Стафилококки в процессе роста могут продуцировать набор

МЕТОД ОДНОВРЕМЕННОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА СЕМИ ЭНТЕРОТОКСИНОВ СТАФИЛОКОККОВ НА ГИДРОГЕЛЕВОМ
БИОЧИПЕ.
Филиппова М.А.1, Рубина А.Ю.1, Фейзханова Г.У.1, Шепеляковсеая А.О.2, Сидина Е.И.
2,5
, Бозиев Х.М. 2, Ламан А.Г. 2, Бровко Ф.А.2, Вертиев Ю.В.4, Заседателев А.С. 1,
Гришин Е.В.3
1
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва
Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
РАН, Московская обл. г. Пущино
2
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
Москва
3
Государственное учреждение научно-исследовательский институт эпидемиологии и
микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва
4
5
Пущинский Государственный университет, Московская обл., г. Пущино
Стафилококки в процессе роста могут продуцировать набор токсинов, наиболее
опасными из которых являются энтеротоксины. Отравление пищевыми продуктами,
содержащими энтеротоксины стафилококков, широко распространено и находится на
втором месте после отравлений, вызываемых сальмонельными инфекциями. При пищевых
отравлениях возможны различные осложнения, включая развитие аутоиммунных
заболеваний, таких как ревматоидный артрит, атопический дерматит, и разного рода
аллергий. Также SEs вовлечены в синдром токсического шока.
SEs являются небольшими белками с молекулярными массами от 27 до 30 кДа и
относятся к семейству суперантигенов. Наиболее распространенными являются
энтеротоксины А-Е, они являются наиболее частой причиной пищевых отравлений.
Энтеротоксины G и I могут быть не только причиной пищевых отравлений, но также
вызывать токсический синдром. Для энтеротоксина А необходимый уровень определения
составляет 200 нг/100 г продукта. При анализе интоксикации детей предел обнаружения в
биологических жидкостях и продуктах питания должен быть еще ниже. Необходимо
также учитывать потенциальную возможность использования энтеротоксинов в качестве
биологического
оружия.
Все
эти
данные
делают
актуальным
создание
высокочувствительных и специфичных методов обнаружения и мониторинга всех
известных SEs.
Для идентификации и анализа стафилококковых энтеротоксинов в настоящее время
используются различные лабораторные методы. Наиболее чувствительным и удобным
методом является твердофазный иммуноанализ.
К недостаткам традиционных иммунологических методов относится невозможность
одновременно тестировать образец на наличие нескольких токсинов. Для решения таких
многопараметрических задач был предложен новый аналитический инструмент биологический микрочип (биочип). В Институте Молекулярной Биологии им.
В.А.Энгельгардта РАН создана технология изготовления гидрогелевых биочипов, которая
позволяет создавать массивы гелевых элементов, содержащие иммобилизованные
молекулярные зонды различной природы (белки, ДНК, РНК и олигосахариды) и
проводить различные типы реакций в ходе одного анализа на биочипе.
Целью данной работы являлось создание прототипа диагностической тест-системы
для одновременного количественного определения энтеротоксинов стафилококка
A, B, C, D, E, G и I. К диагностическим системам для определения патогенов и
энтеротоксинов в частности, предъявляется ряд требований, таких как простота
процедуры подготовки образцов и методики проведения анализа, высокая
чувствительность и специфичность анализа, воспроизводимость получаемых данных.
Практически всем вышеназванным требованиям удовлетворяет тест-система на основе
гидрогелевых биочипов для одновременного определения семи энтеротоксинов
стафилококка, созданию которой посвящена данная работа.
В качестве антигенов для получения моноклональных антител использовали
рекомбинантные энтеротоксины, экспрессируемые в E coli и выделенные металлхелатной
хроматографией. Моноклональные антитела получали по стандартной методике, в общей
сложности было получено 113 специфических моноклональных антител.
Используя возможности метода многопараметрического анализа на биочипах, из
полученной панели моноклональных антител для каждого энтеротоксина были отобраны
пары антител, обладающих высокой аффинностью и не дающие перекрестных
взаимодействий с другими энтеротоксинами. Иммуноспецифичность отобранных антител
была подтверждена в параллельном анализе с коммерческими препаратами нативных
энтеротоксинов А и В.
Для одновременного анализа семи типов стафилококковых энтеротоксинов были
созданы биочипы, содержащие иммобилизованные антитела против данных
энтеротоксинов. В качестве метода был выбран двухстадийный сэндвич-иммуноанализ с
флуоресцентной регистрацией сигнала. Был разработан протокол одновременного анализа
семи энтеротоксинов на биочипе и получены основные характеристики метода:
аналитическая чувствительность от 0,1 нг/мл до 0,5 нг/мл (для различных энтеротоксинов)
и коэффициент вариации, который для всех токсинов не превышал 15 %. Время анализа
составляло 17 часов.
Разработанный метод анализа апробировали на образцах биологических сред. Смесь
семи энтеротоксинов добавляли в различных концентрациях в буферный раствор, молоко,
сливки, творог и кашу для детского питания, содержащую сухое молоко. Выбор молока и
продуктов на основе молока в качестве образцов для анализа основан на литературных
данных о возможном наличии в молочных продуктах энтеротоксинов, появляющихся, как
правило, вследствие использования молока от животных больных маститами. После
проведения пробоподготовки образцы биологических сред тестировались на биочипах.
Минимальная достоверно определяемая концентрация энтеротоксинов в биологических
образцах не превышала 1,1 нг/мл. В результате проведенных экспериментов не было
получено ни ложноположительных, ни ложноотрицательных результатов и было
показано, что разработанный метод одновременного количественного анализа
энтеротоксинов на биочипах позволяет адекватно определять их содержание в различных
пищевых продуктах.
При определении биотоксинов важным параметром является время анализа.
Использование отражающих металлизированных подложек при производстве биочипов
позволило разработать экспресс-вариант анализа, сократив время его проведения с 17
часов до двух часов без потери чувствительности.
Таким образом, на примере анализа семи типов энтеротоксинов стафилококка была
продемонстрирована возможность создания тест-системы на основе гидрогелевых
биологических микрочипов для одновременного определения нескольких биопатогенов в
образце. Полученный прототип тест-системы может быть положен в основу для создания
аналитического инструмента, предназначенного для определения различных антигенов.