ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ РФ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ АМУРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ В.А. Доровских, Т.А. Баталова, А.А. Сергиевич, Г.Е. Уразова ОКСИД АЗОТА В ХИМИИ, БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ БЛАГОВЕЩЕНСК - 2007 3 УДК 547.17+616.1-08 Учебное пособие составлено коллективом авторов, работающих в различных научных направлениях. Комплексный подход позволяет показать применение фундаментальных химических, фармакологических знаний в физиологии и терапии. Пособие предназначено студентам высших медицинских учреждений для ознакомления с небольшой сигнальной молекулой, обладающей удивительно разнообразными функциями в организме. Открытия в области изучения оксида азота позволили открыть механизмы регуляции функций сердечно-сосудистой, нервной, иммунной систем, создать более эффективные фармакологические препараты. Разрешено к печати ЦКМС ГОУ ВПО АГМА (протокол № 7 от 24 мая 2007 г) © ГОУ ВПО «Амурская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ © В.А. Доровских, Т.А. Баталова, А.А. Сергиевич, Г.Е. Уразова, 2008 г. 4 ОГЛАВЛЕНИЕ 1. Введение……………………………………………………………………5 2. Глава 1. Химические свойства оксида азота………………………….6 3. Глава 2. Роль оксида азота в функционировании организма……..16 4. Глава 3. NOи фармакология…………………………………………...25 5. Глава 4 . Терапия оксидом азота………………………………………30 6. Литература……………………………………………………………….40 5 Введение Химический состав живых организмов подтверждает единство живой и неживой природы. Организм человека состоит из тех же атомов, что и окружающая среда. Один из макроэлементов в теле человека – азот, входящий в состав практически всех белков, нуклеиновых кислот, большинства витаминов, липидов, пигментов, гормонов и т.д. В организме взрослого человека содержание азота составляет около 3% от массы тела (2,1 кг на70 кг массы тела). Однако в конце восьмидесятых годов XX века пристальное внимание биологов и медиков привлекло соединение азота, описываемое достаточно простой, маленькой формулой – оксид азота (II) NО. Изучение роли этого соединения в организме человека показало спектр его влияния, как на нормальное функционирование некоторых систем организма, так и на возникновение патологий. Открытие роли оксида азота объяснило механизм действия лекарственных препаратов, издавна применяемых для лечения заболеваний сердечно-сосудистой системы, открыло путь к созданию новых препаратов пролонгированного действия. Целью данного пособия является создание целостного представления у читателя о биологической роли NО, медицинских аспектах этой проблемы. Изучение строения и химических свойств этого соединения (глава 1) помогает понять, как такая небольшая молекула становится важным звеном в регуляции физиологических функций (глава 2). Фармакологическая глава раскрывает возможности медикаментозного влияния на процессы синтеза оксида азота, а, следовательно, и на выполняемые функции. Все эти теоретические знания необходимы для успешной работы врачапрофессионала. Практика и теория взаимодополняют друг друга, открывая новые перспективы. Клиническим аспектам посвящена заключительная, четвертая глава. Пособие будет полезно студентам не только 1-3 курсов при изучении базовых дисциплин, но и старших курсов при работе на клинических кафедрах. 6 Глава 1. Химические свойства оксида азота Оксид азота (II) – индифферентный бесцветный газ. При понижении температуры NО димеризуется в N2О2. Образуется NО при каталитическом окислении NН3, а также температуре электрической дуги по обратимой реакции: N2 + О2 ↔ 2 NО, ΔН = 180 кДж. Синтез NО из простых веществ сопровождается возрастанием энтропии системы. Поэтому в соответствие с уравнением Гиббса ΔG = ΔН – ТΔS при соответствующей температуре ΔG может стать отрицательной величиной. При этих условиях начинает доминировать энтропийный фактор. Поскольку ΔS процесса очень незначительно, то отрицательное значение ΔG достигается при высоких температурах. При 3000ºС равновесие практически устанавливается мгновенно. В лаборатории NО можно получить при взаимодействии разбавленной азотной кислоты с медью: 3Cu + 8HNO3 = 3Cu(NO3)2 +2 NO + 4H2O Для NО весьма характерны реакции присоединения галогенов с образованием газообразных нитрозилгалогенидов: 2 NО + Сl2 = 2 NОСl Оксид азота является несолеобразующим. Для NО характерна окислительновосстановительная двойственность. Он легко окисляется СrО3, КМnО4, кислородом воздуха до оксида азота (IV): 2 NО + О2 = 2 NО2, ΔG = - 70,5 кДж/моль Однако он восстанавливается водородом до элементарного азота: 2 NО + 2Н2 = N2 + 2Н2О, ΔG = - 630 кДж/моль, в растворах - до NН2ОН, NН3 (пери действии SО2, Сr2+). Свободные радикалы – это частицы, имеющие неспаренный электрон на внешней электронной оболочке. Это делает радикалы химически активными, поскольку радикал стремится либо вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул, либо отдать лишний электрон. В обоих случаях молекула - мишень модифицируется. Оксид азота - свободный радикал. Молекулы NО парамагнитны.. Согласно методу молекулярных орбиталей в NО один из электронов находится на πрразр – орбитали: (σscв)2(σsразр)2(πpсв)4(σxсв)2(πpразр)1 Структурную формулу оксида азота можно записать так: ·N=О. В молекуле NО непарный электрон находится на энергетически невыгодной молекулярной πpразр орбитали, поэтому не может образовывать устойчивой связи. Этим объясняется несклонность NО димеризоваться в N2О2.Только при понижении температуры NО димеризуется в твердый оксид азота синего цвета, который состоит из неустойчивых диамагнитных молекул N2О2. но оксид азота легко реагирует с другими свободными радикалами. Поэтому он является индикатором и ингибитором цепных реакций. Если реакция 7 протекает по радикально-цепному механизму, то добавление NО приводит к обрыву цепей и резкому замедлению реакции. Согласно методу МО порядок связи в NО составляет 2,5. Подобная структура NО хорошо согласуется с ее дипольным моментом (0,16 D), а также межъядерным расстоянием, промежуточными между величинами для двойной и тройной связи. D, межъядерное расстояние, Å Двойная связь 1,18 В молекуле NО 1, 14 тройная 1.06 Вследствие повышенной кратности связи молекула NО достаточно устойчива, и ее распад становится заметным лишь при 500ºС. Наличие непарного электрона в молекуле NО и неподеленных электронных пар при атоме азота предопределяет способность NО быть лигандом в различных нитрозильных комплексах: например [Fe(NО)4]. При взаимодействии с наиболее активными металлами в жидком аммиаке NО присоединяет электрон, т.е. выступает как окислитель: Nа + NО = Nа+ + NООксид азота (II) – NО, в окружающей среде рассматривается как загрязняющий фактор. Это соединение появляется в больших объемах за счет выброса в окружающую среду отработанных газов от двигателей внутреннего сгорания, особенно дизельных. С точки зрения экологической опасности по непосредственному воздействию на окружающую среду оксид азота характеризуется как наиболее активное токсичное соединение по сравнению с углеводородами, сажей и оксидами углерода. По уровню предельно допустимых концентраций окиси азота в воздухе это соединение относится ко 2-му классу опасности. Отмечается наличие зависимости между загрязнением воздуха оксидом азота и образованием в нем и водоемах нитрозосоединений – активных канцерогенных веществ 1-го класса опасности. Именно поэтому экологические меры безопасности и защиты от окиси азота предусматривают жесткий контроль содержания этого вещества в отходах производственной деятельности и разработку мер по его обезвреживанию, т.е. утилизации химическим путем. Находясь в воздухе, NО может попадать в организм человека ингаляционным путем из городского смога. До недавнего времени полагали, что NО в организме человека играет роль токсиканта, действуя повреждающее на клетки и их структуры. Положение резко изменилось после открытия в начале 1980-х годов в лаборатории R.F. Furshgott эндотелиального релаксирующего фактора (EDRF), расслабляющего гладкую мускулатуру сосудов. А началось все с открытия, результаты которого были опубликованы Робертом Форшготтом в 1955 году. Ученый, проводя физиологические эксперименты с кровеносными сосудами, обнаружил расслабляющее действие света на аорту кролика. Это загадочное поведение аорты в ответ на действие света стало в дальнейшем 8 для него и других исследователей объектом пристального внимания. Можно считать, что оно явилось своеобразной точкой отсчета нового раздела биологической науки. Следующий шаг был сделан в нашей стране человеком, который совершил открытие, ставшее вехой в понимании роли окиси азота в биологии и медицине. Это - профессор, доктор биологических наук Анатолий Федорович Ванин, заведующий лабораторией Института химической физики Российской академии наук. В 1965 году журнал "Биофизика" опубликовал его небольшую, но, как позже оказалось, чрезвычайно важную статью под названием "Свободные радикалы нового типа в дрожжевых клетках". В ней говорилось, что в биологических объектах обнаружены радикалы неизвестной природы, которые никто в мире еще не наблюдал. Наша страна тогда была лидером по созданию аппаратуры для обнаружения радикалов, основанной на явлении электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Приборы и средства обнаружения радикалов, работающие на его основе, называются радиоспектрометрами. Именно этими приборами и была оснащена лаборатория, где работал Анатолий Федорович, который сегодня считается одним из признанных авторитетов в области ЭПР-спектроскопии. Явление ЭПР в 1944 году открыл профессор Казанского университета Е. К. Завойский. Суть этого явления связана со способностью радикалов, находящихся в магнитном поле, избирательно поглощать энергию радиоволн. Неизвестная радикальная субстанция сначала была обнаружена в культурах дрожжей, а затем и в клетках животного происхождения. Стало понятным, что открыто новое вещество, которое присутствует во всех живых клетках. Работы Форшготта и Ванина открыли новое научное направление. Сейчас ученым понятно, что открытые Анатолием Федоровичем неизвестные радикалы не что иное, как молекулы окиси азота. Но в то время предстояло еще выполнить немало сложнейших исследований, чтобы узнать, какие именно радикалы подают необычный ЭПР-сигнал. Одно было ясно уже тогда: науке эти радикалы неизвестны. Годы напряженного труда позволили Ванину сделать второе открытие. Он доказал, что сигналы подает окись азота, причем не одна, а в комплексе с ионами железа и белками, содержащими сульфгидрильные группы. Теперь их называют "динитрозильные комплексы". Какова роль комплекса окиси азота и белка в живой клетке? На этом вопросе и сконцентрировалось внимание Ванина и других исследователей, подключившихся к изучению проблемы. Между тем Р. Форшготт продолжал изучать природу открытого им явления. В 1961 году он опубликовал обзорную статью, в которой еще раз осветил вопрос о расслабляющем действии видимого света на кровеносные сосуды. Результатом исследований, продолжавшихся четверть века, явилось открытие Форшготтом в 1980 году неизвестного физиологически активного вещества - эндотелиального фактора расслабления сосудов (EDRF). 9 Форшготт обратил внимание, что расслабляющее действие ацетилхолина на сосуды наблюдалось только в тех случаях, когда они были плохо очищены от эндотелиальных клеток, выстилающих внутреннюю поверхность сосудов. Форшготт догадался, что именно присутствие эндотелия объясняло физиологический эффект ацетилхолина на сосуды. После проведения серии остроумных опытов сомнений не оставалось: сделано открытие. Так и был обнаружен эндотелиальный фактор расслабления сосудов (EDRF). Это научное достижение приобрело широкий общественный резонанс и взбудоражило весь ученый мир. Большинство ученых сразу поняли, насколько оно важно для физиологии, патофизиологии и практической медицины. В 1991 году Форшготт публикует целую серию статей, в которых он обосновывает утверждение, что EDRF - это не что иное, как молекула окиси азота. То есть, под действием ацетилхолина происходит выброс окиси азота из эндотелия кровеносных сосудов, которая затем поступает в слой мышечных клеток. И именно молекула окиси азота оказывает расслабляющее действие на стенки сосудов. А что же происходит под действием света? Почему он тоже вызывает сосудистую релаксацию? Видимо, под действием светового излучения высвобождается та же самая окись азота, которая (как показал Ванин) существует в виде динитрозильного комплекса с белками. Как ученый-физиолог, Форшготт в своих научных исследованиях шел от явлений к их механизмам. Это путь от сложного к простому. Для Ванина, как биофизика и биохимика, путь от простого к сложному, от факта к его роли и значению был более естественным. Ванин и начал с того, что открыл существование радикальной субстанции в живых объектах и стал изучать, что это за молекула и какие функции она выполняет. Форшготт первым в мире описал явление, обусловленное действием окиси азота, - релаксацию кровеносных сосудов. Ванин открыл наличие неизвестной субстанции в живой материи. В своих дальнейших исследованиях они шли навстречу друг другу, быстро сближаясь. Ими как бы были поставлены две вехи, между которыми пролегла невидимая связующая нить. В середине 70-х годов американский ученый Ферид Мьюрэд сделал важное открытие. Мьюрэд показал, что гуанилатциклаза, один из ключевых ферментов, управляющих жизнью клетки, активируется при действии нитрои нитрозосоединений. Мьюрэд высказывает идею, что действующим активным началом этих соединений являются не они сами, а окись азота, выделяемая из них, и экспериментально ее подтверждает. В это же время Ванин изучает биологическое действие динитрозильных комплексов железа и показывает, что они обладают мощным гипотензивным действием - расслабляют кровеносные сосуды. Ванин также предложил метод обнаружения окиси азота в органах и тканях, получивший широкое распространение. Следующий шаг его в научном поиске не менее важен. Он первым приходит к убеждению и обосновывает, что EDRF имеет прямое отношение к окиси азота. В таких спорных случаях 10 первенства открытия при установлении приоритета обычно учитывается, чьи результаты раньше увидели свет. Ванин, получив данные, что EDRF имеет отношение к окиси азота, в 1985 году решил их опубликовать в журнале "Бюллетень экспериментальной биологии и медицины", но напечатана статья была только через три года после подачи. В это время растет число публикаций на эту тему в зарубежных изданиях. Такие же данные в 1986 году получили Форшготт и Игнарро, а в 1987 году - Сальвадор Монкада. Последний убедительно показал, что в состав EDRF входит окись азота, и немедленно опубликовал свои данные в международном научном журнале "Nature" ("Природа"). Все эти публикации вышли в свет раньше, чем оригинальная статья Анатолия Федоровича. Форшготт и Ванин, пройдя каждый свою половину пути, встретились в 1989 году во Всесоюзном кардиологическом научном центре в Москве. Их общение продолжилось в Лондоне на 1-й конференции по биологической роли оксида азота и в последующей переписке. Ранние эксперименты Л.Игнарро (на снимке) с циклическим гуанилмонофосфатом (ГМФ) привели к открытию в 1992 году релаксирующего влияния молекулы NO на гладкомышечные клетки сосудистой стенки. Луис Игнарро первым определил, что механизм вазодилатирующего эффекта нитроглицерина и производных нитритов и нитратов реализуется через их метаболизм в NO и последующую стимуляцию синтеза ГМФ в гладкомышечных клетках сосудов. Это привело к не менее важному открытию свойства оксида азота подавлять агрегацию тромбоцитов. Среди заслуг профессора Луиса Игнарро следует выделить и открытие им посреднической роли оксида азота в регуляции эрекции, что послужило толчком к проведению революционных исследований в области патологии эректильной дисфункции у мужчин и разработке принципиально новых и эффективных фармакологических средств для ее лечения. В 1992 году NО в знак большого интереса к этой молекуле исследователей был назван молекулой года. В 1998 году Р. Фуршготт, Л. Игнарро и Ф. Мьюрэд за работы по выяснению механизмов, связанных с участием NО, получили высшую оценку мировой науки – Нобелевскую премию. Авторитет Ванина как основоположника нового научного направления общепризнан. Но вот парадокс: Нобелевская премия ему не присуждена. Величие Анатолия Федоровича в том, что он не стал оспаривать решение Нобелевского комитета. Но и исследователи, которым присудили Нобелевскую премию в 1998, - воистину великие ученые и, вне всякого сомнения, заслужили столь высокое признание. Вряд ли кто усомнится, что все началось с основополагающих открытий Форшготта и Ванина. Именно они были пионерами в установлении всеобъемлющей роли окиси азота в живой природе. 11 Оказалось, что окись азота, считавшаяся до этого ядом и потенциальным канцерогеном, причастна к механизмам регуляции тонуса сосудов и принимает участие в процессах развития сосудистых дистоний, гипертензий, ишемий. Затем появились работы, в которых обосновывалась роль окиси азота как участника межнейронной передачи, иммунных реакций, фактора, влияющего на гипотоническую устойчивость эритроцитов, регулятора процессов переноса кислорода эритроцитами и др. Таким образом, NО может считаться одним из универсальных регуляторов клеточного и тканевого метаболизма. Оксид азота образуется в результате окисления аминокислоты аргинина с одновременным синтезом другой аминокислоты цитруллина под влиянием фермента NО-синтазы. Фермент был назван синтазой, а не синтетазой, поскольку для его работы не требуется энергия АТФ. 2Аrg + 3NАDРН + 4О2 + 3Н+ = 2Сit + 2NО + 3NАDР+ + 4Н2О, где Аrg – аргинин, Сit - цитруллин NО-синтаза – это сложно устроенный фермент, представляющий собой гомодимер, то есть он состоит из двух одинаковых белковых субъединиц, к каждой из которых присоединено несколько кофакторов, определяющих каталитические свойства фермента (НАДФН, ФАД, ФМН, гемовая группа, содержащая железо, кальмодулин, тетрагидробиоптерин). Активность фермента проявляется только при объединении двух его субъединиц. NО выделяется также клетками - фагоцитами и вместе с супероксидными радикалами используется для борьбы с микробами (преимущественно грибковой природы). Полагают, что цитотоксическое действие NО обусловлено его реакцией с супероксидом: ·N=О + ·О-О- + Н+ → О=N-О-ОН (пероксинитрит) Пероксинитрит, образующийся в этой реакции, может разлагаться с образованием ·ОН: О=N-О-ОН → О=N-О· + ·ОН (гидроксил радикал). Образование пероксинитрита и радикала гидроксила приводит к повреждению клеток. Хорошо, если повреждающее действие системы NО· направлено на болезнетворные микроорганизмы. Плохо, если оно направлено на свои собственные клетки и ткани. Поэтому в тех участках кровяного русла, где выделяется NО· (как необходимый фактор регулятор кровяного давления), не должно быть супероксидных радикалов. Для этого, в частности, синтезируется фермент СОД, который удаляет супероксид. Одним их важных кофакторов является внутриклеточный кальцийсвязывающий белок кальмодулин. При повышении содержания ионов кальция в клетке он присоединяется к молекуле NО-синтазы, что приводит к активации фермента и синтезу NО. Такое свойство фермента имеет большое значение для клеток, поскольку ферментативная активность, а значит, и синтез NО прямо зависят от функционального состояния клетки, определяющегося во многом внутриклеточным уровнем ионов кальция. Среди других регуляторных механизмов можно отметить возможность фосфорилирования белковой части молекулы влияние особых белков, 12 участвующих в связывании двух субъединиц фермента в единый функционально активный комплекс. NО-синтазы составляют группу ферментов, несколько различающихся по аминокислотной последовательности белковой части и механизмам, регулирующими активность, но катализирующих одну и ту же реакцию. В настоящее время хорошо изучена структура различных изоформ NО-синтазы, известны механизмы, регулирующие их активность, и хромосомная локализация генов, ответственных за синтез ферментов, проведено клонирование этих генов. Синтезировать и выделять NО способно большинство клеток организма человека, однако наиболее изучены три клеточные популяции: эндотелий кровеносных сосудов, клетки нервной ткани (нейроны) и макрофаги – клетки соединительной ткани, обладающие высокой фагоцитарной активностью. В связи с этим традиционно выделяют три основные формы NО-синтаз: нейрональную, макрофагальную и эндотелиальную (обозначают соответственно как NО-синтаза I, II и III). Нейрональная и эндотелиальная изоформы фермента постоянно присутствуют в клетках и называются конститутивными, а вторая изоформа (макрофагальная) является индуцибельной – фермент синтезируется в ответ на определенное внешнее воздействие на клетку. Активность конститутивных изоформ фермента прямо зависит от внутриклеточной концентрации ионов кальция или кальмодулина и. таким образом, повышается под влиянием различных агентов, приводящих к увеличению их уровня в клетке. Конститутивные изоформы NО-синтазы имеют преимущественно физиологическое значение, поскольку количество образуемого NО относительно невелико. Эти ферменты кратковременно выделяют NО под влиянием ацетилхолина, брадикинина, гистамина, глутамата. NО уменьшает количество внутриклеточного кальция (через гуанилатциклазу), что вызывает расслабление гладких мышечных клеток и вазодилатацию. NО может и активировать Са2+ - зависимый К+ - насос в поверхностной мембране, что ведет к ее гиперполяризации. Этот механизм лежит в основе расширения сосудов, вызываемого увеличением тока крови и механическими (например, пульсовыми) натяжениями сосудистой стенки. Последнее может иметь существенное значение для регуляции кровообращения в органах, соприкасающихся с клетками сосудистой стенки. Индуцибельная NО-синтаза активируется интерлейкином-1 (ИЛ-1), интерфероном γ, фактором некроза опухолей; ингибируется ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ10, инсулиноподобным ростовым фактором, циклическими нуклеотидами. Индуцибельные изоформы NО-синтазы проявляют активность через некоторое время (как правило, 6-8ч – время, необходимое для активации генов и начала синтеза фермента) после внешнего воздействия на клетки, продуцируют огромные (в 100-1000 раз больше, чем конститутивные изоформы фермента) количества NО. Поскольку высокие дозы NО токсичны для клеток, эта форма фермента считается патологической в отличие от конститутивной. Активность индуцибельной NО-синтазы не зависит от 13 уровня кальция/кальмодулина, поскольку, как полагают, кальмодулин постоянно и прочно связан с ферментом. В настоящее время показано, что не только макрофаги, но многие другие клетки способны при определенных условиях, в основном в условиях патологии, синтезировать индуцибельную форму NО-синтазы. Нейрональная и макрофагальная формы фермента находятся в клетках преимущественно в растворенном состоянии – в цитозоле, а эндотелиальная NО-синтаза обычно связана с клеточными мембранами. Низкомолекулярный газ NО легко проникает через клеточные мембраны и компоненты межклеточного вещества, однако время его полужизни (в среднем не более 5с) и расстояние возможной диффузии (небольшое, в среднем 30 мкм) ограничиваются высокой реакционной способностью молекулы и ее взаимодействием со многими возможными субстратами. Среди последних следует отметить гемоглобин, к гемовой группе которого NО имеет очень высокое сродство. Действие, оказываемое NО на клетки, во многом зависит от количества газа. В небольших количествах, продуцирующихся обычно конститутивными формами NО-синтазы, эффект NО в основном связан с влиянием на гемовою группу растворимой (цитозольной) формой гуанилатциклазы. Активированный фермент синтезирует гуанозин монофосфат (цГМФ) – активный внутриклеточный посредник, регулирующий работу мембранных ионных каналов, процессы фосфорилирования белков (через протеинкиназы), активность фосфодиэстеразы, а также другие реакции. В больших концентрациях, образующихся, как правило, индуцибельной изоформой NО-синтазы, NО может оказывать на клетки токсический эффект, связанный как с прямым действием на железосодержащие ферменты, так и с образованием сильного окислителя, очень реакционного и токсичного свободнорадикального соединения пероксинитрита. Токсический эффект NО проявляется, прежде всего в ингибировании митохондриальных ферментов, что приводит к снижению выработки АТФ, а также ферментов, участвующих в репликации ДНК. Кроме того, NО и пероксинитрит могут непосредственно повреждать ДНК, это приводит к активации защитных механизмов, в частности стимуляции фермента поли(АДФ-рибоза)синтетазы, что еще больше снижает уровень АТФ и может приводить к клеточной гибели. Повреждение ДНК под влиянием NО является одной из причин развития апоптоза, особого вида клеточной смерти, регулирующейся геномом клетки. Молекулярные основы физиологических эффектов NО связаны главным образом с реакциями нитрозилирования белков, что изменяет их активность. В основе широкого разнообразия NО-эффектов в клетке лежат изменения редокс-формы молекулы NО, а также дополнительные реакции с металлами, тиолами и остатком тирозина в составе белков. Увеличение количества активных форм кислорода в клетке может трансформировать эффекты NО из защитных в цитотоксические. Подобные эффекты могут 14 возникнуть и при истощении в клетке резервов тиолов и увеличении концентрации активных форм кислорода, что приводит к уменьшению скорости нитрозилирования белков. Нитрозилирование может увеличивать активность белков (гуанилатциклаза, циклооксигеназа), так и уменьшать (фермент гликолиза: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, протеинкиназа С). Под влиянием NО увеличивается экспрессия белков теплового шока, белков антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза), ферритина, рецепторов трансферрина, ядерного белка р53, ответственного за блокаду злокачественных новообразований. NО ингибирует активность протеаз, участвующих в апоптозе, - каспаз. Это один из способов защиты клетки от апоптозных сигналов, в котором участвует NО. Однако при высокой концентрации NО происходит нитрование остатков тирозина в каспазах, что приводит к активации апоптоза и гибели клетки. Следует отметить еще оно интересное наблюдение, связанное уже с нейронами, содержащими NО-синтазу, и не получившее пока полного объяснения. Еще в 60-х годах Е.Томас и Э.Пирс использовали новый гистохимический метод выявления активности фермента НАДФН-диафоразы (фермент, способный восстанавливать окисленную форму НАДФ) для анализа нервной системы и показали, что в разных отделах головного мозга имеются единичные нейроны с интенсивной положительной реакцией. Эти нейроны, которые получили название «одиночные активные клетки», остаются неповрежденными при разнообразной патологии нервной системы, в то время как большинство других клеток погибает. Относительно недавно выяснилось, что НАДФН-диафоразная активность свойственная NО-синтазе (НАДФН – диафоразная активность широко используется в настоящее время для гистохимической идентификации клеток, содержащих NО-синтазу, хотя НАДФН-диафораза и NО-синтаза – разные ферменты и их распределение в клетках мозга не всегда совпадает), и, таким образом была установлена устойчивость нейронов, содержащих NО-синтазу, к разнообразным патологическим воздействиям. Механизмы такого необычного и имеющего большое биологическое значение свойства клеток окончательно не выяснены. Остается невыясненным вопрос о том, почему большие дозы синтезированного газа не оказывают токсического влияния на клетки, в которых они образуются. Одним из возможных объяснений такого парадокса может быть то, что в нейронах, содержащих NО-синтазу, определяется высокая активность супероксиддисмутазы, катализирующей распад токсических радикалов и защищающей клетку от их губительного действия. Клетки многих, если не большинства тканей и органов способны экспрессировать индуцибельный фермент в условиях патологии. Интересно, что глюкокортикоиды, известные своей противовоспалительной активностью, ингибируют NО-синтазы в клетках. 15 Что же касается неорганических нитратов, то их действие в организме остается предметом обсуждения. Из-за загрязнения ими окружающей среды, нитраты стали постоянно действующим токсическим фактором в организме человека. Бытовое отравление неорганическими нитритами было и остается распространенным явлением. По всей видимости, этому способствует их широкое применение в пищевой промышленности, доступность использования с суицидной целью или по ошибке, вместо поваренной соли. Принято считать, что их токсическое действие проявляется, главным образом, в индукции метгемоглобинобразования. Тяжесть метгемоглобинемий и их исход зависят от многих обстоятельств. Вместе с тем в последнее время стали появляться данные, свидетельствующие о возможности синтеза окиси азота в организме из неорганических нитратов, осуществляемого ксантиноксидазой в присутствии НАДН в качестве донора электронов. Ксантиноксидаза обладает и нитрит - редуктазной функцией. Нитрит-ионы обладают сосудорасширяющюим действием и применялись с этой целью в терапии. Предполагается, что окислительный процесс превращения гемоглобина в метгемоглобин или миоглобина в метмиоглобин под действием нитрит-ионов может быть сопряжен с синтезом оксида азота. Процесс ингибируется аскорбатом, серотонином, активируется перекисью водорода. Существование в эритроцитах и мышечных клетках нитратнитритного анаэробного источника NО является, возможно, одним из механизмов повышения кровотока при гипоксии, разрушении гемоглобина. Помимо источников окиси азота, действующих на нитрат-нитритной основе, имеются источники NО, функционирующие на другой близкой основе – на основе гидроксиламина. Гидроксиламин, являясь продуктом жизнедеятельности клеток млекопитающих, обладает выраженными вазодилататорными свойствами. Механизм сосудорасширяющего действия этого соединения опосредован действием окиси азота, освобождаемой при его метаболических превращениях. По этой причине гидроксиламин часто называют эндогенным вазодилататором, эндогенным донором окиси азота в организме. Из всех аналитических методов регистрация окиси азота с помощью чувствительных NО-селективных электродов признается наиболее достоверным. 16 Глава 2. Роль оксида азота в функционировании организма Оксид азота – нетипичная сигнальная молекула. Функциональный ответ клетки на действие NО многообразен и в значительной степени зависит не только от фенотипа клетки-мишени, а что очень существенно, от количества NО в клетке, редокс-состояния самого NО и окружающих его молекул. Оксид азота хорошо растворим в воде и липидах, легко и быстро диффундирует через мембраны. Время жизни NО не превышает 6-10с, после чего он превращается при участии кислорода и воды в нитраты и нитриты. Оксид азота – потенциально токсичная молекула, которая широко используется организмом человека не только в разнообразных физиологических, но и патологических процессах. Вероятно, не существует патологического процесса, в котором бы не участвовало это соединение: гипертензия, сахарный диабет, сердечная недостаточность любой природы, рак, наркомания, нейродегенеративные болезни, атеросклероз, мужская импотенция, цирроз печени, заболевания почек, тромбозы и др. Действие NО на клетку может проявляться двойственным образом. Эта молекула может быть губительна для клеток, включая раковые, а также для внутриклеточных патогенных микроорганизмов Функции оксида азота в организме весьма многообразны. NО участвует в поддержании системной и локальной гемодинамики, способствует снижению повышенного тонуса гладкой мускулатуры сосудов и обеспечивает поддержание нормального уровня артериального давления. NО выступает в роли нейротрансмиттера в желудочно-кишечном тракте, мочевыводящей и половой системе, активируя цГМФ. При иммунном ответе NО является стимулятором фагоцитоза и Киллинга внутриклеточных паразитов. При сепсисе, под влиянием цитокинов, происходит высвобождение NО в больших количествах, что способствует развитию септического шока. Оксид азота играет важную роль медиатора, в патогенезе бронхиальной астмы, хронического гломерулонефрита, туберкулеза, рассеянного склероза, болезни Крона, различных опухолей, а также СПИДа. Септический шок – это самое драматическое проявление острых системных воспалительных реакций, при которых происходит индукция индуцибельной NО-синтазы в кровеносных сосудах. Локальная индукция сопровождает деэндотелизацию и атеросклероз. Однако роль разных сосудистых клеток в гиперпродукции все еще не ясна. Воспалительные стимулы вызывают миграцию лейкоцитов к стенке сосуда. Высокая концентрация NО при воспалении приводит к повреждению тканей. NО участвует в деструкции и метаболизме ферментов, содержащих железо, кобальт, марганец, цинк. Именно благодаря способности NО инактивировать железосодержащие ферменты происходит гибель внутриклеточных микроорганизмов, жизнедеятельность которых зависит от присутствия железа и других биоэлементов. Очевидно, что эта функция NО является универсальной и отводит NО решающую роль в элиминации 17 «стареющих» молекул цитохромов, каталазы, гемоглобина, а также индукции апоптоза в клетках, где повышается уровень свободного железа. Установлено, что цитотоксичность NО является результатом образования большого количества этих молекул и инициацией апоптоза. Двойственность действия NО проявляется в способности его защищать клетку от апоптозных сигналов и вызывать апоптоз. Будет ли молекула обладать цитостатическими функциями или проявиться ее цитотоксичность, зависит от типа клетки, фазы ее развития, биохимического потенциала, локальной концентрации NО и других активных форм кислорода. Конститутивные формы фермента поддерживают низкий стационарный уровень NО, который не превышает нескольких микромолей и необходим для нейротрансмиссии, поддержания электрической активности нервных клеток, что крайне важно для сохранения долговременной памяти; для вазорелаксации, эрекции, агрегации тромбоцитов, секреции гормонов, регуляции почечной гемодинамики, электролитного баланса и многих других физиологических процессов. Индуцибельная форма фермента экспрессируется во многих клетках после иммунологических стимулов и при воспалении, например под влиянием медиаторов этих процессов – цитокинов, а также при действии на клетку эндотоксинов. При участии индуцибельной NО-снтазы высвобождается большое количество NО. Стационарный уровень NО в этих тканях достигает сотни микромолей и поддерживается в течение от нескольких часов до нескольких дней, что зависит от длительности стимула. Оксид азота диффундирует через мембраны и, действуя на близлежащие клетки – мишени, усиливает апоптоз, убивает патогенные микроорганизмы и координирует Т-клеточный иммунный ответ. NО действует как важный регулятор таких общих клеточных процессов, как экспрессия генов и функции митохондрий. NО - активный участник биохимических и молекулярных событий в клетке, составляющих программированную клеточную смерть – апоптоз. Молекула NО обладает уникальной способностью инициировать и блокировать апоптоз. К апоптозу приводят следующие роли NО в клетке: - активация каспаз – специфических цистеиновых протеаз, расщепляющих некоторые ключевые белки; - запуск апоптозактивирующих факторов, например белка р53, белка Всl-2. - конденсация хроматина; - ДНК- фрагментация. Проявлениями благоприятного действия, защищающими от самоубийства клетки можно считать следующее: - повышение экспрессии белков оксигеназы1, шаперона; - взаимодействие с радикалами; - тиоловая модификация белков- каспаз. Сердечно-сосудистая система. Главным источником и местом образования NО в организме человека является эндотелий, общая масса которого в теле 18 человека достигает 1,5 кг. Значение NО в кровообращении многогранно. Прежде всего NО – мощный сосудорасширяющий агент. Эндотелий постоянно продуцирует небольшие количества NО (так называемый базовый фон), а при различных воздействиях – механических, химических, бактериальных или вирусных – синтез NО в эндотелиальных клетках значительно повышается. Действует NО очень быстро – начало расслабления гладких мышц происходит через 10с после добавления NО в культуру изолированных кровеносных сосудов. Открытие сосудорасширяющего действия NО позволило прояснить механизм действия самого распространенного и эффективного лекарственного средства, применяемого для лечения спазма коронарных артерий – нитроглицерина. При расщеплении препарата образуется NО, приводящий к расширению сосудов сердца и снимающий в результате этого чувство боли. Большое значение NО имеет в регуляции мозгового кровообращения. Имеется несколько источников NО для регуляции просвета мозговых сосудов. Это эндотелий сосудов, нейроны и астроциты. Активация нейронов какой-либо области мозга приводит к возбуждению нейронов, содержащих NО-синтазу, и/или астроцитов, в которых также может индуцироваться синтез NО, и выделяющийся из клеток газ приводит к локальному расширению сосудов в области возбуждения. С NО связывают и развитие септического шока, когда большое количество микробов, циркулирующих в крови, резко активирует синтез газа в эндотелии, что приводит к длительному и сильному расширению мелких кровеносных сосудов и как следствие – значительному снижению артериального давления, с трудом поддающемуся терапевтическому воздействию. Гиперпродукция NО в сосудистой стенке вследствие резкого падения сосудистого сопротивления вызывает потенциальную летальную гипотензию. Это происходит при септическом шоке и множественных органических поражениях у человека и может привести к сосудистому коллапсу. Артериальное давление и сосудистое сопротивление в таких случаях можно восстановить введением структурных аналогов аргинина, например NG – монометиларгинина (L-NММА) – конкурентного ингибитора индуцибельной NО-синтазы. NО, образующийся в эндотелии, оказывает влияние и на взаимодействие клеток крови с эндотелием. Газ препятствует прилипанию лейкоцитов и кровяных пластинок к эндотелию и также снижает агрегацию последних. Такое действие NО может иметь большое значение на ранних стадиях развития тромбов и в генезе атеросклеротических повреждений стенки сосудов. Участие NО в развитии атеросклероза может заключаться и еще в одной стороне его действия. NО может выступать в роли антиростового фактора, препятствующего пролиферации гладкомышечных клеток стенки сосудов, важного звена в патогенезе болезни. В нервной системе NО имеет большое значение, как в нормальных физиологических условиях, так и при различной патологии. Источниками NО в ЦНС являются нейроны, астроциты, клетки микроглии и эндотелий 19 кровеносных сосудов. Нейроны, содержащие NО-синтазу, находятся во многих отделах ЦНС и большинстве изученных периферических ганглиев нервной системы. В коре больших полушарий в среднем 2% нейронов содержат NО-синтазу, в большинстве других отделов головного мозга число таких нейронов также невелико. Однако имеются и области с высоким их содержанием. Так, максимальное количество нейронов, содержащих NОсинтазу, находится в коре мозжечка, где большинство клеток-зерен и корзинчатых нейронов содержат фермент. Самые крупные нейроны коры мозжечка – клетки Пуркинье не содержат NО-синтазу. Сравнительно много нейронов, содержащих NО-синтазу, находится в обонятельных луковицах, а также в некоторых отделах гиппокампа и полосатого тела. Только, повидимому, в мозжечке нейроны, содержащие NО-синтазу, составляют компактную популяцию клеток, в остальных отделах это одиночные, редко расположенные нейроны. Преимущественная их часть относится к небольшим по размерам клеткам, многие из которых не содержат дендритных шипиков и являются ассоциативными нейронами. Крупные клетки, например, пирамидные нейроны коры больших полушарий или гиппокампа, моторные нейроны передних рогов спинного мозга, не содержат NО-синтазу. NО-синтаза сосуществует в нервных клетках с другими традиционными нейромедиаторами и нейропептидами, чаще фермент определяется в холинергических нейронах. Нервы, содержащие NО-синтазу, показаны практически во всех внутренних органах преимущественно в стенке кровеносных сосудов, где они наряду с эндотелием могут оказывать сосудорасширяющий эффект. NО признается одним из основных эффекторных агентов в так называемых неадренэргических - нехолинэргических нервах. В периферических нервах подробно изучено сосуществование NО-синтазы с нейропептидами. Наиболее часто фермент определяется вместе с ВИП и нейропептидом Y. Значение NО в ЦНС в нормальных условиях связывают с тремя процессами: 1. участие в межнейронной связи в качестве нейромедиатора; 2. регуляция церебрального кровотока; 3. установление межнейронных синаптических взаимосвязей во время развития нервной системы. Нейромедиаторная сущность NО заключается в том, что он синтезируется при возбуждении нейрона (в ответ на поступление кальция) и, диффундируя в соседние клетки, активизирует в них образование цГМФ, способного влиять на проводимость ионных каналов и, таким образом, изменять электрогенез нейронов. NО отличается от традиционных нейромедиаторов тем, что он оказывает воздействие на ионные каналы не через плазмалеммальные рецепторы, а изнутри, со стороны цитоплазмы. Кроме того, действие NО не ограничивается только областью синаптических контактов, газ может влиять на ионные каналы на значительной площади плазматической мембраны нейрона. 20 Участие NО в синаптической платичности наитболее ярко проявляется в таких процессах, как длительная синаптическая потенциация (повышение эффективности проведения возбждения через синапс для каждого последующего импульса в их последовательности), более детально проанализированная в гиппокампе, и длительная синаптическая депрессия (снижение эффетивности проведения возбуждения через синапс), лучше исследованная в коре мозжечка. С длительной синаптической потенциацией, прежде всего в гиппокампе, связывают пластичность межнейронных связей, лежащих в основе памяти. Такое предположение основывается на ставших уже классическими представлениях Д. Хэбба (1949 год) о повышении эффективности синаптической передачи при возбужденном состоянии нейрона. Физиологические наблюдения об участии NО в процессах памяти и обучения противоречивы. Наряду с работами, в которых показано нарушение процессов обучения у экспериментальных животных при введении ингибиторов NО-синтазы, имеются и исследования с противоположными результатами. Неоднозначность получаемых результатов, возможно, связано с тем, что вводимые в организм ингибиторы NО-синтазы оказывали действие не только на всю нервную систему, но и на все органы и ткани животных, что не позволяло достичь локального влияния на продукцию NО в мозге. Интересно, что нахождение животных (крыс) в обогащенной внешней среде (лабиринт, новая обстановка) приводит к увеличению числа нейронов, содержащих NО-синтазу во многих отделах головного мозга, причем предварительное введение ингибиторов NО-синтазы приводило как к снижению активности NО-синтазы в нейронах, так и к нарушению процессов обучения. На срезах головного мозга было показано, что NО способен инициировать выделение нейромедиатора дофамина из нейронов не посредством экзоцитоза, а путем трансмембранной диффузии при участии особого мембранного переносчика дофамина, участвующего в его захвате из межклеточной среды. Предполагается прямое влияние NО на транспортные белки мембран. Результаты электронно-микроскопических исследований показывают, что NО-синтаза определяется во всем объеме тела нейрона – в перикарионе, аксоне, дендритах. Можно считать, что синтез и выделение NО может инициироваться в любом участке тела и отростков нейронов. Таким образом, нейроны, содержащие NО-синтазу, способны создавать вокруг себя поле воздействия, то есть могут считаться своеобразными полевыми нейронами в отличие от традиционных нейронов, связанных друг с другом в локальных участках – синапсах. Известно, что астроциты способны продуцировать NО, причем они обладают как конститутивной (в небольшом количестве), так и индуцибельной NО-синтазой. Если принять во внимание, что число астроцитов в 10-100 раз превосходит (в зависимости от области мозга) количество нейронов, то их роль в продукции NО и влиянии на механизмы электрогенеза нейронов может являться весьма значимой. 21 Значение астроцитов как источника NО особенно ярко проявляется при патологии ЦНС. При многих нейродегенеративных заболеваниях, ишемии, травмах, опухолях головного мозга астроциты начинают экспрессировать NО-синтазу и продуцировать большой объем NО. С этим связывают гибель нейронов и других макроглиальных клеток, в частности олигодендроцитов. Целенаправленный рост и ветвление отростков нейронов, установление новых синаптических контактов в процессе развития нервной системы во многом определяются возбуждением нервных клеток. Нейроны, содержащие NО-синтазу, показаны еще в эмбриональном периоде, и, как полагают, NО может инициировать разветвление растущих аксонных и дендритных веточек и стимулировать образование синапсов. Эта область нейробиологии остается еще малоисследованной. Избыточная продукция NО является нейротоксичной и вносит определенный вклад в патогенез неврологических заболеваний. Трансгенные мыши, у которых отсутствует NО-синтаза, устойчивы к ишемии мозга. Химическое повреждение дофаминэргических нейронов предотвращается ингибированием NО-синтазы. Активность этого фермента может иметь особенно большое значение для холинэргических нервных сетей в ЦНС. Содержащие NО-синтазу нейроны коры больших полушарий специфично иннервируются холинэргическими нейронами базальных ядер переднего мозга, которые сами содержат высокий уровень NО-синтазы. Иммунитет. Онкологические заболевания. Участие нитропроизводных (производных нитритов и нитратов) во многих патологических процессах, в том числе и опухолевом росте, было известно давно. Первоначально разрозненные и часто необъяснимые данные о связи противомикробного действия макрофагом и противоопухолевого действия макрофагов и нитропроизводных прояснились после открытия синтеза NО в эндотелиальных клетках. Действие макрофагов на чужеродные агенты также стали связывать с NО, и многочисленные эксперименты подтвердили, что макрофага способны синтезировать NО-синтазу и выделять большое количество газа. Уже отмечалось, что NО-синтаза макрофагов является индуцибельным ферментом. В нормальных условиях клетки не содержат этот фермент и не продуцируют NО. Под влиянием липосахаридов микробного происхождения или цитокинов – высокоактивных межклеточных посредников, выделяющихся лимфоцитами при их контакте с чужеродными агентами, в макрофагах начинается синтез индуцибельной изоформы NОсинтазы, образующей большой объем NО, оказывающего цитостатическое и цитолитическое действие на бактериальные и чужеродные, в том числе и раковые, клетки. Нейтрофилы также способны экспрессировать NО, однако данные о цитотоксическом действии этих клеток, связанным с NО, неизвестны, и значение такой способности нейтрофилов остается невыясненным. Известно, что нейтрофилы и макрофаги способны активно образовывать свободные радикалы кислорода (это имеет огромное значение в их защитном противомикробном действии), возможно, образование пероксинитрита в 22 реакции NО со свободными радикалами может усиливать антимикробный эффект этих клеток. При онкологических заболеваниях NО выполняет противоречивые функции. С одной стороны, NО как свободный радикал, является ключевым фактором канцерогенеза. Показано, что при хронических воспалениях органов NО может выступать как промотор рака. С другой стороны, NО, синтезированный лейкоцитами, оказывает большое влияние на их способность уничтожать раковые клетки. Участие NО в цитотоксической активности макрофагов по отношению к опухолевым клеткам – одно из первых функциональных свойств, описанных для этой молекулы. Ингибирование синтеза NО в макрофагах снижает противоопухолевую сопротивляемость организма. Значительные количества NО, синтезируемые индуцибельной NО-синтазой, экспрессируемой в купферовских клетках, клетках-киллерах, микроглиальных и эндотелиальных клетках, оказывают цитотоксическое действие на многие типы опухолей. Макрофаги, выделенные от животных, имеющих опухоли, проявляют пониженную способность продуцировать NО, а также ослабленную противоопухолевую активность. Взаимозависимость снижения уровня NО и увеличения размера опухолей указывает на то, что этот свободный радикал является интегральной частью противоопухолевой защиты иммунной системы. Эксперименты показали, что клетки печени эмбрионов проявляли способность подавлять пролиферацию Т-лимфоцитов и опухолевых клеток. Оксид азота выступал в роли главного супрессорного фактора только против лимфоцитов. Таким образом, клетки эмбриональной печени, как и костного мозга, обладают NО-зависимой иммуносупрессорной и NО – независимой противоопухолевой активностями. Однако NО может выступать в роли важного медиатора роста опухолей. Различные виды опухолей (молочной железы у людей, шейки матки; опухоли, поражающие ЦНС, и др.) характеризуются повышенным уровнем NО-синтазы. NО стимулирует опухолевый рост путем регуляции процессов жизнедеятельности опухолей, оказывает влияние на синтез простангландинов. В частности при повышении уровня РGЕ2 повышается проницаемость капилляров, что увеличивает приток питательных веществ к ткани опухоли и способствует ее быстрому росту. РGЕ2 также подавляет цитотоксическую активность макрофагов. Пролиферация Т-лимфоцитов значительно ингибируется NО, и этот эффект обусловливает негативную роль NО при онкологических заболеваниях. Совокупность данных указывает на то, что NО обладает цитотоксическими и цитостатическими свойствами, те не менее ингибирование синтеза NО на разных стадиях развития опухолей может оказаться полезным. Таким образом, NО – удивительное вещество по своим физиологическим функциям, терапевтическое применение которого продолжает расширяться. Весьма обещающей представляется возможность регуляции NО биохимических процессов, в которых он участвует. 23 Двойственные функции NО: посредник и токсин. Функции в клетке NО - посредник NО – токсин (стационарная Ткань (стационарная концентрация – сотни концентрация – несколько микромолей) микромолей) Вазорелаксация, Септический шок, дезагрегация тромбоцитов, воспаление, реперфузия антисклеротическое (расширение) очага Кровеносные ингибирование миграции воспаления, микрососудистые сосуды гладких мышечных клеток разрывы, атеросклероз, и пролиферации, артериальная гипертония антиадгезивные свойства Коронарное Септический шок, сердечная Сердце кровообращение, недостаточность миотропное действие Астма (обратимая обструкция Вентиляция – перфузия, легочных путей), повышенная геруляция сокращения Легкие чувствительная к различным бронхов, секреция слизи, стимулам иммунная защита Диабетическая Клубочковая гиперфильтрация, почечная Почки ультрафильтрация, недостаточность, антимикробное действие гломерулярный склероз Синаптогенез, нейропластичность, Нейротоксичность, мигрень, формирование памяти, судорожный синдром, регулятор мозгового ЦНС гипералгезия (увеличение кровообращения, болевой чувствительности) нейроэндокринная секреция, зрительная трансдукция, обоняние Поджелудочная Секреция гормонов Разрушение β-клеток железа Регулятор метаболизма, дыхания, обезвреживания Реперфузия повреждения, веществ, перфузия гепатит, цирроз, септический гепатоцитов, Печень и геморрагический шок антимикробное действие, защита при дисфункции и воспалении Ток крови, перистальтика, ЖелудочноГастриты, язвы желудка, экзокринная секреция, кишечный колиты, дискинезии моторики антимикробное действие тракт 24 Иммунная система Антимикробное и антираковое действие Воспаление, септический, эндотоксический, геморрагический шок, повреждение тканей, ускорение роста опухоли, васкуляризация тканей. Вместе с тем, поскольку NО – вездесущий медиатор метаболизма, необходимо вести поиск новых ингибиторов индуцибельной NО-синтазы и доноров NО, способных избирательно воздействовать на клетки и ткани. Такие лекарственные вещества могут быть мощными средствами преодоления различных нарушений сердечно-сосудистой системы, метаболизма печени, кишечника и почек. 25 Глава 3. NО и фармакология Еще в конце 60-х годов ХIХ века было обнаружено, что при вдыхании паров амилнитрита расширяются кровеносные сосуды и прекращаются приступы «грудной жабы» (стенокардии). Уже тогда больным «грудной жабой» рекомендовали смачивать кусочек ткани несколькими каплями амилнитрита и вдыхать его пары. Препарат начинал действовать через 3060с. Одновременно с прекращением загрудинных болей отмечалось покраснение лица и возникновение головной боли (вследствие расширения сосудов мозга). С появлением нитроглицерина и обнаружением его эффективности при стенокардии амилнитрит в связи с выраженными побочными явлениями и кратковременностью стали назначать реже. В настоящее время амилнитрит как антиангинальное средство практически не применяется. В прошлом как сосудорасширяющее средство при стенокардии, иногда при спазмах головного мозга применяли внутрь раствор нитрита натрия. Эффект, подобный действию амилнитрита, развивается медленнее, но более продолжительно. В настоящее время амилнитрит и нитрит натрия для лечения артериальной гипертензии не используют, так как их гипотензивный эффект непостоянен и непродолжителен, может сопровождаться побочными явлениями. В весьма редких случаях нитриты применяют при стенокардии для купирования болевого синдрома. В качестве антиангинальных препаратов сегодня широко используют органические нитраты. В связи со спецификой их химического строения и фармакологического действия, главным образом скорости наступления антиангинального эффекта и его продолжительности, нитраты имеют различное применение. Способность нитроглицерина снимать приступы «грудной жабы» была эмпирически открыта в 1879г. С тех пор он остается основным средством купирования этого тяжелого заболевания. В настоящее время используют различные лекарственные формы нитроглицерина: «обычные» (короткодействующие) – для купирования приступов стенокардии и пролонгированные – для предупреждения развития стенокардии в основным у больных ИБС. После приема внутрь нитроглицерин разрушается в значительной степени в печени. Однако он 26 быстро и полностью всасывается со слизистых оболочек и кожи. Поэтому более эффективно сублингвальное, буккальное введение или в виде аэрозоля. При острой левожелудочковой недостаточности, невосприимчивости к другим видам лечения используют внутривенное введение раствора нитроглицерина. При рекомендуемой скорости не более 0,2 мг в минуту длительность введения может составить двое – трое суток. Частота и длительность применения капель, таблеток, аэрозоля зависят от частоты и интенсивности приступов стенокардии, эффективности и переносимости препаратов. Обычно после купирования приступа переходят на прием препаратов пролонгированного действия. Препараты пролонгированного действия применяют для предупреждения приступов стенокардии иногда при хронической сердечной недостаточности. Эффект развивается постепенно и сохраняется обычно в течение нескольких часов. Пролонгированные формы получают путем включения нитроглицерина в пленку из биорастворимого полимера. Полимерная пластинка апплицируется на слизистую оболочку полости рта с предварительным подбором дозы в зависимости от скорости рассасывания пластинки. Для ускорения наступления эффекта больной может языком полизывать пластинку. При необходимости прекращения действия ее удаляют. Другой вариант пролонгирования действия нитроглицерина – включение его в таблетки в оболочки из полимерных материалов. Это создает условия для относительно медленного высвобождения нитроглицерина и его промедленного действия. Пролонгированный эффект создает также и микрокапсулирование нитроглицерина. Причем капсулы имеют различную скорость распада (от 10 минут до нескольких часов). Созданы пролонгированные препараты в виде защечных таблеток, мазей и пластырей. Мазь обычно назначают как дополнительное средство в сочетании с перорально применяемыми нитратами. Эффект, характерный для нитратов, проявляется обычно через 30-40 минут и длится около 2-5 часов. Пластыри применяют в виде аппликации на кожу переднебоковой поверхности грудной клетки слева или левого предплечья. Длительность разового применения 12-14 часов, после чего удаляют во избежание развития толерантности. Последующее применение пластыря рекомендуется не ранее, чем через 10-12 часов. При применении нитратов в различных лекарственных формах следует учитывать, что непрерывный длительный прием приводит к развитию толерантности. При этом для достижения соответствующего эффекта требуется увеличение дозы, а иногда и частоты приема. Так как большинство пациентов длительно пользуются нитратами, то необходимо тщательно регулировать дозы препарата, временно прекращать прием данного препарата и заменять его другим средством при постоянном контроле терапии. 27 При применении препаратов часто возникает головная боль, возможны головокружения, тахикардия, брадикардия, снижение артериального давления, при передозировке – ортостатический коллапс. Противопоказания: кровоизлияние в головной мозг, повышенное внутричерепное давление, выраженная артериальная гипотензия, закрытоугольная форма глаукомы с высоким внутриглазным давлением. Антиангинальная медикаментозная терапия назначается для предупреждения появления приступов стенокардии и повышения качества жизни пациентов. Нитраты являются основными средствами, назначаемыми для купирования и предупреждения приступов стенокардии. Они применяются в медицине более 100 лет, но и сейчас нет ни одного больного ИБС, который бы не пользовался этими препаратами. Основным эффектом нитратов является релаксация гладкой мускулатуры сосудистой стенки. Наиболее выражено действие нитратов на венозное русло. Вазодилятация сопровождается снижением пред- и постнагрузки желудочков, уменьшением работы сердца и потребности миокарда в кислород; снижением давления наполнения и напряжения миокарда, улучшением кровоснабжения в субэндокардиальных и интрамуральных областях во время диастолы, усилением коллатерального кровотока в зоне ишемии, при этом отсутствует синдром обкрадывания. Нитраты также расширяют просвет субэпикардиальных артерий в месте эксцентрических стенозов, где частично сохранена гладкая мускулатура. Нитраты восстанавливают нарушенную функцию эндотелия, замещая дефицит NO. Биодоступность – это количество лекарства, которое попало в системный кровоток и оказало свой фармакологический, антиангинальный эффект. Биодоступность нитросорбида низкая, это обусловлено тем, что перед попаданием в кровоток препарат метаболизируется в печени с образованием метаболитов. Этот показатель заметно варьирует у пациентов различных возрастных групп и с нарушением функций печени, т.е. имеются индивидуальные колебания биодоступности, а значит, и вариабельности лечебного действия, так как для нитратов существует прямая зависимость между концентрацией в плазме крови и выраженностью антиангинального, антиишемического эффекта. Метаболизм изосорбида динитрата происходит так, что появляются два метаболита: изосорбид-5-мононитрат и изосорбид-2-мононитрат. Последний обладает слабой активностью, в то время как основной антиангинальный ээфект достигается за счет активного метаболита изосорбида-5-мононитрата. Как только пришло понимание того, что основной эффект изосорбида динитрата обусловлен его активным метаболитом, стали создавать препараты изосорбида-5-мононитрата и использовать его в клинической практике. Биодоступность изосорбида-5-мононитрата составляет 100%, т.е. сколько больной принял препарата, столько и попало в его кровоток, при этом биодоступность не зависит от индивидуальных особенностей пациента, а, следовательно, терапевтический эффект постоянный и прогнозируемый. 28 Препарат не метаболизируется, и в организме действует только одна субстанция. Одно из основных требований к препарату – это возможность его назначения один – два раза в сутки, так как при необходимости в частых приемах пациенты не соблюдают рекомендации врачей. Длительный период полувыведения и пролонгированное действие, свойственное изосорбиду-5мононитрату, позволяют назначать его один раз в день, что значительно повышает приверженность пациентов к лечению. Эффект наступает быстро, что позволяет принимать лекарство в режиме «по требованию», т.е. перед планируемым физическим или психическим напряжением. Сегодня фармацевтическая промышленность выпускает формы пролонгированного действия. В отличие от обычных таблеток они действуют 20-24 ч, и для надежной профилактики болевых приступов достаточно принимать 1 капсулу в сутки. Одна из проблем, которую приходится решать рвачу у пациентов с длительным, а иногда практически постоянным приемом нитратов, это развитие толерантности (привыкания), т.е. когда эффект препарата исчезает полностью или ослабляется. Синдром привыкания может проявляться не только учащением приступов стенокардии, но и частоты и продолжительности эпизодов безболевой ишемии миокарда. Риск развития привыкания прямо пропорционален длительности лечения, а главное, тому, насколько долго сохраняется в крови высокая концентрация препарата. Привыкание – обратимое явление. При отмене нитрата через некоторое время его эффект восстанавливается. Единственный надежный способ борьбы с привыканием – это отмена нитрата и замена его на препарат другой группы. Отменять нитрат надо постепенно, так как может развиться синдром отмены. Существует эффективный способ предотвращения развития привыкания к нитратам. Это способ их прерывистого назначения. Он основан на том, что если нитрат будет находиться в организме не постоянно, а только в течение какого-то периода, то чувствительность к нему будет восстанавливаться в период отсутствия препарата. Не обязательно концентрация нитратов должна падать до нуля, она может просто уменьшиться. Если в процессе лечения будут создаваться периоды, свободные от действия препарата, то риск развития привыкания существенно снижается. При приеме пролонгированных препаратов утром антиангинальный эффект выражен в дневное время, когда пациенты более всего подвержены риску развития приступов стенокардии. В ночное время содержание нитратов снижается, тем самым значительно уменьшается риск развития привыкания. При приеме изосорбида-5-мононитрата пролонгированного действия, концентрация препарата в крови сохраняется в течение 19ч на уровне выше нижней границы терапевтического диапазона. При этом существует «безнитратный период», который позволяет снизить риск развития толерантности. Это значит, что больные, страдающие стенокардией, могут принимать препарат один раз в день длительно, не меняя схему лечения и не опасаясь ослабления терапевтического эффекта. 29 Концентрация препарата к концу суток снижается плавно, а значит, нет условий для возникновения синдрома отмены (учащение приступов стенокардии при резкой отмене препарата и быстром падении его концентрации в крови). Побочные эффекты развиваются редко, обычно слабо выражены. Наиболее частым побочным эффектом является появление головных болей, которые, как правило, исчезают при дальнейшем приеме препарата. Причиной головных болей является сосудорасширяющее действие нитратов, на которое особенно реагируют сосуды мозговых оболочек. Может наблюдаться понижение артериального давления, головокружение, ортостатическая гипотония, рефлекторное увеличение частоты сердечных сокращений, гиперемия лица. Обычно эти симптомы умеренно выражены и не требуют отмены препарата. Одновременный прием других сосудорасширяющих средств может усиливать гипотензивный эффект нитратов. Прием у больных артериальной гипертонией может сопровождаться сниж6ением суточной дозы гипотензивных препаратов. Комбинация с бета-адреноблокаторами потенцирует антиангинальный эффект нитратов. Бета-блокаторы препятствуют развитию тахикардии, сопровождающей применение нитратов у некоторых больных. Вазодилатирующий эффект нитратов в свою очередь препятствуют развитию периферической вазоконстрикции, побочного действия, свойственного бета-адреноблокаторам. 30 Глава 4. Терапия оксидом азота В организме человека оксид азота (NO) синтезируется в результате расщепления L-аргинина ферментом NO-синтетазой (NOS) в эндотелиальных и нервных клетках, макрофагах и др. Механизмы воздействия NO на организм еще не достаточно изучены, но, на сегодняшний день известно, что эта молекула выполняет многие важные биологические функции: 1. Синтезируемый в макрофагах и моноцитах NO, обеспечивает их цитотоксическую и цитостатическую активность по отношению к чужеродным клеткам, в том числе и к микробным, активирует Т-лимфоциты и иммуноглобулин Е. 2. Синтезируемый в эндотелиальных клетках NO, воздействует через систему циклического ГМФ на гладкую мускулатуру гладкомышечных волокон сосудов и является вазодилататором, антиагрегантом тромбоцитов и эритроцитов, ингибитором тромбообразования. NO активно участвует в регуляции тонуса сосудистой системы, выполняя роль так называемого "эндотелиального релаксирующего фактора". 3. Синтезируемый в клетках нервной системы NO, выступает в качестве медиатора нейромышечных коммуникаций, синоптической пластичности и памяти, а также медиатора, обуславливающего релаксацию гладкомышечных клеток пищеварительного тракта, бронхов и т.д. Огромный интерес исследователей к изучению патогенетической роли оксида азота первоначально был обусловлен новыми исключительно интересными публикациями, свидетельствующими о том, что расслабляющий сосуды фактор идентичен NO, а многочисленные лекарственные нитраты реализуют свой ангиотропный эффект благодаря освобождению из нитратов NO. NO является аутокринным и паракринным медиатором, так как, будучи синтезирован в каких-либо клетках, он способен влиять на метаболические процессы как в самих этих клетках, так и в расположенных по соседству. NO, как мощный эндогенный вазодилататор, принимает участие в регуляции системного и легочного сосудистого сопротивления и процессах коагуляции крови. NO функционирует в центральной и вегетативной нервной системе. По эфферентным нервам этот агент регулирует деятельность органов дыхательной систем, желудочнокишечного тракта и мочеполовой системы. NO подавляет пролиферацию гладкомышечных клеток сосудов. Совершенно закономерно, что снижение активности NO вызывает вазоконстрикцию и тромбоз. Постоянно расширяется область применения NO в медицинской практике. На сегодняшний день он активно используется в кардиологии, интенсивной терапии, неонтологии, хирургии. Показания в терапии экзогенным оксидом азота (NO-терапии): - в оториноларингологии: ангина, острый фарингит, хронический тонзиллит, ринит, гайморит, острый отит, тугоухость, послеоперационные состояния; 31 - хронические раны: трофические язвы (на фоне варикозного расширения вен и сахарного диабета), "диабетическая стопа", трофические расстройства на фоне сопутствующей патологии; - послеоперационные раны (стимуляция заживления); - стоматология: воспаления и язвы десен, слизистой щек; - гинекология: эрозия шейки матки, гнойный аднексит; - офтальмология: травмы и ожоги роговицы глаза; - внутренние болезни: пульмонология (хронические бронхиты, бронхиальная астма, легочная гипертензия), гастроэнтерология Внутренние болезни Пульмонология Впервые в нашей стране для терапии больных с различными формами легочной гипертензии был применен ингаляционный NO - селективный вазодилататор. N0 является биологически активным газом и используется качестве селективного вазодилататора для снижения легочного сосудистого сопротивления и улучшения газообмена. В настоящее время в силу своей высокой эффективности и высокой безопасности (практически полное отсутствие побочных эффектов), оксид азота является методом стандартной терапии заболеваний, ассоциированных с высокой легочной гипертензией и артериальной гипоксемией: •первичная легочная гипертензия •вторичная легочная гипертензия (на фоне ХОБЛ, фиброзирующего альвеолита, муковисцидоза) •тромбоэмболия легочной артерии •острый респираторный дисстресс синдром •тяжелая пневмония •легочная гипертензия новорожденных •постоперационная легочная гипертензия 1. Механизм селективного вазодилатирующего действия ингаляционного NO на сосуды малого круга. Терапия ингаляционным NО (иNO), экзогенным аналогом естественного регулятора сосудистого тонуса, основана на подаче данного лечебного газа в дыхательные пути пациента, которое может осуществляться с помощью соответствующей аппаратуры, как при самостоятельном, так и принудительном дыхании (ИВЛ) [Higenbottam T. et al., 1988]. При отсутствии значимых препятствий, иNO из верхних дыхательных путей проникает в дистальные отделы трахеобронхиального дерева и затем попадает в просвет альвеол. Малые размеры молекулы и высокая проницаемость через мембраны клеток и клеточные структуры лежит в основе высокой диффузионной способности иNO, что способствует дальнейшему проникновению иNO из просвета альвеол и последующему 32 прохождению через альвеолярно-капиллярную мембрану в направлении легочных сосудов [Frostell C. G. et al., 1991]. Основной точкой приложения биологического эффекта для иNO являются гладкомышечные клетки легочных сосудов. ИNO практически моментально диффундирует в прилегающий слой гладкомышечных клеток, где стимулирует гуанилатциклазу, катализирующую превращение ГТФ в цГМФ. В результате действия цГМФ на процессы транспорта Са2+ внутриклеточная концентрация последнего снижается и происходит расслабление стенки лёгочных сосудов [Frostell C. G. et al., 1993]. При всех равных условиях величина гидростатического давления в лёгочных капиллярах и характер обмена жидкостью между внутрисосудистым и внесосудистым пространствами лёгких зависят от соотношения тонуса лёгочных артерий и лёгочных вен [Yoshimura K. et al., 1989]. Повышение тонуса лёгочных вен может приводить к увеличению гидростатического давления в лёгочных капиллярах, выходу жидкости из просвета сосудов в интерстициальное пространство и развитию интерстициального или альвеолярного отёка лёгких. В ситуации, когда повышение общего легочного сосудистого сопротивления обусловлено вазоконстрикцией, как лёгочных артерий, так и вен применение вазодилататоров, действующих избирательно только на лёгочные артерии, может приводить к повышению гидростатического давления в условиях сохраняющегося высоким сопротивления лёгочных вен и отёку лёгких [Yoshimura K. et al., 1989]. Экспериментальные исследования показали, что иNO, как вазодилататор малого круга, действует пропорционально одинаково действует как на лёгочные артерии, так и вены [Lindeborg D. M. et al., 1995]. 2. Метаболизм ингаляционного NO. Незадействованные в процессе вазодилатации молекулы иNO попадают в просвет лёгочных сосудов. Высокое сродство к гемоглобину (Hb), которое в 105 – 106 раза выше, чем для кислорода, способствует практически мгновенному проникновению этих молекул иNO в эритроциты, где они связываются как оксигемоглобином (HbO2), так и с восстановленным Hb [Rimar S., Gillis C. N., 1993]. При взаимодействии иNO с HbO2 образуются метгемоглобин (HbFe3+) и анионы NO-3, а при взаимодействии с восстановленным Hb - нитрозилгемоглобин (HbNO) и анионы NO-3 [Wennmalm A. et al., 1993]. Большинство молекул иNO в течение 48 часов выделяется с мочой в форме нитратов (NО3-). Оставшиеся молекулы иNO в форме нитритов (NО2-) секретируются в ротовую полость слюнными железами с последующим превращением в желудке до молекулярного азота. Незначительное количество NО2- в просвете кишечника восстанавливается до аммиака. Таким образом, быстрое связывание с Hb и последующая инактивация практически исключают возможность транспортировки иNO с кровотоком и её дилатирующее влияние на сосуды большого круга кровообращения. Данный биологический механизм определяет селективный характер вазодилатирующего действия иNO на сосуды малого круга. 33 3. Эффекты ингаляционного NO. а) Влияние на сосуды малого круга. Уникальное свойство иNO, как селективного вазодилататора малого круга, вызывать избирательное снижение давления лёгочной артерии, проявляется снижением давления легочной артерии и общего легочного сопротивления сосудов в отсутствие значимого влияния на средние показатели артериального давления и общего периферического сопротивления сосудов [Pepe-Zabka J. et al., 1991; Adatia I, Wessel DL.,1994]. По эффективности воздействия на сосуды малого круга иNO не уступает таким внутривенным вазодилататорам, как нитропруссид натрия, простагландины Е1 и I2 [Schmid E. R. et al., 1999]. При этом иNO не вызывает снижения артериального давления и рефлекторного увеличения частоты сердечных сокращений – побочных эффектов, ограничивающих использования внутривенных лёгочных вазодилататоров в эффективных дозировках у больных с сопутствующей сосудистой недостаточностью, гиповолемией и/или сниженным коронарным резервом [Barst R. J. et al., 1996; Cockrill B. A. et al., 2001 ]. б) Влияние на функцию правого желудочка. Уменьшая давление лёгочной артерии и лёгочное сосудистое сопротивление, иNO способствует снижению постнагрузки правого желудочка и улучшению гемодинамических условий его функционирования. У больных с правожелудочковой недостаточностью это проявляется снижением конечно- диастолического и конечно-систолического объёмов правого желудочка, увеличением его фракции изгнания, ударного объема и сердечного [Bhorade S. et al., 1999]. в) Влияние ингаляционного NO на функцию левого желудочка. В нормальных условиях иNO не оказывает существенного влияния на сократительную функцию левого желудочка (ЛЖ) [Hayward B. et al., 1997]. При левожелудочковой недостаточности ингаляция NO сопровождается снижением транспульмонального градиента, увеличением заклинивающего давления лёгочной артерии, конечно-диастолического и конечносистолического объёмов ЛЖ и снижением ударного объёма. [Semigran M. J. et al., 1994]. Основным механизмом отрицательного влияния иNO на насосную функцию ЛЖ большинство исследователей считают вазодилатацию малого круга, сопровождающуюся увеличением притока крови к левым отделам сердца [Loh E. et al., 1994]. При тяжёлой недостаточности объёмная перегрузка ЛЖ увеличивает застой крови в малом круге кровообращения и приводит к развитию отёка лёгких на фоне иNOтерапии [Bocchi E. A., 1994]. В связи с быстрой инактивацией гемоглобином, прямое отрицательное влияние иNO на сократительную способность миокарда, представляется мало вероятной [Cockrill B. A. et al., 2001]. Применение иNO с целью коррекции легочной гипертензии, развившейся на фоне изолированной левожелудочковой недостаточности, противопоказано [Hayward C. et al., 1996]. г) Влияние ингаляционного NO на сосуды большого круга кровообращения. Несмотря на то, что иNO считается наиболее селективным лёгочным вазодилатором, не исключается возможность её транспортировки с 34 кровотоком и последующего действия на сосуды большого круга кровообращения [Stamler J. S. et al., 1997]. Рассматриваются несколько потенциальных механизмов транспорта иNO на системную гемодинамику: обратимое связывание с Hb, циркулирующими лейкоцитами, тромбоцитами и белковыми структурами [Lee J. S. et al., 1996; Fox-Robichaud A. et al., 1998]. Помимо взаимодействия с гемом NO способен вступать в реакцию транснитрозации с сульфгидрильной группой Нb, приводя к образованию Sнитрозогемоглобина. Данная реакция может играть важную роль в связывании и транспортировке NO (в частности, ингаляционной) с кровотоком [Jia L. et al., 1996]. Экспериментальные исследования показали, что артериальная кровь содержит значительно большее количество Sнитрозогемоглобина, чем венозная. Предполагается, что S-нитрозация Hb зависит от степени его насыщения кислородом и особенностей транспорта эритроцитов через малый круг кровообращения [Stampler J. S. et al., 1997]. Исследования показали, что когда восстановленный Hb (дезоксигемоглобин) с высоким сродством к О2 поступает в легочные капилляры, в этот момент тиольные группы Hb имеют значительно более высокое сродство к NO и способны связывать проникающую в просвет сосудов ингаляционную NO, поступающую из просвета альвеол. В дальнейшем в условиях периферического кровообращения происходит не только транспорт О2 от оксигемоглобина в прилегающие ткани с низким pO2, но и одновременное высвобождение NO, которая через локальную вазодилатацию дополнительно усиливает поступление кислорода в ткани с высоким уровнем его потребления. Stamler J. S. et al. (1992) показали, что NO может активно вступать в реакцию нитрирования с тиоловыми группами альбумина с образованием нитрозоальбумина, время полужизни которого составляет приблизительно 40 минут. Авторы считают, что альбумин является основным “резервуаром” NO в крови. д) Влияние ингаляционного NO на оксигенирующую функцию лёгких. иNO обладает уникальным свойством вызывать вазодилатацию только в вентилируемых участках лёгких, способствуя, таким образом, перераспределению лёгочного кровотока в зоны с лучшим вентиляционноперфузионным отношением, снижению внутрилёгочного шунтирования крови (Qs/Qt) и улучшению оксигенирующей функции лёгких [Gerlach H. et al., 1993; Rossaint R. et al., 1993; Putensen C. et al., 1994.]. Этот эффект иNO усиливается при использовании ИВЛ с адекватным уровнем ПДКВ, способствующим раскрытию спавшихся альвеол (alveol recruitment) [Putensen C. et al., 1994]. Однако действие иNO на вентиляционно-перфузионное отношение зависит не только от соотношения ателектазированных (невентилируемых) и неповреждённых участков лёгких, но и от доли слабовентилируемых участков в общем количестве поражённых альвеол. Обладая высокой диффузионной способностью, иNO способен дилатировать сосуды частично вентилируемых альвеол, что может 35 уменьшить её влияние на оксигенирующую функцию лёгких [Hopkins S. R. et al., 1997]. е) Влияние ингаляционного NO на тонус бронхов. Ингибиторы NOсинтазы подавляют бронходилатирующее действие нехолинергических бронходилататоров, что подтверждает участие эндогенной NO в регуляции бронхиального тонуса [Belvisi M. G. et al., 1992;.Belvisi M. G. et al., 1995]. Различные изоформы NO-синтазы обнаружены в неадренергическихнехолинергических нервных окончаниях и в эпителии бронхов человека [Dey R. D. et al., 1993; Watkins DN, Peroni DJ. et al., 1997]. Проходя через просвет дыхательных путей иNO может потенциально воздействовать через цГМФ-систему гладкомышечных клеток на бронхиальный тонус. Бронходилатирующее действие иNO обнаружено у экспериментальных животных [Dupuy P. M. et al., 1992; Hugman M. et al., 1993; Brown R. H. et al., 1994; Lindeman K. S. et al., 1995; Gwyn D. R. et al. 1996; Putensen C. et al., 1995]. Однако у больных бронхиальной астмой и хронических неспецифических забрлеваний легких при ингаляции иNO отмечено лишь незначительно снижение сопротивления дыхательных путей или отсутствие эффекта [Sanna A. et al., 1994; Kacmarek R. M. et al., 1996]. Нельзя исключить, что потенциальное бронходилатирующее действие иNO нивелируется бронхокострикторным эффектом диоксида азота (NO2), образующегося в дыхательных путях при взаимодействии иNO с О2 [Bauer M. A. et al., 1986; Rose R. M. et al., 1988]. ж) Влияние ингаляционного NO на сурфактантную систему лёгких. Экспериментальные исследования показали, что длительная ингаляция высоких концентраций NO (80-200 ppm) при значениях FiO2, близких к 1,0, сопровождается снижением активности сурфактантного протеина А, липидов и сурфактантной системы в целом [Robbins C. G. et al., 1995; Haddad I. Y. et al., 1996]. Возможно, что нарушение сурфактатной системы связано с токсическим действием высоких концентраций О2 и образующегося NO2, способного повреждать альвеолярно-капиллярную мембрану [Ben-Jebria A. et al., 1992; Man S. F. P. et al., 1990]. з) Влияние ингаляционного NO на функцию тромбоцитов. В эксперименте иNO стимулирует образование цГМФ в тромбоцитах, благодаря чему снижает агрегационную способность тромбоцитов и тем самым тормозит свёртываемость крови[Högman M. et al., 1994; Lee J. S. et al., 1996]. Клинические исследования не подтвердили значимого влияния иNO на свертывающую систему крови у человека [Adrie C. et al., 1996]. 4. Методика ингаляционной NO-терапии. Терапия иNO основана на ингаляционной подаче NO в дыхательные пути пациента, обеспечивающей последовательное прохождение лечебного газа по трахеобронхиальному дереву и проникновение через альвеолярнокапиллярную мембрану в гладкомышечные клетки стенки лёгочных сосудов, являющиеся точкой приложения её физиологического действия. иNOтерапия может осуществляться как у больных с самостоятельным дыханием, так и во время искусственной вентиляции лёгких (ИВЛ) [Iotti G. et al., 1995]. 36 В обоих случаях подача иNO происходит из баллона, содержащего сертифицированную смесь NO и молекулярного азота (N2) под давлением 100-200 атмосфер. При самостоятельном дыхании методика подачи иNO аналогична проведению оксигенотерапии. С помощью дозирующего устройства обеспечивается непрерывное поступление иNO в дыхательные пути через лицевую маску. Разработаны передвижные аппараты (баллон+дозирующие утройства) для амбулаторного применения иNOтерапии, аналогичные устройствам для проведения оксигенотерапии в домашних условиях [Koh E. et al., 1998;Perez-Penate G. et al., 2001]. При ИВЛ и её вспомогательных режимах описаны 2 варианта подачи иNO [Gerlach H., Falke K. J., 1995]. В первом случае газ поступает в специальный смеситель, куда также подводят О2 и воздух. Смеситель обеспечивает создание дыхательной смеси с желаемыми значениями FiO2 и концентрации иNO, которая затем поступает в дыхательный контур аппарата ИВЛ. Однако данная методика требует наличия специальных аппаратов ИВЛ. Кроме того, длительный контакт иNO и О2 может приводить к нежелательно избыточному образованию NO2. Большое распространение в настоящее время имеет введение иNO непосредственно в магистраль вдоха аппарата ИВЛ [Miller O. I. et al., 1994; Puybasset L. et al., 1994]. иNO подают через T-образный коннектор на расстоянии 50-80 см от интубационной трубки, что способствует равномерному распределению её молекул в общем объёме дыхательной смеси. Объёмную скорость поступления газа из баллона регулируют ступенчатой системой редукторов и малопоточным ротаметром (0,02-1,5 л/мин). иNO поступает в контур пациента в течение всего дыхательного цикла, либо только во время вдоха. В последнем случае применяют специальное устройство, высвобождающее газ при повышении давления или изменении влажности дыхательной смеси. Для осуществления иNO-терапии необходимо наличие точных малопоточных дозирующих устройств и постоянного мониторного контроля концентраций NO и NO2 в дыхательных путях пациентов. Идеальным вариантом регистрации концентраций иNO и NO2 представляется измерение непосредственно в просвете интубационной трубки, что наиболее точно отражает истинное содержание газов в альвеолах. Вполне адекватную информацию о внутрилёгочных концентрациях NO и NO2 можно получить при сборе проб для газоанализа из участка дыхательного контура между интубационной трубкой и Y-образным коннектором. Именно этот приём используется наиболее часто [Puybasset L. et al., 1994; Miller O. I. et al., 1994; Burke-Martindale C. H.,1998]. Концентрации NO и NO2 определяют хемилюминисцентным и электрохимическим методами[Archer S., 1993]. Гастроэнтерология Хронический воспалительный процесс в эпителиальных тканях желудочно-кишечного тракта является признанным фактором риска 37 злокачественных новообразований. По данным сотрудников клиники Мейо (США), опубликованным Am. J. Physiol.: Gastr. Liver Physiol. (сентябрь, 2001), из многих медиаторов хронического воспаления NO имеет приоритетное значение в канцерогенезе. Активированная NO-синтетаза макрофагов и эпителиальных клеток во время воспалительного процесса генерирует биореактивные молекулы оксида азота. Кроме повреждения ДНК, NO способен прямо взаимодействовать с протеинами, вызывая изменение их свойств с превращением в проканцерогены. Кроме того, функционируя как ангиогенный фактор, NO способствует раковому процессу. Подавление генерации NO в хроническом воспалении и инактивация реактивных азотных участков могут стать полезными в снижении риска развития рака при воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта. Офтальмология В последние годы в офтальмологической литературе все чаще появляются работы по изучению роли NO в функционировании органа зрения. Установлено, что в зависимости от концентрации NO в тканях глаза, он может иметь как положительное, так и отрицательное действие. Положительное действие проявляется при поддерживании NO в нормальных количествах и заключается в вазодилятационном эффекте, улучшении метаболизма в тканях, улучшении оттока внутриглазной жидкости. Отрицательное действие, связанное с увеличением концентрации NO, состоит в активации свободно-радикальных процессов, ослаблении антиоксидантной защиты, образовании токсического соединения пероксинитрита, который вызывает разрушение клеток. Отоларингология Одной из актуальных проблем медицины является поиск способов влияния на воспалительный процесс в организме. Особенно актуально это в оториноларингологии, так как все фазы воспалительного процесса проходят в условиях агрессивной среды: микробное обсеменение, влияние ферментов. Немаловажную роль здесь играет присоединение внутрибольничной инфекции. NO-терапия также применяется при лечении рецидивирующих носовых кровотечений, хронических средних отитов (в том числе после оперативного лечения), при лечении хронических и острых ринитов, гайморитов, в послеоперационном ведении после тонзилэктомий и аденотомий, у больных после восстановительных операций на ухе, после исправления деформаций наружного носа и пр. Послеоперационные осложнения у этих больных могут свести на "нет" результаты лечения. Терапия оксидом азота позволяет избежать этих осложнений. В сравнении с предшествующим опытом можно сделать вывод, что применение NOтерапии дало возможность в значительной степени повысить эффективность лечения больных. 38 Гинекология Ученые обнаружили, что оксид азота значительно замедляет процесс старения яйцеклеток мышей. Это открытие может со временем помочь 30летним и 40-летним женщинам, испытывающим проблемы с зачатием ребенка. Биохимики из Wayne State University School of Medicine (Детройт, США) поставили эксперимент на большом количестве мышиных яйцеклеток через 1-2 и 4-6 часов после овуляции. Яйцеклетки мышей теряют способность к оплодотворению уже через несколько часов после овуляции. Через 6 часов вероятность нормального оплодотворения сильно снижается, чаще происходят хромосомные нарушения у эмбрионов. Чтобы избежать этого, ученые обработали яйцеклетки оксидом азота в разных концентрациях. Молекула оксида азота участвует во множестве физиологических процессов, в том числе, она расширяет артерии и способствует достижению эрекции у мужчин. В "стареющих" яйцеклетках вещество замедляет затвердевание внешней оболочки, снижает активность микротрубочек цитоплазмы, усиливает высвобождение содержимого кортикальных гранул, и замедляет наступление старения яйцеклетки. Вероятно, оксид азота не только увеличивает шансы на зачатие, но и предотвращает хромосомные нарушения, происходящие в раннем эмбриональном периоде. Подобные нарушения приводят к синдрому Дауна, выкидышам и другим проблемам, связанным с поздней беременностью. «Яйцеклетки взрослых женщин быстрее теряют способность к оплодотворению, чем яйцеклетки молодых. С помощью оксида азота можно растянуть этот период, что крайне важно при оплодотворении в пробирке», - говорит Husam Abu-Soud, соавтор исследования. Пока не совсем понятно, как именно работает оксид азота в данном случае. Предполагают, что он улучшает высвобождение кальция в яйцеклетке. Именно с нарушением высвобождения кальция связывают старение яйцеклеток у млекопитающих. Липидный обмен Увеличение количества оксида азота уменьшает вредное влияние холестерина. Нехватка NO вызывает неспособность кровеносных сосудов к расширению в напряженных ситуациях. Такое же явление наблюдается у людей, у кого заметно превышен уровень холестерина. Центральная нервная система Увеличение количества оксида азота в клетках приводит к продлению жизни клетки. Это можно использовать при неодегенеративных болезнях, когда клетки преждевременно умирают. Такими болезнями являются болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. 39 Онкология Антиоксиданты защищают клетки. Если пропадает защита антиоксидантов, то жизнь клетки зависит от NO. Если NO покидает клетку, то клетка умирает. Уход NO из клеток приветствуется патогенными и опухолевыми клетками. Если из опухолевых клеток уходит много NO, то макрофаги уничтожают опухолевые клетки. Оксид азота может препятствовать неоплазии и раку желудка. (Chinthalapally V. Rao, 2004). Костно-суставной аппарат Деятельность клеток костной ткани – остеобластов – стимулирует оксид азота и тем самым создает новую костную ткань. С другой стороны NO препятствует активности остеокластов, которые разрушают костную ткань. NO заботится об обмене веществ кости так, чтоб создание кости было быстрее ее разрушения. Таким образом, достаточное наличие оксида азота ведет к быстрому выздоровлению. Геронтология NO и ни одно другое вещество не могут остановить старение. Оксид азота может эффективно препятствовать тромбозу кровеносных сосудов. Кроме этого NO ускоряет заживление ран и восстановление после хирургических операций. Было получено убедительное доказательство того, что NO защищает печень и эффективно укрепляет иммунную систему. Все это указывает на то, что NO влияет на продление жизни. Необходимость в оксиде азота растет с возрастом, т.к. естественное производство NO в организме уменьшается. Метаболический синдром Исследователь диабета Gerald Raven в 1988 году дал общее название факторам риска инфаркта. Он пробовал показать, что особенно у мужчин присутствующая «мясистость» в области живота, низкий HDL-холестерин, повышение уровня инсулина в крови и повышенное давление связаны с одним и тем же основным заболеванием. Позже это стали называть метаболическим синдромом. По Reaven главным фактором инфаркта является резистентность к инсулину. Многие исследования указывают на то, что нехватка оксида азота служит причиной таких заболеваний, как резистентность к инсулину, сахарная диабет у взрослых, проблемы с артериальным давлением и синдром хронической усталости. Инфекционные заболевания Оксид азота уменьшает или препятствует размножению вируса HIV (Torre D, Pugliese A, Speranza F., 2003). 40 Литература. 1. Скальный А.В. Химические элементы в физиологии и экологии человека. М., ОНИКС 21век, Мир. 2004.215 с. 2. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах. // Соровский образовательный журнал, 2000. – т.6. -№12. – С.13-19. 3. Сосунов А.А. Оксид азота как межклеточный посредник. // Соровский образовательный журнал, 2000. – т.6. -№12. – С.27-34. 4. От нейрона к мозгу. /Дж.Г. Николс, А.Р. Мартин, Б.Дж. Валлас, П.А. Фукс. – пер. с англ. – М., УРСС, 2003.671с. 5. Петренко Ю.М., Шашаурин Д.А., Титов В.Ю. Новые источники окиси азота, их возможная физиологическая роль и значение. // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2001.- №2. – С.72-79. 6. Бельский Ю.П., Данилец М.Г., Бельская Н.В. и др. Роль оксида азота в иммуносупрессорной и противоопухолевой активностях клеток эмбриональной печени.// Бюллетень СО РАМН, №2 (116), 2005г, С.75-78. 41
