Иммунохроматографический метод определения

ЭКСПРЕСС-МЕТОД АНАЛИЗА СТАФИЛОКОККОВОГО ЭНТЕРОТОКСИНА В
ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ
Любавина И.А1., Шепеляковская А.О.2, Бровко Ф.А.2, Зинченко А.А1., Сидина Е.И. 2,3,
Бозиев Х.М. 2, Ламан А.Г. 2, Вертиев Ю.В.4, Гришин Е.В.1
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
Москва, Россия
1
Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
РАН, Московская обл. г. Пущино, Россия
2
3
Пущинский Государственный университет, Московская обл., г. Пущино, Россия
Государственное учреждение научно-исследовательский институт эпидемиологии и
микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, Россия
4
Стафилококковые энтеротоксины, продуцируемые грамположительными
бактериями Staphylococcus aureus, являются наиболее частой причиной пищевых
отравлений. Известно несколько серологических типов энтеротоксинов (SE),
обозначаемых А, В, С1, С2, С3, D и Е. Механизм действия энтеротоксинов состоит в
стимулировании массового высвобождения цитокинов, вызывающих различные
токсические поражения центральной нервной системы и ее симпатических отделов, а
также нарушение проницаемости стенок кишечника. Все стафилококковые энтеротоксины
очень устойчивы к воздействию окружающей среды, включая экстремальные значения
рН. Хотя сами клетки стафилококков разрушаются при нагревании, SE термостабильны и
выдерживают высокотемпературные обработки с сохранением функциональной
активнсти. При благоприятных условиях возможно интенсивное развитие стафилококков
и секреция токсинов в самых различных пищевых продуктах (молочные, мясные, рыбные,
овощные), наиболее благоприятной средой для развития стафилококков является молоко
и молочные продукты, а также мясо и мясные полуфабрикаты.
Наиболее распространен в продуктах питания стафилококковый энтеротоксин А
(SEA). В соответствии с методическими указаниями МУК 4.2. 2429-08 развитие
стафилотоксикоза у человека вызывает содержание в пищевых продуктах SEA в
количестве 100-200 нг и выше.
Основными задачами при диагностике стафилококковых энтеротоксинов является
их обнаружение в продуктах питания для контроля качества продуктов и недопущения
массовой вспышки заболевания.
Для тестирования продуктов питания на содержание в них SE используют
биологические методы (тестирование на животных), различные инструментальные
методы (масс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография,
капиллярный электрофорез и т.д.), а также иммунологические методы анализа (ИФА,
метод иммунодиффузии и т.д). В настоящее время наибольшее распространение получили
иммунохимические методы тестирования, характеризующиеся высокой
чувствительностью и специфичностью. Предел обнаружения SEA с помощью
диагностического набора RIDASCREEN® SET A, B, C, D, E (метод качественного ИФА)
0,7 нг/мл. Предел обнаружения метода иммунодиффузии 0,1 мг/мл. Набор RIDASCREEN®
SET A, B, C, D, E рекомендован как метод определения SE в пищевых продуктах (МУК
4.2. 2429-08) Роспотребнадзором. В тоже время использование методов ИФА
тестирования ограниченно кругом лабораторий, имеющих необходимое оборудование и
высококвалифицированных специалистов. Время проведения ИФА составляет несколько
часов и для выполнения требуется квалифицированный персонал. Очевидно, что для
контроля качества пищевых продуктов производителями, а также сотрудниками
контролирующих организаций необходимы методы, простые в исполнении, не требующие
сложного оборудования и позволяющие проводить тестирование в короткие сроки и
имеющий невысокую стоимость.
Целью нашей работы и являлась разработка одностадийного качественного
иммунохроматографического метода тестирования SEA в различных продуктах питания.
Иммунохроматографический
тест
представляет
собой
иммуноаналитический
твердофазный метод, проходящий в формате хроматографии. Его проведение
обеспечивает тест полоска, состоящая из нескольких мембран производства фирмы Arista,
США. В качестве неподвижной фазы выступают моноклональные антитела, связанные на
поверхности тест-полоски. Подвижную фазу образуют анализируемый на содержание
SEA образец, в который добавляют вторые антитела, коньюгированные с наночастицами
коллоидного золота. Коньюгаты высокостабильны, яркая окраска наночастиц
коллоидного золота позволяет визуально оценивать результаты тестирования. Тест
проводится в одну стадию, поэтому не требуется дополнительное временя на стадии
инкубации и отмывания. Время анализа составляет 15-20 мин. Процедура тестирования не
требует использования никакого дополнительного оборудования и отличается простотой,
результаты анализа легко интерпретировать. Тест имеет невысокую стоимость. Для его
проведения не требуются квалифицированные специалисты. В качестве тестового токсина
в работе использовался рекомбинантный SEA, сравнительный анализ проводился также на
энтеротоксине А продуцируемом стафилококками. Моноклональные антитела получали
по стандартной методике. Специфичность антител на взаимодействие с другими
энтеротоксинами стафилококков проверяли в иммуноферментном анализе (ИФА), всего
было получено 19 антител. При подборе пар антител для сандвич варианта ИФА
проводили биотинилирование антител, анализ проводили в стрептавидин-биотиновой
сиситеме. Пары анатител характеризовали по специфичности и чувствительности. Предел
детекции в сандвич варианте ИФА составлял 0,5 нг/мл. Полученные пары антител
конъюгировали с наночастицами коллоидного золота и отбирали произвольной
комбинацией пары пригодные для иммунохроматографиченского определения SEA. В
качестве положительного контроля использовали поликлональные овечьи антимышинные антитела.
Оценка результатов тестирования качественная, она отвечает на вопрос,
содержится или нет токсин в пробе в количестве, превышающем чувствительность теста.
Тестирование проходит при комнатной температуре. Срок хранения теста в течение
1 года.
В результате наших исследований мы создали иммунохроматографический тест,
имеющий предел обнаружения 4 нг/мл SEA. Время анализа составляло 15 мин.
Для проверки теста на реальных продуктах, тестирование SEA проводили в образцах
3% молока, 9% творога, яблочного сока, в ветчине, в бутылированной и водопроводной
воде и в растворе водно-солевого буфера в качестве контроля. Растворы образцов
пищевых продуктов готовили в соответствии с МУК 4.2. 2429-08, а затем вносили в них
SEA в различных концентрациях. Предел обнаружения SEA для всех образцов был
одинаков и составил 4 нг/мл время анализа при этом составляло 15 минут.
Специфичность тест-системы характеризовали, определяя с ее помощью
стафилококковые энтеротоксины А, В, D, C1, E и термолабильный токсин - LT E.coli. В
диапозоне концентраций 1 мкг/мл связывания не наблюдали. Полученные результаты
говорят о высокой специфичности разработанного метода, позволяющей проводить
высокоселективную диагностику.
В качестве контроля на всех этапах разработки теста мы использовали метод
сандвич-ИФА. Чувствительность ИФА для определения SEA составляла 0,5 нг/мл.
Таким образом, создан экспресс-метод обнаружения стафилококкового
энтеротоксина А в различных пищевых продуктах с помощью иммунохроматографии.
Метод прост в применении и оценке результатов, не требует специальных помещений и
оборудования и может быть использован в пищевой промышленности и организациях
Роспотребнадзора для контроля за качеством продукции.
Мировой опыт показывает, что подобные экспресс-тесты широко используются для
контроля качества и безопасности пищевых продуктов. Так, для контроля содержания
SEB широко используются иммунохроматографические тесты SEB BioThreat Alert® Kit,
Германия (чувствительность 6 нг/мл); SMART™ Staph Enterotoxin B, США
(чувствительность 10 нг/мл); BADD™ (чувствительность 4 нг/мл), США.