Identification of Nrf2-regulated genes induced by the chemopreventive agent sulforaphane by oligonucleotide microarray. Cancer Res. 2002 Sep 15;62(18):5196-203. 10. Karapetian RN, et al. Nuclear oncoprotein prothymosin α is a partner of Keap1: implications for cellular oxidative stress response [в печати] 11. Macara IG. Transport into and out of the nucleus. Microbiol Mol Biol Rev. 2001 Dec;65(4):570-94, 12. Lee SH, Hannink M., Molecular mechanisms that regulate transcription factor localization suggest new targets for drug development. Adv Drug Deliv Rev. 2003 Jun 16;55(6):717-31. 29 13. Маниатис, Т., Фрич, Э., Сэмбрук, Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984. 30
