СОВМЕСТНОЕ ВЛИЯНИЕ КЛАВУЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ И АМОКСИЦИЛЛИНА НА МИКРОФЛОРУ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ. Введение

СОВМЕСТНОЕ ВЛИЯНИЕ КЛАВУЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ И АМОКСИЦИЛЛИНА
НА МИКРОФЛОРУ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ.
Шаронова Людмила Владимировна
ГБОУ СОШ №654 имени А. Д. Фридмана
Введение
«Пришло время закрыть книгу инфекционных
болезней. Война против эпидемий выиграна!»
(Вильям Стюарт, 1969)
В 1950-х – 60-х гг. был рассвет открытия новых классов антибиотиков. Однако
широкое использование антибиотиков создало проблему возникновения устойчивости к
этим веществам среди микроорганизмов. Известно пять групп механизмов резистентности
микроорганизмов к антибиотикам:
1. Ферментативная инактивация антибактериального агента.
2. Модификация мишени действия антибактериального агента.
3. Эффлюкс (механизм активного удаления антибиотика из бактериальной клетки).
4. Нарушение проницаемости оболочки бактериальной клетки.
5. Защита мишени (синтез белков, закрывающих мишень для антибактериального агента).
Один из наиболее распространенных механизмов приобретенной защиты от
антибиотиков является выработка ферментов, способных переводить антибиотик в
неактивную форму, например в результате гидролиза одной из связей β-лактамного
кольца ферментами β-лактамазами. Они встречаются у подавляющего большинства
болезнетворных микроорганизмов, за исключением рода Streptococcus. Этот механизм
приводит к инактивации антибиотиков пенициллинового ряда.
Чтобы преодолеть такую приобретенную резистентность было предложено добавлять к
антибиотикам игибиторы β-лактамаз.
В начале 70-х гг. из культуры грибка Streptomyces clavuligerus была выделена
клавулановая кислота, которая в комплексе с новым полусинтетическим антибиотиком
амоксициллином существенно повысила эффективность антибактериальной терапии.
Поэтому основной задачей нашей работы стало сравнение эффективностей
действия на бактерии амоксициллина и препарата, содержащего антибиотик в сочетании с
игибитором β-лактамаз (клавулановая кислота).
Цель работы:
амоксициллина.
Определить
влияние
клавулановой
кислоты
на
действие
Задачи работы:
1. Получить культуру чистой линии бактерий из микрофлоры ротовой полости.
2. Установить порог устойчивости бактериальной культуры к действию
амоксициллина.
3. Установить порог устойчивости бактериальной культуры к действию
амоксициллина/клавулановой кислоты.
4. Сравнить
эффективности
действия
на
бактерии
амоксициллина
и
амоксициллина/клавулановой кислоты.
Материалы и методы:
1. Микрофлора полости рта (значительную часть микроорганизмов полости рта
взрослых людей составляют анаэробные виды, в основном кокки – 85-90% от всех
видов)
2. Набор «Микробиология»
3. Термостат
4. Суспензия Амоксициллин 250мг/5мл
5. Суспензия Амоксиклав (Амоксициллин 250мг + клавулановая кислота 62.5мг/5мл)
1. Выделение чистой линии культуры бактерий из микрофлоры ротовой полости
2. Определение чувствительности к Амоксициллину методом разведений
Методика:
Перед тем, как приступить к выполнению исследовательской работы необходимо изучить
правила техники безопасности работы с микроорганизмами и антибиотиком, а также
правила соблюдения условий стерильности (см. Методическое пособие к набору
«Микробиология»)
1. Выделение чистой линии культуры бактерий из микрофлоры ротовой полости:
Подготовить чашку Петри с МПА (мясо-пептонный агар) в стерильных условиях.
Провести соскобы стерильной ватной палочкой с внутренней поверхности щеки.
Опустить кончик ватной палочки в микропробирки со стерильной деионизованной водой.
В стерильных условиях нанести пипеткой содержимое пробирки на поверхность агара и
втереть круговыми движениями шпателем, предварительно прокаленным в пламене
горелки. Накрыть чашки Петри крышкой и поставить на крышку в неосвещенный
термостат на 37оС на 2-4 дня до наступления фазы стационарного роста.
Для дальнейшей работы необходимо отколоть одну колонию зубочисткой и
угасающим зигзагом нанести штрихи на поверхность агара в заранее подготовленные
чашки Петри с МПА. Оставить в термостате на 2-4 дня. Повторить процедуру, отколов
колонию из последнего штриха на новую чашку Петри.
Для накопления культуры чистой линии необходимо одну колонию отколоть
зубочисткой и растворить в пробирке со стерильной деионизованной водой. Пипеткой
нанести на поверхность агара полученную смесь и равномерно круговыми движениями
втереть шпателем. Поставить в термостат на 2-4 дня.
2. Определение чувствительности к Амоксициллину методом разведений:
Метод разведений основан на использовании двойных последовательных
разведений концентраций антибиотика от максимальной к минимальной. В данной работе
используются исходные суспензии Амоксициллин 250мг/5мл и Амоксиклав
(Амоксициллин 250мг+ клавулановая кислота 62.5мг/5 мл). Для проведения эксперимента
нужно рассчитать необходимые количества вносимого амоксициллина для получения
конечных концентраций в чашках Петри и внести в таблицу 1. Расчет ведется по формуле:
Х= А*B/C, где
А – нужная концентрация,
В – количество раствора, которое нужно приготовить,
С – концентрация имеющегося раствора,
Х – количество концентрированного раствора, которое необходимо взять для
приготовления рабочего раствора.
После чего необходимое количество антибиотика вносят в остывающий агар, из
расчета последовательных двойных разведений на общий объем среды в чашке Петри
согласно таблице 1 (не забыв подписать концентрацию и название препарата на крышке
чашки Петри).
Таблица 1. Расчет количества вносимого амоксициллина.
№
С (мкг/мл)
Амоксициллин
Амоксиклав
1
256
2
128
3
64
4
32
5
16
6
8
7
4
8
2
9
1
10
0,5
11
0,25
12
0,125
Две чашки Петри без добавления антибиотика для постановки положительного
(среда, не содержащая антибиотик) и отрицательного (чашка с посевом стерильной
деионизованной воды, используемой в экспериментах) контролей.
После того, как чашки Петри со средой, содержащей разведения амоксициллина и
амоксиклава, будут готовы, необходимо подготовить культуру клеток для посева. Для
этого с чашки Петри с культурой чистой линии прокаленной в пламене горелки и
остуженной петлей собрать клетки с поверхности агара и растворить стерильной
деионизованной воде (0,1 мл стерильной деионизованной воды нанести на чашку Петри в
качестве отрицательного контроля). Стерильной пипеткой внести по 0,1 мл культуры в
каждую чашку Петри (12+12+1 контроль) и круговыми движениями втереть стерильным
шпателем насухо. Поставить чашки Петри дном вверх в термостат на 37оС, каждый день
следя за ростом клеток, особенно за положительным контролем. После того, как наступит
фаза стационарного роста необходимо провести сравнительный анализ всех чашек,
определив интенсивность роста на тех или иных концентрациях антибиотика и количество
колоний.
Ожидаемые результаты:
Основываясь на том, что добавление клавулановой кислоты к амоксициллину
должно приводить к увеличению у микроорганизмов восприимчивости к антибиотикам,
то мы предполагаем, что порог устойчивости в случае с амоксиклавом будет ниже, т.е.
клетки бактерий должны прекращать рост при более низких концентрациях антибиотика.
На чашках в результате мы должны увидеть градиентный рост клеток в зависимости от
концентрации антибиотика. Полученные результаты необходимо оформить в таблицу 2.
Таблица 2. Определение порога устойчивости микрофлоры ротовой полости.
№
С
Количество колоний на
Количество колоний на
(мкг/мл)
Амоксициллине
Амоксиклаве
1
256
2
128
3
64
4
32
5
16
6
8
7
4
8
2
9
1
10
0,5
11
0,25
12
0,125
Список литературы
1. Прунтова О.В., Сахно О.Н. Лабораторный практикум по общей микробиологии. //
Владимир: ВлГУ. – 2005.
2. Шлыкова Д.С., Струкова Е.Н. Методическое пособие к набору «Микробиология».
// М.: Научные развлечения. – 2013.
3. Ronald M. Atlas. Microorganisms in our World. // Mosby-Year Book. – 1994.
4. Международный банк данных лекарственных веществ. URL:
http://www.drugbank.ca (дата обращения 3.02.2015).
5. Энциклопедия лекарственных средств. URL: http://www.rlsnet.ru (дата обращения
3.02.2015).
6. Сидоренко С.В. Механизмы резистентности к антибактериальным препаратам.
Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии под редакцией
Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова.// Смоленск: НИИАХ СГМА. –
2007. URL: http://www.antibiotic.ru/index.php?doc=97 (дата обращения 3.02.2015).