Под редакцией Д.Ю. Кустова, А.В. Мельник ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА Учебное пособие Донецк 2022 МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ДОНЕЦКОЙ НАРОДНОЙ РЕСПУБЛИКИ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ДОНЕЦКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. ГОРЬКОГО» Под редакцией Кустова Д.Ю., Мельник А.В. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА Учебное пособие Рекомендовано Ученым советом ГОО ВПО ДОННМУ ИМ.М.ГОРЬКОГО Донецк 2022 УДК 616-074/-078(075.8) ББК 53.45я7 Л12 Авторы: Кустов Д.Ю., Мельник А.В., Зоркова Е.В., Валигун Я.С., Куляс В.М., Лисанова С.В., Мельник В.А., Панфилова В.В., Смирнова Т.Я., Федорова А.В., Шрамко И.А. Рецензенты: Долженко С.А. – канд. мед. наук, руководитель УМО, доцент кафедры оториноларингологии Христуленко А.Л. – канд. мед. наук, методист УМО, доцент кафедры терапии ФИПО им. А.И. Дядыка Рекомендовано Ученым советом ГОО ВПО ДОННМУ ИМ.М.ГОРЬКОГО (протокол № _____от ___________) Л49 Лабораторная диагностика : учебное пособие / Д.Ю. Кустов, А.В. Мельник, Е.В. Зоркова [и др.] / (под редакцией Д.Ю. Кустова, А.В. Мельник. – Донецк: ФЛП Кириенко, 2022. – 152 с. – Текст : непосредственный. Учебное пособие написано в соответствии с программой учебной дисциплины «Лабораторная диагностика» для студентов, обучающихся по специальности Лечебное дело. В пособие включены главы по подготовке пациентов к лабораторным исследованиям и забору проб различного биологического материала; общеклиническим, гематологическим и биохимическим исследованиям; оценке показателей системы гемостаза. Пособие знакомит студентов с иммунодиагностическими методами определения биологических активных веществ, в том числе гормонов различных эндокринных желез. Большое внимание уделено использованию полимеразной цепной реакции для диагностики инфекций. Данное пособие рекомендовано также для самостоятельной работы студентов, обучающихся по направлениям подготовки «Медико-профилактическое дело» и «Фармация». УДК 616-074/-078(075.8) ББК 53.45я7 ©Коллектив авторов, 2022 ©ГОО ВПО ДОННМУ ИМ. М. ГОРЬКОГО, 2022 СОДЕРЖАНИЕ Введение………………………………………………………………………… Глава 1. Современные аспекты взаимодействия клиники и лаборатории, клинико-лабораторные методы диагностики инфекционного процесса в организме ……………………………………………………………….………. Задания для самоконтроля …………………………………….………….... Глава 2. Клинико-лабораторные методы оценки состояния системы гемостаза в организме и лабораторная гематология………………………..... Задания для самоконтроля…..………………………………….…………... Глава 3. Клинико-лабораторные методы оценки метаболических процессов в организме и активности эндокринных желез…………..…….… Задания для самоконтроля …………………………………….…………... Заключение ……………………………………………………………………... Библиографический список …………………………………………………… Список сокращений ……………………………………………………………. Эталоны ответов ……………………………………………………………….. 4 5 37 44 77 82 141 146 147 149 152 ВВЕДЕНИЕ Согласно требованиям современности, врачами клинической лабораторной диагностики могут работать выпускники медицинских университетов, обучающихся по специальности Лечебное дело. Отсутствие учебного пособия для студентов по этой специальности создает определенные трудности обучения. В последнее время значительно увеличились объем и информативность объективных сведений о состоянии организма обследуемого пациента, которые лабораторная медицина может предоставить лечащему врачу. В пособии представлены сведения о некоторых основных современных направлениях и методах лабораторной диагностики. Наибольшее внимание уделено особенностям диагностики распространенных нозологий, диагностическим алгоритмам, построенным на рациональном и эффективном использовании тестов клинической лабораторной диагностики. Пособие соответствует рабочей программе по дисциплине «Лабораторная диагностика» по специальности Лечебное дело, иллюстрировано рисунками, таблицами и схемами, что позволяет лучше усвоить предлагаемый материал. Настоящее учебное пособие будет полезно также при подготовке студентов других специальностей, расширит их знания о диагностических возможностях современной лабораторной службы, диагностической значимости лабораторных технологий и лабораторных показателей. 4 ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ КЛИНИКИ И ЛАБОРАТОРИИ И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА В ОРГАНИЗМЕ Взаимодействие врача-клинициста и диагностической лаборатории при постановке диагноза в современном лечебном учреждении базируется на том, что клиницист определяет круг необходимых ему анализов, исходя из своего диагностического предположения и организует получение соответствующих биоматериалов пациента, а врач клинико-диагностической лаборатории (КДЛ) предоставляет достоверную информацию о клеточном, биохимическом, молекулярном составе проб биологических материалов, полученных у больного, о соответствии показателей этого состава общепринятой «норме» и/или сопоставление их с раннее определявшимися у того же человека аналогичными показателями. Клинические лабораторные исследования – это изучение состава образцов биоматериалов пациентов с целью обнаружения эндогенных или экзогенных компонентов, которые отражают состояния и деятельность органов, тканей, систем организма. Клинические лабораторные исследования являются одним из главных направлений современной параклинической диагностики и выполняются по назначению врача с использованием специальных методов. Единый процесс проведения лабораторных исследований общепринято делить на три этапа: преаналитический, аналитический (лабораторный анализ биоматериала) и постаналитический (интерпретация полученного результата). Правильность выполненного лабораторного анализа во многом зависит от преаналитического этапа. Преаналитический этап лабораторного исследования – комплекс мероприятий, выполняемых от момента назначения врачом пациенту определенного анализа до момента его проведения в лаборатории. Основные составляющие преаналитического этапа I. Преаналитическая фаза вне лаборатории: • составление заявки на лабораторное исследование и оформление бланка направления; • подготовка пациента, основанная на знании биологических ритмов, особенностей проведения исследований и клинической интерференции (влияния лекарственных препаратов на результаты лабораторных исследований); • процедура взятия биологического материала для исследования; • хранение биоматериала в процедурном кабинете или в отделении и его доставка в лабораторию. 5 Это важнейшая часть преаналитического этапа. Она полностью находится в компетенции врача-клинициста, но в еще большей степени в компетенции медицинской сестры. II. Преаналитическая фаза в лаборатории: • регистрация и маркировка доставленного в лабораторию биоматериала; • пробоподготовка биоматериала к исследованиям (центрифугирование, термостатирование, аликвотирование, маркировка, доставка биоматериала на рабочие места). Составление заявки на лабораторное исследование и оформление бланка направления Каждая лаборатория должна разработать свою форму заявки на лабораторные исследования с учетом своих требований и возможностей. Не допускается указывать в бланке «биохимия крови». Обязательно проводить устное инструктирование пациента или выдачу ему памятки об особенностях назначенного исследования и правилах сбора биоматериала (моча, кал и т.д.), учет факторов (лекарственная терапия, пункции, массаж, цистоскопия, введения контрастных веществ и др.), влияющих на исследование. Процедура взятия биологического материала для исследования К первичным пробам биоматериала относят: кровь (капиллярная, венозная, артериальная), мочу, кал, ликвор, мокроту, слюну, желчь, желудочное содержимое, выделения половых органов, выпотные жидкости, содержимое полостей, мазки-отпечатки, биопсийный материал. К аналитическим пробам относят: сыворотку, плазму, осадок мочи, выделенные ДНК, окрашенные мазки крови, нативные или окрашенные мазкиотпечатки. Кровь. Основным видом биологического материала, который подвергают анализу в лаборатории, является кровь. Кровь состоит из клеток (эритроциты, лейкоциты и тромбоциты) и жидкой части, которая представляет собой раствор многих неорганических и органических веществ. Обученный медицинский персонал осуществляет забор крови в комнате взятия биоматериала, находящейся вне лаборатории или в процедурном кабинете стационара, поликлиники. Продолжительность пережатия сосудов при наложении жгута (если это необходимо) должна быть минимальной и не превышать 1–2 мин. Пациенту не следует сжимать и разжимать пальцы рук, поскольку это вызывает местный стаз и гипоксию и, как следствие, сдвиги в распределении биохимических показателей. Для различных видов исследования кровь необходимо собирать в пробирки разной маркировки. Наиболее часто используют моноветты или вакутейнеры. Моноветт – вакуумный шприц-контейнер со специальными иглами предназначен для взятия венозной крови как шприцевым способом, так и вакуумным. Вакутейнер – одноразовое приспособление, предназначенное для взятия проб венозной крови, представляющее собой комплекс из стерильной 6 одноразовой иглы и пробирки (непосредственно вакутейнера). Пробирки изготавливаются из пластика (полиэтилентерефталат), силиконизированы и содержат внутри дозированный вакуум и различные реагенты для забираемой крови в зависимости от вида исследования. Вакутейнеры различаются по ряду признаков: • назначению (биохимическое исследование крови, гематологическое исследование, коагулограмма и т.д.); • объему пробирки (наиболее распространенные объемы – 2,7; 4; 4,5 и 8 мл); • цвету колпачка (определяется наполнитель-реагент, который содержится в вакутейнере, и наличие геля). Верхний колпачок вакуумной пробирки закодирован цветом, который говорит о том, какой специфический наполнитель имеется в вакутейнере. В случае, когда у одного пациента кровь берется в несколько пробирок, необходимо соблюдать правильную последовательность их заполнения для предотвращения возможной перекрестной контаминации пробы реагентами из других пробирок. Если в вакуумную пробирку (вакутейнер) с пробой крови добавлены антикоагулянты, кровь остается жидкой (не сворачивается), и получаемая после центрифугирования жидкая часть называется плазмой. Антикоагулянты – это добавки, которые тормозят процесс свертывания крови, что обеспечивает отсутствие существенных изменений исследуемых компонентов перед аналитическим процессом. Свертывание крови предотвращается путем связывания ионов кальция (этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), цитрат натрия) или торможением активности тромбина (гепарин, гирудин). Твердые или жидкие антикоагулянты, находящиеся в вакуумных пробирках должны быть смешаны с кровью немедленно после взятия проб крови. Маркировка вакутейнеров для взятия крови (по цвету колпачка) 1. Красный. Так маркируют пробирку с активатором свертывания крови. Из этой пробирки получают аналитическую пробу – сыворотку крови. Сыворотка – это жидкая часть крови, лишенная фибриногена. Активатор сокращает время свертывания, не влияя на результаты исследования. 2. Желтый. Пробирки с желтой крышкой имеют активатор свертывания и разделительный гель, находящийся на дне. При обработке в центрифуге формируется барьер, разделяющий сыворотку и форменные элементы. 3. Голубой. Данный вид пробирки предназначен для анализа коагуляции. В емкости содержится раствор цитрата натрия. 4. Черный. Пробирки содержат буферный раствор цитрата натрия. Изделия предназначены для исследования скорости оседания эритроцитов. 5. Розовый. Изделия разработаны для определения группы крови и проведения перекрестной пробы для переливания. Продукцию выпускают с наполнителем или без. 7 6. Зеленый. Данный вид пробирки предназначен для иммунологических исследований. В емкости содержится раствор гепарина. 7. Серый. Пробирки используют для определения содержания глюкозы. В пробирке содержатся флуорид натрия и оксалат калия. Образцы сохраняются длительное время, благодаря антикоагулянту и стабилизатору глюкозы. Изначальное состояние биоматериала не изменяется. 8. Фиолетовый. Изделия используют для проведения гематологических исследований. ЭДТА калия блокирует свертывание и связывание ионов кальция. В результате концентрация клеточных и внеклеточных компонентов крови сохраняется. Категорически запрещается забирать кровь шприцом и переливать в вакуумную систему для взятия крови в связи с опасностью возникновения гемолиза и активации факторов свертывания крови. Вечером, накануне сдачи крови на анализ, нежелательно употреблять тяжелую, жареную и жирную пищу. Кровь сдают натощак. Между ужином и забором крови должно пройти не менее 8, но и не более 14 часов. Не рекомендуется сдавать анализ крови, если принимаются лекарственные препараты, так как это может исказить результаты тестов. По возможности, рекомендуется отказаться от приема препаратов на некоторое время, достаточное для того, чтобы организм очистился (10–14 дней). Если необходимо сдать кровь для оценки эффективности пройденного лечения, то это нужно делать не ранее чем через 7–14 дней после последнего приема лекарственного препарата. При подготовке к сдаче анализа крови категорически запрещено употреблять алкоголь, курить в течение часа до забора крови, потому что курение воздействует на секрецию биологически активных веществ. Подготовка к анализу крови предполагает воздержание от сильных эмоциональных и физических нагрузок, чтобы избежать биохимических и гормональных перестроек и, как следствие, искажения результата анализа. Нельзя сдавать кровь после инструментального обследования, физиотерапевтических или других медицинских процедур, т.к. они могут вызвать изменение некоторых лабораторных параметров. Перед взятием крови рекомендуется успокоиться и отдохнуть, например, посидеть в коридоре лаборатории 10–15 минут. Кровь для общего анализа берут в пробирку с К 2 или К3 ЭДТА (фиолетовый колпачок) и заполняют точно до указанного объема. После взятия крови пробирку аккуратно переворачивают в горизонтальную плоскость и перемешивают 8–10 раз. Недостаточное перемешивание также может привести к агрегации тромбоцитов, образованию микросгустков или коагуляции. Венозная кровь является лучшим биологическим материалом для лабораторных исследований, так как стандартизация процессов взятия, хранения, транспортировки крови позволяет добиться минимальной травматизации клеток, примеси других веществ. Стандартизация взятия капиллярной крови затруднительна. 8 Кровь из пальца (капиллярную) рекомендуется брать в случаях: • ожогов, занимающих большую площадь поверхности тела пациента; • наличия у пациента очень мелких вен, или, когда вены труднодоступны; • выраженного ожирения пациента; • установленной склонности к венозному тромбозу; • у новорожденных. Пункция артерии для взятия крови на лабораторные исследования используется редко, в основном для исследования газов крови. Моча. В зависимости от предполагаемого анализа в лабораторию должны быть доставлены разные порции мочи. Перед сбором мочи пациент должен провести туалет наружных половых органов. Не употреблять красящие пищевые продукты (свекла, морковь). Не собирать мочу во время менструации. Для общего анализа мочи собирают всю мочу после ночного сна. Из катетера можно собирать только свежую мочу. Из длительно стоящего катетера мочу для исследования собирать НЕЛЬЗЯ. После изъятия катетера не рекомендуется собирать мочу в течение 10–14 дней. Исследование суточной мочи Для этого анализа необходимо исследовать небольшую порцию (100–150 мл) (часть суточной мочи), но обязательно необходимо знать весь объем мочи пациента за одни сутки. Для исследования пациент должен собрать всю мочу в течение одних суток (24 часов), находясь на обычном для него питьевом режиме (до 1,5–2 л жидкости в сутки). Утром пациент освобождает мочевой пузырь, затем в течение суток, включая утреннюю порцию следующего дня, собирает всю мочу в чистую широкогорлую емкость с плотно закрывающейся крышкой. Эта емкость должна иметь объем не менее 2 л и храниться во время сбора в прохладном, темном месте. После истечения одних суток пациент измеряет все количество суточной мочи и записывает результат. Из общего объема нужно отлить 100–150 мл и доставить в лабораторию. При регистрации анализа в лаборатории обязательно нужно называть полный объем суточной мочи. Анализ мочи по методу Нечипоренко Для этого анализа в лабораторию доставляют среднюю порцию утреннего мочеиспускания. Поэтому весь объем утренней мочи условно делят на 3 части, средняя часть из которых, подлежит анализу. Обратите внимание! Если утром собирают мочу для анализа по Нечипоренко, то сбор мочи на общеклинический анализ проводят в другой день! Анализ мочи по методу Зимницкого Для этого анализа собирают 8 порций мочи в течение одних суток. Исследование проводят при обычном питьевом режиме и питании больного, но количество употребляемой жидкости в сутки не должно превышать 1,0–1,5 литра. 9 Вначале для исследования готовят 8 чистых прозрачных емкостей. На каждом сосуде отмечают номер порции и время ее сбора (9 00, 1200, 1500 и т.д.). В 6 часов утра пациент опорожняет мочевой пузырь, и эта порция не учитывается. Начиная с 9 часов утра, точно каждые 3 часа, собирают порцию мочи в отдельную маркированную емкость (до 6 часов утра следующего дня получится 8 порций). Для этого исследования все порции доставляют в лабораторию, где измеряют количество и относительную плотность каждой порции. Кал. Материал для исследования должен быть собран в чистый, сухой контейнер. Следует избегать примеси к калу мочи, выделений из половых органов. Следует соблюдать диету, предписанную лечащим врачом, воздержаться от приема лекарственных препаратов, влияющих на секреторные процессы в желудке, на перистальтику желудка и кишечника, а также меняющих его цвет (препараты железа, активированный уголь и т.д.). Перед исследованием кала на скрытую кровь, должны быть отменены лекарственные вещества, содержащие металлы (бромиды, иодиды, медь, аскорбиновая кислота, ацетилсалициловая кислота, нестероидные противовоспалительные препараты). Исследование кала проводят не ранее, чем через 2 дня после рентгенологического исследования желудка и кишечника. Для исследования на простейшие (вегетативные формы) кал должен быть свежевыделенным. Проводят данное исследование в течение 15–20 минут после дефекации. Ликвор. Ликвор собирают как минимум в 2 стерильные пробирки: 1-я – для общеклинического и биохимического анализа, 2-я – для бактериоскопического (фибриновая пленка) исследования. Мокрота. Материал получают с помощью отхаркивания в специальном помещении. Перед тем, как выделить мокроту, необходимо прополоскать рот и глотку кипяченой водой. Ограничений в диете и приеме лекарственных препаратов нет. Если мокрота выделяется плохо, следует дать отхаркивающее средство накануне сбора и утром, можно применить аэрозольную ингаляцию. Выделения женских половых органов. Взятие выделений женских половых органов проводит врач-гинеколог. В течение 24 часов перед исследованием исключаются спринцевания и применение внутривагинальных терапевтических средств, половой контакт. Материал равномерно наносят на предметное стекло, мазки высушивают на воздухе и направляют в лабораторию с сопроводительным бланком. При получении материала необходимо помнить, что нельзя брать его: • ватным тампоном; • во время менструации. Выделения мужских половых органов. Материал для исследования секрета предстательной железы получают после массажа предстательной 10 железы, проводимого врачом в течение 3–4 минут. Секрет собирают в чистую сухую пробирку. Перед сдачей эякулята необходимо половое воздержание в течение 3–5 суток. Биологический материал получают методом мастурбации, нельзя использовать эякулят из презерватива. Эякулят собирают в чистый контейнер и сразу же доставляют в лабораторию. Молекулярно-биологические исследования. Соскобы клеток берут в пробирки с физиологическим раствором или в специально-предназначенные пробирки с транспортной средой (фабричные пробирки, содержащие консервант «ДНК-экспресс»). При взятии образцов используют специальный одноразовый пластиковый зонд типа Сervex-brush (Voba-brush), имеющий вид ёршика и обеспечивающий получение большого количества клеточного материала с исследуемого участка. Исследования на выявление возбудителей бактериальных инфекций необходимо проводить не менее чем через 2 недели после последнего приема антибиотиков и/или антибактериальных препаратов. Мочу (первые 20–40 мл) собирают после туалета наружных половых органов утром или после последнего мочеиспускания через 3–4 часа. При сдаче биоматериала из урогенитального тракта рекомендуется воздержаться от мочеиспускания и половых контактов в течение 2 часов перед взятием пробы. У женщин материал берут перед менструацией или через 1–2 дня после ее окончания. За 3 часа до сбора слюны запрещается чистить зубы, полоскать рот, употреблять пищу, жевать жвачку. Мокроту собирают утром натощак до выполнения гигиенических процедур при глубоком откашливании в количестве не менее 0,5 мл в стерильный одноразовый контейнер. Содержимое везикул, пустул, язв собирают стерильным зондом и переносят в пробирку с транспортной средой. Мазки с задней стенки глотки берут сухими стерильными ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, нёбных дужек и задней стенки ротоглотки, не касаясь языка и нёба. Соскоб с конъюнктивы глаза берут, вывернув нижнее веко, зондом собирают эпителиальные клетки с конъюнктивы. Собранный материал переносят в пробирку с транспортной средой. Взятие крови проводят из локтевой вены в вакуумную систему с антикоагулянтом ЭДТА в соответствии с инструкцией производителя вакуумных систем. Взятый биологический материал сразу же доставляют в лабораторию. Биохимический анализ крови сдают строго натощак. Определение биохимических показателей проводят в сыворотке крови. Для этого в пробирку с активатором сыворотки (красный колпачок) или без наполнителя (коричневый колпачок) набирают кровь пациента, которую затем центрифугируют либо оставляют для отстаивания. Отбирают прозрачную часть 11 крови, оставляя в пробирке образовавшийся сгусток. Подготовка к биохимическому анализу крови предполагает более жесткие ограничения в рационе питания и режиме дня. Мочевина. За 1–2 дня до забора крови необходимо отказаться от употребления богатой белком пищи. Запрещены физические нагрузки накануне. Липопротеины, холестерин. Сдавать кровь на эти показатели надо через 12–14 часов после последнего приема пищи. Если нет необходимости определить гиполипидемический эффект терапии лекарственными препаратами, то за две недели до анализа крови надо отменить препараты, понижающие уровень липидов. Глюкоза. Перед забором крови запрещено не только принимать пищу и пить напитки, но даже жевать резинку и чистить зубы. Коагулограмма. Определение показателей свертывающей системы крови проводят в плазме крови. Кровь забирают в пробирку, содержащую 3,2% или 3,8% раствор цитрата натрия (голубой колпачок), соотношение объемов крови и цитрата натрия – 9:1. Первые капли крови выпускают на ватный тампон, так как они могут содержать тканевой тромбопластин. Сразу после взятия образца пробирку с цитратом необходимо аккуратно перемешать не менее 5 раз для предотвращения образования микросгустков. В результате центрифугирования получают прозрачную часть крови (плазму) и осевшие форменные элементы крови. Гормоны. Определение гормонов проводят в сыворотке крови. Для этого используют пробирки: с активатором сыворотки (красный колпачок) и с гелем (желтый колпачок). После взятия пробы крови в вакуумные пробирки с гелем, ее следует перемешать путем переворачивания 5–6 раз. Гель твердеет, и образуется барьер между форменными элементами крови и сывороткой. Устойчивый барьер образуется через 5 минут после окончания центрифугирования пробы. Отбирают прозрачную часть крови, оставляя в пробирке образовавшийся сгусток. При исследовании на адренокортикотропный гормон (АКТГ), ренин/ангиотензин взятие крови рекомендуется производить с 7 до 9 утра. Референсные значения данных гормонов рассчитаны именно на это время. До забора крови больной должен находиться в покое (сидя или лежа) не менее 1 часа. При исследовании на кортизол и альдостерон взятие крови необходимо провести до 10 утра. Важно помнить, что секреция гонадотропинов осуществляется в импульсном режиме с частотой импульсов – 1 раз в 60–80 минут. Поэтому при однократном взятии крови всегда есть шанс попасть на минимум или максимум пика. Избежать данной ошибки преаналитического режима можно путем получения 2–3 образцов крови в течение часа, объединения сывороток и определения гормонов в едином образце. 12 За 24 часа до сдачи крови необходимо исключить алкоголь, курение, тепловые процедуры (баня, сауна), физические тренировки, введение радиоактивных и рентгенконтрастных веществ, половые контакты (в любом их проявлении). Женщины должны обязательно указать текущий день менструального цикла или срок беременности. Не менее чем за 2 недели до начала исследования необходимо отменить прием оральных контрацептивов и препаратов, влияющих на концентрацию половых гормонов – циметидина, фенотиазинов, резерпина, алкалоидов спорыньи, диуретиков (особенно стероидных – верошпирона). Фолликулостимулирующий (ФСГ) и лютеинизирующий (ЛГ) гормоны, эстрадиол должны исследоваться на 5–7-е сутки менструального цикла (МЦ). Эстрадиол должен исследоваться в предовуляторные дни (11–13-е сутки МЦ). ФСГ, ЛГ и прогестерон должны исследоваться на 7-е сутки после предполагаемой овуляции – на 20–22-е сутки МЦ. Если исследование проводят в период медикаментозного лечения, необходимо указать в направлении название лекарственного препарата и время последнего приема. При исследовании функции щитовидной железы (ЩЖ) в период лечения препаратами, содержащими ее гормоны, исследование проводится через 24 часа после последнего приема препарата. За 2–3 дня до взятия крови необходимо исключить прием медикаментозных и пищевых препаратов, содержащих йод. Онкомаркеры. Определение онкомаркеров проводят в сыворотке крови. Для этого используют пробирки: с активатором сыворотки (красный колпачок) и с гелем (желтый колпачок). При исследовании простатспецифического антигена (ПСА) за неделю до анализа необходимо исключить любые манипуляции с предстательной железой. Раковые антигены (СА-15-3, СА-125). Данные онкомаркеры могут повышаться при наличии у пациента сопутствующих заболеваний общей патологии (хронические гепатиты, циррозы печени, доброкачественные фибромиомы, банальные гинекологические инфекции). Раково-эмбриональный антиген (РЭА). Необходимо указать является ли пациент курильщиком, т.к. от этого зависит верхняя граница допустимого значения в норме. Раковый антиген 19-9 (СА-19-9). Принято определять в сочетании с РЭА. Использование комбинации этих двух маркеров позволяет повысить степень выявления рака желудка до 70%, а рака кишечника – до 75%. Аутоиммунные антитела, инфекционные антитела. Определение антител проводят в сыворотке крови. Для этого используют пробирки: с активатором сыворотки (красный колпачок) и с гелем (желтый колпачок). 13 Хранение и транспортировка биоматериала Максимально допустимое время хранения проб – период времени, в течение которого обеспечивается требуемая стабильность 95% проб биологического материала. Это минимальное требование, так как при наличии у пациента патологии стабильность аналитов в пробе может быть значительно снижена. Делают различие между хранением первичной пробы (кровь, моча, спинномозговая жидкость) и хранением аналитической пробы (плазма, сыворотка, осадок и т.д.). Хранение первичной пробы может быть только при комнатной температуре (от 20°С до 25°С), и она должна пройти пробоподготовку от 30 мин до 2 часов с момента получения. Хранение аналитической пробы при комнатной температуре (от 20°С до 25°С) допускается до 7–8 часов; при температуре холодильника (от 4°С до 8°С) – до 4 суток; при глубоком замораживании (-20°С) – до 6 месяцев. Если биоматериал нужно транспортировать, то общим правилом должна быть доставка материала в лабораторию как можно быстрее. Для транспортировки биоматериала необходимо использовать специально предназначенные и промаркированные для этого термоконтейнеры отдельно для проб крови, мочи и другого биоматериала, а также бактериологических исследований. Термоконтейнеры должны обеспечивать соответствующие температурные режимы в зависимости от вида лабораторных исследований. Если для транспортировки в термоконтейнере необходимо поддерживать температуру 2–8ºС, то в них должны быть вложены хладагенты в нужном количестве. Для поддержания температуры при транспортировке в диапазоне 37ºС, термоконтейнеры необходимо оборудовать термоэлементами. Перечень процедур по подготовке проб крови к транспортировке зависит от вида лабораторных исследований, используемых вакуумных пробирок, времени и условий транспортировки. Например, проба крови, взятая для исследования на АКТГ, ангиотензин I, II, ренин, альдостерон, гомоцистеин, кальцитонин, остеокальцин должна быть сразу после взятия помещена в лед и как можно скорее доставлена в лабораторию для центрифугирования. Регистрация и маркировка биоматериала Курьер (медицинская сестра или санитарка) доставляет контейнер с образцами биоматериала в комнату приема и взятия биоматериала и передает регистратору (фельдшеру-лаборанту). В комнате приема фельдшер-лаборант открывает крышку контейнера и извлекает оттуда биоматериал и папку с направлениями на исследования. Согласно направлениям, делает запись в регистрационный журнал, сортирует и проверяет биоматериал на критерии для отказа в принятии лабораторией на исследования. 14 Критерии для отказа в принятии лабораторией биоматериала на исследования 1. Отсутствие маркировки на пробирке (фамилия, инициалы, отделение, номер палаты, дата взятия крови). 2. Несоответствие маркировки бланка – направления и используемой пробирки. 3. Неправильно заполненный бланк – направление (отсутствие сведений в некоторых графах). 4. Несвоевременная доставка материала для плановых исследований в лабораторию. 5. Несоблюдение сроков и условий хранения материала до момента доставки в лабораторию (замораживание, перегрев, утрата части материала при опрокидывании и т.д.). 6. Взятый биоматериал находится в несоответствующей пробирке, т.е. материал взят не с тем антикоагулянтом, консервантом и т.д. 7. Наличие сгустков в пробирках с антикоагулянтом. 8. Стекла предметные для цитологических исследований не имеют идеально ровную поверхность, высокую прозрачность, толщину до 1 мм. Сотрудник лаборатории заносит информацию о причине отказа в выполнении исследования в журнал «Преаналитических ошибок», информирует об этом лечащего врача по телефону и фиксирует это в бланкенаправлении. Затем ставит штативы с пробирками (емкостями) для общеклинических, биохимических, иммунологических, коагулологических исследований в контейнеры с маркировкой «для переноса биоматериала» и относит их на обработку. Обработка биоматериала Приготовление проб из первичного образца включает все действия, требующиеся для того, чтобы сделать образец пригодным для анализа. Например, приготовление плазмы или сыворотки, включает: ­ центрифугирование; ­ отбор аликвот; ­ пипетирование; ­ разведение; ­ сортировку проб по сериям для автоматического анализа. Перед проведением центрифугирования проверяют, все ли вакуумные пробирки, стаканы для них, вкладыши одинаковы по весу, форме и величине. Это делается для того, чтобы «плечи» ротора центрифуги были уравновешены. При выборе оптимальных условий центрифугирования необходимо ориентироваться на центробежную силу (g), а не на скорость вращения ротора (обороты в минуту). К паспорту центрифуги должна быть приложена таблица, указывающая связь между числом оборотов и величиной центробежной силы. 15 Факторы преаналитического этапа, влияющие на результат анализа Существует множество факторов, влияющих на результат исследования. Прием пищи повышает содержание в крови глюкозы, холестерина, триглицеридов, свободных жирных кислот, аминокислот, неорганических фосфатов, калия, железа, т.е. веществ, содержащихся в пищевых продуктах, а также тех регуляторных соединений, которые вырабатываются в организме в ответ на включение пищевых компонентов в метаболизм метаболитов (инсулин, мочевая кислота) (рис. 1). Рис. 1. Факторы преаналитического этапа, влияющие на результат анализа (Натрус Л.В. и др., 2012) Характер изменений зависит от диеты (углеводная, жировая, белковая, бессолевая и т.д.). Так, богатая белком пища повышает содержание азота мочевины, фосфора, уратов примерно на 12 ч, а холестерина, гормона роста, инсулина, глюкагона – на 1–2 ч. Углеводная диета обладает менее выраженным влиянием на эти компоненты, за исключением инсулина. У здоровых мужчин (22–30 лет), выкуривающих более 25 сигарет в день, повышается концентрация холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), содержание α2-макроглобулина. Снижается содержание липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) и значительно снижается активность слюнного изофермента α-амилазы. После употребления алкоголя в крови повышается активность ферментов печеночного происхождения. У больных хроническим алкоголизмом содержание в сыворотке крови общих липидов, ТГ, ХС, свободных жирных кислот выше, а фосфолипидов и эфиров ХС ниже, чем у лиц, не употребляющих алкоголь. 16 Важно помнить, что от корректно идентифицированных и стандартизированных образцов биоматериала зависят правильность выполнения лабораторных исследований и клинические решения врачей. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ Молекулярно-биологические методы диагностики инфекционных заболеваний относятся к прямым методам лабораторной диагностики. Основную группу этих методов составляют методы генетического анализа, к которым принадлежит ПЦР. Этапы метода ПЦР: • подготовка пациента и получение биологического материала; • выделение нуклеиновых кислот (НК) возбудителя; • амплификация; • детекция (учет результатов). Существует две основных группы методов выделения НК в зависимости от поставленных целей исследования методы: сорбционной экстракции и термической обработки. В основе методов сорбционной экстракции лежит лизис и денатурация компонентов биологического материала с помощью хаотропных агентов – высококонцентрированных растворов некоторых солей (например, гуанидин хлорида или гуанидин изоционата) с одновременной избирательной сорбцией НК на твердой фазе (частицах силикагеля, нейлоновых или нитроцеллюлозных мембранах). С помощью спиртовых отмывок ингибиторы удаляют, а НК впоследствии снимают с твердофазных носителей путем растворения их в воде или низкосолевом буфере. Данные методы очистки высокоэффективны, как в отношении дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), так и рибонуклеиновой кислоты (РНК). За счет высокой воспроизводимости результатов экстракции возможна количественная оценка содержания НК возбудителей в биологическом материале. При использовании методов термической обработки биоматериала проводят нагревание и инкубацию в течение 5–15 минут образцов биологического материала при температуре 95–100ºС в присутствии детергентов. В результате этого происходит разрушение клеточных мембран, выход НК в раствор и инактивация (обратимая или частичная) ингибиторов. Так как ингибиторы не удаляются из раствора, а некоторые из них (в первую очередь РНКзы) устойчивы к нагреванию, этот метод не используют для очистки и экстракции РНК. Метод термической обработки относят к экспрессметодам, он прост в исполнении и позволяет за короткое время обработать большое количество образцов (рис. 2). В связи с тем, что количество неинактивированных ингибиторов может значительно варьировать от образца к образцу, эффективность очистки ДНК такими методами трудно стандартизовать, поэтому их не рекомендуют 17 использовать в тех случаях, когда необходима количественная оценка содержания ДНК в биологическом материале. Рис. 2. Схема выделения методом термической обработки (ресурсы сети Интернет) Амплификация – многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК возбудителя, катализируемое ДНК-полимеразой. Это увеличение основано на уникальном свойстве ДНК – удвоении. В ПЦР процессы репликации ДНК осуществляются в пробирке в циклическом режиме. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. ПЦР проводят в амплификаторе – приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Этапы проведения амплификации 1. Расплетение спирали ДНК и расхождение нитей (денатурация) происходит при нагревании раствора до 93–95°С. 2. Присоединение праймеров происходит комплиментарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой находятся в интервале от 50 до 65°С. Время отжига 20–60 сек. 3. Достраивание цепи дочерней нити ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом taq-полимеразой и проходит при температуре 70–72°С. Время 18 протекания синтеза – 20–40 сек. Остальные компоненты ПЦР: дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ) в эквивалентных концентрациях 200–500 мкм; магний, необходимый для работы taq-полимеразы (2–3 мМ); трис-HCl-буфер рН 6,8–7,8. Происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2 n, где n – число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула, то за 30–40 циклов синтезируется 106–108 молекул ампликона, что делает возможным учет результатов. Присоединившись к противоположным цепям молекулы ДНК, праймеры ограничивают собой тот ее участок, который будет в дальнейшем многократно удвоен или амплифицирован. Длина такого фрагмента, который называется ампликоном, обычно составляет несколько сот нуклеотидов (рис. 3). Рис. 3. Этапы амплификации (ресурсы сети Интернет) Детекция продуктов амплификации Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Детекция ПЦР при электрофоретическом способе (рис. 4) осуществляется с помощью электрофореза в агарозном геле. В лунки агарозного геля, помещенного в камеру с буферным раствором и интеркалирующим красителем, вносится аликвота продукта ПЦР. Электроды камеры подключаются к источнику постоянного тока, в поле которого в геле 19 молекулы ДНК, заряженные отрицательно, движутся в направлении положительного электрода. Скорость движения зависит от длины фрагмента ДНК. Присутствующий в растворе интеркалирующий краситель связывается с двухцепочечной ДНК и флуоресцирует оранжевым цветом в УФ-свете. Наличие специфического продукта ПЦР в исследуемых образцах определяется по наличию флуоресцирующей полосы, расположенной в геле на одном уровне с продуктом амплификации положительного контрольного образца, содержащего либо нативный, либо рекомбинантный препарат ДНК выявляемого микроорганизма. Рис. 4. Детекция методом электрофореза (ресурсы сети Интернет) Наиболее современным способом учета реакции является регистрация флуоресцентного сигнала – «по конечной точке» (ПЦР-КТ) или в «режиме реального времени» (ПЦР-РВ). Технология ПЦР-РВ основывается на гибридизации флуоресцентных зондов с матрицей в процессе амплификации. Этот метод является количественным, так как уровень флуоресценции пропорционален количеству образовавшихся специфических продуктов ПЦР. Технология ПЦР-КТ подразумевает детекцию флуоресценции по окончании реакции, поэтому метод является не количественным, а качественным. Основная особенность данной технологии – детекция результата ПЦР в закрытой пробирке, быстрота детекции и, как следствие, упрощение и ускорение получения результатов ПЦР при одновременном уменьшении трудозатрат лаборатории. Для работы с этой технологией в лаборатории должен быть специализированный ПЦР-детектор флуоресценции «Джин» (рис. 5) или аналоги. При проведении этапа амплификации НК из образцов биологического материала необходимо использовать контрольные образцы (КО): • Внутренний КО – показатель прохождения реакции. • Положительный КО – образец, содержащий либо фрагмент очищенной ДНК/РНК исследуемого возбудителя, либо рекомбинантный препарат с детектируемым фрагментом генома. Его назначение – определение наличия ДНК возбудителя путем сравнения. • Отрицательный КО – образец, заведомо не содержащий НК искомого возбудителя. Назначение – контроль возможной контаминации. 20 Рис. 5. ПЦР-детектор флуоресценции «Джин» (ресурсы сети Интернет) Для грамотного проведения методики ПЦР и учета полученных результатов необходимо правильно подготовить пациента, взять биологический материал из места наиболее вероятной локализации возбудителя. Решение о выборе материала для исследования принимает врач на основании совокупности жалоб пациента и клинических проявлений инфекции. Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний Прямое определение наличия возбудителей. Многие традиционные методы диагностики, например, иммуноферментный анализ (ИФА), выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. Высокая специфичность ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. Высокая чувствительность ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-анализ обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10–100 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов – 103–105 клеток). Среди методов диагностики инфекционных возбудителей ПЦР обладает наиболее высокими (до 99,7%) показателями чувствительности. Высокая скорость получения результата анализа ПЦР обеспечивается тем, что не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полный анализ за 4–5 часов. 21 Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Ограничения метода ПЦР Амплифицируется ДНК, как живого, так и погибшего микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Обычно этот интервал составляет 4–8 недель. Возможность перекрестной реакции. Подбор праймеров происходит на основе существующих знаний о геноме искомого и сходных микроорганизмов. Теоретически существует возможность присутствия такого же фрагмента у других микроорганизмов, геном которых в настоящее время не расшифрован, не был протестирован на возможность перекрестной реакции. Присутствие в пробе таких микроорганизмов может привести к ложноположительному результату анализа. Изменчивость микроорганизмов. Хотя при конструировании тестсистемы фрагмент генома, используемый для амплификации, выбирается из высококонсервативной области, изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом участке генома, и, таким образом, становиться неуловимыми данной тест-системой. Исследования методом ПЦР проводят на базе КДЛ, которая оборудована согласно требованиям, предъявляемым к данному типу лабораторий. Интерпретация результатов ПЦР Описанный метод открывает для врача клинициста довольно большие диагностические возможности, однако, часто врачи-клиницисты допускают ошибки на пре- или постаналитическом этапе данного исследования, что приводит к неправильным результатам и серьезно дискредитирует метод. Это, прежде всего, ошибки, связанные с нарушением правил сбора, хранения и транспортировки проб. Поскольку, эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего сбор проб, так как именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Примеры ошибок, связанных с неверной диагностической стратегией врача: 22 Врач-клиницист не учитывает специфичность используемых тест-систем. Больной с предполагаемым диагнозом «респираторный хламидиоз» направлен на исследование С. trachomatis в соскобе с задней стенки глотки. При постановке ПЦР использовалась видоспецифическая тест-система, выявляющая фрагмент генома С. trachomatis. Результат исследования отрицательный. Врач снимает предполагаемый диагноз «респираторный хламидиоз». Однако у больного инфекция может быть вызвана С. pneumonia, C. psitaci, которые не улавливаются данной тест-системой. Поэтому при назначении ПЦР-исследования больному врач должен четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем. 2. Врач не учитывает особенности персистенции и элиминации возбудителя. Больная с хроническим хламидийным цервицитом направлена на контрольное исследование через 1 неделю после окончания курса антибиотикотерапии. Результат анализа положительный. Врач сделал вывод о неэффективности проведенной терапии. Такое заключение может быть ошибочным, так как погибшие и персистирующие хламидии дают положительный результат ПЦР-анализа. Окончательный вывод об излеченности можно сделать не ранее, чем через 5–6 недель после курса антибиотикотерапии. Это срок необходим для неоднократной смены эпителиального слоя, в клетках которого паразитируют хламидии. 1. 3. Клиническая ошибка заключается в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Зачастую отождествляются два принципиально различных понятия – «инфицированность» и «инфекционная болезнь». Известно, что только у 40–60% лиц с обнаруженным в крови цитомегаловирусом (методом ПЦР) заболевание может развиться клинически. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИММУНОДИАГНОСТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИЙ Применение иммунологических методов с целью диагностики заболеваний органов и систем имеет в настоящее время большое значение. Наиболее широко иммунологические методы используют в области инфекционной патологии, аллергологии, эндокринологии, гематологии, в онкологии и при переливании крови, а также при изучении трансплантационного иммунитета и аутоиммунных заболеваний. Иммунологические методы: • детекция клеток и молекул иммунной системы с помощью маркированных моноклональных антител (МАТ); • серологические исследования на основе взаимодействия антигенантитело; 23 • молекулярно-генетические методы (ПЦР, метод молекулярной гибридизации с использованием ДНК-, РНК-зондов, реакция секвенирования); • культивирование клеток иммунной системы в лабораторных условиях. Применение серологического метода на основе взаимодействия антиген-антитело для выявления различных антител Реакция in vitro между антигеном и антителом состоит из специфической и неспецифической фаз. В специфическую фазу происходит быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза – более медленная, которая проявляется видимыми физическими явлениями – образованием хлопьев (феномен агглютинации), преципитата в виде помутнения, окрашивания. Реакции по регистрируемому эффекту и технике постановки: • агглютинация; • преципитация; • нейтрализация; • реакция с участием комплемента; • реакция с использованием меченых антител и антигенов. Реакция агглютинации (склеивание). Простая по постановке реакция, при которой происходит связывание антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например, при добавлении изотонического раствора натрия хлорида. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осадка. Наиболее частое применение данной реакции – определение групп крови. Группа крови – набор индивидуальный антигенных характеристик эритроцитов. По данным Международного общества переливания крови, у человека обнаружено 36 систем групп крови. Из них наибольшее значение в прикладной медицине имеют и определяются чаще всего системы AB0 и резусфактора. Но остальные системы групп крови также имеют значение, поскольку пренебрежение ими в некоторых случаях может привести к тяжелым последствиям и даже смертельному исходу. Систему групп крови АВ0 составляют два групповых эритроцитарных антигена – агглютиногены А и В, и два соответствующих антитела – агглютинины плазмы анти-А (α) и анти-В (β). I (0) группа крови – агглютинины (αβ), агглютиногенов нет II (А) группа крови – агглютиноген А и агглютинин β III (В) группа крови – агглютиноген В и агглютинин α IV (АВ) группа крови – А и В, агглютиногены (АВ), агглютининов нет Кроме системы АВ0 кровь различают по знаку резус-фактора. Резусфактор(Rh) – белок (антиген D) на мембране эритроцитов. Он присутствует не у всех людей. Есть антиген – резус-фактор положительный(Rh+), нет антигена – отрицательный (Rh-) (рис. 6). 24 Рис. 6. Группы крови системы AB0 (ресурсы сети Интернет) В клинической практике определяют группы крови двумя способами: • первичное определение группы крови и резус фактора (цоликлоны АнтиА, Анти-B и Анти-D); • вторичная диагностика группы крови и резус-фактора (стандартные сыворотки и перекрестный способ, определение фенотипа, т.е. антигенов C, c, E, e, Cw, K, k). Экспресс-диагностика (первичное определение группы крови и Rh-фактора) не учитывает другие системы верификации. Поэтому цоликлоны применяют только для первичного определения группы крови и резус-фактора и при экстренных показаниях трансфузии компонентов крови. Определение группы крови АВ0 должны проводить специалисты, имеющие подготовку по вопросам иммуногематологии на специализированных циклах усовершенствования на базе учреждений службы крови. Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Эта реакция используется в настоящее время в лабораториях для экспресс-диагностики сифилиса с кардиолипиновым антигеном (реакция микропреципитации – РМП). Реакции преципитации используют также для определения антигенов бактерий, тканей человека и животных; диагностики некоторых инфекционных заболеваний; определения видовой принадлежности белка в судебной медицине; выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях в санитарной практике. Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.е. 25 происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности, сифилиса (реакция Вассермана). Реакция нейтрализации (РН). Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т.е. их нейтрализацией. Реакцию нейтрализации проводят путем введения смеси антиген-антитело животным или в чувствительные тестобъекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тестобъектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов, говорят о нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело. Реакции с использованием меченых антител или антигенов Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) является методом экспрессдиагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. РИФ была основана на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченные флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Радиоиммунологический метод (РИА) – высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченных радионуклидом ( l25J, 14С, 3Н, 51Сr и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике (бета- или гамма-излучение), где интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Иммуноблоттинг (ИБ) – высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Антиген выделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг – от англ. blot, пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченую ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больного + антитело против Ig человека выявляют добавлением субстрата/хромогена, изменяющего окраску под действием фермента. ИБ используют как диагностический метод при ВИЧинфекции (рис. 7). 26 Рис. 7. Схема проведения иммуноблоттинга (ресурсы сети Интернет) ИФА – выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бетагалактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней (например, для диагностики ВИЧ-инфекции, гепатитов и др.), а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале. При использовании твердофазного ИФА определение выполняют в специальных лунках на планшетах. В роли твердой фазы используется пластик лунки, на которую в фабричных условиях нанесен специфический антиген (рис. 8). После добавления сыворотки в лунку, имеющиеся антитела адсорбируются на поверхности пластика, образуя специфический комплекс антиген-антитело (фрагмент 1). Этому способствует эффективное перемешивание и определенная температурная среда, в которую помещен планшет. После промывки в лунку добавляют вторичные антитела для узнавания человеческих антител определенного типа (IgA, IgG, IgM) с активным ферментом Е (фрагмент 2). Лунку вновь промывают, и в нее помещают пероксидазу хрена (или щелочную фосфатазу), связывающуюся с вторичными антителами и образующую так называемый четвертый слой иммунного «сендвича» (фрагмент 3). Количество фиксированной пероксидазы прямо пропорционально содержанию исследуемого вещества в биопробе, поэтому раствор изменяет интенсивность окраски (оптическую плотность), которая измеряется фотометрически. 27 Рис. 8. Схема проведения ИФА (ресурсы сети Интернет) Далее с учетом значений оптической плотности контрольных проб проводят математическую обработку результатов анализа. В общем случае, чем выше оптическая плотность в данной лунке, тем большее количество специфических антител содержится в соответствующей пробе и, следовательно, выше титр анализируемой сыворотки. При отсутствии в сыворотке исследуемых антител лунки остаются неокрашенными. Результат исследования можно представить в виде титра антител. Это способ полуколичественного выражения содержания специфических антител в сыворотке крови. Титр выражается в виде дроби, представляющей собой степень разведения исследуемой сыворотки, при которой анализ дает положительный результат. При интерпретации результата исследования титров антител необходимо помнить, чем больше знаменатель дроби, тем выше концентрация антител в пробе. С дальнейшим развитием ИФА на смену полуколичественному выражению содержания антител в виде титра приходит их количественное измерение в Международных Единицах (МЕ) или нанограммах на литр. Серая зона – это диапазон концентраций специфических антител, в который с равной вероятностью могут попадать как положительные, так и отрицательные пробы. Результаты анализа, попавшие в серую зону, не могут быть однозначно интерпретированы, для уточнения результата необходимо повторить исследование с новой сывороткой, полученной через 1–2 недели. Сероконверсия – появление специфических антител (главным образом класса IgG) в сыворотке крови, после того как предыдущие анализы давали отрицательный результат. Во многих случаях сероконверсия может дать наиболее убедительное и строгое доказательство первичного инфицирования обследуемого. Из пяти классов Ig в диагностике инфекционных заболеваний чаще всего используются Ig трех типов А, M и G. 28 Существует некоторый промежуток времени с момента внедрения инфекционного агента в организм и до момента появления антител в сыворотке крови – серонегативный период. В среднем для различных инфекций он составляет 1–4 недели (рис. 9). Рис. 9. Изменение содержания Ig в сыворотке крови в динамике инфекционного процесса (ресурсы сети Интернет) В первую очередь начинают вырабатываться IgM, пик которых приходится на максимум проявлений клинических признаков острой инфекции. IgM является маркером острой фазы заболевания (табл. 1). Таблица 1 Определение стадии заболевания на основании выявления антител Стадия заболевания Острая Хроническая Реактивация или реинфекция Cостояние после реконвалесценции (серологические шрамы) Классы антител IgM, IgG, IgA IgA, IgG Скачкообразное резкое повышение IgG, повышение в меньшей степени – IgA, IgM IgG С отставанием на 1–2 недели начинает увеличиваться титр IgG. В последующем содержание IgM в сыворотке крови снижается, а IgG – продолжает увеличиваться. Этот период соответствует стадии перехода инфекции из острой фазы в хроническую. Если в какой-то момент происходит обострение хронической инфекции, то наблюдается новый всплеск IgM с последующим увеличением титра IgG, соответствующим фазе ремиссии. Даже если организм справляется с инфекцией, IgG могут еще длительное время оставаться повышенными (для некоторых инфекций пожизненно). Для ряда заболеваний, таких как корь, дифтерия, паротит и другие, наличие специфических иммуноглобулинов является надежным барьером против повторного инфицирования. Это не относится к урогенитальным заболеваниям (хламидиоз, микоплазмоз, трихомониаз и др.), т.к. пожизненный 29 иммунитет против них не развивается. Обычно спустя 2 месяца после эффективной терапии уровень IgG опускается ниже критического значения, тем не менее, следует с осторожностью использовать данные анализа IgG в качестве показателя излеченности, поскольку, в силу индивидуальных особенностей иммунной системы, данные антитела еще длительное время могут присутствовать в крови. В типичных случаях IgМ (первичный иммунный ответ) сменяются на IgG. Однако при повторном заражении или реактивации хронической инфекции IgМ (вторичный иммунный ответ) будут вырабатываться в значительно меньших объемах и чувствительность тест-систем не позволит нам определить IgМ, поэтому в сыворотке крови будут определяться только IgG, а активность воспалительного процесса будет определяться только клинически. Такое различие динамики антителообразования при первичном и вторичном иммунном ответе объясняется тем, что после первичного введения антигена в иммунной системе формируется клон лимфоцитов, несущих иммунологическую память о данном антигене. После повторной встречи с этим же антигеном клон лимфоцитов с иммунологической памятью быстро размножается, интенсивно включает процесс антителогенеза, и образуются главным образом IgG (рис. 10). Рис. 10. Динамика образования антител при первичном и вторичном иммунном ответе (ресурсы сети Интернет) Динамика Ig на начальном этапе лечения вообще не имеет четких тенденций. Может наблюдаться как снижение, так и увеличение их уровня. Поэтому антитела нельзя рассматривать в качестве показателя эффективности терапии, т.е. элиминации или сохранения в организме инфекционного агента. Используя данные однократного исследования, затруднительно вынести клиническое заключение. Персистенция латентных инфекций вирусной или 30 бактериальной природы в организме пациентов часто приводит к невозможности моментального определения присутствия патогена даже при наличии воспалительных симптомов. В связи с этим предпочтительно проводить серийное обследование нескольких образцов. Иммунодиагностика некоторых инфекций Хламидиоз. Это заболевание, передающееся половым путем. Диагностика хламидийной инфекции затруднена из-за особенности жизненного цикла этого микроорганизма и объясняет склонность данного вида инфекции к длительному хроническому течению. Два вида – Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae наиболее часто вызывают заболевания у человека. Хладимийная инфекция может наносить серьезный, постоянный вред женской репродуктивной системе, что впоследствии может затруднить или сделать невозможным наступление беременности у женщины. Первоначально определяют титры IgМ, IgA, IgG к C. trachomatis для характеристики стадии заболевания. В ходе лечения возможно повторное определение титров IgA, IgG с целью мониторинга эффективности лечения. Через 3–6 месяцев после курса лечения определяют титры IgA, IgG для отдаленной оценки его эффективности. Герпесвирусная инфекция. Вирус герпеса имеет 8 типов. Вирус персистирует в организме и может переходить в активную форму при ряде обстоятельств: при беременности, снижении иммунной защиты, наличии сопутствующих соматических заболеваний, применении иммуносупрессивной терапии. Резервуаром инфекции является инфицированный человек, у которого вирус содержится в слезной жидкости, слюне, грудном молоке, в крови, внутренних органах, моче, влагалищном секрете, сперме. За первичным инфицированием наступает пожизненное носительство вируса. У лиц с сохранной иммунной системой не происходит развитие манифестных форм болезни, но вирус сохраняется и размножается в лейкоцитах, системе мононуклеарных фагоцитов. При заражении плода развивается острая форма заболевания с поражением головного и костного мозга, печени и других органов; заболевание чаще заканчивается гибелью плода. В случае выздоровления у ребенка наблюдается микроцефалия, замедленное умственное развитие, двигательные расстройства. При заражении детей в возрасте до двух лет развивается подострая инфекция в виде интерстициальной пневмонии. Определение антител к нему имеет большое значение у беременных. Существует определенная закономерность в динамике выработки специфических антител к герпесу. Через некоторое время после инфицирования, на первом этапе формирования иммунитета образуются IgM. На втором этапе формирования иммунитета, в более позднее время, начинают формироваться IgG, концентрация которых повышается в течение нескольких недель (5–8) до максимального уровня. К этому времени продукция IgM снижается или прекращается совсем. После выздоровления или стабилизации процесса в крови в небольших количествах циркулируют только IgG. Эту 31 закономерность важно учитывать при подозрении на острую инфекцию у женщин с малыми сроками беременности (І–ІІ триместры). Вирус герпеса 1,2 типов (HSV-1,2) вызывает лабиальный и генитальный герпес. Вирус герпеса 3 типа (HSV-3) протекает как ветряная оспа у детей, а ее рецидивы – как опоясывающий лишай (у взрослых). Вирус герпеса 4 типа (HSV-4, Эпштейна-Барр, EBV) был открыт в 60-х годах XX века. EBV поражает в основном два типа клеток: эпителий верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта, а также В-лимфоциты, которые в результате инфицирования изменяют свои свойства. Вирус герпеса 4 типа вызывает такие заболевания, как инфекционный мононуклеоз, злокачественная лимфома Беркитта, злокачественная носоглоточная карцинома. Наиболее специфичными и чувствительными маркерами острой стадии инфекции являются IgM к капсидному комплексу (VСA) и IgG к раннему антигену (ЕА). В стадии ремиссии, переболевшие EBV, имеют IgG к ядерному антигену (EBNA). Вирус герпеса 5 типа (HSV-5, цитомегаловирусная инфекция, CMV). Этот вирус находится в латентном состоянии в лимфоидных органах, и при снижении иммунной способности возникают различные клинические синдромы, определяющие проявление вторичной ЦМВ-инфекции. Вирус герпеса 6 типа (HSV-6) был выделен из лейкоцитов периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией и лимфопролиферативными заболеваниями. Он способен поражать Т-лимфоциты. Вирус герпеса 6 типа у взрослых может никак себя не проявлять, но при этом может вызывать болезненное состояние – синдром хронической усталости. Вирус герпеса 7 типа (HSV-7) Практически все дети в возрасте до пяти лет заражены этим типом. До настоящего времени клинические признаки четко не описаны, но существуют доказательства связи заболевания с развитием энцефалита. Вирус герпеса 8 типа (HSV-8). На начальной стадии заболевание протекает в виде мононуклеозоподобного синдрома. Позже у пациентов со сниженным иммунитетом (особенно у ВИЧ-инфицированных) развивается саркома Капоши. Вирус иммунодефицита человека (HIV) В настоящее время основным диагностическим методом при ВИЧ-инфекции является выявление антител к вирусу, производящееся преимущественно с применением методики ИФА. В случае положительного результата исследуют сыворотку крови с помощью методики иммунного блоттинга. Это позволяет идентифицировать антитела к специфическим антигенам ВИЧ, что является достаточным критерием для окончательного диагностирования. Не выявленные с помощью иммуноблоттинга антитела не исключает ВИЧ. В инкубационный период иммунный ответ на внедрение вируса еще не сформирован, а в терминальной стадии в результате выраженного иммунодефицита антитела перестают вырабатываться. 32 При подозрении на ВИЧ и отсутствии положительных результатов иммунного блоттинга эффективным методом выявления частиц РНК вируса является ПЦР. Вирус краснухи (Rubella). Наиболее часто краснуха встречается в детском и подростковом возрасте. Однако 20–60% женщин детородного возраста не имеют иммунитета к вирусу краснухи, так как не болели краснухой в детском возрасте и являются группой риска по заболеванию во время беременности и инфицированию плода (диагностируется как Torch-инфекция). Заболевание краснухой в течение беременности, особенно в течение первого триместра, может быть причиной серьезных осложнений у плода. Глухота, болезни сердца, микро- и гидроцефалия являются одними из некоторых отличительных признаков синдрома врожденной краснухи. Новорожденного ребенка с малым весом и имеющего любой из ряда перечисленных симптомов, необходимо обследовать на врожденную краснуху путем определения специфических антител класса IgМ. Специфические антитела против вируса краснухи класса IgМ определяются спустя 1–3 дня с момента появления первых симптомов заболевания. В большинстве случаев с 6-й по 9-ю неделю их титр снижается. Нередко в первые дни болезни IgМ отсутствуют, что связано с коротким инкубационным периодом. Для подтверждения положительного результата рекомендуется параллельно проанализировать образцы, взятые у тех же больных через 7–14 дней. Инфекции органов пищеварения, ассоциированные с хеликобактером пилори (Helicobacter pylori). H. pylori – спиралевидная, грамотрицательная бактерия, которая инфицирует различные области желудка и двенадцатиперстной кишки. Иммунодиагностика этой инфекции заключается в выявлении иммуноглобулинов класса G и A к H. pylori в сыворотке крови. Диагностическая точность варьируется в зависимости от продолжительности воздействия бактерии, перекрестной антигенности с другими антигенно-родственными бактериями, степени гастрита и обсемененности. Кроме того, антитела сохраняются долгое время после успешного лечения, и использовать этот метод для проверки успешности лечения затруднительно. Однако, поскольку инфекция H. рylori является хронической и ее спонтанный клиренс (полное и окончательное самоизлечение лишь силами организма) невозможен, то положительные тесты на антитела у нелеченных пациентов указывают на наличие текущей инфекции. Между тем, после успешного лечения, титр антител, со временем, снижается. Достоинством этого метода является то, что анализ крови на антитела можно делать во время приема антибиотиков. Сифилис – хроническое системное венерическое инфекционное заболевание с поражением кожи, слизистых оболочек, внутренних органов, костей, нервной системы с последовательной сменой стадий болезни, вызываемое бактериями вида Treponema pallidum (бледная трепонема). 33 Основным методом диагностики и подтверждения диагноза «сифилис» является серодиагностика. В результате взаимодействия антигенов бледной трепонемы с иммунной системой больного начинают вырабатываться три группы антител. В начале заболевания в крови обнаруживаются преимущественно IgA (флюоресцины); после появления твердого шанкра к ним присоединяются IgM (реагины), и только после этого – IgG (иммобилизины). В настоящее время для определения антител к возбудителю используется ИФА. Наиболее распространенным является сочетание кардиолипинового теста с трепонемным ИФА. Если оба эти анализа положительны, то лабораторные данные будут трактоваться как подтверждение диагноза сифилиса. Если оба анализа отрицательные, то при отсутствии других проявлений заболевания, считается, что человек сифилисом не болен. Если кардиолипиновый тест отрицательный, а ИФА положительный, то можно предположить, что человек когда-то переболел сифилисом. При положительном кардиолипиновом тесте и отрицательном ИФА нужно повторить анализ. Такое сочетание может быть вызвано особенностями состояния иммунной системы человека (наличием ВИЧ-инфекции, вирусов гепатита, перестройкой организма в связи с беременностью и пр.). Иммуноферментные методы способны дополнить, а порой и заменить, существующие рутинные серологические методы диагностики сифилиса (РМП, РСК). Установлено, что ранние стадии инфицирования характеризуются появлением в крови трепонемоспецифических IgМ (примерно через две недели после заражения), концентрация которых нарастает, и через два месяца достигает своих пиковых значений с последующим снижением уровня до неопределяемых величин. IgG появляются в крови только через месяц после инфицирования, однако, уже на 6-й неделе после инфицирования их уровень преобладает над уровнем IgM и может сохраняться в таком состоянии годы. Большое диагностическое значение приобретает выявление антитрепонемных IgM в крови новорожденных. Так как IgM не проходит через плаценту, выявление антитрепонемных IgM у новорожденного указывает на врожденный сифилис. Точно так же IgM не проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), и их появление в спинномозговой жидкости (СМЖ) говорит о нейросифилисе. Лямблиоз – кишечное заболевание, вызываемое протозойным паразитом Giardia lamblia. Острые симптомы лямблиоза могут включать в себя диарею, нарушение всасывания, спазмы кишечника, анорексию, тошноту, потерю веса, общую слабость, зачастую на фоне нормальной температуры тела, продолжающуюся от нескольких недель до нескольких месяцев. Хроническая инфекция может протекать и без острой фазы и часто является следствием безуспешного лечения, приводящего к рецидивам заболевания. Для диагностики лямблиоза используют определение в кале специфического антигена GSA 65, продуцируемого в больших количествах во 34 время размножения лямблии в кишечнике хозяина. GSA 65 является специфическим антигеном Giardia и не обладает перекрестной реактивностью по отношению к другим кишечным паразитам. В сыворотке крови инвазированных лямблиями людей выявляются антитела к антигенам лямблий, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов. Попадание антигенов лямблий в периферическую кровь увеличивается при резорбции слизистой оболочки кишечника. В связи с этим выявление IgМ к специфическим антигенам лямблий в сыворотке крови может свидетельствовать о наличии острого лямблиоза, диагностика которого возможна на 10–14-й день от начала инвазии. Антитела классов IgG появляются через 2–4 недели после заражения, могут сохраняться в течение длительного периода. Токсоплазмоз – паразитарное заболевание человека и животных, вызываемое токсоплазмами Toxoplasma gondii, в подавляющем большинстве случаев протекающее бессимптомно. Источник инвазии – различные виды домашних и диких млекопитающих. Это заболевание характеризуется полиморфизмом клинических проявлений, поражается в основном нервная система, мышцы, миокард, глаза, увеличивается печень и селезенка. Основной метод диагностики токсоплазмоза – серологический. Выполняется определение уровня иммуноглобулинов G с помощью ИФА. Уровень антител достигает максимального уровня через 1–2 месяца после начала заболевания и впоследствии регистрируется неопределенно долго. У пациентов с сероконверсией или четырехкратным увеличением титра IgG определяют уровень специфических IgM для подтверждения наличия острой инфекции. Пик концентрации антител достигается через месяц, исчезают они обычно через 6–9 месяцев, но в отдельных случаях могут периодически обнаруживаться в течение 2 и более лет, затрудняя дифференцировку острой и хронической форм инфекции Токсокароз – заболевание человека, вызываемое миграцией личинок гельминтов, поражающих главным образом представителей псовых (Toxocara canis) и семейства кошачих (Toxocara mystax). Человек для токсокары не является окончательным хозяином, поэтому личинки паразита в его организме не достигают половой зрелости, однако они способны к длительной миграции, поражая различные органы и ткани. Прижизненный паразитологический диагноз токсокароза практически невозможен, поскольку обнаружить мигрирующие личинки трудно, а идентифицировать их по гистологическим срезам весьма непросто. Ограниченная возможность паразитологической диагностики приводит к тому, что ведущим в диагностике токсокароза является определение IgG в титре 1:800. 35 Определение IgE Важное значение в клинической практике имеет определение IgE. Концентрация IgE в сыворотке крови возрастает постепенно с момента рождения человека до подросткового возраста. У взрослых людей концентрация IgE в норме может достигать 100 МЕ/мл. В пожилом возрасте уровень IgE иногда снижается. IgE отличается от других иммуноглобулинов высокой цитофильностью, т.е. способностью присоединяться к клеткам, в частности к тучным клеткам и базофилам. Присоединение антигена к IgE, находящемуся на этих клетках, приводит к выделению гистамина и других активных субстанций, что вызывает развитие реакций гиперчувствительности немедленного типа. У больных с аллергиями (астмой, сенной лихорадкой, эктопической экземой) уровень IgE в крови значительно повышен. Концентрация IgE зависит от длительности заболевания, поэтому короткие атопические приступы не вызывают ее повышения. Количество IgE увеличено в 15–20 раз при многих паразитарных заболеваниях. 36 Задания для самоконтроля 1. В КДЛ был доставлен биоматериал в пробирке – вакутейнер с красной крышкой. Назовите исследование, которое можно сделать из этой пробирки: A. Общеклинический анализ крови B. Протромбиновое время C. Международное нормализованное отношение D. Фибриноген E. Холестерин 2. В 1400 в КДЛ была доставлена кровь больного для биохимического анализа. Кровь была набрана в отделении в 8 30 утра. Какой аналит будет изменяться в первую очередь? A. Аланинаминотрансфераза B. Холестерин C. Глюкоза D. Общие липиды E. Мочевина 3. В КДЛ был доставлен биоматериал в пробирке – вакутейнер с сиреневой крышкой на 2 мл. Назовите исследование, которое можно сделать из этой пробирки: A. Общеклинический анализ крови B. Глюкоза C. Тиреотропный гормон D. Билирубин E. Холестерин 4. В 1400 в КДЛ из кардиологического отделения была доставлена кровь пациента для проведения общеклинического анализа крови. Укажите действия персонала лаборатории. A. Отказать в исследовании B. Определить показатели с коэффициентом погрешности C. Отметить на бланке ответа время поступления материала D. Заморозить пробу для выполнения на следующий день E. Зарегистрировать в журнале преаналитических ошибок 5. Для проведения лабораторных исследований в ходе пробоподготовки получена плазма. Для каких тестов используется данная аналитическая проба? A. Биохимических B. Общеклинических C. Коагулологических D. Гематологических E. Иммунологических 6. При исследовании в лаборатории биоматериалов пациентов, находящихся в лечебном учреждении, часто наблюдаются неустранимые колебания ряда показателей за пределы референтных значений, что становится причиной 37 неправильной интерпретации исследований. Как называется такая вариация показателей? A. Биологическая B. Межиндивидуальная C. Ятрогенная D. Межвидовая E. Патологическая 7. В лабораторию доставлена проба крови, набранная в вакутейнер с активатором свертывания. Визуально видно изменение цвета надосадочной жидкости. После центрифугирования полученная сыворотка – ярко-розового цвета. Охарактеризуйте полученную сыворотку: A. Гемолизная B. Иктеричная C. Хилезная D. Пригодная к использованию E. Бактериально загрязнённая 8. В КДЛ была доставлена кровь больного в вакутейнере для исследования. Данная пробирка должна центрифугироваться только в центрифугах с горизонтальными откидывающимися стаканами. С каким наполнением данный тип вакутейнера? A. ЭДТА К2 B. Цитратом натрия C. Активатором свертывания D. Разделительным гелем E. Гепарином 9. Для биохимических исследований в лабораторию доставлена сыворотка крови. Назовите белок, который отсутствует в сыворотке и поэтому не может быть определен при данном биохимическом исследовании. A. Глобулин B. Альбумин C. Тропонин D. Иммуноглобулин E. Фибриноген 10. В манипуляционном кабинете медсестра утром набрала кровь у больного и оставила на 2 часа у освещенного окна. Какой аналит будет изменяться в первую очередь, если кровь храниться таким способом? A. Билирубин B. Холестерин C. Глюкоза D. Креатинин E. Мочевина 38 11. Гинеколог пациентке назначил исследование на урогенитальные инфекции методом ПЦР. К каким методам диагностики относится данное исследование? A. Прямым B. Серологическим C. Бактериологическим D. Микроскопическим E. Непрямым 12. Врач-лаборант проводит постановку ПЦР. Положительный результат наблюдается при многократном удвоении фрагмента ДНК возбудителя. Как называется такой фрагмент? A. Ампликон B. Субстрат C. Результат ПЦР D. Часть молекулы ДНК E. Копируемый фрагмент 13. Гинеколог назначил исследование на М. genitalium методом ПЦР через 2 месяца после проведенного лечения. Но пациентка самостоятельно сдала этот анализ через 1 неделю после окончания терапии и получила ответ: «М. genitalium – обнаружена». С каким ограничением метода ПЦР может быть связан этот результат? A. Копированием ДНК убитого возбудителя B. Денатурацией ДНК C. Нестабильностью нуклеиновых кислот D. Изменчивостью микроорганизмов E. Перекрестным копированием 14. После пробоподготовки для проведения ПЦР врач-лаборант собирает реакционную смесь, добавляет обработанный биоматериал пациента и ставит в термоциклер, где происходит копирование и умножение копий ДНК возбудителя по заданной программе. Укажите, как называется этот этап ПЦР? A. Детекция B. Денатурация C. Амплификация D. Агрегация E. Абсорбция 15. Уролог назначил пациенту обследование на урогенитальные инфекции методом ПЦР, предупредив, что это надо сделать до начала лечения. Что возможно определить методом ПЦР? A. Жизнеспособность микроорганизмов B. Наличие или отсутствие ДНК возбудителя C. Морфологические свойства ДНК D. Способность создавать комплекс антиген-антитело 39 E. Патогенетические особенности ДНК 16. В лабораторию детским урологом были направлены два мальчика 7 и 11 лет для обследования методом ПЦР (кровь, моча) на М. hominis и Ur. urealiticum. Мальчики занимаются плаванием. У обоих мальчиков жалобы на боли при мочеиспускании и покраснение головки полового члена. В результате обследования у них в моче была обнаружена только М. hominis, в крови данные микроорганизмы не обнаружены. Чем объяснить расхождение результатов? A. Наиболее вероятным местом локализации возбудителя B. Видом возбудителя и длительностью течения заболевания C. Реакцией организма на возбудителя D. Восприимчивостью возбудителя к основным красителям E. Желанием пациента 17. Женщина 23 лет пришла на контрольное исследование через 1 неделю после окончания курса антибиотикотерапии по поводу хламидийной инфекции. Результат анализа положительный. Врач предположил, что результат мог быть ложноположительный и назначил дополнительный метод исследования, чтобы оценить жизнеспособность микроорганизма и сделать вывод о неэффективности проведенной терапии. Какой метод исследования целесообразно назначить в данном случае? A. Микроскопический B. Бактериологический C. Молекулярно-биологический (ПЦР) D. Прямую иммунофлюоресценцию (ПИФ) E. Иммуноферментный 18. Врач с целью подбора патогенетической терапии при пневмании неясной этиологии назначил пациенту исследование соскоба из зева методом ПЦР на C. pneumoniae, т.к. данный метод обладает практически 100% специфичностью. Это обусловлено: A. Подбором буфера для реакции B. Изменением объема реакционной смеси C. Копированием всей молекулы ДНК возбудителя D. Копированием уникального фрагмента ДНК возбудителя E. Квалификационными навыками персонала 19. Девочке 7 лет на основании клинического осмотра и обнаружении мононуклеаров в общем анализе крови был поставлен диагноз: инфекционный мононуклеоз. Для уточнения диагноза врач назначил исследование слюны ребенка на наличие ВЭБ. Каким методом необходимо выполнить исследование? A. Микроскопическим B. Бактериологическим C. Молекулярно-биологическим (ПЦР) D. Прямой иммунофлюоресценцией (ПИФ) 40 E. Иммуноферментным 20. Перед планированием беременности семейной паре врач назначил обследование на заболевания, передающиеся половым путем и рекомендовал в качестве наиболее чувствительного и специфического метода лабораторной диагностики использовать: A. Микроскопический B. Молекулярно-биологический (ПЦР) C. Прямую иммунофлюоресценцию (ПИФ) D. Иммуноферментный анализ E. Бактериологический 21. Врач-лаборант выполняет постановку реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном для выявления антител к Т. рallidum. Что является патофизиологической основой развития ответной иммунной реакции организма? A. Внедрение антигена B. Количество антигена C. Выработка антител D. Дифференциация лимфоцитов E. Реактивность организма 22. В клинико-диагностическую лабораторию с целью прохождения медицинского осмотра направлена кровь пациента для серологической диагностики на наличие сифилитической инфекции. Какие из перечисленных методов серодиагностики наиболее часто используют в качестве скрининговых (отборочных) реакций при диагностике сифилиса? A. ИФА B. Реакцию микропреципитации C. Иммунный блоттинг D. РИФ E. Агглютинации 23. У пациетки при профосмотре были обнаружены антитела к цитомегаловирусу. Клинических проявлений нет. К какому классу иммуноглобулинов относятся антитела, которые длительно (иногда годами) сохраняются в сыворотке крови переболевших? A. IgG B. IgM C. IgA D. IgD E. IgE 24. У ребенка с клиническими проявлениями были обнаружены антитела к краснухе. При повторном обследовании через 2 недели данные антитела не обнаружились. Врач объяснил, что они появляются в остром периоде заболевания и относительно быстро исчезают. К какому классу иммуноглобулинов они принадлежат? 41 A. IgG B. IgM C. IgA D. IgD E. IgE 25. У пациента были обнаружены антитела к ВИЧ. Но инфекционист назначила дополнительное исследование на антитела к гликопротеинам оболочки вируса, белкам сердцевины и ферментам вируса для уточнения диагноза. Назовите метод, который использовался для определения антител к отдельным антигенам вируса. A. ИФА B. Биохимический C. Иммунный блоттинг D. Реакция склеивания комплемента E. Метод радиальной диффузии 26. Беременной женщине поставили диагноз Хламидиоз. Какие методы исследования были использованы для подтверждения диагноза? A. ИФА, ПЦР B. Выделение чистой культуры хламидий C. Темнопольная микроскопия D. ИФА, бакпосев E. Биологический метод на мышах 27. У больного выявлена агглютинация эритроцитов с цоликлоном анти-В и не было агглютинации с цоликлоном анти-А. Какая группа крови у пациента? A. 0 (1) B. А (II) C. В (III) D. А1В (IV) E. А2В (IV) 28. Больной 40 лет, житель сельской местности, в доме имелась дворовая собака свободного содержания. Заболел остро: возникла лихорадка до 39ºС, кашель, на фоне которого стали возникать приступы удушья. Наблюдались диспепсические расстройства, появились зудящие кожные высыпания. При обследовании была выявлена полилимфаденопатия, увеличение печени, сухие свистящие хрипы в легких. В крови: эозинофилия 18%, обнаружены суммарные Ig к T. canis. Какой диагностический титр антител для постановки диагноза токсокароз? A. 1:100 B. 1:200 C. 1:400 D. 1:600 E. 1:800 29. Больной 33 лет с установленным диагнозом Хламидиоз прошел курс 42 лечения. Через 4 месяца повторно сдал кровь на антитела к C. trachomatis, но результат анализа вновь был положительный. Врач повторно назначил сдать антитела через полгода. Какая особенность данного возбудителя приводит к тому, что не всегда наблюдается полная излеченность от инфекции? A. Наличие напряженного пожизненного иммунитета B. Возможность персистенции возбудителя C. Возможность специфической профилактики D. Образование спор E. Полиорганность поражения 30. В крови 20-летней беременной женщины обнаружены IgG к краснухе в количестве 120 МЕ/мл. В анамнезе она краснухой не болела, но была привита по возрасту. Чем обусловлена длительная циркуляция антител в организме человека после вакцинации или перенесенного заболевания? A. Клетками памяти B. Формированием нестерильного иммунитета C. Клетками-киллерами D. Системой мононуклеаров E. Высоким уровнем фагоцитарной активности 43 ГЛАВА 2. КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В ОРГАНИЗМЕ И ЛАБОРАТОРНАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ Гемостаз – это система организма, обеспечивающая, с одной стороны, сохранение крови в кровеносном русле в жидком агрегатном состоянии, а с другой – остановку кровотечения и предотвращение кровопотери при повреждении кровеносных сосудов. Процесс внутрисосудистого свертывания крови, или гемокоагуляции, происходит постоянно в течение всей жизни человека. В то же время его интенсивность бывает различной. Нарушения интенсивности внутрисосудистого свертывания крови приводят к развитию таких патологических проявлений как геморрагии, тромбозы и ДВС-синдром (диссеминированное внутрисосудистое свертывание). Составляющие систему гемостаза компоненты условно можно разделить на морфологические и функциональные. Морфологические компоненты системы гемостаза: 1. Сосудистая стенка. 2. Тромбоциты и клеточные элементы крови. 3. Плазменные компоненты – белки, пептиды и небелковые медиаторы гемостаза, цитокины, гормоны. 4. Костный мозг, печень, селезенка тоже могут рассматриваться, как компоненты системы гемостаза, поскольку в них синтезируются и пулируются тромбоциты и плазменные компоненты системы гемостаза. Функциональные компоненты системы гемостаза: 1. Прокоагулянты (факторы свертывания крови). 2. Ингибиторы коагуляции, антикоагулянты. 3. Фибринолитики. 4. Ингибиторы фибринолиза. Гемокоагуляция внутри сосудистого русла осуществляется при взаимодействии системы прокоагулянтов, формирующих фибрин, тромбоцитов и системы фибринолиза, которая регулирует величину формирующегося кровяного сгустка. Активированные тромбоциты и мембраны поврежденных клеток участвуют в формировании специфических комплексов, состоящих главным образом из белков – прокоагулянтов, которые и обеспечивают сам феномен свертывания крови. Пять составляющих гемостатического процесса: 1. Локальная вазоконстрикция. 2. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз (первичный, микроциркуляторный) – формирование тромбоцитарной пробки для быстрого закрытия поврежденного сосуда (микроциркулятоное русло). 44 3. Плазменный гемостаз (вторичный, коагуляционный, макроциркуляторный) – образование фибриновой сети, которая стабилизирует тромбоцитарную пробку. 4. Антикоагулянты (противосвертывающая система) – ингибируют факторы коагуляции для ограничения процесса в пространстве и предотвращения чрезмерного роста сгустка. 5. Фибринолиз – растворение фибринового сгустка и восстановление просвета сосуда. Локальная вазоконстрикция Высвобождающиеся из активированных клеток медиаторы обеспечивают быстрое (менее 60 с) локальное сужение сосудов: • из тромбоцитов – серотонин, тромбоксан А2 (ТХ А2); фактор, активирующий тромбоциты (ФАТ, PAF); • из эндотелиальных клеток – эндотелин-1 (ET-1), ангиотензин II (АТ II), PAF, ТХ А2. Вазоконстрикция может сохраняться до 2 часов, она способствует сокращению размеров дефекта сосуда, открытию коллатеральных сосудов, что снижает давление крови в поврежденном участке. Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз Первичный гемостаз запускает все реакции гемостаза в капиллярах, венозных и артериальных сосудах до 100 мкм в диаметре. Неповрежденный эндотелий является антикоагулянтной поверхностью, не привлекающей клетки крови и не активирующей свертывание. После активации или травмы эндотелий превращается в прокоагулянтную поверхность, приводящую к запуску гемокоагуляции. При патологии наиболее часто реактивной поверхностью также могут являться: • атеросклеротическая бляшка; • дисфункциональный (поврежденный) эндотелий; • искусственные клапаны сердца; • сосудистые шунты. Нормальные тромбоциты имеют дисковидную форму и в циркулирующей крови перемещаются изолированно друг от друга, не вступая во взаимодействие с эндотелием сосудов. При повреждении сосудистой стенки тромбоциты с помощью фактора Виллебранда (vWF) прилипают к субэндотелиальным структурам – коллагеновым волокнам, миофибриллам, миоцитам, и при этом приобретают сферическую форму. Эта стадия обозначается термином «адгезия тромбоцитов» (рис. 11). Через 30–60 сек адгезированные тромбоциты выделяют в окружающую среду аденозиндифосфат (АДФ), серотонин, адреналин, фибриноген, фактор-4 тромбоцитов (F4-Pt) и ряд других биологически активных веществ (БАВ). Происходит стимулирование агрегации тромбоцитов, под которой 45 подразумевается их слипание друг с другом. При этом освобождение БАВ из тромбоцитов усиливается. Этот феномен обозначается как «реакция освобождения». Наиболее сильными активаторами тромбоцитов являются коллаген и тромбин, кроме того, АДФ, серотонин, PAF, ТХ А2, адреналин. Рис. 11. Адгезия и агрегация тромбоцитов (ресурсы сети Интернет) Важную роль в агрегации выполняют рецепторы на поверхности тромбоцита – рецепторы GP IIb-IIIa, лигандами которого являются фибриноген, фибрин, vWF (именно с этим фактором происходит связывание псевдоподий тромбоцитов с коллагеновыми волокнами) (рис. 12). Рис. 12. Механизм агрегации тромбоцитов (ресурсы сети Интернет) Далее образуются фибриногеновые мостики между тромбоцитами. В результате происходит быстрое образование рыхлой тромбоцитарной пробки, которая обеспечивает первичный гемостаз, но является нестойкой и может быть разрушена. В связи с этим данную фазу принято называть обратимой агрегацией тромбоцитов. Благодаря лавинообразному нарастанию концентрации агрегатов, обратимая фаза агрегации тромбоцитов переходит в 46 необратимую. В этом существенную роль играет тромбин, образующийся в результате активации плазменных факторов свертывания крови. При разрушении мембран тромбоцитов создаются условия для объединения тромбоцитарных агрегатов и уплотнения полученного сгустка. Этот феномен получил название ретракции кровяного сгустка. Для остановки кровотечения в капиллярах «хватает работы» только первичного гемостаза. За счет низкого тока крови в микроциркуляторном русле достаточно тромбоцитарной пробки. Плазменный гемостаз Тромбоцитарная пробка непрочная и будет разрушаться, если не стабилизируется фибриновым каркасом, особенно в сосудах среднего и крупного калибра. Одновременно с тромбоцитами в процессе гемокоагуляции участвуют факторы свертывания крови (прокоагулянты) – группа белков и ионы кальция, которые в процессе своего взаимодействия приводят к образованию фибрина. Именно фибрин является основой как гемостатического, так и тромботического эффекта. Прокоагулянты обозначаются римскими цифрами: ф.I – фибриноген; ф.II – протромбин; ф.III – тканевой фактор (тромбопластин); ф.IV – ионы кальция; ф.V–VI – проакцелерин-акцелерин; ф.VII – проконвертин; ф.VIII – антигемофильный глобулин; ф.IX – Кристмас-фактор; ф.X – фактор Стюарта; ф.XI – плазменный предшественник тромбопластина; ф.XII – фактор Хагемана; ф.XIII – фибринстабилизирующий фактор. Общепринятым в настоящее время является использование цифрового обозначения прокоагулянтов, кроме тканевого фактора, ионов кальция, фибриногена и протромбина. Кроме указанных факторов в процессе фибринообразования принимают участие прекалликреин, обозначаемый так же как фактор Флетчера, и кининоген высокого молекулярного веса, называемый фактором Фитцжеральда. В основном, прокоагулянты, антикоагулянты и белки системы фибринолиза синтезируются в печени. Факторы ф.II, ф.VII, ф.IX, ф.X зависят от присутствия витамина К, без которого они не могут связываться с фосфолипидной поверхностью. 47 Три фазы коагуляционного гемостаза Первая фаза – образование протромбиназы. Это самая длительная фаза. Она включает взаимодействие целого ряда плазменных факторов, и проходит по двум путям: внутреннему и внешнему. Во внешнем пути участвует меньшее количество факторов. Конечным этапом первой фазы гемокоагуляции по обоим путям является образование активной протромбиназы (рис. 13). При активации по внешнему пути свертывания крови в кровоток поступает ф.III, образующийся в результате разрушения клеток (травмы и операции, ожоги, сепсис, роды и т.д.). Соединение тканевого тромбопластина с ф.VII и ионами кальция приводит к активации протромбиназы. Время, необходимое на образование фибрина при попадании в кровоток тканевого тромбопластина, составляет менее 15 секунд. По внутреннему пути активация более сложная и длительная. ф.XII может активироваться контактной поверхностью (стекло, металл), иммунными комплексами, адреналином, коллагеном, и т.д. Ф.XIIа (активированный) запускает целый каскад активаций, происходящих на фосфолипидных матрицах с участием ионов кальция. В этом каскаде каждый активированный фактор приводит к активации следующего – ф.XI, ф.IX, ф.VIII, ф.V, ф.X. Внутренний путь активации занимает 3–5 минут. Рис. 13. Схема плазменного гемостаза (ресурсы сети Интернет) 48 Вторая фаза – образование тромбина. Эта фаза осуществляется при взаимодействии протромбиназного комплекса с протромбином в присутствии ф.V, ф.VII, когда происходит образование активного фермента – тромбина. Третья фаза – образование фибрина. При взаимодействии тромбина с фибриногеном, когда от последнего отщепляются фрагменты (фибринопептиды А и В), и оставшиеся фрагменты молекулы фибриногена склеиваются между собой в линейную последовательность (растворимые фибрин-мономерные комплексы – РФМК, их нарастание в плазме может свидетельствовать о происходящем процессе образования фибрина). Линейные молекулы соединяются между собой, образуя сетчатую структуру (фибрин-полимерные комплексы или «растворимый» фибрин). Под действием ф.XIII происходит уплотнение сетчатого фибринового сгустка и превращение его в «нерастворимый» фибрин. Одновременно в сгустке оказываются тромбоциты, эритроциты и лейкоциты, вовлекаемые в тромб нитями фибрина. В конечном итоге образуется «красный кровяной» тромб, осуществляющий остановку кровотечений. Далее тромб подвергается фибринолизу, параллельно с этим в стенке сосуда развиваются репаративные процессы, завершающиеся полным восстановлением целостности сосудистой стенки. Антикоагулянтная система Физиологические антикоагулянты инактивируют факторы свертывания. Важную роль играют антитромбин III (AT III), протеины С и S, которые синтезируются в печени и постоянно циркулируют в кровотоке. АТ III является главным антикоагулянтом, поскольку на его долю приходится до 80% всей антикоагулянтной активности плазмы. Инактивация тромбина происходит под влиянием АТ III в комплексе с гепарином (кофактор AT III). AT III обладает способностью ингибировать как тромбин, так и ф.XII, ф.XI, ф.IX, ф.X и ф.VII. В процессе свертывания крови AT III расходуется очень быстро, так как на инактивацию каждой молекулы любого из перечисленных выше факторов свертывания утилизируется по одной молекуле AT III. При снижении AT III до уровня 30–50% и ниже резко возрастает риск тромбозов и тромбоэмболии. Гепарин в отсутствии или при дефиците AT III не оказывает антикоагулянтного действия. Когда тромбин вымывается потоком крови из места образования и контактирует с неповрежденным эндотелием, он нейтрализуется АТ III, связанным с гликопротеинами стенки сосуда, имеющими гепариноподобные структуры. Антикоагулянтные свойства гликопротеинов сосудистой выстилки могут нарушаться активированными нейтрофилами, что является одним из механизмов тромбоза при воспалении и сепсисе. Еще одна группа веществ – антикоагулянтов – система протеинов С и S. Протеин С, его рецептор на эндотелиальных клетках – тромбомодулин, и протеин S инактивируют ф.V и ф.VIII. Если вымываемый из места повреждения тромбин не инактивирован АТ III, то он может связаться с 49 тромбомодулином и активировать протеин С, который расщепляет ф.V и ф.VIII. Протеин С обладает не только антикоагулянтной, но и противовоспалительной активностью – снижает синтез цитокинов, экспрессию адгезивных молекул, предотвращает апоптоз эндотелия. Фибринолиз Фибринолитическая система состоит из профермента плазминогена, ферментов, превращающих плазминоген в активную форму – плазмин (фермент, непосредственно расщепляющий фибрин), и системы ингибиторов, контролирующих как активацию плазминогена, так и процесс лизиса фибрина. После выполнения гемостатической функции и регенерации ткани фибрин должен быть удален для восстановления нормального кровотока. Система фибринолиза расщепляет фибрин на продукты деградации фибрина (ПДФ), которые обозначаются как маркеры постоянно происходящего внутри сосудистого русла процесса свертывания крови различной степени интенсивности. Одним из таких маркеров является D-димер, который дает информацию о формировании в кровяном русле фибрина, укрепленного действием ф.ХIII. Тканевой активатор плазминогена синтезируется эндотелиальными клетками. Активатор плазминогена урокиназного типа синтезируется эндотелиальными клетками, фибробластами, макрофагами, эпителиальными и некоторыми другими клетками. Активация физиологического фибринолиза возможна так же посредством ф.XII. Фибринолиз в норме идет только в тромбах. Процесс начинается сразу же после повреждения сосуда, растворение тромба и реканализация сосуда могут занимать 7–10 сут. Нефизиологическими активаторами плазминогена являются стрептокиназа гемолитического стрептококка и стафилокиназа стафилококка. Эти вещества и их высокоочищенные формы применяются для лечения острых тромбозов. Так же, как и система свертывания крови, система фибринолиза ограничена ингибиторами. А2-антиплазмин, синтезируемый в печени и тромбоцитах, является наиболее мобильным ингибитором фибринолиза. Ингибитор активатора плазминогена 1 образуется в эндотелиоцитах и печени и относится к белкам острой фазы. Ингибитор активатора плазминогена 2 образуется в плаценте и макрофагах. Оценка сосудисто-тромбоцитарного гемостаза Измерение времени кровотечения. Удлинение времени кровотечения говорит о дефекте тромбоцитарного звена гемокоагуляции в результате уменьшения количества тромбоцитов или при дефекте их качественных характеристик – способности к адгезии, агрегации, реакции высвобождения или ретракции кровяного сгустка. При удлинении времени кровотечения необходимо определить количество тромбоцитов в крови. При отсутствии 50 тромбоцитопении следует констатировать тромбоцитопатию и производить специальные исследования функциональной активности тромбоцитов. Метод Дюке (Duke). При этом методе требуется осуществить прокол кожи в мочке уха, так как именно здесь толщина кожи в подавляющем большинстве случаев одинакова. Исключения составляют лица, имевшие рубцевания мочек ушей вследствие нагноений после процедур по формированию отверстий для ношения сережек. Одновременно с проколом кожи включают секундомер, а капельку крови снимают фильтровальной бумажкой сразу же после ее появления. Как только капля крови не появляется, секундомер выключают и фиксируют продолжительность имевшего место кровотечения. Длительность кровотечения по Duke составляет 2–4 минуты. Метод Айви (Ivy) более стандартизирован и широко применяется за рубежом. Манжету от аппарата для измерения АД накладывают на плечо, и поддерживают в ней давление в 40 мм рт.ст. После чего на ладонной поверхности верхней трети предплечья делают скарификатором поперечные насечки глубиной 1,5–2,0 мм, фильтровальной бумагой осторожно снимают капли крови через каждые 15–30 с. В норме через 3–4 мин размер пятна крови на бумаге начинает уменьшаться, и через 6–8 мин истечение крови прекращается (рис. 14). Рис. 14. Метод Ivy (ресурсы сети Интернет) Подсчет количества тромбоцитов. В настоящее время используют определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью гематологических анализаторов. Эти аппараты точны и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин). Развернутый анализ тромбоцитов на анализаторе позволяет определить такие показатели: 9 РLТ – количество тромбоцитов. Норма: 150–400×10 /л. MPV – средний объем тромбоцитов. Норма: 8,6–8,9 фл у детей 1–5 лет; 9,0–9,4 фл у взрослых; 9,5–10,6 фл у людей старше 70 лет. 51 PDV – ширина распределения тромбоцитов по объему отражает степень анизоцитоза тромбоцитов. Норма: 14–18%. РСТ – тромбокрит – доля объема цельной крови, занимаемая тромбоцитами (аналогичен Hct). Норма: 0,15–0,40%. Снижение числа тромбоцитов (<150 Г/л) может наблюдаться при следующих состояниях или терапевтических воздействиях: • острый ДВС-синдром; • острый лейкоз и миелодиспластические синдромы; • гипо- и апластические анемии; • нарушение образования в организме тромбоцитопоэтина; • химиотерапия и лучевая терапия; • тромботическая тромбоцитопеническая пурпура и гемолитикоуремический синдром; • спленомегалия и гепатолиенальный синдром; • эклампсия и преэклампсия; • экстракорпоральное кровообращение; • гемодиализ у больных с хронической почечной недостаточностью; • гемосорбция; • интенсивная трансфузионная терапия; • пароксизмальная ночная гемоглобинурия; • иммунные формы патологии (системная красная волчанка и другие коллагенозы, антифосфолипидный синдром, иммунная тромбоцитопеническая пурпура); • гепарин-индуцированная тромбоцитопения. В случае наличия ЭДТА-зависимой псевдотромбоцитопении (лабораторный феномен) возможно ошибочное определение тромбоцитопении. Повышение числа тромбоцитов (>400 Г/л) наблюдается в случаях: • инфекционных заболеваний, чаще всего бактериальных, реже вирусных, паразитарных и грибковых; • мегакариоцитарные и миелолейкозы; • эритремии; • спленэктомии (через 1–3 недели); • внутриполостных кровоизлияний после оперативных вмешательств; • хронических воспалений (колит, васкулит, ревматоидный артрит и т.д.); • переломов крупных костей (бедренной, плечевой, костей таза); • спустя 7–10 дней от начала подострого токсико-инфекционного ДВС-синдрома; • перенесенного острого кровотечения; • злокачественных новообразований (предвестник опухоли легкого, поджелудочной железы). 52 Исследование функциональных свойств тромбоцитов. Нормальное количество тромбоцитов может не обеспечивать полноценный гемостаз при нарушении их функциональных свойств – тромбоцитопатиях. Поэтому в обязательном порядке исследуют функциональные свойства тромбоцитов, способность к спонтанной и индуцированной различными индукторами агрегации: тромбином, АДФ, коллагеном, ристоцетином, адреналином и т.д. Для исследования функциональных свойств тромбоцитов используют плазму богатую тромбоцитами (рис. 15). Рис. 15. Агрегации тромбоцитов в пробирке (ресурсы сети Интернет) Преимущество имеет графическая регистрация процесса на агрегометре, однако выполнение исследований требует большого количества плазмы. Результаты этих исследований позволяют диагностировать тромбоцитопатии, нозологическая принадлежность которых обусловлена характерным нарушением тех или иных функциональных свойств тромбоцитов или их сочетанием (рис. 16). Рис. 16. Агрегация тромбоцитов под воздействием малых доз АДФ (ресурсы сети Интернет) 53 Повышение агрегационной активности тромбоцитов характерно для: • претромботических состояний; • идиопатического тромбоцитоза; • тромбозов; • инфарктов органов; • атеросклероза; • васкулита; • беременности. Снижение агрегационной активности тромбоцитов наблюдается при первичных и симптоматических тромбоцитопатиях, лечении антиагрегантами (табл. 2, рис. 17). Таблица 2 Агрегаторгамма Показатели агрегации Степень агрегации, % Скорость агрегации, %/мин До начала терапии 77,3 56,4 Через месяц после терапии аспирином 36,8 45,8 Рис. 17. Кривые агрегации тромбоцитов (ресурсы сети Интернет) Методы исследования коагуляционного гемостаза При исследовании коагуляционного (плазменного) гемостаза используют ряд тестов. Нормы для тестов могут менятся в зависимости от фирмыпроизводителя и указываются в бланках ответа. АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время. Принцип метода АЧТВ состоит в определении времени свертывания декальцинированной плазмы после добавления к ней каолин-кефалинкальциевой смеси. АЧТВ оценивает способность формировать фибрин по внутреннему пути коагуляционного гемостаза посредством последовательного взаимодействия ф.XII, ф.XI, ф.IX, ф.VIII, ф.X, ф.V, ф.II, ф.I. Исследование проводят с помощью коагулометра (клоттинговые методы основаны на фиксации времени образования фибриновой нити). 54 Удлинение АЧТВ может быть вызвано: • врожденным (гемофилия) или приобретенным недостатком факторов: ф.XII, ф.XI, ф.VIII, ф.IX, ф.V, ф.X, ф.II, ф.I; • наличием антител к факторам свертывания; • болезнью Виллебранда (более тяжелые формы); • антифосфолипидным синдромом, в том числе и антикоагулянта волчаночного типа; • ДВС II и III фазы; • дисфибриногенемией; • передозировкой кумариновых препаратов; • попаданием гепарина в пробу крови. Укорочение АЧТВ свидетельствует об активации процесса свертывания крови, гиперкоагуляции и опасности возникновения тромбозов (например, при сепсисе, ожогах, обширных раневых поверхностях, беременности, канцероматозе, I фазе ДВС-синдрома). АЧТВ применяют для скрининговой оценки состояния системы гемокоагуляции, в том числе и перед операциями; он обязателен для контроля лечения нефракционированным гепарином. Дозу гепарина подбирают таким образом, чтобы АЧТВ удлинялось в 1,5–2,5 раза, в зависимости от клинических симптомов больного и терапевтической задачи. АЧТВ является основным исследованием для скрининговой оценки функционирования системы гемостаза. ПВ – протромбиновое время. В основе измерения протромбинового времени лежит определение времени формирования фибринового сгустка в исследуемой плазме после добавления к ней тромбопластин-кальциевой смеси. Эта смесь активирует ф.VII и обеспечивает функционирование внешнего каскада формирования фибрина. Исследование проводят с помощью коагулометра. Удлинение протромбинового времени может быть при: • врожденном или приобретенном дефиците факторов: ф.VII, ф.X, ф.V, ф.II, ф.I; • дефиците витамина К; • заболеваниях печени; • терапии антикоагулянтами непрямого действия; • наличии ингибиторов к указанным факторам свертывания крови; • II и III фазах ДВС-синдрома. Протромбиновый тест применяют для оценки состояния системы гемокоагуляции, контроля терапии антикоагулянтами непрямого действия и определения активности ф.VII. Измеряемый в тесте показатель – протромбиновое время может выражаться в секундах или в процентах протромбина по Квику (Quick). Контроль лечения непрямыми антикоагулянтами – антагонистами витамина К необходимо производить определением показателя 55 Международного Нормализованного Отношения (МНО). Показатель МНО было предложено использовать для стандартизации тромбопластина, т.к. он имеет различную чувствительность к недостатку факторов внешнего пути гемокоагуляции (прежде всего ф.VII). Для этого требуется знать международный индекс чувствительности (МИЧ) того образца тромбопластина, с помощью которого выполняют исследование (указывается в тест-системе). МНО рассчитывают по формуле: МНО = (ПВ пациента/ПВ норма)МИЧ Укорочение ПВ свидетельствует об активации процесса свертывания крови, гиперкоагуляции и опасности возникновения тромбозов (например, при сепсисе, ожогах, обширных раневых поверхностях, беременности, канцероматозе, I фазе ДВС-синдрома). ТВ – тромбиновое время. Данный тест, отражающий взаимодействие тромбина с фибриногеном, проводят с помощью коагулометра. При добавлении тромбина к исследуемой плазме измеряют время от момента добавления реагента до образования сгустка. Удлинение тромбинового времени может быть следствием уменьшения количества фибриногена в плазме, нарушения структуры фибриногена (дисфибриногенемия), наличия в плазме гепарина или его фракций, а также при наличии в плазме иных ингибиторов тромбина, в том числе ПДФ или фибриногена. Укорочение тромбинового времени свидетельствует о риске тромбозов. Фибриноген. Наиболее распространенным является метод определения фибриногена по Клауссу (Clauss). Сущность метода заключается во взаимодействии тромбина, добавленного в повышенной концентрации с фибриногеном разведенной плазмы обследуемого (для исключения действия антитромбинов). В этих условиях время реакции образования сгустка зависит только от количества фибриногена. Определение фибриногена по Клауссу осуществляют с помощью коагулометра. Увеличение количества фибриногена наблюдается при острофазовых реакциях (воспаление, инфекции, травмы, ожоги, послеоперационный период); болезнях соединительной ткани; злокачественных новообразованиях. Уменьшение возникает при гиперпотреблении – образовании микросгустков (ДВС, травмы, ожоги, шок, тяжелый токсикоз), действии фибринолитиков; уменьшении синтеза – тяжелые поражения печени. РФМК – растворимые фибрин-мономерные комплексы. При патологиях, характеризующихся активацией свертывания крови, происходит расширение пула фибриногена, в результате чего увеличивается количество РФМК. Они образуются в крови в результате воздействия тромбина на фибриноген. Определение РФМК производят с помощью ортофенантролинового теста. 56 Повышение содержания РФМК наблюдается при: • активации внутрисосудистого свертывания крови (тромбофилии, ДВС-синдром, тромбоз глубоких вен, эмболии легочной артерии); • лечении антикоагулянтами; • физическом и психологическом стрессе; • нормально протекающей беременности; • в период новорожденности. Определение фибринолитической активности крови. D-димер. Определения D-димера позволяет помочь в дифференциальной диагностике тромбоэмболизма в трудных диагностических случаях при малой и средней клинической вероятности тромбоза глубоких вен и/или тромбоэмболии легочной артерии. Отсутствие повышения D-димера дает возможность исключать эти заболевания. Определение D-димера совместно с оценкой клинической картины позволяет почти на 30% снизить назначение сложных и дорогостоящих инструментальных обследований больного. Оценка уровня D-димера в качестве показателя эффективности антитромботической терапии в настоящее время находится в стадии изучения. Следует иметь в виду, что у больных со старыми структурированными тромбами уровень D-димера может быть в пределах нормы. В связи с этим для принятия решения о дальнейшей тактике лечения больного результаты определения данного теста должны сопоставляться с оценкой клинической картины и данными визуализации. Лабораторное мониторирование терапии антикоагулянтами Препараты, понижающие свертываемость крови, представлены следующими группами: 1. Дезагреганты (аспирин, плавикс и др.). 2. Антикоагулянты: • прямые – нефракционный гепарин (НФГ), низкомолекулярные гепарины (НМГ); • непрямые – антикоагулянты непрямого действия (АНД). Дезагреганты – препараты, ингибирующие агрегацию тромбоцитов, следовательно, в процессе их применения необходим контроль функции тромбоцитов на агрегометре. Точкой приложения НФГ является инактивация ф.IIa, контроль его применения осуществляется при помощи АЧТВ. Кроме этого, есть возможность отследить конечный итог применения высокомолекулярного гепарина определением РФМК, как маркера тромбинемии. При удлиннении АЧТВ, но при высоких цифрах РФМК риск тромбообразования остается. Гепарин может вызывать тромбоцитопению, поэтому обязателен контроль количества тромбоцитов. НМГ в терапевтических дозах не влияют на значение АЧТВ, и в этом случае для контроля достаточности антикоагулянтной терапии следует использовать определение концентрации РФМК и анти-ф.Xa. 57 Принцип действия непрямых антикоагулянтов заключается в угнетении синтеза витамина К. Основным и единственным достоверным методом оценки применения непрямых антикоагулянтов является измерение ПВ с последующим расчетом МНО. При подборе дозы антикоагулянтов ориентируются на терапевтические пределы МНО 2,0–3,0. Как правило, наиболее оптимальным значением при терапии считается МНО=2,3–2,4. Но это определяется состоянием пациента. При назначении непрямых антикоагулянтов необходимо соблюдать специфическую диету, исключающую продукты, содержащие витамин К (например, зеленый чай, шпинат, яйца и т.д.). Стабилизация МНО происходит в течение 6 недель от начала приема препарата. Необходимая частота определения МНО по протромбиновому тесту: в начале лечения ежедневно с показателем АЧТВ; при стабильном уровне МНО еженедельно, затем ежемесячно. Важной задачей лабораторной диагностики системы гемостаза является распознание ДВС-синдрома, для которого характерно фазность изменений лабораторных показателей. В фазу гиперкоагуляции – АЧТВ укорочено, а РФМК высокие, в переходную фазу – АЧТВ начинает удлиняться или нормализоваться, а РФМК остаются высокими, в фазу гипокоагуляции – АЧТВ удлинено, а РФМК ниже нормы. Главными тестами при исследовании ДВС-синдрома являются: количество тромбоцитов в крови, РФМК, D-димеры, активность АТ III. При этом выявляется чаще тромбоцитопения, повышение РФМК и D-димеров, активность АТ III менее 70%. ЛАБОРАТОРНАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ Клинический анализ крови – один из самых распространенных и важных лабораторных анализов. Изменения в этом анализе отражают процессы, происходящие в организме в ответ на воздействие физиологических и патологических факторов, но они не всегда специфичны. Как известно, одним из важнейших физиологических свойств крови является реактивность – способность отвечать на изменения, происшедшие в организме, изменением своего качественного и количественного состава. Поэтому анализ результатов гематологического исследования крови характеризует физиологическое состояние организма в данный момент и составляет неотъемлемое звено в диагностическом процессе и последующем мониторинге на фоне проводимой терапии. Клинический анализ крови широко используется как первичный метод обследования при обращении к специалистам любого профиля, для диспансеризации и контроля проводимого лечения. Особое значение анализ крови имеет при диагностике анемий и системных заболеваний крови. В качестве антикоагулянта в вакуумных пробирках для гематологических исследований цельной крови используют калиевую или натриевую соли ЭДТА. Антикоагулянт ЭДТА наносят распылением на внутреннюю поверхность 58 пластиковых пробирок. Для обеспечения правильного соотношения кровь/антикоагулянт пробирка с ЭДТА должна быть заполнена точно до указанного объема. Недостаток ЭДТА в пробе приводит к ее коагуляции, а избыточная концентрация ведет к сморщиванию клеток крови и искажению таких клинических показателей, как гематокрит, размер клеток и т.д. Сразу после взятия крови в вакуумную пробирку с ЭДТА ее необходимо тщательно перемешать, переворачивая 8–10 раз. Гематологический анализатор Клинический анализ крови, выполненный с помощью гематологического анализатора, позволяет оценивать состояние эритропоэза, а также функции эритроцитов периферической крови для характеристики процессов тканевого дыхания и дифференциальной диагностики анемических синдромов. Лейкоцитарный состав крови, физиологическое состояние ядерных клеток, свойства их мембран характеризуют функциональную активность неспецифического звена иммунитета и отражают ход воспалительного процесса. Существует четыре типа гематологических анализаторов крови, заточенных под конкретный вид исследований, на которых специфицируется лаборатория: 1. Первый тип. Анализирует до восьми показателей, не проводя деление лейкоцитов на субпопуляции. 2. Второй тип (3-DIFF). Анализирует среднее количество показателей (до двадцати) и имеет аппаратную возможность разделения лейкоцитов на три субпопуляции. 3. Третий тип (5-DIFF). Работает с максимальной цифрой в 28 показателей и способен делить лейкоциты на пять популяций. 4. Четвертый тип. Способен обрабатывать до 40 показателей и работать с дифференцировкой ретикулоцитов, что обеспечивается подключением расширительного модуля. Главный принцип работы гематологического анализатора – кондуктометрический – основан на оценке объема клеток. Этот метод базируется на эффекте изменения электрического сопротивления микроотверстия (трансдьюсера, апертуры) при прохождении через него клетки крови. Величина изменения сопротивления пропорциональна объему клетки. Это позволяет различать тромбоциты и эритроциты при их одновременном подсчете. Для подсчета лейкоцитов предварительно производится лизис эритроцитов. Устройство трансдьюсера во всех современных гематологических анализаторах практически одинаковое. Концентрация клеток определяется как отношение числа подсчитанных клеток к объему разведения пробы, которое прошло через трасдьюсер. Клетка крови во взвешенном растворе движется и проходит через отверстие. Сопротивление между электродами возрастает и вызывает увеличение напряжения. Амплитуда импульсов напряжения, измеряемая в десятых долях 59 микровольта, пропорциональна объему клетки. Усиление импульса происходит за счет малошумных усилителей, которые не допускают изменения формы импульса. На выходе расположен конденсатор, пропускающий импульсы с интервалом 50 мс. Промежуток соответствует времени прохождения одной клетки через отверстие (рис. 18). Импульсы поступают в реальном времени, обрабатываются и анализируются микропроцессором. В результате получают гистограммы распределения трех типов клеток: тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов. Рис. 18. Принцип работы гематологического анализатора (ресурсы сети Интернет) Каждый гематологический анализатор предназначен для определенной реагентной системы. Основные ее компоненты: • лизирующий раствор; • изотонический разбавитель; • промывающий раствор для обработки после пробы; • раствор для глубокой очистки. После ввода пробы крови в анализатор внутри прибора выполняется ряд процедур. На первом этапе осуществляется приготовление двух разведений введенной пробы крови: первое разведение – для подсчета концентрации лейкоцитов (в нем же после лизиса эритроцитов подсчитывается концентрация гемоглобина), и второе разведение – для подсчета концентрации эритроцитов и тромбоцитов. Первое разведение крови получается путем дозирования цельной крови (обычно 10–20 мкл) и изотонического разбавителя (5–10 мл) с последующим добавлением лизирующего раствора, который разрушает эритроциты и преобразует все формы гемоглобина к одной форме. Второе разведение крови получается путем дозирования первого разведения крови 60 (обычно 50–100 мкл) (до того, как в него добавляют лизирующий раствор) и изотонического разбавителя (5–10 мл). На втором этапе анализатор определяет концентрации клеток крови в приготовленных разведениях, анализирует индивидуальные характеристики клеток крови: объем, свойства пропускания и рассеяния света; измеряет концентрацию производной формы гемоглобина. Для этого часть первого разведения крови по магистралям анализатора поступает в специальное устройство, которое подсчитывает лейкоциты, другая часть первого разведения поступает в проточную кювету гемоглобинометра, а второе разведение крови поступает в устройство, которое подсчитывает эритроциты и тромбоциты. Для расчета концентраций клеток при их подсчете измеряется объем разведения крови, прошедшего через устройство подсчета клеток. На третьем этапе прибор выполняет комплекс вычислений, в результате которых получаются конечные данные анализа, после чего выводит на дисплей и на печать эти данные. Оценка эритроцитарного звена Оценка эритроцитарных индексов позволяет получить представление о характеристиках эритроцитов, что очень важно для дифференциальной диагностики анемии. Эритроцитарные индексы зачастую быстро реагируют на лечение анемий, и могут также использоваться для оценки эффективности терапии. Результат анализа представляется пользователю в виде протокола (табл. 3). Помимо паспортных данных в протоколе указаны полученные результаты с аббревиатурой показателей и графические изображения гистограмм. Увеличение количества эритроцитов может иметь реактивный (вторичный, симптоматический) генез. Чаще всего он развивается вследствие гиперпродукции эритропоэтина в ответ на тканевую гипоксию, причины которой могут быть самые различные. Такие эритроцитозы могут быть транзиторными и сопровождаются невысоким ретикулоцитозом. Гематокрит относится к эритроцитарным параметрам и отражает отношение объема эритроцитов к объему плазмы. Показатель позволяет оценивать реологические свойства крови и интерпретировать колебания объема циркулирующей крови (ОЦК). MCV. Показатель MCV имеет диагностическое значение при оценке микро-, нормо- и макроцитоза. MCV <75 фл свидетельствует о микроцитозе (железодефицитная анемия (ЖДА), сидеробластные анемии, талассемия, анемии при хронических заболеваниях и злокачественных опухолях, системные заболевания, гемобластозы). MCV в пределах 75–95 фл при анемиях свидетельствует о нормоцитарном характере анемии (ранние стадии ЖДА, острые постгеморрагические анемии, гемолитические анемии, анемии при гемобластозах и метастазировании опухолей в костный мозг, анемии хронических заболеваний). 61 MCV >95 фл свидетельствует о макроцитозе эритроцитов. Среди макроцитарных анемий наибольшую группу составляют фолиево- и В12дефицитные анемии. Макроцитоз может наблюдаться при аутоиммунных гемолитических анемиях, апластических анемиях, остром эритромиелозе, хронических миелопролиферативных лейкозах (ХМЛ) и на фоне лечения цитостатическими препаратами. Таблица 3 Измеряемые параметры красной крови Показатель HGB (Hemoglobin) – концентрация гемоглобина RBC (Red Blood Cells) – эритроциты MCV (Mean Corpuscular Volume) – средний объем эритроцитов HCT (Hematocrit) – гематокрит МСН (Mean Corpuscular Hemoglobin) – среднее содержание гемоглобина в эритроците МСНС (Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration) – средняя концентрация гемоглобина в эритроците RDW-CV (Red cell Distribution Width) – ширина распределения эритроцитов по объему Единицы измерения Метод определения Норма г/л Фотометрический 117–173 1012/л или Т/л Кондуктометрический 3,7–5,1 фл Кондуктометрический 75–95 % HCT=RBC×MCV/10 36–48 пг MCH=HGB/RBC 26–34 г/л MCHC=HGB×10/HCT 320–380 % Кондуктометрический 12–15 Макроцитоз эритроцитов без анемии может наблюдаться при диффузном поражении печени, алкоголизме, у лиц после спленэктомии, понижении функции щитовидной железы. В то же время необходимо иметь в виду что MCV – средний показатель объема всей популяции эритроцитов, может иметь нормальное значение при наличии у пациента, одновременно выраженного макро- и микроцитоза, большом количестве аномальных эритроцитов (например, при серповидноклеточной анемии, микросфероцитозе, наличии шистоцитов, выраженном пойкилоцитозе). 62 Для оценки анизоцитоза и представления о размерах эритроцитов в популяции используют три показателя: MCV, RDW и гистограмму распределения эритроцитов по ширине. Распределение всех эритроцитов по ширине в абсолютных числах отображается на гистограмме (рис. 19). Кривая распределения в норме – мономодальная и отражает превалирование нормальных эритроцитов при небольшом присутствии макро- и микроцитов. Рис. 19. Эритроцитарная гистограмма в норме (фото кафедры трансплантологии и клинической лабораторной диагностики ГОО ВПО ДОННМУ ИМ.М.ГОРЬКОГО) Деформация кривой отражает наличие или преобладание клеток иного размера. Например, появление второй моды в области макроцитов, как правило, является признаком предшествующей кровопотери и последующей за ней массивной регенерации клеток более крупного размера (ретикулоцитов) (рис. 20). Рис. 20. Бимодальная эритроцитарная гистограмма при появлении ретикулоцитов после кровопотери (фото кафедры трансплантологии и клинической лабораторной диагностики ГОО ВПО ДОННМУ ИМ.М.ГОРЬКОГО) Физиологический анизоцитоз обеспечивается постоянным изменением размера клетки в течение жизни. Молодые клетки, поступающие в периферический кровоток, иногда достигают 10 мкм (в том числе, ретикулоциты). В течение жизни эритроцита происходит необратимое уменьшение его поверхности (до 6 мкм) в результате процесса микровезикуляции. Поврежденный участок мембраны выпячивается наружу в виде микровезикулы и слущивается. Поэтому о «возрасте» клетки можно судить по диаметру (степени его уменьшения). У каждого конкретного пациента при отсутствии патологии со стороны кроветворения MCV является довольно стабильным показателем. Изменения 63 MCV могут дать полезную информацию о различных нарушениях в организме как связанных непосредственно с эритроцитами, так и общего характера. Например, активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) при различных патологических состояниях приводит к увеличению очагов поврежденной мембраны и усилению процессов микровезикуляции. Также микроцитоз описан при хроническом вирусоносительстве. В то же время, изменение MCV может быть отражением сдвига водно-электролитного баланса. Повышенное значение MCV свидетельствует о гипотоническом характере нарушений водно-электролитного баланса, тогда как понижение – о гипертоническом характере. Информативным показателем анизоцитоза эритроцитов считается RDW-CV. Гематологическим анализатором анизоцитоз улавливается значительно быстрее, чем при визуальном просмотре мазка крови. Норма RDW-CV свидетельствует о наличии в данной пробе гомогенной по объему популяции эритроцитов (макро-, микро - или нормоцитов). Повышение RDW-CV >15% указывает на присутствие в пробе гетерогенных клеток (анизоцитоз смешанного характера). RDW-CV необходимо оценивать только параллельно с анализом гистограммы эритроцитов и оценкой морфологии эритроцитов в мазках крови. В большинстве случаев небольшое снижение этого показателя считается нормой. Анализатор может показывать либо нормальное значение RDW-CV, либо повышенное. Если же показатель снижен значительно, необходимо провести дополнительное исследование, чтобы выяснить причину, т.к. такие результаты свидетельствуют о неправильной работе анализатора. RDW-CV – важный дополнительный критерий для диагностики анемий и динамического наблюдения за результатами лечения. Увеличение процента неоднородных эритроцитов рассматривается как ранний признак анемии, когда другие морфологические изменения в эритроцитах еще не наблюдаются. Показатель также может быть полезен для контроля эффективности гемотерапии при железодефицитной или мегалобластной анемии. По мере образования новых, нормальных по размеру, эритроцитов RDW сначала повышается, но затем снижается, когда клетки нормальных размеров составляют большинство. МСН отражает абсолютное содержание гемоглобина в эритроците. По клиническому значению этот показатель аналогичен цветовому показателю (ЦП), но МСН является более объективным параметром, отражающим абсолютное содержание гемоглобина в эритроците. ЦП – величина относительная и является отношением количества гемоглобина в одном эритроците пациента к нормальному его содержанию (принятому равным 33,3). Таким образом, чтобы перейти от значения MCH к ЦП (более привычному), достаточно разделить MCH на 33,3. MCH является важным показателем в дифференциальной диагностике анемий в зависимости от которого анемии разделяют: 64 • Нормохромные (MCH=26–34 пг) – апластические анемии, анемии при лейкозах, миелодиспластическом синдроме (МДС), анемии при заболеваниях почек, эндокринных нарушениях, белковой недостаточности. • Гипохромные (MCH <26 пг) – ЖДА, талассемии, сидеробластные анемии, анемии при злокачественных опухолях, хронических инфекциях, системных заболеваниях. Гипохромия может сочетаться как с уменьшением объема эритроцитов, так и наблюдаться при нормо- и макроцитозе. • Гиперхромные (MCH >34 пг) – мегалобластные анемии (В12- и фолиеводефицитные), анемии при лейкозах (ХМЛ, острый эритромиелоз), тяжелые гемолитические анемии, лечение цитостатиками. Необходимо помнить, что снижение или повышение MCH не всегда свидетельствует о гипо- или гиперхромии эритроцитов. Например, при макроцитарных гипохромных анемиях MCH может быть в пределах нормы, а при микроцитарной анемии среднее содержание гемоглобина в эритроцитах будет снижено не за счет гипохромии, а вследствие уменьшения объема эритроцитов. В этом случае большое значение имеет правильная характеристика морфологии эритроцитов в мазках крови. MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроците. МСНС не зависит от клеточного объема, является чувствительным показателем нарушения процессов гемоглобинообразования. MCHC – стабильный, генетически детерминированный показатель (константная величина). Насыщение более 380 г/л не бывает, т.к. это может закончиться кристаллизацией гемоглобина и гемолизом эритроцита. Этот показатель может быть использован как индикатор ошибки прибора или ошибки, допущенной при подготовке прибора к работе. Любая неточность, связанная с определением гемоглобина, гематокрита, среднего объема эритроцитов приводит к увеличению MCHC. Повышение MCHC наблюдается крайне редко и встречается при наследственной микросфероцитарной гемолитической анемии. Снижение MCHC ниже 320 г/л наблюдается при заболеваниях, связанных с нарушением синтеза гемоглобина: ЖДА, сидеробластные анемии, талассемия, полиэтиологические микроцитарно-гипохромные анемии, некоторые гемоглобинопатии, а также макроцитарные и особенно мегалоцитарные анемии, при которых наблюдается непропорционально большое увеличение объема эритроцита по сравнению с увеличением насыщения его гемоглобином; синтез гемоглобина в эритрокариоците. Подобное состояние обусловлено патологиями, при которых происходит нарушение процессов производства железосодержащего белка. Необходимо подчеркнуть, что важным шагом при назначении препаратов железа является оценка не только указанных индексов, но и состоятельности гемоглобиновой цепочки у пациента по анализу количества трансферрина, рецепторов к трансферрину и ферритина. 65 Железо проникает в клетку вместе с трансферрином за счет рецепторопосредованного эндоцитоза (при участии рецепторов к трансферрину СD-71). В условиях низкого рН железо высвобождается и соединяется с протопорфирином, который синтезируется главным образом в митохондриях из глицина и сукцинил-КоА, образуя гем. Регулятором синтеза гема из железа является ферритин. Глобин синтезируется в клетке на рибосомах. Молекула гема и одна из цепей глобина составляют субъединицу гемоглобина; четыре субъединицы образуют молекулу гемоглобина. Лишенный железа трансферрин (апотрансферрин) возвращается в плазму, а рецептор трансферрина – в клеточную мембрану. При нарушении синтеза гема вследствие дефицита железа или других причин развивается гипохромная анемия. Гемоглобин. В анализаторе концентрацию гемоглобина оценивают с помощью встроенного спектрофотометра. Основными источниками ошибок в определении концентрации гемоглобина является повышенная мутность сыворотки при гиперлипидемии, гипербилирубинемии, криоглобулинемии, присутствии нестабильных гемоглобинов. Так, например, при генетическом нарушении гемоглобиновой цепочки у пациентов с талассемией, железо, не соединенное с трансферрином, и свободный гемоглобин, циркулирующий в плазме, могут ускорять атерогенез. Механизм этого процесса сейчас интенсивно изучается, но уже выявлено, что свободные атомы железа индуцируют эндотелиальные активаторы и вызывают сосудистую адгезию молекул и эндотелиальных воспалительных хемокинов. Современные тенденции анализа клеток периферической крови направлены на изучение гемодинамики в микроциркуляторном русле. Как ключевое звено микроциркуляции активно обсуждается фильтрационная способность эритроцитов, в основном определяющаяся свойствами клеточной мембраны и способностью эритроцита к деформации при прохождении по капилляру, имеющему диаметр меньший, чем сам эритроцит. Активно обсуждаются факторы и механизмы, которые снижают способность эритроцитов к деформации, изменяют вязкостно-эластические свойства их мембраны и лишают клетки энергии. В свою очередь, даже при нормальном количестве эритроцитов и их параметров, возникают застойные явления в микроциркуляторном русле и как следствие – тканевая гипоксия с выраженными изменениями гомеостаза и гемодинамики. Необходимо помнить, что одним из основных метаболических процессов, протекающих в эритроцитах, является гликолиз с целью получения аденозинтрифосфата (АТФ). Глюкоза – главный источник энергии для жизнедеятельности эритроцита. Прекращение гликолиза приводит эритроцит к «метаболической смерти» – гемолизу. Нарушение углеводного обмена и гликолиза в эритроците лишают клетку энергии, т.е. изменяют вязкостноэластические свойства ее мембраны и снижают способность эритроцитов к деформации. 66 Оценка лейкоцитарного звена При интерпретации результатов анализа белой крови необходимо помнить, что свою деятельность лейкоциты осуществляют в ткани, т.е. выйдя из кровеносного русла в окружающую соединительную ткань. В кровеносном русле они практически не проявляют свою активность. Подсчет лейкоцитов выполняют из венозной крови, т.е. учитывают клетки, которые в этот момент находились в кровеносном сосуде. В норме, при отсутствии воспаления, можно наблюдать равномерную миграцию, и интерпретировать состав и количество лейкоцитов. При патологическом состоянии картина периферической крови изменяется и зависит от потребностей тканей (гипоксия, гиперонкия, гиперосмия, изменение кислотно-щелочного равновесия), в которые распределяются лейкоциты. Это необходимо учитывать, прежде всего, интерпретируя общее количество клеток белой крови. Костный мозг запасает резерв лейкоцитов, а в кровеносное русло выходит лишь 10% зрелых клеток. Лейкоциты находятся в крови 3–4 часа, а затем необратимо уходят из нее и продолжают свою жизнедеятельность в ткани около 8–10 суток. При наличии инфекционного очага ситуация с количеством циркулирующих лейкоцитов резко изменяется. В самое короткое время в кровоток выбрасывается костномозговой резерв. За счет этого в кровеносном русле наблюдается лейкоцитоз. Маргинальный пул исчезает, и все клетки уже в составе циркулирующего пула направляются в область очага воспаления, движимые хемотаксисом. Регуляторами этого процесса являются хемокины, которые вырабатываются макрофагами ткани, а также непосредственно антигеном и продуктами его деятельности. Важным индуктором выхода клеток в ткань является снижение рН среды. Считается, что поврежденные антигеном (бактерией) мембраны клеток, выделяя арахидоновую кислоту и провоспалительные цитокины, приводят к окислению среды очага воспаления, что и является одним из факторов, определяющим поступление сюда лейкоцитов. Появление в кровотоке незрелых форм нейтрофилов (палочкоядерных или даже юных) свидетельствует об истощении резерва зрелых клеток и выходе из костного мозга менее дифференцированных при высокой активности антигена. Чем активнее и острее бактериальная инфекция, тем больше потребность организма в нейтрофилах и более выражен сдвиг лейкоцитарной формулы влево. Лейкоцитарная формула крови отражает процентное отношение различных типов лейкоцитов к их общему числу, что принимается за 100%. Согласно принятым методическим условиям, врач-лаборант визуально дифференцирует ядерные клетки в мазке и считает их абсолютное количество в расчете на 100 ядерных единиц. 67 В основу этого методического подхода положено различие типов лейкоцитов по их морфологическим признакам: наличие или отсутствие гранул, форма ядра, ядерно-цитоплазаматическое соотношение и состав гранул. Наиболее многочисленным типом клеток белой крови являются нейтрофилы. На их долю приходится до 70% всех ядерных клеток. Одно из названий нейтрофилов – «микрофагоциты» – указывает на их способность фагоцитировать микроорганизмы, но в меньших количествах, чем это делают макрофаги. Особую активность нейтрофилы проявляют по отношению именно к бактериям. При воспалении бактериальной этиологии процентное содержание нейтрофилов в лейкоцитарной формуле увеличивается. Нейтрофилез – это увеличение числа нейтрофилов более 6×10 9/л. Реже нейтрофилез бывает проявлением ХМЛ, сопровождается специфическими для него клиническими и гематологическими особенностями (увеличение селезенки, лимфоузлов, омоложение крови, анемия, гипертромбоцитоз, гиперплазия костного мозга, наличие Рh-хромосомы и химерного гена c-abl-bcr). Нейтрофильный лейкоцитоз может сопровождать любое воспаление, бактериальные, грибковые и паразитарные инфекции, некротические изменения тканей, гипоксемию, интоксикацию и опухоли различной локализации. При длительном воздействии факторов, индуцирующих нейтрофилез, происходит истощение костномозгового гранулоцитарного резерва, и в кровь начинают выходить молодые клетки нейтрофильного ряда (палочкоядерные, метамиелоциты и миелоциты). Такое состояние крови носит название лейкемоидной реакции миелоидного типа. Иногда возникает необходимость проведения дифференциального диагноза между такой реакцией и начальной формой ХМЛ. Отсутствие анемии, гипертромбоцитоза и высокое содержание щелочной фосфатазы в нейтрофилах характерно для лейкемоидной реакции. Нейтропения – это снижение числа нейтрофилов менее 1,6×10 9/л. Нейтропении могут быть первичными (врожденными и приобретенными), связанными с болезнями крови (острый лейкоз, аплазия кроветворения, циклическая нейтропения), и вторичными, сопровождающими заболевания, в процессе которых происходит разрушение нейтрофилов. К вторичным, реактивным нейтропениям, относятся иммунные и нейтропении при тяжелых инфекциях. Нейтропения при сепсисе сопровождается обычно омоложением лейкоцитарной формулы и является плохим прогностическим симптомом, свидетельствующим об истощении кроветворения. Но ~ 4% людей имеют нормальный состав крови с пониженным содержанием нейтрофилов. Эта особенность связана с генетически детерминированым быстрым перемещением нейтрофилов в ткани, где они и осуществляют присущие им защитные функции. Люди с таким составом крови обычно меньше подвержены интеркуррентным инфекциям, быстрее выздоравливают от них. Однако нередко такие пациенты, к сожалению, 68 являются предметом пристального внимания врачей, подвергаются множеству ненужных инвазивных исследований, у них развивается ятрогенная патология. Таким образом, нейтропения, не сопровождающаяся другими изменениями крови и какими-либо клиническими симптомами, не требует немедленного вмешательства. Такие пациенты нуждаются в динамическом наблюдении. Отдельно хочется коснуться перераспределительных нейтрофилезов и нейтропений. Циркуляция нейтрофилов имеет свои особенности: половина клеток циркулирует с кровью (эти клетки и подлежат подсчету), в то время как другая половина находится в «краевом стоянии» у стенок сосудов. Раздражение симпатической системы увеличивает число циркулирующих клеток, а парасимпатической системы – уменьшает их число. Отсюда, стрессовые состояния способствуют преходящему нейтрофилезу (например, нейтрофилез у маленьких детей при крике), а ваготония – нейтропении. Рассматривая механизмы повреждения бактерий нейтрофилами, выделяют два способа: бескислородный и кислородный. Бескислородный способ реализуется посредством содержимого гранул нейтрофила при их внутриклеточной и внеклеточной дегрануляции. Содержащийся в большом количестве в гранулах лизоцим повреждает стенку бактерии, вызывая гибель микроорганизма. Лактоферрин обеспечивает бактериостатический эффект путем склеивания бактерий между собой, лишая способности делиться. Щелочная фосфатаза – мощный лизирующий фермент. Кислородный механизм повреждения бактерий (киллинг) в нейтрофиле является достаточно мощным оружием против большинства бактерий. Фагосома с антигеном сливается с первичной гранулой (пероксидазпозитивной), в присутствии свободных радикалов и внутриклеточного кислорода происходит мощная окислительная реакция, т.н. «взрыв» (кислородный, дыхательный, респираторный). В результате чего бактерия подвергается неспецифическому разрушению. Гранулы, содержащие миелопероксидазу, характерны для клеток нейтрофильного ряда. Эозинофилы – это клетки, фагоцитирующие комплексы антиген– антитело. Они отвечают на хемотаксические факторы, выделяемые тучными клетками и базофилами. При аллергических реакциях в крови находится много IgЕ, он «связывается» с мембраной базофилов, способствуя их дегрануляции (то есть выходу из клеток гистамина). Эозинофилия – это увеличение числа эозинофилов выше 0,4×109/л. Повышенный выброс эозинофилов в кровь происходит под действием интерлейкинов (ИЛ-4 и ИЛ-5), образующихся в большом количестве в процессе иммунологического повреждения тканей. В последнее время доказан киллерный эффект, обеспечивающийся катионным белком гранул эозинофилов, при некоторых гельминтозах и паразитарных инфекциях. Базофилы – это клетки, выделяющие гистамин и гепарин. Они также участвуют в регуляции проницаемости сосудистой стенки при воспалительных и аллергических реакциях. Выделяющийся из гранул гепарин 69 уменьшает вязкость крови и способствует притоку новых лейкоцитов в очаг воспаления. Главная функция базофилов заключается в участии в реакциях гиперчувствительности немедленного типа. В периферической крови клетки неактивны. Выйдя из кровотока, в соединительной ткани они обретают активность в виде тучных клеток. Количество базофилов в крови 0,02–0,09×109/л. Моноциты – клетки, относящиеся к системе фагоцитирующих мононуклеаров. Циркулируют в крови от 36 до 104 ч, а затем мигрируют в ткани. Внесосудистый пул моноцитов в 25 раз превышает циркулирующий. Их значение в ткани достаточно велико. Система мононуклеарных фагоцитов является центральной, объединяющей различные типы клеток, участвующих в защитных реакциях организма. Макрофагам принадлежит важнейшая роль в процессах фагоцитоза. Фагоцитируя антиген, макрофаг переводит антиген из корпускулярной формы в молекулярную и распознает его свойства. Далее, экспрессируя на своей поверхности сигнальные рецепторы, осуществляет антигенпрезентацию для вовлечения других иммунокомпетентных клеток в реакции защиты организма. Они удаляют из организма отмирающие клетки, остатки разрушенных клеток, денатурированный белок, бактерии и комплексы антиген–антитело. Не менее важной функцией макрофагов ткани является секреция провоспалительных цитокинов и ряда регуляторных молекул, которые обеспечивают течение иммунных реакций. Макрофаги участвуют в регуляции кроветворения, иммунном ответе, гемостазе, метаболизме липидов и железа. Нельзя не отметить важную функцию макрофагов в ткани – «поедание» живых и мертвых микрорганизмов, комплексов антиген–антитело (образуются в процессе борьбы с вирусами, бактериями и их токсинами), погибших клеток самого организма, за что эти клетки нередко называют «дворниками» ткани. В этой связи можно отметить увеличение моноцитов в периферической крови, как предшественников макрофагов, после перенесенных затяжных инфекций, системных заболеваний соединительной ткани и гранулем. Моноцитоз – количество моноцитов в крови выше 0,8×10 9/л. При туберкулезе появление моноцитоза считается доказательством активного распространения туберкулезного процесса. При этом важным показателем является отношение абсолютного числа моноцитов к лимфоцитам, которое в норме составляет 0,3–1,0. Это отношение бывает более 1,0 в активную фазу заболевания и снижается при выздоровлении, что позволяет оценить течение туберкулеза. При септических эндокардитах, вялотекущем сепсисе возможен значительный моноцитоз, который нередко встречается в отсутствие лейкоцитоза. Моноцитоз отмечается у 50% больных с системными васкулитами. Кратковременный моноцитоз может развиться у больных с острыми инфекциями в период реконвалесценции. Моноцитопения – уменьшение числа моноцитов (<0,09×109/л). 70 При гипоплазии кроветворения количество моноцитов в крови снижено. Лимфоциты активно участвуют в многочисленных иммунных реакциях, обеспечивая нормальное функционирование общего и местного иммунитета – обнаружение, распознавание и разрушение антигенов, синтез антител и многое другое. Лимфоцитоз – увеличение числа лимфоцитов более 4,0×10 9/л. Лимфоциты и молекулярные компоненты их взаимодействия являются элементами патогенеза иммунодефицитных состояний, инфекционных, аллергических, лимфопролиферативных, онкологических заболеваний, трансплантационных конфликтов, а также аутоиммунных процессов. При перечисленных процессах количество лимфоцитов в крови может существенно меняться. В результате адекватного ответа на антигенную стимуляцию происходит увеличение количества лимфоцитов – лимфоцитоз, при неадекватном ответе количество лимфоцитов может снижаться – лимфопения. Лимфоцитоз характерен для многих инфекций, прежде всего инфекций вирусных. В клинической практике он встречается при лейкемоидных реакциях лимфатического типа, когда картина крови напоминает таковую при остром или хроническом лейкозе. Лейкемоидные реакции лимфатического типа фиксируют наиболее часто при инфекционном мононуклеозе, но иногда они возникают при туберкулезе, сифилисе, бруцеллезе. Картина крови при остром инфекционном мононуклеозе – вирусной инфекции, возникающей чаще у детей, характеризуется высоким лейкоцитозом за счет лимфоцитов. Лимфоциты при инфекционном мононуклеозе приобретают морфологическое разнообразие. В крови появляется большое количество атипичных лимфоцитов, характеризующихся дисплазией ядра и увеличением цитоплазмы и приобретающих сходство с моноцитами. Абсолютная лимфопения – количество лимфоцитов <1,0×10 9/л – наблюдается при острых инфекциях и заболеваниях. Возникновение лимфопении характерно для начальной стадии инфекционно-токсического процесса и связано с миграцией лимфоцитов из сосудов в ткани к очагам воспаления. Лимфоциты являются источниками иммуноглобулинов. Среди злокачественных лимфопролиферативных заболеваний с высоким лимфоцитозом чаще всего встречается хронический лимфолейкоз – заболевание людей старше 45 лет. Отличительной особенностью этого лимфоцитоза является его моноклоновый характер и В-клеточное происхождение. Вторичные, реактивные лимфоцитозы, носящие поликлоновый характер, сопровождают многие вирусные инфекции, некоторые воспалительные и иммунокомплексные болезни: 1. Инфекционный мононуклеоз (атипичные мононуклеары, характерная клиника). 2. Инфекционный лимфоцитоз (эпидемическая форма у маленьких детей). 71 3. Цитомегаловирусная инфекция (атипичные мононуклеары, характерная клиника). 4. Детские инфекции: коклюш, ветрянка, продрома скарлатины. 5. Другие вирусные инфекции: краснуха, гепатит, некоторые респираторные аденовирусные инфекции в стадии реконвалесценции. 6. Воспалительные и иммунокомплексные болезни: тиреотоксикоз, язвенный колит, болезнь Крона, васкулиты. Лимфоцитопения – снижение числа лимфоцитов ниже 1,2×10 9/л. Наблюдается относительно редко, чаще всего при кортикостероидной терапии. Может также сопровождать ВИЧ, лимфогрануломатоз и различные хронические инфекции (например, туберкулез, диссеминированную красную волчанку, саркоидоз). В гематологическом анализаторе «3 Diff» выделяют 3 основные популяции: гранулоциты, лимфоциты и так называемые средние клетки (табл. 4). При использовании специально подобранных лизирующего раствора и изотонического разбавителя можно несколько модифицировать различные субпопуляции лейкоцитов – лимфоциты уменьшаются в объеме практически до ядер, а гранулоциты, напротив, увеличивают свой объем. В область малых объемов (35–90 фл) попадают лимфоциты, которые значительно уменьшаются в размере. Гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), напротив, подвергаются небольшому сжатию и расположены в области больших объемов (120–400 фл). Таблица 4 Лейкоцитарные параметры, регистрируемые гематологическим анализатором Показатель WBC (White Blood Cells) – лейкоциты LYM (LY) – лимфоциты MID (MON) – средние клетки (в них входят моноциты и частично эозинофилы и базофилы) GRA (GRAN) – гранулоциты Единицы измерения Метод определения Норма 109/л Кондуктометрический 4,0–9,0 %, 109/л Кондуктометрический 19-45 (1,2–3,5) %, 109/л Кондуктометрический 4–11 (0,1–0,6) %, 109/л Кондуктометрический 45–80 (1,6–6,9) Считается, что именно наличие пероксидазы в гранулах клеток (больше всего ее в нейтрофилах, значительно меньше – в эозинофилах и почти нет в базофилах) препятствует их сжатию и уменьшению в размере. Поэтому, интересным и наглядным диагностическим признаком активности нейтрофилов при бактериальной атаке является увеличение зоны гранулоцитов на гистограмме. Между двумя пиками имеется зона средних клеток, которая лучше всего соотносится с моноцитами. В зону средних клеток могут попадать также базофилы и эозинофилы, особенно если они частично или полностью 72 дегранулированы, поэтому более корректным названием параметра следует считать «средние» клетки (MID), а не моноциты. Таким образом, получают трехкомпонентную лейкоцитарную формулу WBC (количество лейкоцитов): GRА (гранулоциты, относительное и абсолютное количество); LYМ (лимфоциты, относительное и абсолютное количество); MON (моноциты, относительное и абсолютное количество) (рис. 21). В бланке выдачи результатов анализа отражены абсолютное и относительное количество различных типов лейкоцитов. Абсолютные величины отражают истинное содержание тех или иных видов лейкоцитов в крови, а относительные характеризуют только соотношение различных клеток между собой в единице объема крови. Рис. 21. Дифференцированная гистограмма лейкоцитов (фото кафедры трансплантологии и клинической лабораторной диагностики ГОО ВПО ДОННМУ ИМ.М.ГОРЬКОГО) Гематологические анализаторы «5 Diff» способны осуществлять дифференцированный подсчет лейкоцитов по пяти основным популяциям с использованием различных принципов дифференцирования клеток: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты. Некоторые высокотехнологичные анализаторы способны анализировать ретикулоциты и их субпопуляции, проводить оценку стволовых гемопоэтических клеток и субпопуляций лимфоцитов. Использование таких приборов позволяет повысить точность дифференциального подсчета лейкоцитов, провести скрининг нормы и патологии, динамический контроль лейкоцитарной формулы и резко сократить ее ручной подсчет, оставляя примерно 15–20% образцов крови для световой микроскопии, что связано с неспособностью гематологических анализаторов идентифицировать незрелые гранулоциты и бластные клетки. Особенности гемограммы у детей В первый день жизни число лейкоцитов увеличивается до 35–40×109/л с преобладанием нейтрофилов. При этом в крови могут быть найдены молодые формы нейтрофилов (метамиелоциты, миелоциты, промиелоциты) и нормобласты. Такие изменения состава крови особенно характерны для недоношенных новорожденных. 73 На 5–6-е сутки количество лимфоцитов и нейтрофилов становится одинаковым. К концу периода новорожденности лейкоцитоз снижается, и среди форменных элементов крови начинают преобладать лимфоциты. Максимальное число лимфоцитов определяется в возрасте 5–6 месяцев. Принципиальная и очень важная особенность детского организма – количество лейкоцитов у ребенка в среднем намного больше, чем у взрослого (10×109/л – считается нормой). Уровень лимфоцитов максимален, ориентировочно, с месячного возраста и до двух лет. После двух лет численность лимфоцитов начинает медленно уменьшаться, к 4–5 годам количество лимфоцитов сравнивается с количеством нейтрофилов, но даже у подростка в 15 лет лимфоцитов все равно больше, чем у взрослого человека. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) В 1894 поляк Эдмунд Бернацкий предложил в клинической лабораторной практике количественно измерять СОЭ – показатель скорости разделения крови в пробирке с добавленным антикоагулянтом на 2 слоя: верхний (прозрачная плазма) и нижний (осевшие эритроциты). В связи с тем, что удельная масса эритроцитов выше, чем удельная масса плазмы, в пробирке при наличии антикоагулянта под действием силы тяжести эритроциты оседают на дно. Скорость оседания эритроцитов представляет собою неспецифическую реакцию. В норме она составляет у мужчин – 2–15 мм/час, а у женщин – 2–20 мм/час. Определение СОЭ проводят методом Панченкова (в капилляре Панченкова), либо методом Вестергрена (в пробирке). Метод Панченкова. Выполнение данной методики достаточно простое. Венозную или капиллярную кровь стабилизируют цитратом натрия (3,2%, 9:1), набирают в стеклянные пипетки внутренним диаметром 1,0±0,1 мм до высоты 100 мм. Пипетки закрепляют в специальном держателе. Через час отмечают величину столбика плазмы в миллиметрах (рис. 22). Рис. 22. Штатив с капиллярными стеклянными трубками для определения скорости оседания эритроцитов. Метод Панченкова (фото кафедры трансплантологии и клинической лабораторной диагностики ГОО ВПО ДОННМУ ИМ.М.ГОРЬКОГО) 74 Метод Вестергрена – это международный метод определения СОЭ. Он отличается от метода Панченкова характеристиками используемых пробирок и калибровкой шкалы результатов. Результаты, получаемые этим методом, в области нормальных значений совпадают с результатами, получаемыми методом Панченкова. Но метод Вестергрена более чувствителен к повышению СОЭ, и результаты в зоне повышенных значений СОЭ будут точнее результатов, получаемых методом Панченкова (рис. 23). Для выполнения определения СОЭ по методу Вестергрена необходима венозная кровь, взятая с цитратом натрия (3,8%) в соотношении 4:1. Также используют венозную кровь, взятую с ЭДТА (1,5 мг/мл) и затем разведенную цитратом натрия или физиологическим раствором в соотношении 4:1. Метод выполняют в специальных пробирках Вестергрена с просветом 2,4–2,5 мм и шкалой, градуированной на 200 мм. СОЭ считывают в мм за 1 час. Рис. 23. Сравнение скорости оседания эритроцитов (слева 76 мм/час, справа 5 мм/час). Метод Вестергрена (фото кафедры трансплантологии и клинической лабораторной диагностики ГОО ВПО ДОННМУ ИМ.М.ГОРЬКОГО) Вполне понятно, что скорость, с которой происходит оседание эритроцитов, в основном определяется степенью их агрегации, т.е. их способностью слипаться вместе и, благодаря закону тяготения, оседать на дно. Считается, что агрегация эритроцитов главным образом зависит от двух факторов – их электрических свойств и белкового состава плазмы крови. Электростатическая сила объясняет тот факт, что эритроциты in vivo отталкиваются друг от друга как одноименно заряженные частицы, поскольку несут отрицательный заряд (дзета-потенциал). Они не приближаются к стенке сосуда, т.к. эндотелий также заряжен отрицательно. Однако, второй механизм влияния концентрации плазменных белков на «слипаемость» клеток до сих пор не понятен. Существует мнение, в соответствии с которым эритроциты «склеиваются» друг с другом некими молекулярными «клеями», т.е. белками, присутствующими в плазме. Доказано, что на дзета-потенциал эритроцитов влияет большое количество факторов: например, выход из спинного мозга новых 75 «высокозаряженных» клеток, ретикулоцитов, рН плазмы (ацидоз снижает СОЭ, алкалоз повышает), ионный заряд плазмы, липиды, вязкость крови, наличие антиэритроцитарных антител, лекарственная интерференция: применение глюкокортикоидов, половых стероидов, витамина В12, салицилата натрия и т.д. Число, форма и размер эритроцитов также влияют на оседание. Снижение содержания эритроцитов (анемия) в крови приводит к ускорению СОЭ и, напротив, повышение содержания эритроцитов в крови замедляет скорость седиментации (оседания). СОЭ – это интегральный показатель, отражающий сумму сложных процессов, происходящих в крови в сосудистом русле и непрекращающихся в пробирке. И всегда нужно учитывать сложное сочетание факторов, которые влияют на СОЭ и препятствуют адекватной трактовке этого теста. Изначально данный показатель был предложен для отражения изменения белкового состава крови. Путем наблюдения выявлена корреляция, что степень агрегации (а значит и СОЭ) повышается при увеличении концентрации в плазме белков острой фазы – маркеров воспалительного процесса, в первую очередь фибриногена, C-реактивного белка, церулоплазмина, иммуноглобулинов, гиалуроновой и хондроитиновой кислоты, попадающих в кровь при дезорганизации основного вещества соединительной ткани, некоторых антигенов и их антител. Напротив, СОЭ снижается при увеличении концентрации альбуминов. Но на сегодня «золотым стандартом» диагностики воспаления и ряда осложнений признан С-реактивный белок (СРБ). Показано, что при воспалении концентрация СРБ в плазме увеличивается в 10–100 раз и прямо коррелирует с тяжестью процесса. Именно поэтому изменение концентрации СРБ широко применяется для мониторинга и контроля эффективности терапии бактериальных и вирусных инфекций, хронических воспалительных заболеваний, ожогов, онкологических заболеваний, осложнений в гинекологии и хирургии. Информативность определения СРБ при воспалении выше, чем количественное определение лейкоцитов. Таким образом, анализ морфологического состава крови имеет огромное клиническое значение, а иногда является ведущим признаком в диагностике и выборе терапии многих болезней человека. Однако следует помнить, что важнейшим звеном в таком анализе является интегральная оценка всех показателей крови и обязательное соотнесение имеющихся в крови изменений с анамнезом и клиническими проявлениями болезни. 76 Задания для самоконтроля 1. Пациент 50 лет после проведения комплекса терапии, направленной на нормализацию системы гемостаза, был направлен в лабораторию для определения D-димера. Какой этап в системе гемостаза можно оценить с помощью данного показателя? A. Фибриногенез B. Деградацию фибрина C. Тромбообразование D. Агрегацию тромбоцитов E. Адгезию тромбоцитов 2. У больного ребенка двух лет с выраженным геморрагическим синдромом выявлено отсутствие антигемофильного глобулина (ф.VIII) в плазме крови. Какой лабораторный тест будет изменен? A. ПВ B. АЧТВ C. ТВ D. Фибриноген E. РФМК 3. Пациентка 68 лет с диагнозом тромбофлебит глубоких вен нижних конечностей постоянно получает антикоагулянтную терапию. Какой лабораторный тест подтверждает отсутствие тромба в сосудах? A. Плазминоген B. АЧТВ C. D-димеры D. Фибриноген E. РФМК 4. Пациентке 65 лет с диагнозом ишемическая болезнь сердца был назначен аспирин-кардио. Какой тест необходим для мониторинга приема данных препаратов? A. Время кровотечения по Айви B. Агрегатограмма C. Количество тромбоцитов D. РФМК E. D-димеры 5. У женщины 50 лет на теле появились петехиальные высыпания. Несколько дней назад был однократный подъем температуры до 38 оС. Какое из перечисленных условий является ведущим для активации сосудистотромбоцитарного гемостаза? A. Повышение температуры B. Оголение коллагена C. Повышение концентрации кальция D. Выброс адреналина E. Инактивация гепарина 77 6. При тромбозах, ДВС-синдроме и других острых нарушениях гемостаза в комплексную терапию включают гепарин, как прямой антикоагулянт. Даже малые дозы гепарина существенно влияют на исследование коагуляционных проб. Какой показатель будет информативным для контроля лечения гепарином? A. АЧТВ B. ПВ C. ТВ D. РФМК E. D-димеры 7. Мальчик, 8 лет, поступил в клинику с жалобами на боль в коленном суставе при ходьбе. Боль появилась после незначительного ушиба на турнике. Полгода назад болезненные ощущения были в локтевом суставе и самостоятельно прошли. Также у ребенка наблюдаются регулярные носовые кровотечения. При осмотре: коленный сустав увеличен в размере, шарообразный, мягкие ткани очень тугие, напряженные, при пальпации возникает боль и ощущается флюктуация. На рентгенографии был подтвержден гемартроз. Какой тип кровоточивости наблюдается у пациента? A. Петехеально-пятнистый B. Васкулитно-пурпурный C. Гематомный D. Смешанный E. Ангиоматозный 8. После операции на сердце пациенту был назначен варфарин – непрямой антикоагулянт, который является конкурентным антагонистом витамина К. Какой показатель коагулограммы необходимо назначить пациенту для контроля лечения данным препаратом? A. ТВ B. АЧТВ C. МНО D. РФМК E. Фибриноген 9. Мама ребенка, 5 лет, предъявляет жалобы на часто образующиеся синяки на теле ребенка. Они появляются даже после незначительного надавливания на кожу. Для исследования первичного гемостаза необходимо оценить состояние сосудистой стенки и активность тромбоцитов. Какой метод исследования надо назначить как наиболее объективный и специфичный? A. Активированное время свертывания B. Время кровотечения по Ли-Уайту C. Время кровотечения по Айви D. Время кровотечения по Сухареву E. Экспресс-анализ по Шитиковой 78 10. Пациент жалуется на появление на коже мелких красных пятен, особенно в местах сжатия и трения одеждой. При осмотре пятна безболезненные, не выступают над поверхностью кожи и не исчезают при надавливании. При осмотре видны на теле точечные кровоизлияния от 3 мм до нескольких сантиметров в диаметре, а также кровоподтеки различной окраски – красные и синие. Какой тип кровоточивости наблюдается у пациента? A. Петехеально-пятнистый B. Васкулитно-пурпурный C. Гематомный D. Смешанный E. Ангиоматозный 11. Врач оценивает результаты клинического анализа крови пациента. Количество эритроцитов и показатель гемоглобина в норме. Показатель MCV выше нормы, а МСНС – ниже нижней границы нормы. Как можно оценить данное состояние эритроцитов? A. Макроциты гипохромные B. Нормоциты нормохромные C. Нормоциты гипохромные D. Макроциты гиперхромные E. Макроциты нормохромные 12. Пациент поступил в хирургическое отделение с подозрением на острый аппендицит. Результаты клинического анализа крови: эритроциты – 4,2×1012/л, лейкоциты – 8,8×109/л, эозинофилы – 4%, сегментоядерные нейтрофилы 42% и палочкоядерные нейтрофильные гранулоциты – 12%. Какой лабораторный показатель у пациента свидетельствует в пользу острого воспаления? A. Лейкоцитоз B. Увеличение палочкоядерных нейтрофилов C. Уменьшение сегментоядерных нейтрофилов D. Лейкопения E. Анемия 13. Аллерголог наблюдает пациента в течение месяца после возникновения симптомов аллергии. В клиническом анализе крови выявлено 14% эозинофилов. Гельминтоз исключает. С каким свойством эозинофилов можно связать эти изменения лейкоформулы? A. Активация комплемента B. Выработка цитокинов C. Способность образовывать специфические антитела D. Способность фагоцитировать комплекс антиген–антитело E. Высокая цитотоксичность 14. Пациентку доставили в отделение после острой кровопотери, вызванной травмой. В течение первых суток эритроцитарные показатели были в норме. На следующий день резко уменьшился гематокрит, а показатель количества 79 эритроцитов и гемоглобина оставался в норме. Через 5 суток появились в периферической крови ретикулоциты. Чем можно объяснить такую динамику эритроцитарных показателей? A. Компенсаторными процессами системы крови B. Снижением иммунного ответа C. Отсутствием реанимационных мероприятий D. Продолжающейся кровопотерей E. Наличием воспалительного процесса 15. На приеме у терапевта женщина с жалобами на одышку, мышечную слабость. В течение 2 лет беспокоит ломкость ногтей, волос, стоматит. В анамнезе язвенная болезнь 12-перстной кишки. В анализе крови: RBC – 3,4 Т/л; HGB – 78 г/л; MCV – 74 фл; MCH – 23 пг; HCT – 24,9%; MCHC – 314 г/л. Какой вид анемии у больной? A. Железодефицитная B. Фолиеводефицитная C. Апластическая D. Гемолитическая E. В12-дефицитная 16. При выполнении клинического анализа крови с помощью гематологического анализатора врач получил высокое значение концентрации гемоглобина – 150 г/л. При этом в мазке крови встречались только гипохромные эритроциты, и наблюдался выраженный пойкилоцитоз. Какова может быть причина расхождения данных морфологической картины и анализатора? A. Увеличенное количество макроцитов B. Повышение содержания холестерина C. Гемолиз эритроцитов D. Нарушение правил взятия пробы E. Неисправность аппарата 17. В современной лаборатории подсчет клеток крови осуществляют с помощью гематологического анализатора, в котором используется принцип кондуктометрии. Какой параметр лежит в основе измерения? A. Масса клетки B. Объем клетки C. Скорость кровотока D. Поверхностный заряд мембраны E. Толщина мембраны клетки 18. При исследовании крови на гематологическом анализаторе получены следующие показатели: Hb – 60 г/л, МСV – 123 фл. Для какой анемии характерен такой объем эритроцитов? A. Талассемия B. Гемоглобинопатия C. Железодефицитная анемия 80 D. В12-дефицитная анемия E. Постгеморрагическая 19. При подсчете формулы крови врач-лаборант обратил внимание на то, что большое количество нейтрофильных гранулоцитов имеют несегментированное ядро в виде палочки или буквы S, и характеризовал состояние как «сдвиг лейкоцитарной формулы влево». Для какого клинического процесса характерна такая картина периферической крови? A. Аутоиммунная реакция B. Хронический воспалительный процесс C. Глистная инвазия D. Острая бактериальная инфекция E. Аллергическая реакция 20. Хирург направил пациента в лабораторию для клинического анализа крови и указал на обязательное исследование лейкоцитарной формулы, под которой понимают: A. Абсолютное количество лейкоцитов B. Отношение гранулоцитов к агранулоцитам C. Соотношение разных форм лейкоцитов D. Выявление молодых форм лейкоцитов E. Количество лейкоцитов в костном мозге 81 ГЛАВА 3. КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ОРГАНИЗМЕ И АКТИВНОСТИ ЭНДОКРИННЫХ ЖЕЛЕЗ Клиническая биохимия – это раздел клинической лабораторной диагностики, изучающий взаимосвязь и взаимовлияние нарушений метаболизма в организме человека при заболеваниях, что позволяет существенно облегчить постановку диагноза, выбор лечения и методов предупреждения заболевания, развитие патологических процессов. С помощью биохимических методов оценивают активность ферментов, определяют концентрацию субстратов, пигментов, микроэлементов, отражающих основные процессы обмена веществ. Биохимическому исследованию подлежит биологический материал, получаемый от больных – кровь, моча, кал, мокрота, СМЖ, выпотные жидкости. Наиболее используемый биоматериал – это сыворотка или плазма крови. Для выполнения биохимического анализа используют анализаторы, полуанализаторы и электрофотоколориметры. Принцип работы автоматического биохимического анализатора В ячейке реакционной (спектрофотометрической) кюветы специальным миксером при определенной температуре производят полное перемешивание реагента с пробой (исследуемой биологической жидкостью), что обеспечивает осуществление химической реакции (рис. 24). Рис. 24. Схема строения автоматического биохимического анализатора (ресурсы сети Интернет) В результате реакции изменяется оптическая плотность полученного раствора, при этом поглощение длины волны коррелирует с количеством биологически активного вещества, которое измеряется в биоматериале. 82 Свет от лампы накаливания проходит через ячейку реакционной кюветы, через специальный фильтр и попадает на регистрирующее устройствоизмеритель – колориметр. Затем сигнал через транскриптор (преобразователь) электронной системы поступает в компьютер, где фиксируется цифровое значение, на основании которого определяется показатель. Лабораторная энзимология Ферменты или энзимы – это белки, обладающие каталитической активностью и ускоряющие протекание реакций обмена веществ. Важное свойство ферментов – избирательность (специфичность) в отношении субстрата. Некоторые ферменты обладают абсолютной специфичностью, каждый такой фермент катализирует единственную реакцию. К таким ферментам относится уреаза, катализирующая расщепление мочевины до аммиака и оксида углерода. Однако многие ферменты обладают лишь относительной субстратной специфичностью. Активность большинства ферментов в клетках в норме значительно превышает их активность во внеклеточной жидкости. Уровень ферментативной активности в кровяном русле после повреждения ткани определяется в первую очередь содержанием фермента в этой ткани, а также стадией патологического процесса. Органоспецифических ферментов нет, но некоторые ферменты присутствуют в определенной ткани в более высокой концентрации. При повреждении этой ткани в крови появляются «органоспецифичные» ферменты, которые нацеливают врача на диагностическое предположение. Выход ферментов непосредственно в кровь происходит только в хорошо васкуляризированных тканях, например, печени. В скелетной мышце большая часть ферментов попадает в кровяное русло через лимфатические пути. При пассаже ферментов, вышедших из поврежденных кардиомиоцитов в кровоток, имеет значение скорость лимфотока. Ферменты локализуются в разных клеточных компонентах: цитозоль, лизосомы, плазматическая мембрана или митохондрии. Появление определенной группы ферментов может свидетельствовать о степени и тяжести повреждения клеток. При обратимых дистрофических процессах, характеризующихся только увеличением проницаемости мембраны, высвобождаются ферменты из цитоплазмы. Появление в сыворотке как митохондриальных, так и цитоплазматических ферментов свидетельствует о некрозе клеток. Ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но различающиеся величиной молекулярной массы, аминокислотным составом, электрофоретической подвижностью, термостабильностью, рН, субстратной специфичностью, по действию на них активаторов и ингибиторов и иммунологическим характеристикам, называют изоферментами. Например, креатинфосфокиназа (КФК) является димером, состоящим из 2 типов субъединиц: В и М. Поэтому в организме представлены 3 изофермента креатинкиназы – ВВ, МВ и ММ. 83 Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) – фермент, катализирующий обратимую реакцию превращения пирувата в лактат. Содержится в цитоплазме клеток практически всех органов и тканей организма. Максимальная активность ЛДГ определяется в миокарде, почках, скелетной мускулатуре, паренхиме печени, эритроцитах, лимфоцитах, поджелудочной железе. ЛДГ в организме представлена пятью изоферментами. В тканях с преимущественно аэробным путем обмена (сердце, головной мозг, почки) активность ЛДГ связана с изоферментами ЛДГ1 и ЛДГ2. В тканях с выраженной способностью к анаэробному обмену (печень, скелетная мускулатура) в изоферментном спектре преобладает ЛДГ5. В ряде тканей (миометрий, надпочечники, селезенка, легкие, клетки крови) активность ЛДГ равномерно распределена между всеми изоферментами. Референтные пределы (ориентировочные): <250 Ед/л. Увеличением активности фермента сопровождаются: • застойная сердечная недостаточность (при развитии гипоксии печени и др. органов); • острые гепатиты (при вирусных гепатитах увеличение в течение первой недели желтушного периода в 2–3 и более раз, при типичном течении нормализация активности на 5–8-й неделе); • хронические гепатиты различной этиологии (как правило, лишь в период обострения); • токсические поражения паренхимы печени; • миопатии различной этиологии, исключая дистрофию нейрогенного характера, инфекционный мононуклеоз; • гемолитическая, мегалобластная анемия. Аланинаминотрансфераза (АЛТ, АлАТ) катализирует обратимую реакцию дезаминирования аминокислоты аланина. Наиболее высокая активность фермента обнаруживается в печени (цитоплазме гепатоцитов). Но при поражении поджелудочной железы, миокарда, скелетных мышц, эритроцитов, почек активность этого фермента может быть повышена. Определение АЛТ обычно применяют совместно с определением аспартатаминотрансферазы (АСТ, АсАТ). При острых вирусных гепатитах активность АЛТ повышается у больных за несколько суток до клинических симптомов или желтухи и достигает максимума (повышение в 5–10 раз и более) на 1–2-й неделе острого гепатита, что совпадает с тяжестью течения болезни. Референтные значения (ориентировочные): 5–40 Ед/л. Увеличением активности фермента сопровождаются: • острые и хронические заболевания печени с повреждением паренхимы любой этиологии (гепатиты, цирроз, внутри- и внепеченочный холестаз, инфекционный мононуклеоз); • шок, сердечная недостаточность с застойными явлениями в печени; • метастазы рака в печень, первичный рак печени; • острый инфаркт миокарда, острый миокардит, миопатии; 84 • травма или операционное повреждение скелетных мышц, печени, миокарда; • миозит, дерматомиозит; • гемолитическая анемия, мегалобластная анемия. АСТ катализирует обратимую реакцию дезаминирования аминокислоты аспартата. Наиболее высокая активность фермента обнаруживается в митохондриях и в цитоплазме клеток сердечной мышцы, затем, по убыванию, – в печени (в цитоплазме и в митохондриях гепатоцитов), скелетных мышцах, эритроцитах, головном мозге, семенниках и почках. Референтные значения (ориентировочные): 5–40 Ед/л. Увеличением активности фермента сопровождаются: • острый инфаркт миокарда; • острый миокардит; • острые и хронические заболевания печени с повреждением паренхимы любой этиологии (гепатиты, цирроз); • инфекционный мононуклеоз; • гемолитическая анемия, мегалобластная анемия. КФК – фермент, участвующий в энергопродукции, катализирует фосфорилирование креатина и его дефосфорилирование с образованием АТФ. Изоферменты КФК состоят из двух субъединиц, обозначаемых как M («muscle»–мышца) и B («brain»–мозг). В наибольших количествах MB-КФК присутствует в кардиомиоцитах. Именно поэтому увеличение в сыворотке крови MB-КФК – один из наиболее специфичных показателей цитолиза и некроза кардиомиоцитов. Референтные значения КФК (ориентировочные): женщины <170 Ед/л, мужчины <190 Ед/л. Увеличением активности фермента сопровождаются: • острый инфаркт; • острые миокардиты (инфекционные и токсические); • полимиозиты, дерматомиозиты; • мышечные дистрофии. Гамма-глютамилтранспептидаза (ГГТ) – фермент, катализирующий реакции переноса аминокислот из плазмы крови в клетки, а также участвующий в процессах реабсорбции аминокислот из желчи и мочи в кровь. В значительных количествах фермент обнаруживается в цитоплазме и гладком эндоплазматическом ретикулуме (микросомах) гепатоцитов, расположенных в области воротной вены, эпителии извитых канальцев нефрона, в желчных канальцах и ближайших к просвету частях эпителиальных клеток, выстилающих желчный проток. Референтные значения (ориентировочные): женщины <30 Ед/л, мужчины <50 Ед/л. Увеличением активности фермента сопровождаются: • обтурация внутри- и внепеченочных желчных путей; • острые и хронические гепатиты; • инфекционный мононуклеоз с поражением печени; 85 • • • • токсические поражения печени (алкогольные, лекарственные и т.д.); панкреатит острый и хронический; опухолевый рост в печени; нефротический синдром. Щелочная фосфатаза (ЩФ). Так называют группу ферментов, катализирующих гидролитическое отщепление фосфатной группы от различных органических соединений с максимальной активностью в щелочной среде. Максимальную активность ЩФ проявляет в эпителиоцитах желчных канальцев печени, остеобластах (остеокласты не содержат фермент), в меньшей степени в слизистой оболочке кишечника, проксимальных отделах извитых канальцев почек, плаценте, легких. Несмотря на наличие множественных форм ЩФ в тканях организма, в сыворотке крови чаще всего обнаруживают печеночный и костный изофермент. Референтные значения (ориентировочные): дети <480 Ед/л, взрослые <150 Ед/л.. Увеличением активности фермента сопровождаются: • холестаз при гепатитах, метастазах в печени, циррозах, первичном раке печени, инфекционном мононуклеозе с поражением печени; • холангит, холангиолит; • увеличение функциональной активности остеобластов (болезнь Педжета, метастазы рака в кости, остеогенная саркома, переломы костей, ампутации конечностей); • первичный и вторичный гиперпаратиреоз при вовлечении скелета; • саркома, миелома, костный туберкулез, лейкозы. Альфа-амилаза – фермент, катализирующий гидролитическое расщепление крахмала и гликогена пищи до мальтозы. Секретируется в полость рта слюнными железами (изоферменты амилазы S-типа) и в желудочнокишечный тракт (ЖКТ) поджелудочной железой (изоферменты амилазы Р-типа). Оба изофермента α-амилазы фильтруются в почках и экскретируются с мочой. Тем не менее, в составе мочи наибольший удельный вес приходится на панкреатический изофермент. Также считают, что уровень α-амилазы в крови во многом зависит от функционального состояния печени. Активность фермента может быть повышена при ряде заболеваний, имеющих сходную клиническую картину с острым панкреатитом, а именно: остром аппендиците, перитоните, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки. Референтные значения (ориентировочные): взрослые до 70 лет – 25–125 Ед/л, старше 70 лет – 0–160 Ед/л. Увеличением активности фермента в крови в 5–10 раз сопровождаются: • острый панкреатит; • почечная недостаточность; • тяжелый диабетический кетоацидоз. Липаза – фермент, катализирующий гидролиз триглицеридов (нейтрального жира) с высвобождением жирных кислот в клетках жировой 86 ткани, а также в тонкой кишке, куда фермент секретируется поджелудочной железой. Увеличение активности в сыворотке крови, как правило, является следствием цитолиза и некроза ацинарных клеток поджелудочной железы. Определение активности липазы используют для диагностики и мониторинга острого и хронического панкреатита. В отличие от альфа-амилазы активность липазы не повышается при синдроме острого живота. Референтные значения (ориентировочные): взрослые <190 Ед/л. Увеличением активности фермента сопровождается острый панкреатит любой этиологии (начало увеличения через 4–8 ч, максимальная активность через 24 ч, снижение до референтного уровня через 8–14 суток). Углеводный обмен Глюкоза – главный источник энергии для организма. Фильтруясь с плазмой крови через капсулу нефрона почки, глюкоза включается в состав первичной мочи и реабсорбируется в проксимальных канальцах нефрона, поэтому с мочой в норме из организма не выводится. Повышение уровня глюкозы в крови выше 8,8–9,9 ммоль/л приводит к появлению ее в моче в связи с недостатком белков-переносчиков, участвующих в реабсорбции глюкозы. Это называется порогом выведения глюкозы (почечный порог). Понижает уровень глюкозы в крови единственный гормон – инсулин, повышают – контринсулярные гормоны: адреналин, глюкокортикоиды, глюкагон, гормон роста. Инсулин способствует проникновению глюкозы в клетку, увеличивая проницаемость клеточных мембран в 20 раз. Абсолютно зависимые от инсулина органы те, на мембранах которых есть инсулиновые рецепторы, – печень, мышцы, жировая ткань. Нечувствительные к инсулину органы – головной мозг (на нейронах гипоталамуса выявлены рецепторы), мозговое вещество надпочечников, эритроциты, семенники. Механизм действия инсулина Соединение инсулин + рецептор → активирует в клетках мышц и жировой ткани ферменты для глюкозы – гексокиназу, а в печени глюкокиназу (IV изофермент гексокиназы). Таким образом, для реализации эффекта инсулина необходимо не только наличие самого инсулина, но также наличие инсулинового рецептора и внутриклеточных переносчиков. Содержащаяся в депо (в печени и мышцах) глюкоза является основным и почти единственным источником питания инсулиннезависимых тканей. Более 60% глюкозы, образующейся в печени, идет на обеспечение нормальной активности ЦНС. Это соотношение остается неизменным не только при гипергликемии, но даже при диабетической коме. Потребление глюкозы ЦНС уменьшается лишь после того, как ее уровень в крови становится ниже 1,65 ммоль/л. В патологии обмена глюкозы возможны такие состояния как: гипергликемия и гипогликемия. Хроническая гипергликемия чаще всего бывает в случае сахарного диабета (СД) и фактически является основной характеристикой этого заболевания. Гипергликемия может развиваться на фоне инфекции и 87 воспалительного процесса или стресса. Запускают этот процесс эндогенные контринсулиновые гормоны (катехоламины, глюкокортикоиды и другие). Поэтому повышение уровня глюкозы в крови не должно сразу расцениваться как СД 2-го типа – для начала следует исключить все другие причины. Для гипогликемии характерны: головокружение, ступор, обморок, которые появляются, если уровень глюкозы менее 2,5 ммоль/л или же было очень быстрое понижение уровня глюкозы, даже при нормальных ее значениях (тогда вначале – потливость, тахикардия как результат выброса адреналина). Причины гипогликемии: голодание, введение инсулина натощак или его высокой дозы, недостаточность глюкокортикоидов, тяжелые заболевания печени, инсулиномы (разрастание β-клеток поджелудочной железы), опухоли («пасть» глюкозы), алкоголь (в печени снижается глюконеогенез в процессе метаболизма алкоголя). Белковый обмен Количественный и качественный состав белков в крови отражает состояние белкового обмена в целом, при этом белки плазмы наиболее широко используются для диагностических целей. Физиологическая функция белков плазмы состоит в поддержании коллоидно-осмотического давления, буферной ёмкости плазмы, осуществлении транспорта, депонировании молекул липидов, продуктов метаболизма, гормонов, лекарственных веществ и микроэлементов. Общий белок. Под определением «общий белок» понимают большое количество белков плазмы крови, различающихся между собой по структуре, физико-химическим свойствам, функциям. Концентрация белка в плазме зависит от скорости синтеза, скорости удаления и распределения в тканях. Альбумины, -глобулины и часть -глобулинов синтезируются в печени, -глобулины и часть -глобулинов – в клетках лимфоидной ткани. Концентрация общего белка в плазме может быстро меняться. Так, через 30 мин в положении стоя после длительного лежания она может увеличиться на 10–20%, после венопункции может измениться в течение нескольких минут. Диагностическое значение изменений общего белка плазмы крови • • • • • • • • Повышение концентрации: дегидратация – недостаточное питье, избыточные потери воды при потоотделении, профузные поносы, болезнь Аддисона; диабетический кетоацидоз; острые и хронические инфекции; аутоиммунные болезни; парапротеинемические гемобластомы, миеломная болезнь; лимфогранулематоз; активный хронический гепатит; цирроз печени без выраженной печеночно-клеточной недостаточности и т.д. 88 • • • • • • • Снижение концентрации: недостаток белка в пище, голодание; мальабсорбция, энтериты, панкреатиты; пониженный синтез белка (гепатит, цирроз, атрофия и др.); длительное лечение кортикостероидами; увеличенные потери белка (гломерулонефрит, патология почек, сахарный диабет, асцит, экссудаты и транссудаты, ожоги, кровотечения и т.д.); повышенный распад белка (тиреотоксикоз, длительная физическая нагрузка, длительная лихорадка, травмы, опухоли); гипергидратация. Альбумин. На долю альбумина приходится 55–60% белка сыворотки крови. Основные функции альбумина: транспорт, поддержание постоянства коллоидно-осмотического давления и обеспечение клеток аминокислотами. Он вносит доминирующий вклад (80%) в онкотическое давление плазмы, поэтому при гипоальбуминемии из-за снижения онкотического давления плазмы жидкость не возвращается в кровяное русло из интерстиция. По такому механизму возникают, в частности, голодные отеки. Время полужизни альбумина в плазме 15–20 дней, в организме содержится 310–330 г альбумина, из которых около 40% присутствует в кровяном русле. В острых ситуациях, в частности при остром гепатите, уменьшение количества альбумина в сыворотке крови связано с перераспределением жидкости, а не со снижением его синтеза. При хроническом гепатите гипоальбуминемия может быть результатом как уменьшения синтеза, так и увеличения объема распределения из-за задержки жидкости в организме (например, асцит). Велика роль альбумина в переносе гормонов щитовидной железы, кальция, других катионов, билирубина, жирных кислот, лекарственных препаратов. Билирубин, соединенный с альбумином, теряет токсичность, приобретает свойства растворимого в воде соединения. При гипоальбуминемии содержание растворимой фракции билирубина уменьшается. Динамическое равновесие между ионизированным и связанным кальцием определяется уровнем альбумина в плазме. Альбумин путем пиноцитоза потребляется клетками, где деградирует до аминокислот, которые используются для синтеза клеточных белков. Норма альбумина в плазме 37–53 г/л. Клинико-диагностическое значение альбумина плазмы крови Повышение концентрации: • острое обезвоживание; • прием анаболических стероидов. Снижение концентрации: • повышенный катаболизм (травма, инфекция, сепсис, лихорадка, опухоли, гипоксия, синдром Кушинга, гипертиреоз, гиперкортицизм); • аномальные потери (шок, кровотечение, энтероколиты, нефротический синдром); • патологическое распределение (операционные вмешательства, ожоги, 89 токсикоз, асцит, плеврит). Белки острой фазы воспаления С-реактивный белок – компонент иммунного ответа. Может связывать не только полисахариды, присутствующие на поверхности бактерий, грибов и паразитов, но и полианионы, поликатионы, нуклеиновые кислоты. Присоединенный к мембранам микроорганизмов и поврежденным клеткам СРБ активирует каскад комплемента, способствует фагоцитозу. Важной функцией является распознавание потенциально токсических веществ, образующихся при распаде собственных клеток организма, связывание их, детоксикация и удаление из крови. Уровень СРБ повышается в течение 6–10 ч после заболевания, травмы, хирургического вмешательства. Тест применяют для оценки активности воспалительных процессов, наблюдения за их динамикой, при дифференциальной диагностике бактериальных и вирусных инфекций, выборе адекватного лечения и контроле его эффективности. После травмы или операции при отсутствии осложнений концентрация СРБ возвращается к норме в следующие 5–7 сут. Неблагоприятный прогноз – если концентрация СРБ 200 мг/л в течение 10 суток и более или через 7–10 суток происходит только незначительное его снижение. Присутствие повышенной концентрации СРБ указывает на сохраняющийся в организме воспалительный процесс, неадекватное лечение. Транспортные белки Транспортные белки, которые имеют наибольшее клиникодиагностическое значение и определяются с помощью биохимических методов: - трансферрин (транспорт ионов железа в эритробласт); - ферритин (основное депо железа внутри клетки, обеспечение его внутриклеточного транспорта); - церулоплазмин (транспорт меди). К γ-глобулинам относят все иммуноглобулины (антитела) классов IgA, IgG, IgM, IgE, участвующие в специфическом иммунитете. Биохимическими методами не определяют. Липидный обмен В плазме крови содержатся несколько классов липопротеидов: хиломикроны (ХМ), липопротеиды очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеиды промежуточной плотности (ЛППП), липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), липопротеиды высокой плотности (ЛПВП). Характеристика разных классов липопротеидов крови • ХМ: основной липидный компонент – триглицериды, место образования – эпителий тонкого кишечника, функции – транспорт экзогенных триглицеридов; 90 • ЛПОНП: основной липидный компонент – триглицериды, место образования – печень, функции – транспорт эндогенных триглицеридов; • ЛППП: основной липидный компонент – холестерин, место образования – кровеносные капилляры печени, функции – транспорт холестерина к периферическим тканям; • ЛПНП: основной липидный компонент – фосфолипиды, место образования – печень, тонкий кишечник; функции – транспорт холестерина от периферических тканей к печени; • ЛПВП: основной липидный компонент – фосфолипиды и белковые компоненты, место образования – печень, функции – обратный транспорт холестерина в печень, откуда он выделяется в виде жирных кислот. Гиперлипопротеинемии Повышенный уровень липидов крови является важным фактором в появлении и развитии дегенеративных изменений сосудов, особенно сердца. Уровень липидов крови в норме зависит от возраста, пола, характера питания. У взрослых о гиперлипопротеинемии свидетельствует увеличение холестерина свыше 5,2 ммоль/л или триглицеридов более 2,9 ммоль/л. Гиперлипопротеинемия сопровождается развитием атеросклероза, организацией атеросклеротических бляшек сосудов, повышением свертывания крови и образованием тромбов, способствует формированию гипертензии. По происхождению гиперлипопротеинемии бывают первичными (наследственными) и вторичными (приобретенными). В зависимости от причин и механизмов развития гиперлипопротеинемия может быть алиментарной (пищевой), транспортной (при перемещении жира из депо в печень) и ретенционной (вследствие задержки жира в крови). Алиментарная гиперлипидемия. Этот вид гиперлипидемии начинает выявляться через 2–3 ч после употребления в пищу жиров, достигает максимума через 4–6 ч, а через 9 ч уровень жиров в крови возвращается к норме. Это физиологическое явление. При алиментарной гиперлипидемии сыворотка крови имеет молочный цвет и слегка опалесцирует, что обусловлено повышенным содержанием в крови хиломикронов (хилез). Функциональные нарушения печени, блокада ретикулоэндотелиальной системы и спленэктомия, а также недостаточность липопротеинлипазы (I тип гиперлипопротеинемии) сопровождаются более выраженной алиментарной гиперлипидемией. Транспортная гиперлипидемия. При активации расщепления жировой ткани, усиленной мобилизации жиров из депо и переносе липидов из депо в печень наблюдается транспортная гиперлипидемия. Избыток соматотропного гормона (СТГ), тиреотропного гормона (ТТГ), тироксина, адреналина, глюкагона способствует развитию транспортной гиперлипидемии. Так, при стрессе повышается тонус симпатической нервной системы, что вызывает увеличение секреции адреналина мозговым слоем надпочечников. Адреналин и норадреналин, воздействуя через β-адренорецепторы на жировую ткань, 91 вызывают стимуляцию липолиза, повышение уровня неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) и глицерина в крови, повышение в печени синтеза ЛПНП, развитие вторичной гипертриглицеридемии. При возбуждении α-адренорецепторов ингибируется инсулин, оказывающий антилиполитический эффект. При диабете дефицит инсулина приводит к снижению утилизации глюкозы, резкому снижению липогенеза в жировых депо и усиленной мобилизации жира из депо. Значительное опустошение жировых депо вызывает липидемию. В печени из НЭЖК синтезируются ЛПОНП, в результате может возникнуть вторичная гипертриглицеридемия. При голодании снижается уровень глюкозы в крови, что приводит к усилению мобилизации жиров из депо в печень. В результате больше синтезируется ЛПОНП и наблюдается вторичная гипертриглицеридемия. При этом часто развивается жировая инфильтрация печени. Ретенционная гиперлипидемия возникает при задержке перехода нейтральных жиров из крови в ткани. Уменьшение содержания в крови альбуминов (например, при нефрозе), которые транспортируют НЭЖК, а также снижение активности липопротеинлипазы способствуют развитию ретенционной гиперлипидемии. Активность липопротеинлипазы зависит от соотношения концентраций инсулина и глюкагона. Инсулин стимулирует липопротеинлипазу, а его антагонисты (глюкагон и СТГ) подавляют ее секрецию. При сахарном диабете, сопровождающемся подавлением синтеза триглицеридов в жировой ткани и увеличенным липолизом в печени, а также дефицитом липокаина, активирующим поступление в кровь липопротеинлипазы, наблюдается выраженная гиперлипидемия. При застойной желтухе, когда большие количества желчных кислот попадают в кровь и ингибируют липопротеинлипазу, развивается гиперлипидемия. Хлорид натрия является ингибитором липопротеинлипазы, поэтому при его избыточном поступлении в организм или задержке выведения возникает ретенционная гиперлипидемия. Гепарин, выделяющийся при дегрануляции тучных клеток, стимулирует образование липопротеинлипазы и активирует ее. При атеросклерозе нарушается высвобождение гепарина, что способствует развитию гиперлипидемии. При ретенционной гиперлипидемии наблюдается β-липопротеинемия. Нарушения превращения жирных кислот Жирные кислоты поступают в кровь из пищи и жировых депо, а также при гидролизе β-липопротеинов печени. Основная масса жирных кислот доставляется в печень, где используется для ресинтеза триглицеридов, которые входят в состав более сложных липидов и липопротеинов. Часть жирных кислот окисляется до образования холестерина и кетоновых тел. Нарушение промежуточного жирового обмена приводит к кетозу, который проявляется повышением уровня кетоновых тел (ацетоуксусной кислоты, β-гидроксимасляной кислоты, ацетона) в крови (кетонемия) и 92 выделением их в повышенном количестве с мочой (кетонурия). Кетоновые тела – это группа органических соединений, являющихся промежуточными продуктами жирового, углеводного и белкового обмена. Кетоновые тела вне печени через образование ацетил-КоА используются в цикле Кребса как энергетический материал с образованием конечных продуктов СО2 и Н2О. При дефиците углеводов, в том числе в печени, или нарушении их утилизации (сахарный диабет, голодание, токсикоинфекционные поражения печени) усиливаются образование контринсулярных гормонов, мобилизация жира из жировых депо. Жирные кислоты в большом количестве поступают в печень, где интенсивно используются (в условиях дефицита углеводов) как основной энергетический материал. Резко возрастает количество холестерина и кетоновых тел. Кетонемия возникает в тех случаях, когда скорость образования кетоновых тел превышает способность периферических тканей (сердце, легкие, почки, мышцы, нервная ткань) их утилизировать. Таким образом, в результате нарушения превращения жирных кислот развиваются явления гиперхолестеринемии и кетоза. Нарушения образования и превращения холестерина ХС входит в состав всех фракций крови. Больше всего его в β-липопротеидах. Он необходим для построения всех мембран, в печени из него синтезируются желчные кислоты, в эндокринных железах – стероидные гормоны, в коже – витамин D. Синтез его происходит почти во всех тканях, но больше всего в кишечнике и печени. При избыточном поступлении пищевого холестерина синтез его в печени тормозится по принципу обратной связи. Повышение синтеза холестерина в печени наблюдается при отсутствии желчных кислот. В условиях их дефицита синтез холестерина в слизистой тонкой кишки увеличивается в 5–10 раз. Важным путем элиминации холестерина является синтез из продуктов его распада желчных кислот в печени и удаление их с калом. Основываясь на полученных данных, врач рассчитывает коэффициент, показывающий степень риска развития атеросклероза. Он носит название коэффициента атерогенности (КА) и рассчитывается по формуле: КА = (общий холестерин – ЛПВП) / ЛПВП. Нормы для коэффициента атерогенности зависят от пола и возраста (табл. 5). Их превышение говорит о большей вероятности развития атеросклероза. Аполипопротеины – это белковые компоненты липопротеинов, необходимые для оценки риска возникновения атеросклеротического повреждения сосудов. Аполипопротеин А-1 (Апо-А) является основным компонентом ЛПВП (90%), участвует в транспорте триглицеридов и холестерина, активирует лецитин-холестерин-ацетилтрансферазу, способствуя обратному транспорту холестерина с периферии и стенок сосудов в печень, тем 93 самым препятствуя развитию атеросклероза. Нормальный уровень Апо-А обеспечивает снижение риска поражения коронарных и мозговых сосудов. Таблица 5 Нормы основных показателей липидного обмена (ресурсы сети Интернет) Показатель Общий холестерин ЛПВП ЛПНП ЛПОНП Нормы, ммоль/л мужчины 3,6–5,2 0,7–1,7 2,25–4,82 <2,6 дети 3,10–5,18 0,78–1,68 1,55–3,60 <2,6 женщины 3,6–5,2 0,9–1,9 3,5 <2,6 Определение только Апо-А дает мало информации для оценки нарушений обмена липопротеидов, целесообразно одновременное определение Апо-липопротеин B (Апо-В) и расчет их соотношения, которое в норме <1. Апо-В является частью ЛПНП, участвуя в регуляции синтеза и метаболизма холестерина. Уровни Апо-А и Апо-В являются более стабильными и лучше коррелируют с тяжестью и широтой повреждений сердечно-сосудистой системы, чем холестерин, ЛПНП и ЛПВП. Пигментный обмен Билирубин – конечный продукт катаболизма порфиринового кольца молекулы гемоглобина; он не содержит ни железа, ни белка. При отщеплении от гемоглобина гема образуется биливердин, который затем восстанавливается в билирубин. Билирубин из селезенки транспортируется кровью в печень в комплексе с альбуминами (это непрямой, неконъюгированный или свободный билирубин). Непрямой билирубин нерастворим в воде. В печени билирубин ферментативно связывается с глюкуроновой и серной кислотами, формируя водорастворимый (конъюгированный, прямой или связанный) билирубин. Билирубин поступает в толстую кишку, где под воздействием нормальной кишечной флоры восстанавливается до стеркобилиногена. В дистальном отделе толстой кишки основное количество стеркобилиногена окисляется в стеркобилин, который окрашивает каловые массы в различные оттенки коричневого цвета. Незначительная часть стеркобилиногена всасывается слизистой толстой кишки и через геморроидальные вены попадает в кровь, по нижней полой вене поступает в почки и фильтруется через почечный фильтр в мочу. Минимальное количество конъюгированного билирубина, выделяемое с мочой, не определяется в норме тест-полосками. Желтуха (иктеричность кожи и видимых слизистых) появляется тогда, когда количество билирубина в плазме крови превышает пороговое значение; при этом билирубин начинает связываться эластическими волокнами кожи и конъюктивы. В зависимости от механизма образования различают следующие виды желтух: • подпеченочная или механическая (обтурационная); 94 • печеночно-клеточная или внутрипеченочная (паренхиматозная или гепатоцеллюлярная); • гемолитическая (надпеченочная или внепеченочная). Обтурационная желтуха обусловлена вне- или внутрипеченочной обструкцией желчных путей вследствие частичного или полного прекращения оттока желчи. При гепатоцеллюлярной желтухе в результате интоксикации повреждается паренхима печени (печеночные клетки – гепатоциты), одновременно в крови повышается уровень конъюгированного и неконъюгированного билирубина. Гепатоцеллюлярная желтуха характерна для острого вирусного гепатита в токсической фазе, тяжелой бронхопневмонии, гриппа, токсикозов и других инфекционных заболеваний. Гемолитическая желтуха характеризуется чрезмерным образованием неконъюгированного билирубина либо его задержкой в организме при нарушении выведения. В плазме крови больных повышается уровень общего билирубина за счет неконъюгированного. Такое состояние характерно для гемолитических анемий с внутриклеточным и внутрисосудистым или смешанным гемолизом, гемолитического криза при малярии, при В12-мегалобластической анемии, действии токсинов (отравление грибами, змеиными ядами и т.д.) либо при трансфузии несовместимой крови. Повышенный уровень неконъюгированного билирубина в плазме крови наблюдается при нарушении его метаболизма, в частности, при наследственном нарушении транспорта желчных пигментов (синдром Жильбера). При физиологической желтухе новорожденных наблюдается транзиторная недостаточность механизмов конъюгации за счет недостаточности функции печени новорожденных. Лабораторные маркеры заболеваний поджелудочной железы Сахарный диабет (СД) – группа метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся гипергликемией, которая является результатом недостатка секреции инсулина, инсулинорезистентности или сочетания этих факторов. Глюкоза накапливается в крови, создавая гипергликемию, нередко превышающую почечный порог, что сопровождается глюкозурией. Накапливаясь в межклеточной жидкости, глюкоза вызывает эффект дегидратации клеток, полиурию. Накапливаются недоокисленные продукты распада жирных кислот – кетоновые тела, ацетил, который является источником синтеза холестерина. Увеличение количества кетоновых тел и снижение рН крови, связанное с повышенным выделением щелочных ионов (натрий, калий, аммоний) из организма с мочой при полиурии приводит к ацидозу – сдвигу реакции внутренней среды организма в кислую сторону. Это, в свою очередь, нарушает нормальное течение всех реакций обмена веществ. 95 Глюкоза – осмоактивное вещество, т.е. удерживает вокруг себя молекулы воды. Когда уровень глюкозы выше 30 ммоль/л, осмотическое давление повышается так значительно, что развивается дегидратация клеток тканей, содержащих рецепторы к инсулину, что вызывает гиперосмолярную кому. Основные лабораторные тесты при диагностике СД Определение уровня глюкозы в плазме/сыворотке, крови проводят натощак. Тест толерантности к глюкозе проводится в том случае, если неясен диагноз. Если же диагноз «сахарный диабет» не вызывает сомнений из клинической картины и повышенного уровня глюкозы натощак или после еды, то проведение теста толерантности к глюкозе не показано, так как этот тест не безразличен для функции поджелудочной железы. ВОЗ выработала рекомендации для проведения теста толерантности к глюкозе и критерии для постановки диагноза «сахарный диабет» или «нарушение толерантности к глюкозе» (табл. 6). Таблица 6 Диагностический уровень концентрации глюкозы (ммоль/л) Диагноз Норма Нарушение толерантности к глюкозе Сахарный диабет Момент взятия пробы Уровень концентрации глюкозы через 2 ч после нагрузки натощак 4,0–6,1 <7,8 7,0 через 2 ч после нагрузки >7,8 и <11,1 натощак натощак через 2 ч после нагрузки глюкозой 7,0 11,1 Показания и рекомендации по выполнению теста толерантности к глюкозе: • сомнительные результаты при измерении глюкозы в крови натощак/случайно; • клинические симптомы диабета, при которых уровень сахара в крови и моче нормальный. Гликозилированный (гликированный) гемоглобин (НвА1с). Около 5–8% гемоглобина, находящегося в эритроцитах, присоединяет к себе молекулу глюкозы, поэтому такие молекулы называют гликированными. Степень гликирования зависит от концентрации глюкозы, которая сохраняется в эритроцитах в течение их жизни, поэтому в любой конкретный момент времени процент НвА1с отражает средний уровень концентрации глюкозы в крови пациента на протяжении 2–3 месяцев, предшествующих исследованию. Норма НвА1с 4,5–6,5% от общего количества гемоглобина (табл. 7). 96 Измерение концентрации НвА1с показано для выявления: нарушенной толерантности к глюкозе; диабета, в том числе «скрытых» форм и диабета беременных; для оценки компенсации СД, эффективности лечения и степени риска осложнений. У пациентов, страдающих диабетом, при повышении уровня НвА1с >7,0% повышается риск осложнений. Таблица 7 Интерпретация результатов анализа на HbA1c Показатель НвА1с Значение 4–6,2% У пациента нет диабета 5,7–6,4% Преддиабет (нарушение толерантности к глюкозе, связанное с повышенным риском диабета) 6,5% и больше Пациент болен СД Повышенное содержание НвА1с может наблюдаться не только при СД и состояниях, сопровождающихся нарушением толерантности к глюкозе: • высокая концентрация фетального гемоглобина (HbF) влечет возрастание уровня НвА1с (когда HbF уходит из крови, норма НвА1 у ребенка уравнивается с нормой взрослого человека); • недостаток в организме железа проявляется увеличением процентного содержания HвA1с; • после удаления селезенки (спленэктомии) можно ожидать изменение многих показателей крови, в том числе, и рост HвA1с. Нечастым явлением считают снижение уровня HвA1с. Уменьшение его концентрации происходит в случаях: • снижения уровня глюкозы в крови; • усиленной продукции гемоглобина; • активации эритропоэза после потери крови; • усиленного разрушения эритроцитов при некоторых патологических состояниях (гемолитическая анемия); • кровоизлияний (острых и хронических); • почечной недостаточности; • гемотрансфузий. Острый панкреатит сопровождается активацией протеолитических ферментов и аутолизом поджелудочной железы. Фермент амилаза начинает повышаться в крови через 3–12 ч после начала заболевания, максимум в крови достигается через 20–30 ч, затем активность фермента уменьшается. В моче уровень амилазы повышается на 6–10 ч позднее, чем в сыворотке. Между степенью повышения α-амилазы и тяжестью панкреатита жесткой связи нет, тем не менее, высокие цифры α-амилазы свидетельствуют о тяжелой форме заболевания. Примерно в 20% случаев острый панкреатит протекает без 97 повышения активности α-амилазы в сыворотке, тогда как активность липазы у этих больных повышается. Хронический панкреатит сопровождается повышением α-амилазы и липазы при обострениях. В то же время поджелудочная железа является единственным источником образования трипсина, определение его активности может дать ценную информацию об экзокринной функции органа. Исследуют активность трипсина в крови, а также содержание в крови его ингибитора – α1-антитрипсина. Об обострении хронического панкреатита свидетельствует повышение в крови трипсина и уменьшение концентрации его ингибитора. Активность химотрипсина и эластазы исследуют в кале, эти тесты применяют для оценки экзокринной функции поджелудочной железы и при дифференциальной диагностике хронического панкреатита с синдромом мальабсорбции. Лабораторные маркеры заболеваний сердечно-сосудистой системы Инфаркт миокарда (ИМ) – следствие некроза миокарда в результате длительного нарушения кровоснабжения. Традиционными маркерами острого повреждения сердечной мышцы являются активность ферментов (КФК-МВ, АсАТ, ЛДГ) и сократительные белки (миоглобин, тропонины Т и I). Для ткани сердца характерен изофермент КФК-MB. Изофермент КФК-МВ важно исследовать при остром ИМ (ОИМ), так как эта изоформа в значительном количестве содержится практически только в сердечной мышце. КФК-МВ значительно более специфична при повреждении миокарда, чем общая активность КФК в сыворотке. Однако активность гена, кодирующего субъединицу B, может повышаться в регенерирующей скелетной мышце, что снижает специфичность этого маркера. Повышение активности ЛДГ, АсАТ тоже не является строго специфичным для ОИМ. Увеличение ЛДГ происходит за счет изофермента ЛДГ1. Различают 5 изоферментов ЛДГ. Изоферменты ЛДГ 1 и ЛДГ2 преобладают в миокарде, эритроцитах, лейкоцитах, почках; ЛДГ 4 и ЛДГ5 – в печени, скелетных мышцах, неопластических тканях; ЛДГ 3 – лимфоидной ткани, тромбоцитах, опухолях. При ОИМ концентрация ЛДГ начинает превышать нормальный уровень через 14–48 ч после начала симптомов, достигая максимального значения на 3–6-е сутки заболевания, и возвращается к норме на 7–14-е сутки. Из-за позднего повышения концентрации ЛДГ в сыворотке крови, этот маркер не применяется для ранней диагностики ИМ и суждения об успехе тромболитической терапии (табл. 8). У больных ИМ уровень АсАТ превышает норму через 8–12 ч после начала боли, достигает максимального значения к 24–36-му часу и возвращается к норме за 3–4 дня. Большое количество этого фермента содержится в тканях печени, что сильно снижает его специфичность в отношении некроза миокарда. 98 Повышение АсАТ, превышающее повышение АлАТ, характерно для повреждения сердечной мышцы; если же показатель АлАТ выше, чем АсАТ, то это, как правило, свидетельствует о разрушении клеток печени. Миоглобин – небольшой гем-содержащий растворимый белок скелетных мышц и миокарда. По структуре он сходен с гемоглобином и тоже связывает кислород. Концентрация миоглобина в плазме повышается через 2 часа после инфаркта, что позволяет осуществить раннюю диагностику этого заболевания. К сожалению, повышение уровня миоглобина в крови может быть вызвано и повреждением скелетных мышц, так как этот белок в них тоже присутствует. Таким образом, этот тест нельзя считать строго специфичным для ИМ. Массивное разрушение мышечной ткани, независимо от причины его возникновения, приводит к высвобождению миоглобинов. При этом мышца теряет до 75% пигмента и 65% калия. В нормальных условиях, в отсутствие повреждения или воспаления мышечной ткани, миоглобин в кровь не попадает. Таблица 8 Сравнительная кинетика маркеров ОИМ Показатель КФК-МВ ЛДГ АсАТ Миоглобин Тропонин Начало увеличения активности, час 2–4 8–10 4–6 0,5–2 4–10 Максимум увеличения активности, час 24–36 48–72 24–48 6–12 12–24 Возвращение к норме, сутки Увеличение, раз (max) 3–6 8–9 4–7 0,5–1 7–20 30 4 20 До 20 До 400 Тропонин входит в состав сократительной системы мышц. Сердце и скелетные мышцы содержат разные изоформы тропонинов I и T, что позволило создать тесты, высокоспецифичные для поражения сердца. С точки зрения диагностики инфаркта миокарда, обе субъединицы тропонина I и T совершенно равнозначны, и все международные рекомендации не делают различия между ними. Оба маркера (ТнI и ТнT) могут быть обнаружены в крови пациента спустя 3–6 часов после начала болей в груди, достигая пикового уровня в течение 12–36 часов (а иногда и позже). Концентрация тропонина в сыворотке в 1-й день после появления болей очень четко зависит от кровотока в зоне инфаркта. Это раннее вымывание тропонина обычно прекращается через 32 часа после начала болей. Отношение концентрации тропонина через 14 часов к его концентрации через 32 часа не зависит от величины инфаркта. Это отношение служит надежным индикатором успешной тромболитической терапии. Если отношение >1, то это является достоверным доказательством того, что ранняя реканализация окклюзированной артерии произошла успешно (менее чем за 6 часов от начала болей). Если при тромболитической терапии реперфузии не наступает, то отношение концентраций <1, и можно говорить о неэффективности проводимого лечения. 99 Внутри клетки содержится 95% тропонина, во внеклеточном пространстве – 5%, что объясняет двухфазность пика при ИМ. Повышение концентрации тропонинов у пациентов с нестабильной стенокардией говорит о неблагоприятном прогнозе и риске развития ИМ в ближайшие 4–6 недель. Экспресс-тесты (миоглобин, тропонин) для выявления ИМ в сыворотке, плазме или цельной крови человека выполняют иммунохроматографическим методом. При получении положительного результата экспресс-теста, проведенного пациентом дома, необходимо вызвать скорую помощь. При выявлении тропонинов в условиях больницы или поликлиники пациента доставляют в специализированный кардиологический стационар для дальнейшего обследования и лечения. Атеросклероз При атеросклеротическом повреждении сосудов используют несколько лабораторных тестов: общий холестерин, ЛПНП, ЛПВП, АпоВ и АпоА и маркер неспецифического воспаления СРБ. Измерение концентраций АпоВ и АпоА – ключевых белков ХС-ЛПНП и ХС-ЛПВП – это наиболее точное и однозначное определение баланса проатерогенных и антиатерогенных холестеринов, которое оценивает риск фатальных и нефатальных инфарктов миокарда в течение последующих пяти лет. Рекомендуемое значение АпоВ/АпоА – <1,1. Чем больше в сыворотке АпоА и меньше АпоВ, тем ниже вероятность развития сердечно-сосудистой патологии. При остром коронарном синдроме дестабилизацию (разрыв) атеромы и образование тромба связывают с процессами воспаления. У больных нестабильной стенокардией повышенный базовый уровень СРБ встречается значительно чаще (у 70% пациентов), чем при стенокардии напряжения (у 20% больных). Среди больных с нестабильной стенокардией, у которых развился острый инфаркт миокарда, уровень СРБ повышается (>3мг/л) практически у всех (98%) пациентов. Вялотекущее воспаление в интиме сосуда отражает уровень СРБ, определяемый высокочувствительным методом (hsСРБ). Этот показатель проспективно оценивает риск развития сосудистых осложнений, дополняя прогностическую информацию, которую дают классические факторы риска, такие как курение, ожирение, инсулинорезистентность, уровень холестерина и ЛПНП. Повышенное содержание гомоцистеина (ГЦ) является независимым фактором риска атеросклероза, деменции и болезни Альцгеймера. Гомоцистеин – это серосодержащая аминокислота, промежуточный продукт обмена аминокислот метионина и цистеина. Ключевую роль в обмене гомоцистина играют витамины В6, В12 и фолиевая кислота. Содержание гомоцистеина в плазме крови здорового человека составляет 5–15 мкмоль/л. Гомоцистеин ускоряет развитие атеросклероза с помощью трех основных эффектов: токсического действия на эндотелий сосудов, усиления адгезии 100 тромбоцитов, неблагоприятного воздействия на факторы свертывания крови. Увеличение концентрации ГЦ в плазме крови повышает агрегационную способность тромбоцитов и их адгезивные свойства. Эффективным средством снижения уровня гомоцистеина в плазме являются добавки фолиевой кислоты, одной или в комбинации с витаминами В6 и В12. Лабораторные маркеры заболеваний печени Гепатиты. Основным маркером гепатита является повышение в сыворотке активности ферментов АЛТ и АСТ за 3–4 дня по появления желтухи и увеличения билирубина. Для паренхиматозного гепатита характерно увеличение в системе циркуляции конъюгированного непрямого билирубина. При длительном затяжном течении наряду с непрямым повышается и прямой билирубин. При вовлечении в воспалительный процесс желчевыводящих путей маркером холестаза является повышение в сыворотке активности ЩФ. Совместное повышение в сыворотке ЩФ и ГГТ – четкий признак синдрома холестаза. При внутрипеченочной обтурации ЩФ может быть увеличенной более чем в 10 раз, при внепеченочной обтурации – в 2–3 раза, что объясняется меньшей степенью повреждения желчных протоков. Для синдрома холестаза характерно также повышение конъюгированного билирубина. Цирроз печени – прогрессирующее заболевание, характеризующееся перестройкой нормальной структуры печени с нарушением функции и развитием в последующем печеночной недостаточности. Наиболее важные причины, приводящие к циррозу печени – вирусный гепатит (прежде всего, гепатиты В и С) и алкоголизм. Цирроз печени развивается, как правило, в течение длительного периода и биохимически проявляется неактивно: имеет место незначительное повышение АсАТ и АлАТ и выраженное повышение ГГТ. Для оценки синтетической способности гепатоцитов используют определение в сыворотке концентрации альбумина, тестов коагуляционного звена гемостаза, активности холинэстеразы. В острых ситуациях уменьшение количества альбумина в сыворотке крови отражает перераспределение жидкости, потерю альбумина в выпотные жидкости, с мочой, а не снижение его синтеза. При хроническом гепатите гипоальбуминемия может быть результатом уменьшения синтеза. Рак печени. Опухолевым маркером первичного рака печени и метастазирования является альфа-фетопротеин (АФП). Биохимические маркеры повреждения почек Мочевина. В ходе нормального клеточного метаболизма аминокислот образуется аммиак (NH3). Этот токсический побочный продукт распада белков транспортируется кровью в печень, где обезвреживается, превращаясь в мочевину в ферментативном процессе, называемом циклом мочевины. Как вторичный метаболит она должна элиминироваться из организма. 101 Синтезируясь в печени, она переносится с кровью в почки, откуда выводится с мочой. Креатинин. Является конечным продуктом белкового обмена. Синтезируется в основном в мышцах, высвобождается из сокращающихся миоцитов и транспортируется в почки, откуда экскретируется вместе с мочевиной в составе мочи. Если способность почек выводить мочевину и креатинин нарушается, они начинают накапливаться в крови – сывороточные концентрации обоих метаболитов возрастают. Клиренс креатинина − чувствительный способ измерения скорости клубочковой фильтрации (СКФ). Фактически клиренс креатинина – это объем плазмы крови, который очищается от креатинина за 1 мин при прохождении через почки. Чем выше клиренс, тем эффективнее работают почки по очищению крови от креатинина и выведению его с мочой. Измерение концентрации мочевины и креатинина в сыворотке или плазме крови включено в большинство обычно выполняемых биохимических анализов. Оба теста используют для оценки функции почек. Нормальные показатели: креатинина: • у мужчин – от 70 до 110 мкмоль/л; • у женщин – от 40 до 90 мкмоль/л. клиренса креатинина: • у мужчин до 40 лет – 106–140 мл/мин; • у женщин до 40 лет – 85–105 мл/мин. С возрастом происходит постепенное снижение значений данного показателя. Нормальные показатели мочевины: 2,5–8,3 ммоль/л. Причины снижения концентрации мочевины в сыворотке/плазме крови: • беременность (обычно приводит к увеличению СКФ и, следовательно, к повышению скорости экскреции мочевины); • диета с низким содержанием белков; • болезни печени (снижение синтеза мочевины и накопление токсичного аммиака). Причины повышения концентрации мочевины и креатинина в сыворотке крови: • Нарушение фильтрационной способности почек при острой и хронической почечной недостаточности (ОПН, ХПН). • Умеренное повышение мочевины (<10,0 ммоль/л) может быть проявлением непочечной патологии. В этом случае уровень креатинина остается нормальным. Если же умеренно повышаются оба показателя, то это проявление дисфункции почек. Значительное увеличение уровня мочевины (>10,0 ммоль/л) всегда свидетельствует о поражении почек. 102 Внепочечные причины повышения уровня мочевины: белковая диета, распад белков при опухолях, желудочно-кишечные кровотечения из язв, опухолей и т.п. Цистатин С – современный лабораторный маркер исследования функции почек. Скорость синтеза цистатина С в организме постоянная и практически не зависит от антропометрических параметров (пола, возраста, массы тела и мышечной массы). Фильтрационная способность почек является единственным фактором, определяющим концентрацию цистатина С в сыворотке крови. Являясь белком с низкой молекулярной массой, он свободно фильтруется в почечных клубочках. Из ультрафильтрата цистатин С в почечных канальцах подвергается обратному всасыванию (реабсорбции) и полностью метаболизируется, то есть разрушается в почках и не возвращается назад в кровь. Нарушение функции клубочкового аппарата почек приводит к снижению СКФ и, соответственно, накоплению в крови некоторых веществ (в том числе цистатина С). Таким образом, существует зависимость между снижением СКФ и повышением уровня цистатина С в крови. С учетом этого были разработаны расчетные формулы, по которым можно достаточно точно рассчитать СКФ, основываясь на сывороточной концентрации цистатина С. Повышение концентрации цистатина С в крови указывает на снижение скорости клубочковой фильтрации и, следовательно, дисфункцию почек. ХАРАКТЕРИСТИКА И ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ФУНКЦИИ ЭНДОКРИННЫХ ЖЕЛЕЗ Практически все клетки организма способны синтезировать БАВ, имеющие свойства гормонов. Отдельные группы клеток, синтезирующие однотипные БАВ, составляют паракринную систему, а клетки, собранные в специализированную структуру, образуют железу, которая вырабатывает гормоны, способные регулировать различные процессы и поддерживать гомеостаз. Эндокринные железы, в отличие от экзокринных, выделяют свой секрет непосредственно в кровь и лимфу. Сововкупность эндокринных желез формирует эндокринную систему организма (рис. 25). По одной из принятых классификаций различают следующие группы эндокринных желез: • гипоталамо-гипофизарная система с нейросекреторными нейронами; • мозговые придатки: гипофиз и эпифиз; • бранхиогенная группа (эволюционно сформировалась из эпителия глоточных карманов): щитовидная железа, паращитовидные железы, вилочковая железа; • надпочечниково-адреналовая система: кора надпочечников, мозговое вещество надпочечников и параганглии; • АPUD-система (диффузная эндокринная система). 103 Кроме этого существуют железы, одновременно осуществляющие эндокринную и экзокринную функции. К таким железам относят поджелудочную железу (инсулин, глюкагон и ферменты поджелудочного сока) и половые железы (половые стероиды и половые клетки). К железам смешанной секреции также относят вилочковую железу и плаценту, которые сочетают синтез гормонов с неэндокринными функциями. Рис.25. Эндокринная система человека (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) По химической структуре различают 4 группы гормонов: • производные аминокислот; • белки и пептиды; • стероидные гормоны; • производные арахидоновой кислоты. К производным аминокислот относят амины, которые синтезируются в мозговом слое надпочечников (адреналин, норадреналин и дофамин – производные фенилаланина и тирозина), эпифизе (серотонин и мелатонин, синтезирующиеся из аминокислоты триптофан) и йодсодержащие гормоны щитовидной железы – трийодтиронин и тироксин (также производные тирозина). Помимо этого, можно выделить производное гистидина – гистамин, являющийся гормоноподобным веществом, выполняющим в организме ряд 104 важных функций. Следует отметить, что часть этих гормонов (серотонин, норадреналин, дофамин, гистамин) являются также и нейромедиаторами ЦНС. Белки и пептиды – это гормоны гипоталамуса и гипофиза, поджелудочной и паращитовидной желез и гормон щитовидной железы кальцитонин. Некоторые гормоны, например, фолликулостимулирующий и тиреотропный, являются гликопротеидами. Стероидные гормоны синтезируются в коре надпочечников и в половых железах из холестерина. Стероиды отличаются по количеству атомов углерода в молекуле: С21 – гормоны коры надпочечников и прогестерон, С 19 – мужские половые гормоны (андрогены и тестостерон), С 18 – женские половые гормоны (эстрогены). Арахидоновая кислота и ее производные: простагландины, простациклины, тромбоксаны, лейкотриены – гормоноподобные вещества, являющиеся медиаторами воспалительного процесса (как и гистамин). Одно из важных свойств гормонов – их высокая биологическая активность. Незначительное их количество оказывают мощное воздействие на деятельность определенных органов и их систем. Например, кортиколиберин гипоталамуса, выделяющийся в количестве 0,1 мкг, способствует секреции 1 мкг АКТГ, который, в свою очредь, вызывает секрецию 40 мкг кортизола, инициирующих превращение 5600 мкг гликогена в глюкозу. Особенность гормонов – специфическое влияние на строго определенный тип обменных процессов или на определенную группу клеток. Свойства тропности и генерализованности действия гормонов связаны с наличием специализированных рецепторов к тому или иному гормону в клетке и их плотностью (количеством), которая является динамической величиной, изменяющейся под воздействием экзо- или эндогенных факторов. В зависимости от этого различают высокоспецифические (рилизинг-факторы гипоталамуса), низкоспецифические (тироксин, адреналин) и избирательно специфические (инсулин, кальцитонин) гормоны. В ряде случаев на одной и той же клетке есть рецепторы к разным гормонам, что обусловливает сложные процессы взаимовлияния на конечный результат. Различают синергическое взаимодействие (аддицию), когда несколько гормонов действуют однонаправлено, а их эффекты суммируются, потенцирование (при комбинированном действии результирующий эффект выше, чем при простом суммировании их отдельных эффектов), сенсибилизацию – усиление эффекта одного гормона на фоне присутствия другого, сходным эффектом не обладающего, пермиссивное (разрешающее) действие, при котором реализация эффекта одного гормона обязательно сопряжена с присутствием другого (например, глюкокортикоиды) и антагонизм, когда каждый из гормонов изучаемой пары оказывает на функцию противоположное действие. Так, если инсулин снижает уровень сахара в крови, то глюкагон его повышает. Еще одним важным свойством гормонов является наличие у некторых из них выраженной видовой специфичтости, что тесно коррелирует с их 105 химической струтктурой. Так, гормоны, обладающие «простой» организацией – производные аминокислот и стероиды – не обладают видовой специфичностью, в то время как белково-пептидные гормоны в той или иной степени видоспецифичны. Это находит свое отражение в фармакологии при заместительной терапии, внося сложности в использовании гормонов животного происхождения. Это связано как с некоторым отличием в структуре белка, так и с восприятием его организмом человека как чужеродного. Для оценки эффективности гормонов и гормонодиагностики имеет значение и интенсивность их метаболизма (табл. 9). Таблица 9 Пролонгированность действия некторых гормонов Гормон Время метаболизма 4 сут 45 ч 70–90 мин 50–60 мин 30–40 мин 30–40 мин 90–105 мин 20–25 мин 15–17 мин 10–12 мин 10–15 мин 10–25 мин 8–10 мин 15–20 мин 2,5–5 мин 30–150 сек Тироксин (Т4) Трийодтиронин (Т3) Кортизол Кортикостерон Альдостерон Тестостерон Прогестерон Эстрадиол Соматотропный гормонСТГ) Тиреотропный гормон (ТТГ) АКТГ Мелатонин Инсулин Вазопрессин (АДГ) Рилизинг-факторы Катехоламины Гормоны оказывают влияние на интенсивность обмена веществ (тироксин, кортизол), рост и дифференцировку тканей (СТГ, половые гормоны), определяют наступление полового созревания. На клеточном уровне действие гормонов осуществляется двумя путями. Одни действуют на клетки, связываясь с белками-рецепторами на их поверхности (АДГ, инсулин, адреналин), другие проникают в клетку и активируют определенные гены (тироксин, эстрадиол, кортизол). Эндокринную систему нельзя рассматривать отдельно от других жизненно важных систем организма, например, таких как нервная и иммунная. Вырабатываемые в организме гормоны могут влиять на активность нервных клеток, модулировать иммунную реактивность. В свою очередь компоненты иммунной системы оказывают существенное влияние на работу желез внутренней секреции и ЦНС, а нервная система, влияя на внутренние органы, координирует их функцию. Таким образом, нервная, иммунная и эндокринная системы составляют единое целое и объединяются, согласно современным представлениям, в единую нейроиммуноэндокринную систему. 106 Помимо этого, надо помнить, что физиологические процессы в организме характеризуются ритмичностью. У животных и человека наблюдаются половые циклы, сезонные колебания физиологической активности щитовидной железы, надпочечников, половых желез, суточные изменения двигательной активности, температуры тела, частоты сердцебиения, обмена веществ объединенные в понятия циркадианных, ультрадианных и инфрадианных биологических ритмов, знание которых необходимо для правильной оценки работы органов и систем при проведении лабраторных тестов. Таким образом, эндокринная регуляция жизнедеятельности организма является комплексной и сбалансированной. Изменения физиологических и биохимических реакций под действием гормонов способствуют приспособлению организма к изменяющимся условиям окружающей среды. Центральные регуляторы эндокринных функций Гипоталамус – область промежуточного мозга, по своей анатомической сути, являющаяся нервным центром, а по функции еще и железой внутренней секреции. В его ядрах синтезируются и секретируются гормоны, которые либо поступают непосредственно в кровеносное русло гипоталамо-гипофизарнопортальной системы, либо в виде нейромедиаторных пузырьков длинных аксонов супраоптических и паравентрикулярных ядер переднего гипоталамуса, минуя ГЭБ, попадают в нейрогипофиз, откуда выделяются в кровь. Гипоталамус является ведущим образованием в активации функции аденогипофиза при помощи гипофизотропных гормонов, получивших название рилизинг-гормоны (либерины). Эти вещества продуцируются в гипоталамусе пептидергическими терминалями, содержащими в высокой концентрации также и статины, которые напротив, тормозят выделение гипофизарных гормонов. Различают следующие либерины: пролактолиберин, соматолиберин, люлиберин, фоллиберин, тиролиберин, кортиколиберин, меланолиберин. Ингибирующие факторы (статины) найдены пока что только к трем гормонам, которые не являются тропными к определенному органу внутренней секреции. К ним относятся соматоститин, меланостатин и пролактостатин. Таким образом, существуют рилизинг-факторы гипоталамуса: • тиролиберин – гормон, который стимулирует выделение гипофизом ТТГ; • люлиберин и фоллиберин – гормоны, которые стимулируют продукцию обоих гонадотропинов: ЛГ и ФСГ; • кортиколиберин – гормон, который стимулирует выделение АКТГ; • соматолиберин – гормон, который стимулирует выделение СТГ. Существует теория о двойном механизме гипоталамической регуляции тропных функций гипофиза – стимулирующем и ингибирующем. Примером двойного механизма гипоталамической регуляции тропных функций служит контроль секреции пролактина. Известно, что основная роль в регуляции выделения пролактина принадлежит туберогипофизарной дофаминовой системе. Секрецию пролактина стимулирует тиролиберин, основная функция которого заключается в активации продукции ТТГ, а ингибитором секреции 107 пролактина служит дофамин. Дофамин тормозит выделение пролактина из лактотрофов гипофиза. Антагонисты дофамина – резерпин, аминазин, метилдофа и другие вещества этой группы, истощают запасы дофамина в церебральных структурах, и этим вызывают усиление выделения пролактина. Способность дофамина подавлять секрецию пролактина широко используется в акушерстве и эндокринологии. Агонист дофамина бромкриптин и его аналоги успешно применяют для лечения функциональной гиперпролактинемии и пролактинсекретирующей аденомы гипофиза (табл. 10). Таблица 10 Нейрогормоны гипоталамуса и гормоны аденогипофиза ими регулируемые Гипоталамический нейрогормон Тиролиберин Гонадолиберин Дофамин Кортиколиберин Соматолиберин Соматостатин Меланостатин Пролактиностатин Гипофизарный гормон ТТГ, пролактин Гонадотрофины, пролактин? Гонадотрофины, ТТГ, пролактин АКТГ, меланокортины СТГ СТГ, ТТГ, АКТГ Меланотропины Пролактин Принципы организации функций желез внутренней секреции Эпифиз (шишковидная железа) – паренхиматозный орган, включающий три основных клеточных компонента: пинеалоциты, глию и нервные окончания, которые расположены преимущественно в околососудистом пространстве вблизи отростков пинеалоцитов. Основными стимулами являются свет и эндогенные механизмы генерации биологических ритмов. Световые сигналы передаются в супрахиазматические ядра гипоталамуса, являющиеся ведущим осциллятором циркадианных ритмов. Считается, что ретиногипоталамический путь запускает механизм генерации ритма, который действует на остальные структуры. Эпифиз секретирует мелатонин из серотонина в соответствии с суточным ритмом. Кроме того, эпифиз выделяет вещества, оказывающие антигонадотропное, антитиреоидное и антистероидное действие. Мелатонин оказывает широкий спектр влияний на гормональный статус организма. Он тормозит образование тиролиберина, тиреотропного гормона, гонадотропных гормонов, окситоцина, тиреоидных гормонов, тирокальцитонина, инсулина, а также синтез простагландинов. Этот гормон снижает сексуальную возбудимость и осветляет кожу путем воздействия на меланофоры. Гипофиз, или нижний мозговой придаток, расположен в углублении турецкого седла и соединяется ножкой со структурами гипоталамуса. Представляет собой железу с массой около 0,5 г. В нем выделяют два основных отдела: переднюю долю – аденогипофиз и заднюю – нейрогипофиз. 108 Аденогипофиз синтезирует и секретирует гормоны: • АКТГ – кортикотропин, который регулирует активность коры надпочечников; • гонадотропные гормоны – гонадотропины – ФСГ и ЛГ, которые стимулируют деятельность мужских и женских половых желез; • ТТГ – тиреотропин, который регулирует функцию щитовидной железы; • СТГ – соматотропин, который стимулирует рост организма и дифференцировку тканей; • пролактин – регулятор фертильности и лактации у женщин. Нейрогипофиз накапливает синтезируемый в нервных ядрах гипоталамуса вазопрессин или АДГ, который контролирует обратное всасывание воды в почечных канальцах на определенном уровне и является одним из факторов, определяющих постоянство водно-солевого баланса в организме. Вазопрессин уменьшает мочевыделение, а также сужает кровеносные сосуды, что обусловливает повышение кровяного давления. Вторым гормоном, депонирующимся в нейрогипофизе является окситоцин, который вызывает сокращение гладких мышц матки, кишечника, желчного и мочевого пузыря (рис. 26). Рис. 26. Гипофизарные гормоны и их местоприложение (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) Изменение функций гипофиза Нарушения функций гипофиза сопровождаются избыточным либо недостаточным образованием гормонов. Причиной их могут быть гиперстимуляция рилизинг-гормонами, сопровождающаяся гиперфункцией 109 соответствующих клеток и их последующей гиперплазией, которая может завершиться формированием аденомы, а также первичные опухоли гипофиза. При нарушении гормонообразовательной функции гипофиза возникают разнообразные синдромы. Гипоплазия и атрофия аденогипофиза, а также разрушение его паренхимы патологическим процессом вызывают пангипопитуитаризм, сопровождающийся выпадением функции периферических эндокринных желез, и гипофизарную кахексию. Разрушение задней доли, повреждение ножки гипофиза или поражение ядер переднего гипоталамуса ведут к возникновению несахарного диабета. Гиперпродукция соматотропина при наличии в гипофизе опухоли, именующейся соматотропиномой, ведет к развитию акромегалии или гигантизма в детском и юношеском возрасте, а недостаточная продукция – к карликовости. Гиперпролактинемия функционального или опухолевого происхождения сопровождается развитием галактореи – синдрома аменореи и гипогонадизма. Гиперпролактинемия может быть связана и с синдромом так называемого «пустого турецкого седла», развивающимся, как правило, при разрушении его спинки. Обычно он наблюдается у тучных женщин, нередко страдающих артериальной гипертензией. При этом отмечаются головные боли, головокружения, сочетающиеся с расстройством менструального цикла. Первичное нарушение продукции гонадотропинов (лютропина и фоллитропина) вызывает расстройства половых функций: раннее половое созревание у детей, а при выпадении гонадотропной функции – гипогонадотропный гипогонадизм. Чревато расстройствами половых функций также нарушение циклической гонадотропной функции гипофиза у женщин. Гиперфункция кортикотрофов, связанная как с их гиперплазией вследствие гиперстимуляции рилизинг-гормонами, так и с первичной кортикотропиномой гипофиза, приводит к развитию болезни ИценкоКушинга, а выпадение кортикотропной функции – к недостаточности надпочечников. Гипопитуитаризм (от glandula pituitaria – гипофиз) – хроническое болезненное состояние, вызываемое ослаблением внутренней секреции гипофиза. Проявляется недостаточностью функций других желез внутренней секреции – щитовидной железы, коры надпочечников и половых желез. Гипопитуитаризм могут вызывать травмы, опухоли, инфекции, кровоизлияния в области основания мозга. Болезнь проявляется задержкой роста (гипофизарная карликовость), нарушением жирового обмена – ожирением или резким истощением (кахексией), недоразвитием половых органов. У женщин при гипопитуитаризме прекращаются менструации, атрофируются матка, яичники, молочные железы. У мужчин происходит атрофия яичек и полового члена. Характерны физическая и психическая вялость, частые головокружения, шум в ушах, головные боли, сонливость, быстрая утомляемость, понижение основного обмена веществ. 110 Гипофизарная (гипопитуитарная) кома. Эта редкая патология чаще всего обусловлена сосудистыми нарушениями в гипофизе вследствие обильной кровопотери, опухоли и травмы гипоталамо-гипофизарной области, инфекционно-воспалительных заболеваний головного мозга с преимущественно базальной локализацией патологического процесса. Спровоцировать развитие комы могут стрессовые ситуации (переохлаждение, травмы, инфекции), неадекватная терапия тиреоидином, назначение инсулина, диуретиков, барбитуратов, применение наркотиков. Щитовидная железа Это непарная, самая крупная из желез внутренней секреции. Располагается в переднем отделе шеи, сбоку и спереди от гортани и трахеи, как бы охватывая их. Железа имеет форму подковы с вогнутостью, обращенной кзади, и состоит из двух неодинаковых по величине боковых долей: правой доли, lobus dexter, и левой доли, lobus sinister, и соединяющего обе доли непарного перешейка щитовидной железы, isthmus glandulae thyroideae. Перешеек может отсутствовать, и тогда обе доли неплотно прилегают одна к другой (рис. 27). Рис. 27. Щитовидная железа (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) ЩЖ вырабатывает гормоны тироксин, трийодтиронин, тиреокальцитонин и кальцитонин, которые регулируют обмен веществ (кальция и фосфора) в организме, увеличивая теплообмен и усиливая окислительные процессы, принимают участие в костеобразовании. В тканях щитовидной железы происходит накопление йода. 111 Содержание тиреоидных гормонов в крови не является строгой константой гомеостаза. В целом ряде случаев наблюдают как физиологическое повышение (активная работа, зима, беременность), так и понижение (покой, тепло, уменьшение массы тела) выработки тиреоидных гормонов. Регуляция деятельности. Функция ЩЖ регулируется двумя общими механизмами: супратиреоидным и местным интратиреоидным (рис. 28). Конечным медиатором супратиреоидной регуляции является тиреотропин (тиреотропный гормон, ТТГ) – гликопротеид, секретируемый базофильными (тиреотрофными) клетками передней доли гипофиза. Рис. 28. Схема регуляции функции щитовидной железы (ресурсы сети Интернет) ТТГ стимулирует гипертрофию и гиперплазию тиреоидных клеток, ускоряет большинство реакций межуточного обмена в ЩЖ, повышает синтез нуклеиновых кислот и белка (в том числе тиреоглобулина) и активирует все этапы синтеза и секреции тиреоидных гормонов. Эти эффекты ТТГ обусловливаются его связыванием специфическими рецепторами на поверхности фолликулярной клетки и последующей активацией фермента плазматической мембраны – аденилатциклазы. Возрастающая концентрация цАМФ в клетке запускает большинство реакций, характерных для действия ТТГ. Секреция тиреоидных гормонов в ответ на ТТГ – это острая реакция. Если повышенный ТТГ действует длительно, то проявляется его хронический эффект – увеличение как числа клеток – тироцитов, так и их объема. Из-за этого появляется и растет зоб. Регуляция секреции ТТГ, в свою очередь, осуществляется двумя противоположными влияниями на тиреотрофную клетку. Тиреотропинрилизинг-гормон (ТРГ) – трипептид гипоталамического происхождения – стимулирует секрецию и синтез ТТГ, тогда как тиреоидные гормоны непосредственно ингибируют механизм секреции ТТГ и препятствуют действию ТРГ. Таким образом, гомеостатическая регуляция секреции ТТГ осуществляется тиреоидными гормонами по механизму отрицательной обратной связи. ТРГ синтезируется в вентромедиальном отделе гипоталамуса, поступает в гипофиз по системе воротного кровообращения этой железы и 112 связывается со специфическими рецепторами на плазматической мембране тиреотрофной клетки. Тиреоидные гормоны прямо не влияют на гипоталамическую секрецию ТРГ, но уменьшают число рецепторов ТРГ на тиреотрофной клетке и тем самым нарушают ее реактивность по отношению к ТРГ. Основная роль в действии тиреоидных гормонов на клетки гипофиза принадлежит трийодтиронину (Т3), как образующемуся здесь же из тироксина (Т4), так и поступающему из пула свободного Т3 плазмы. Экстремальные проявления действия этого механизма наблюдаются при тиреотоксикозе. При этом уровни Т4 и Т3 возрастают, в ответ на это ТТГ падает почти до неопределимых величин. Кардинально противоположная картина наблюдается при гипотиреозе, когда ЩЖ поражена, к примеру, аутоиммунным процессом, и не может удовлетворить потребности организма в гормонах. Уровни Т4 и Т3 в крови понижены, а их тормозное влияние на гипофиз незначительное. В такой ситуации гипофиз секретирует ТТГ в огромных количествах. Большая часть гормонов циркулирует в крови в связанном виде, и только 0,5% Т4 и 0,05% Т3 находятся в свободном состоянии. В фолликулах (структурно-функциональной единице ЩЖ) гормоны Т3 и Т4 связаны с белком тиреоглобулином (ТГ), который играет незаменимую роль в йодировании L-тирозина. После того как эти гормоны попадают в кровь транспортными белками для них служат тироксинсвязывающий глобулин (ТСГ) и альбумин. Свободные фракции тиреоидных гормонов в лабораторной диагностике обозначают также как fT4 и fT3 (в русской транскрипции сТ4 и сТ3). Патология щитовидной железы Болезни ЩЖ распространены во всем мире. Практически каждый второй человек на Земле имеет тот или другой патологический процесс в ЩЖ. Любые повреждения ЩЖ чаще встречаются у женщин. Причины широкой распространенности патологии ЩЖ: • дефицит йода и, в меньшей степени, его избыток; • действие радиации, токсинов, других неблагоприятных экологических факторов; • генетический фактор; • аутоиммунные процессы; • дисфункция гипоталамо-гипофизарного участка; • стрессы; • ятрогенные факторы (хирургические вмешательства, действие медикаментов). Йододефицит считается основной причиной эндемического зоба. При этом он одновременно признается одним из факторов, приводящих к возникновению узлов в ЩЖ. Особенно тяжело протекают йододефицитные состояния при недостатке йода и селена одновременно. На ЩЖ также существенно влияют радиационные факторы, последствия чернобыльской аварии. Еще более тяжелая ситуация складывается в регионе с повышенным 113 шахтным радиационным фоном и присутствием в атмосфере солей тяжелых металлов в высокой концентрации. Патология ЩЖ может быть первичной (нарушения в самой железе) и вторичной (результат сбоя в гипоталамо-гипофизарном отделе ЦНС). Для того чтобы своевременно распознать начало заболевания и первые признаки изменений со стороны ЩЖ предлагаются разные методы диагностики. Субклинический гипотиреоз – состояние, когда падение уровней Т3 и Т4 носит временный характер и столь незначительно, что почти никаких проявлений гипотиреоза у пациента нет. При этом уровни гормонов в анализе крови нормальные, а ТТГ уже увеличивается до верхних границ нормы и даже чуть выше. Такое состояние, существующее длительно в нелеченном виде, приводит к возникновению диффузного и узлового зоба. Гипотиреоз – наиболее частая разновидность патологии ЩЖ. Он вызывает стойкое и прогрессирующее нарушение обмена веществ, ухудшает работу сосудов и сердца, желудка и кишечника, влияет на деятельность нервной системы (рис. 29). Низкий уровень гормонов неизбежно влияет на работу мозга: снижается производство серотонина и дофамина – нейромедиаторов, отвечающих за положительные эмоции. По этой причине гипотиреоз часто вызывает плаксивость, капризность, обидчивость, снижение когнитивных способностей, развитие длительных депрессий. Установлено, что пятая часть депрессивных состояний (особенно у женщин), которые лечат медикаментами и психотерапией, вызвана на самом деле недостатком Т3, Т4. Рис. 29. Зоб, располагающийся, главным оразом, в районе перешейка (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) • • • • • • • • Наиболее частые симптомы гипотиреоза: утомляемость, отсутствие сил, постоянная усталость; сонливость; пониженный тонус мышц; необоснованное беспокойство; безразличие к сексу; периодические запоры; проблемы с памятью; частые судороги; 114 • • • • • • • увеличение веса, несмотря на обычное количество пищи; выпадение волос; сухость кожи; повышенный холестерин; гипертензия (высокое давление); изменение тембра голоса; нарушение глотания (дисфагия). Без лечения заболевание чревато угрожающими жизни осложнениями: самым опасным из них является гипотиреоидная кома. Данное состояние часто возникает у пожилых женщин при отсутствии специфической терапии. Падение уровня тиреоидных гормонов в организме приводит к угнетению функциональности всех систем. Больной в таком статусе нуждается в срочной госпитализации. Кома может быть спровоцирована переохлаждением, острыми инфекциями, инфарктом миокарда. Микседема («слизистый отек») – заболевание, обусловленное дефицитом гормонов щитокидной железы. Рассматривается как крайняя, клинически выраженная форма гипотиреоза. Вследствие нарушения белкового обмена органы и ткани становятся отечными. В межклеточных пространствах увеличивается содержание муцина и альбуминов. Онкотическое давление тканевой жидкости повышается, вследствие чего жидкость задерживается в тканях, вызывая отеки. В комплексе – это и есть муциновый отек (микседема). Основной обмен при микседеме падает на 30-40%. Кретинизм – это проявление врожденного гипотиреоза. Он характеризуется выраженным снижением функции щитовидной железы и проявляется, задержкой физического и умственного развития (рис. 30). Рис. 30. Ребенок, страдающий кретинизмом (слева) и здоровый ребенок (справа) одного возраста. Разница в росте – 30 см (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) 115 Кретинизм, или врожденный гипотиреоз, может быть вызван как патологией со стороны эндокринной системы (щитовидной железы – при первичном и гипоталамо-гипофизарной системы – при центральном гипотиреозе), так и дефицитом йода, необходимого для синтеза тиреоидных гормонов. Характерный признак кретинизма – задержка роста и умственная отсталость, доходящая иногда до идиотии. У таких больных при карликовом росте (90–110 см, тиреогенный нанизм) крайне непропорциональное строение тела: короткие конечности, большая голова, маленькие косые глаза, вдавленная переносица. Кожа толстая и грубая. Вторичные половые признаки недоразвиты. В тяжелых случаях гипотиреоза наблюдаются микседематозные отеки (микседематозный кретинизм). Гипертиреоз (тиреотоксикоз) – гиперфункция ЩЖ, более часто диагностируют у женщин 20–40 лет. Заболевание обычно носит аутоиммунное происхождение – то есть, вызвано агрессивным поведением собственных антител, стимулирующих избыточную активность органа. Повышенная выработка тиреоидных гормонов вызывает интоксикацию и сбои в деятельности многих органов (в частности сердца). Основные симптомы гипертиреоза: • раздражительность, агрессивность, нервозность; • интенсивное потоотделение; • тахикардия; • диарея и другие проявления диспепсии; • тремор рук; • снижение веса на фоне нормального (иногда даже избыточного) питания; • импотенция у мужчин. Аутоиммунные заболевания ЩЖ являются классической моделью органоспецифической патологии. Их можно подразделить на две основные группы: Диффузный токсический зоб (ДТЗ, болезнь Грейвса, Базедова болезнь) – это аутоиммунное заболевание, обусловленное избыточной секрецией тиреоидных гормонов, которое приводит к отравлению этими гормонами, приявляющемуся тиреотоксикозом. ДТЗ проявляется триадой – гипертиреоидизмом, зобом и экзофтальмом (выпученными глазами). Вследствие того, что гормоны щитовидной железы имеют множество физиологических функций, болезнь имеет многообразные проявления, характерные для гипертиреоза, но имеющие крайнюю форму выражения. При Базедовой болезни характерны офтальмологические проявления: так называемая «тиреоидная болезнь глаз», которая включает в себя следующие признаки: подъем верхнего века, опущение (зияние) нижнего века, неполное смыкание век, экзофтальм, периорбитальный отек и разрастание периорбитальных тканей (рис. 31). Дефекты полей зрения и повышенное внутри глазное давление, боль в глазах и даже полная слепота могут быть 116 результатом сдавленияо течными периорбитальными тканями глазного нерва или глазного яблока. Рис. 31. Проявление базедовой болезни (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) Аутоиммунный тиреоидит (АИТ), который включает два основных варианта: классический гипертрофический вариант (тиреоидит Хашимото), протекающий на фоне эутиреоза или гипотиреоза, и атрофический вариант АИТ, который сопровождается гипотиреозом. Кроме того, АИТ может иметь транзиторный характер (чередование фаз тиреотоксикоза и гипотиреоза); в частности, послеродовый тиреоидит встречается примерно у 5–6% женщин. АИТ – аутоиммунный процесс в ЩЖ, обусловленный появлением антител к тиреопероксидазе (АТ-ТПО), содержащейся в микросомальном аппарате тироцитов, и антител к тиреоглобулину (АТ-ТГ), находящемуся в коллоиде фолликулов ЩЖ. АТ-ТПО присутствуют в сыворотке у большинства пациентов с болезнью Грейвса (80%), тиреоидитом Хашимото (более 90%), послеродовым тиреоидитом (60%); их распространенность среди лиц без нарушения функции ЩЖ достигает 26%. АТ-ТПО продуцируются В-лимфоцитами, инфильтрирующими ЩЖ, и их уровень отражает выраженность лимфоидной инфильтрации. ТПО и АТ-ТПО вовлечены в комплементзависимую цитотоксичность и антителозависимые клеточно-опосредованные механизмы цитотоксичности, включающие NK-клетки. Кроме того, было обнаружено, что ТПО может активировать каскад комплемента в несвязанном с антителами состоянии. Аутоиммунные процессы в ЩЖ являются также Т-лимфоцитзависимыми процессами. При всех аутоиммунных заболеваниях ЩЖ происходят схожие процессы, и они развиваются в соответствии со схожими патофизиологическими механизмами. Они могут встречаться у членов одной семьи и, в отдельных достаточно редких случаях, у одного и того же пациента может наблюдаться трансформация одного аутоиммунного заболевания ЩЖ в другое. Кроме того, аутоиммунные тиреопатии могут сочетаться с другими аутоиммунными заболеваниями, в частности, с первичным гипокортицизмом, пернициозной анемией, первичным гипогонадизмом, миастенией и рядом других. 117 Лабораторная диагностика заболеваний щитовидной железы Наиболее распространенным и популярным на сегодня является определение содержания гормонов ТТГ, фракции Т4, Т3, АТ-ТПО и АТ-ТГ иммунохемилюминисцентным, радиоиммунологическим и иммуноферментным методами. Показания к назначению определения ТТГ в крови: • подтверждение диагноза и дифференцировка форм центрального и периферического гипо- или гипертиреоза; • подозрение на аутоиммунный тиреоидит и рак ЩЖ (в динамике заболевания). Показаниями к определению Т4 и Т3 является диагностика и контроль эффективности лечения любых заболеваний ЩЖ, поскольку их количественное содержание, как правило, определяет наличие клинических проявлений заболевания. Высокое содержание общего Т4 и/или Т3 может наблюдаться при синдроме повышенного содержания ТСГ, а повышение содержания свободных фракций этих гормонов – при нарушении синтеза этих белков при патологии печени. Низкий уровень общего Т4 и Т3 может наблюдаться в пожилом возрасте, при атеросклерозе, заболеваниях почек, сердца, психосоматических расстройствах; приеме препаратов йода, брома, нейротропных веществ. Самыми надежными и точными маркерами функции ЩЖ являются свободные фракции Т4 и Т3, т.к. их уровень не зависит от содержания ТСГ. Однако, учитывая, что большая часть Т3 образуется из Т4, а концентрации свободного Т4 превышают на порядок таковые свободного Т3, можно сказать, что основным маркером оценки гормональной активности ЩЖ является сТ4. В случае, когда имеется клинически очевидное заболевание, и целью лабораторной диагностики является подтверждение диагноза, целесообразно проводить обследование по двум гормонам – ТТГ и сТ4. Если лабораторное исследование проводят по типу скрининга в группах с высокой вероятностью тиропатии, разумнее использовать при этом на начальном этапе определение только ТТГ, что позволит исключить эутиреоз (уровень ТТГ нормальный), а при получении повышенного или пониженного уровня ТТГ дополнительно исследовать свободный Т4, с целью выявления как субклинических вариантов распространенных тиропатий, так и более редких клинических ситуаций. Для оценки адекватности терапии первичного гипотиреоза рекомендуется исследовать уровень ТТГ. При этом важно помнить, что уровень гормона нормализуется не ранее, чем через 2 месяца после восполнения дефицита Т4. Более раннее исследование неизбежно влечет за собой ошибочное заключение о недостаточности терапии. При тиреотоксикозе быстрее нормализуется уровень тиреоидных гормонов, чем растормаживается секреция ТТГ. Определение свободных Т4 и 118 Т3 при изолированном Т3-токсикозе, начиная с 3 месяцев лечения, служит более достоверным показателем эутиреоза. При достижении клинического и лабораторного эутиреоза, дальнейший лабораторный контроль (по уровню ТТГ) целесообразно проводить с интервалом 1 раз в 6–12 месяцев пожизненно при гипотиреозе и 1 раз в 1–3 месяца (в зависимости от клиники) на протяжении 1,5–2-годичного периода лечения диффузного токсического зоба. Информативным методом для динамического наблюдения за пациентами с удаленным раком ЩЖ и для диагностики тиреотоксикоза, вызванного приемом гормонов ЩЖ, является исследование уровня ТГ. Повышение содержания в крови ТГ отражает нарушение целостности гемато-фолликулярного барьера и наблюдается при заболеваниях, протекающих с нарушением структуры железы. ТГ – матрица для синтеза тиреоидных гормонов, представляет собой гликопротеид, состоящий из двух идентичных субъединиц с молекулярным весом по 330 кДа. Он синтезируется фолликулярными тироцитами и транспортируется в коллоид. В области апикальной мембраны тироцита происходит йодирование ТГ по тирозильным остаткам. Уровень йодирования ТГ, содержащегося в коллоиде, варьирует и, по некоторым данным, он в значительной мере может определять иммуногенные свойства ТГ. В небольших количествах ТГ высвобождается из ЩЖ в кровоток, где он оказывается доступным для иммунокомпетентных клеток. Показания к определению ТГ: • раннее выявление рецидивов и метастазов рака ЩЖ у оперированных больных; • оценка эффективности радиойодтерапии метастазов рака ЩЖ (по убыли его содержания в крови до нормальных значений); • определение тяжести тиреотоксикоза и контроль эффективности его лечения. Определение ТГ нельзя проводить с целью дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей ЩЖ, однако его увеличение в 4 и более раза в дооперационный период указывает на наличие рака ЩЖ и/или метастазов в отдаленные органы. ТСГ является белком, синтезируемым печенью и специфически связывающим Т4 и Т3. Определение ТСГ необходимо проводить с целью выявления наследственных аномалий синтеза ТСГ, что может явиться причиной гипотиреоза. Временное повышение в крови концентрации ТСГ возможно под влиянием эстрогенов при беременности или при терапии эстрогенами, что, однако, клинически сопровождается эутиреозом. Низкий уровень ТСГ может наблюдаться при циррозе печени, нефрозе, терапии андрогенами. Несмотря на то, что ключевым звеном патогенеза аутоиммунных заболевания ЩЖ, как правило, является Т-клеточная аутоиммунная агрессия, в сыворотке пациентов в большинстве случаев выявляются циркулирующие антитела. За исключением стимулирующих антител к рецептору ТТГ 119 (АТ-рТТГ), антитела к ЩЖ, судя по всему, не играют ключевой роли в патогенезе аутоиммунных заболеваний, а появляются в процессе аутоиммунной агрессии, когда происходит деструкция тироцитов Т-клетками. Тем не менее, определение уровня циркулирующих антител к ЩЖ в клинической практике может подтвердить аутоиммунную природу тех или иных заболеваний ЩЖ, а также помочь в их диагностике. Определение уровня антител к ЩЖ является быстрым, достаточно чувствительным и вполне надежным методом диагностики аутоиммунных заболеваний ЩЖ, а в ряде случаев, в частности при болезни Грейвса, оно может помочь оценить прогноз консервативной терапии. К наиболее значимым по сегодняшним представлениям антигенам ЩЖ относят ТГ, ТПО и рТТГ. АТ-ТГ вырабатываются при контакте содержимого коллоида с кровью, и используются для диагностики АИТ и фолликулярного рака ЩЖ. АТ-ТГ относятся к иммуноглобулинам класса G и реже – к иммуноглобулинам классов А и М. АТ-ТПО – аутоантитела, направленные против фермента апикальной части фолликулярных клеток, катализирующего йодирование тирозина в тиреоглобулине в процессе синтеза ТЗ и Т4. Тиреоидная пероксидаза идентифицирована как основной антигенный компонент микросом. Антитела против ТПО при аутоиммунных заболеваниях ЩЖ встречаются чаще, чем АТ-ТГ, и являются их более чувствительным маркером. АТ-рТТГ имеют прямое и основное патогенетическое значение при болезни Грейвса. Высокие уровни АТ-ТГ и АТ-ТПО, как правило, определяют в сыворотке у пациентов с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ. Тем не менее, у существенной части здоровых людей также может быть выявлено легкое или умеренно выраженное повышение уровня АТ-ТГ и/или АТ-ТПО. У 20–30% взрослых женщин и у 10% здоровых мужчин выявляются АТ-ТПО и/или АТ-ТГ. Носительство этих антител ассоциируется с повышенным риском развития гипотиреоза. Распространенность носительства АТ-ТГ и АТ-ТПО увеличивается с возрастом, достигая максимума среди женщин в возрасте 40–60 лет, но после 90 лет дальнейшего увеличения распространенности их носительства уже не происходит. АТ-ТГ выявляют у 70–80% пациентов с АИТ и у 30–50% пациентов с болезнью Грейвса, а также у 10–15% пациентов с неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ. Серьезной проблемой является интерференция АТ-ТГ при определении уровня ТГ. Определение уровня ТГ в сыворотке, содержащей АТ-ТГ, представляет существенные трудности из-за связывания ТГ этими эндогенными антителами, а также, возможно, в связи с повышением метаболического клиренса ТГ вследствие его вытеснения из иммунных комплексов ТГ+АТ-ТГ, что приводит к получению заниженных результатов. Об этом очень важно помнить при наблюдении пациентов, которые получили комплексное лечение по поводу высокодифференцированного рака ЩЖ (тиреоидэктомия + терапия 120 I131). Использование сверхчувствительных методов определения уровня ТГ при помощи нескольких моноклональных антител, судя по всему, также не позволяет обойти эту проблему. В связи со сказанным, у пациентов, получавших лечение по поводу высокодифференцированного рака, уровень ТГ всегда должен определяться совместно с АТ-ТГ. АТ-ТПО выявляются у 90–95% пациентов с АИТ и у 80% пациентов с болезнью Грейвса, а также у 15–20% пациентов с неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ. Показанием для определения уровня АТ-ТГ и АТ-ПТО является подозрение на АИТ, которое может базироваться на семейном анамнезе аутоиммунных заболеваний ЩЖ, а также в случае выявления у пациента первичного гипотиреоза и/или зоба. Тем не менее, отсутствие АТ-ТГ и/или АТ-ТПО не исключает возможность наличия АИТ, поскольку у очень небольшого числа пациентов, чаще в возрасте до 20 лет, циркулирующие антитела к ЩЖ при АИТ могут отсутствовать. С другой стороны, обнаружение в сыворотке пациента АТ-ТГ и/или АТ-ТПО еще не позволяет установить диагноз аутоиммунного заболевания ЩЖ, поскольку этот феномен может выявляться у части здоровых людей, а также у пациентов с заболеваниями ЩЖ неаутоиммунного генеза. То есть при обнаружении этих антител необходимо проведение дополнительного обследования с целью исключения АИТ. Среди других признаков АИТ в фазе эутиреоза следует указать на гипоэхогенность ЩЖ по данным УЗИ. При тиреотоксикозе определение уровня АТ-ТПО и АТ-ТГ может использоваться для дифференциальной диагностики болезни Грейвса и неиммуногенного тиреотоксикоза, хотя АТ-рТТГ в этом плане имеют значительное преимущество. Определение уровня АТ-ТГ и АТ-ТПО, наряду с оценкой функции ЩЖ, целесообразно перед назначением пациенту амиодарона, препаратов интерферона и лития, поскольку носители антител имеют повышенный риск развития патологии ЩЖ, индуцированной этими препаратами. Референсные значения лабораторных показателей, характеризующих состояние ЩЖ, зависят от выбранного лабораторного метода исследования. Во время беременности определение уровня АТ-ТПО может помочь выделить женщин с повышенным риском развития послеродового тиреоидита, который развивается у 5–10% всех женщин после родов и протекает с чередованием фаз деструктивного тиреотоксиокоза и транзиторного гипотиреоза. Для носительниц АТ-ТПО этот риск составляет до 50%. Как правило, послеродовый тиреоидит заканчивается полным восстановлением функции ЩЖ, но в 20–30% случаев может развиваться стойкий гипотиреоз. Еще одним гормоном ЩЖ, который синтезируется парафолликулярными клетками, является кальцитонин (тиреокальцитонин – ТКТ). Его производство зависит от уровня кальция в плазме – при повышении концентрации микроэлемента оно усиливается, при понижении – сокращается. ТКТ регулирует кальций-фосфорный обмен – взаимодействует с рецепторами остеоцитов (клеток костей), усиливая поступление кальция в костную ткань, 121 предотвращая ее разрушение и снижение минеральной плотности. ТКТ – антагонист паратгормона, выводящего кальций из костей. Сбалансированная активность этих двух гормонов поддерживает обмен фосфора и кальция, целостность костей. Уровень ТКТ в плазме повышается при увеличенной концентрации кальция, при гиперфункции C-клеток. Причины повышения показателей теста: Медуллярный рак ЩЖ. При карциноме С-клетки мутируют, активно делятся и продуцируют гормон. После провокации пентагастрином его концентрация превышает норму в 10–20 раз. Гиперплазия C-клеток. Патология приводит к формированию карцином, аденоматозных структур. Другие опухолевые заболевания. C-клетки расположены не только в ЩЖ, но и в некоторых других органах. Производство ТКТ усиливается при лейкемии, пролиферативных заболеваниях, гастриноме, раке легких, молочной, поджелудочной и половых желез, при некоторых доброкачественных новообразованиях. Неопухолевые патологии. Иногда отклонение значения анализа определяется при мегалобластной анемии, почечной недостаточности, гиперпаратиреозе, алкогольном циррозе, тиреоидите, болезни Педжета. Прием лекарств. Повышение концентрации кальцитонина в плазме происходит на фоне применения гормональных средств, препаратов кальция. Снижение уровня ТКТ диагностически значимо после оперативного удаления медуллярной опухоли ЩЖ. Нормализация показателей теста свидетельствует об успешности лечения. Паращитовидные железы. Представляют собой округлой или овальной формы тельца, расположенные на задней поверхности долей щитовидной железы (рис. 32). Рис. 32. Взаимное расположение щитовидной и паращитовидной желез (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) 122 Их количество непостоянно и может изменяться от 2 до 7–8. Нормальные паратироидные железы имеют объемные размеры 1×3×5 мм и весят от 35 до 40 мг. После 20-летнего возраста масса паращитовидных желез не изменяется, у женщин она несколько больше, чем у мужчин. Паращитовидные железы вырабатывают паратгормон, который регулирует обмен Са2+ и Р2+ в организме. Этот гормон обусловливает всасывание Са2+ в кишечнике, высвобождение его из костей и обратное всасывание из первичной мочи в почечных канальцах. Падение содержания Са2+ в крови приводит к усилению секреции паращитовидных желез, что способствует выделению в кровь Са 2+ из костей. Заболевание сопровождается мышечной слабостью, Са 2+ в виде камней откладывается в почках, мочевыводящих путях и других органах. Удаление или поражение паращитовидных желез ведет к спазмам мышц, судорогам, повышается возбудимость нервной системы. Такое состояние носит название тетании. Объясняется оно снижением концентрации Са 2+ в крови. Возможна также гибель от удушья вследствие судорог дыхательных мышц. Следует обратить внимание, что паращитовидная железа регулирует уровень кальция в организме в узких рамках, так чтобы нервная и двигательная системы функционировали адекватно условиям окружения. Когда уровень кальция в крови падает ниже определенного уровня, рецепторы паращитовидной железы, чувствительные к кальцию, активируются и секретируют гормон в кровь. Таким образом, физиологическое значение паращитовидной железы состоит в секреции ими паратгормона, а также кальцитонина, который является антагонистом паратгормона. Эти гормоны вместе с витамином D участвуют в регуляции обмена кальция и фосфора в организме. Врожденное отсутствие или недоразвитие паращитовидных желез, отсутствие их в результате хирургического удаления, нарушения секреции паратгормона, а также нарушение чувствительности к нему рецепторов тканей приводят к патологиям фосфорно-кальциевого обмена в организме и развитию эндокринных заболеваний (гиперпаратиреозу, гипопаратиреозу), заболеваний глаза (катаракты). Удаление желез у животных ведет к смерти при явлениях тетании (судорог). Регуляция деятельности паращитовидных желез осуществляется по принципу обратной связи, регулирующим фактором является содержание кальция в крови, регулирующим гормоном – паратгормон. Основным стимулом к выбросу в кровоток паратгормона служит снижение концентрации кальция в крови (норма 2,25–2,75 ммоль/л, или 9–11 мг/100 мл). Падение уровня ионизированного Са2+ в крови повышает секрецию паратгормона, который повышает высвобождение Са 2+ из кости за счет активации остеокластов. Уровень Са2+ в крови повышается, но кости теряют жесткость и легко деформируются. Таким образом, основная функция паратгомона заключается в поддержании постоянного уровня ионизированного 123 Са2+ в крови и эту функцию он выполняет, влияя на костную ткань, почки, а посредством витамина D – еще и на кишечник. Гормон паращитовидной железы приводит к эффектам, противоположным по действию тореокальцитонина щитовидной железы. Нарушение функции паращитовидных желез может приводить к развитию двух болезненных состояний – к гиперпаратиреозу и гипопаратиреозу. Гиперпаратиреоз. При увеличенной выработке паратгормона возрастает содержание Са2+ в крови (гиперкальциемия), выделение его с мочой (гиперкальциурия). В связи с тем, что у больных гиперпаратиреозом большое количество 2+ Са выделяется с мочой, в почках образуются камни. Могут быть приступы почечной колики – сильные боли в поясничной области, кровь в моче. Повышение количества Са2+ в крови приводит к излишней стимуляции выделения в желудке желудочного сока и может вызвать образование язв, что также проявляется болями в подложечной области. Ион Са 2+ при этом заболевании как бы вымывается из костей, в них появляются боли, могут быть переломы, изменения формы костей. О гиперпаратиреозе свидетельствует повышение Са2+ в крови, повышение содержания паратгормона. Непосредственная причина болезни распознается с помощью ультразвукового исследования, компьютерной и магниторезонансной томографии. Гипопаратиреоз. Это состояние встречается намного реже гипертаратиреоза. Развивается при снижении функции паращитовидных желез, уменьшении выделения паратгормона. Приводит к развитию гипокальциемии – уменьшению его содержания. Причины гипопаратиреоза – удаление паращитовидных желез ошибочно во время операций на щитовидной железе, алкоголизм и другие неясные причины Проявляется гипопаратиреоз мышечными судорогами различной степени выраженности, могут быть нарушения глотания, изменения психики. Кожа становится сухой, изменяются ногти. Очень характерны нарушения сердечного ритма. В крови отмечается снижение содержания Са 2+, паратгормона, повышение уровня фосфора. Гиперактивность паращитовидных желез возникает при поражении одного или более участков паращитовидных желез. Это бывает чаще всего при аденоме паращитовидных желез. При этом происходит выделение слишком большого количества паратгормона в кровь. Гиперпаратиреоз развивается на фоне повышенной функции двух (или сдвоенных) паращитовидных желез. Двойная железа вырабатывает паратгормон, который вместе с гормоном щитовидной железы – кальцитонином, регулирует кальциевый обмен. В норме существует баланс «интересов» между этими гормонами, что выражается в нормальном соотношении свободного Са2+ в плазме крови и его содержания в костях. 124 Причинами гиперпаратиреоза, чаще всего, бывают доброкачественная опухоль (аденома паращитовидной железы), увеличение клеточной массы всех четырех желез, множественное опухолевое поражение эндокринных желез, редко рак паращитовидной железы. Причиной гиперпаратиреоза может также стать дефицит витамина D, некоторые заболевания почек, применение противосудорожных лекарств. Вилочковая железа (тимус) Относится к числу смешанных желез. Ее внутрисекреторная функция заключается в выработке гормона – тимозина, модулирующего иммунные и ростовые процессы. Иммунная функция обеспечивает образование лимфоцитов, осуществляющих реакции клеточного иммунитета и регулирующих функции других лимфоцитов, вырабатывающих антитела. Вилочковая железа располагается загрудинно, в верхнем отделе средостения (рис. 33). Секреция тимических гормонов и функция тимуса регулируется глюкокортикоидами, а также растворимыми иммунными факторами – интерферонами, лимфокинами, интерлейкинами, которые вырабатываются другими клетками иммунной системы. Глюкокортикоиды угнетают иммунитет, а также многие функции тимуса, и приводят к его атрофии, однако функция уничтожения аутоагрессивных клонов иммунокомпетентных клеток не только не страдает, но даже усиливается под их влиянием. Впрочем, многие исследования последних лет опровергают это предположение. Рис. 33. Тимус и рядом расположенные органы: А – щитовидная железа; В – трахея; С – тимус; D – правая доля; E – левая доля; F – перегородки; G – дольки (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) Пептиды шишковидной железы замедляют инволюцию тимуса. Аналогичным образом действует ее гормон мелатонин, способный даже вызывать «омоложение» этого органа. Пороки развития (аплазия и гипоплазия вилочковой железы) сопровождаются явлениями первичного иммунодефицита с признаками резкого угнетения системы иммунитета, рецидивирующими воспалительными заболеваниями дыхательных путей и кишечника, которые нередко являются 125 непосредственной причиной гибели таких больных. Поэтому у детей, особенно у детей раннего возраста, страдающих рецидивирующими воспалительными заболеваниями дыхательных путей и кишечника, должно быть тщательно проверено функциональное состояние вилочковой железы. Поджелудочная железа Относится к числу смешанных желез. Она расположена в брюшной полости, лежит на уровне тел поясничных позвонков LI-II позади желудка, от которого отделяется сальниковой сумкой. Поджелудочная железа взрослого человека в среднем весит 80–100 г. Ее длина составляет 14–18 см, ширина – 3–9 см, толщина – 2–3 см. Железа имеет тонкую соединительнотканную капсулу и снаружи покрыта брюшиной. В железе выделяют головку, тело и хвост. Внешнесекреторная функция поджелудочной железы заключается в секреции поджелудочного сока, который по выводным протокам попадает в двенадцатиперстную кишку и принимает участие в процессах расщепления питательных веществ. Внутрисекреторную функцию выполняют особые клетки, расположенные островками (скоплениями), не связанными с выводными протоками. Эти клетки получили название панкреатических островков (островки Лангерганса). Величина островков составляет 0,1–0,3 мм, а общий вес не превышает 1/100 массы железы. Больше всего островков расположено в хвосте поджелудочной железы. Островки пронизаны кровеносными капиллярами, эндотелий которых имеет фенестры, облегчающие поступление гормонов из островковых клеток в кровь через перикапиллярное пространство. В островковом эпителии выделяют пять типов клеток: А-клетки (α-клетки, ацидофильные инсулоциты) – вырабатывают глюкагон, при помощи которого происходит процесс превращения гликогена в глюкозу. Секреция этого гормона приводит к повышению уровня глюкозы в крови. В-клетки (β-клетки) – секретируют инсулин, регулирующий уровень глюкозы в крови. Инсулин превращает избыток глюкозы в крови в гликоген и понижает уровень сахара в крови. Под влиянием инсулина усиливается поглощение глюкозы периферическими тканями, а гликоген депонируется в печени и мышцах. Удаление или поражение железы вызывает сахарный диабет. Недостаток или отсутствие инсулина приводит к резкому повышению сахара в крови и прекращению его перехода в гликоген. Избыток сахара в крови обусловливает его выделение с мочой. Расстройство углеводного обмена приводит к нарушению обмена белков и жиров, в крови накапливаются продукты неполного окисления жиров. При осложнениях заболевание может вызвать гипергликемическую (диабетическую) кому, при которой возникает расстройство дыхания, ослабление сердечной деятельности, потеря сознания. Все это прекращается при срочном введении инсулина. Повышение секреции инсулина ведет к увеличению потребления глюкозы клетками тканей и 126 отложению в печени и мышцах гликогена, снижению концентрации глюкозы в крови с развитием гипогликемической комы. Д-клетки (∆-клетки) – вырабатывают соматостатин. Д1-клетки (∆1-аргирофильные клетки) встречаются в островках в небольшом количестве, имеют в цитоплазме плотные гранулы, содержащие вазоактивный интестинальный полипептид. РР-клетки – вырабатывают панкреатический полипептид. Наибольшее значение имеют гормоны, продуцируемые α- и β-клетками поджелудочной железы (рис. 34). Рис. 34. Гормоны поджелудочной железы и желудочнокишечного тракта (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) Методы исследования внутренней секреции поджелудочной железы При заболеваниях поджелудочной железы могут появиться симптомы нарушения углеводного обмена. При остром и хроническом панкреатитах, панкреолитиазе, кисте поджелудочной железы могут иногда наблюдаться временная гипергликемия, гликозурия, а в далеко зашедших случаях развитие сахарного диабета. Наоборот, при аденомах островков Лангерганса отмечаются явления гиперинсулинизма, проявляющиеся в клинике симптомами гипогликемии (рис. 35). Для исследования внутренней секреции, то есть активности инсулярного аппарата поджелудочной железы, предложен так называемый тест с двойной нагрузкой глюкозой: утром натощак у больного берут кровь на сахар, после чего ему дают 50 г глюкозы и затем повторно такое же количество, но через час. Кровь на сахар берут каждые полчаса в течение 3 час. У здоровых людей 127 повторная нагрузка не дает подъема гликемической кривой, тогда как при функциональных нарушениях поджелудочной железы она вызывает повторное повышение сахара в крови и нередко не возвращается к норме через 2 часа. Вторичный подъем гликемической кривой после повторной нагрузки глюкозой обусловлен недостаточностью инсулярного аппарата. Рис. 35. Экспресс-метод определения уровня инсулина в крови (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) Иногда применяют одновременное исследование гликемической и диастазной кривой после нагрузки глюкозой. Рекомендуется исследовать содержание в крови диастазы (синоним: амилаза) после различных пищевых нагрузок или стимуляторов поджелудочной железы (секретин и другие). Предложено также проводить одновременное исследование диастазы и сахара крови и течение 3 часов после двукратной нагрузки глюкозой. Предлагаемый метод дает возможность судить одновременно о внешней и внутренней секреции поджелудочной железы. В норме после нагрузки глюкозой количество диастазы обычно снижается и возвращается к исходным цифрам к концу 3-го часа. При функциональных нарушениях поджелудочной железы диастазные кривые имеют другой вид, и количество диастазы при этом превышает нормальные цифры. Кроме функционального исследования поджелудочной железы, проводят и лабораторные исследования: клинический анализ крови, исследование крови на содержание кальция, натрия, калия, трансаминазы, альдолазы, эфирорастворимого билирубина, геморрагический синдром и прочее. Для полноценного суждения о функциональном состоянии поджелудочной железы необходимо проводить комплексное ее исследование, то есть исследовать одновременно содержание панкреатических ферментов в крови, дуоденальном содержимом, моче, сочетая это исследование с построением гликемической и диастазной кривых (после двойной нагрузки глюкозой). В диагностике заболеваний поджелудочной железы имеют значение и иммунологические методы исследования. Например, уменьшение числа 128 Т-лимфоцитов в крови, а также появление антител и сенсибилизация лимфоцитов к общим тканевым антигенам поджелудочной железы наблюдаются при остром и хроническом панкреатите. Радиоиммунологические методы используют для определения в крови гастрина, инсулина, вазоактивного интестинального полипептида при подозрении на гормонально-активную опухоль поджелудочной железы. Кроме того, методами иммуноцитохимии и электронной микроскопии определяется наличие в островках инкреторных клеток, содержащих гастрин, тиролиберин и соматолиберин В некоторых случаях проводят пункцию поджелудочной железы, однако повреждение поджелудочной железы представляет серьезную опасность, поэтому ее пункция требует особой осторожности при выполнении (рис. 36). Рис. 36. Лабораторные методы исследования функций поджелудочной железы (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) Надпочечники Представляют собой парный эндокринный орган, распологающийся в забрюшинном пространстве над верхними полюсами почек на уровне ТhXI–LI позвонков. Масса надпочечников взрослого человека в среднем составляет 5– 8 г и, как правило, не зависит от пола и массы тела. Развитие и функцию коры надпочечников регулирует адренокортикотропный гормон гипофиза. Надпочечники состоят из двух слоев, представленных соответственно корковым и мозговым веществом. В коре надпочечников выделяют клубочковую, пучковую и сетчатую зоны. Надпочечники вырабатывают несколько гормонов. Гормоны мозгового слоя надпочечников вырабатывают катехоламины: адреналин, норадреналин, дофамин, а также другие пептиды, в частности адреномедуллин. 129 Хорошо известно, что большое количество адреналина выделяется при сильных эмоциях – гневе, испуге, боли, напряженной мышечной или умственной работе. Увеличение количества поступающего в кровь адреналина вызывает повышение кровяного давления и учащенное сердцебиение, сужение кровеносных сосудов (однако при этом сосуды мозга, сердца и почек расширяются). Адреналин усиливает обмен веществ, особенно углеводов, ускоряет превращение гликогена печени и мышц в глюкозу. Под влиянием адреналина расслабляется мускулатура бронхов, угнетается перистальтика кишечника, повышается возбудимость рецепторов сетчатки, слухового и вестибулярного аппарата. Усиление образования адреналина может вызвать экстренную перестройку функций организма при действии чрезвычайных раздражителей. Кроме того, катехоламины регулируют распад жиров (липолиз) и белков (протеолиз), когда источник энергии, мобилизованный из запасов углеводов, истощается. Под влиянием катехоламинов стимулируются процессы глюконеогенеза в печени, где для образования глюкозы используют лактат, глицерин и аланин. Наряду с непосредственным влиянием на обмен веществ катехоламины оказывают опосредованное действие через секрецию других гормонов (СТГ, инсулин, глюкагон, почечная ренин-ангио-тензиновая система). Адреномедуллин – принимает участие в регуляции гормонального, электролитного и водного баланса в организме, снижает артериальное давление, увеличивает частоту сердечных сокращений, расслабляет гладкую мускулатуру. Его содержание в плазме крови изменяется при различных патологических состояниях. Гормоны коркового слоя надпочечников вырабатываются разными клетками: гормоны клубочковой зоны – минералокортикоиды (альдостерон), регулируют солевой обмен (Nа+, К+) в организме, а также оказывают провоспалительный эффект. Избыток минералокортикоидов обусловливает повышение артериального давления (артериальную гипертензию) и снижение содержания К+ (гипокалиемию), недостаток – гиперкалиемию, которые могут оказаться несовместимыми с жизнью. Гормоны пучковой зоны – глюкокортикоиды (кортикостерон, кортизол), регулируют углеводный и белковый обмен. Они также угнетают выработку антител, обладают противовоспалительным действием, в связи с чем, их синтетические производные широко применяются в медицине. Глюкокортикоиды поддерживают определенную концентрацию глюкозы в крови, увеличивают образование и отложение гликогена в печени и мышцах. Избыток или недостаток глюкокортикоидов сопровождается угрожающими жизни сдвигами. Гормоны сетчатой зоны – половые гормоны: дегироэпиандростерон (ДГЭА), дегироэпиандростерон-сульфат (ДГЭА-с), андростендион, тестостерон, эстрадиол. 130 При недостаточности функции коры надпочечников и снижении выработки гормонов развивается бронзовая, или аддисонова, болезнь. Методы исследования функций надпочечников Исследование функции надпочечников путем определения содержания его гормонов в крови и моче связано с большими трудностями и доступно лишь специальным лабораториям. Определение концентрации 17-оксикортикостероидов в крови и моче позволяет судить о глюкокортикоидной функции коры надпочечников. О минералокортикоидной функции судят по выделению с мочой альдостерона, ионов К+ и Na+, об андрогенной – по содержанию в суточной моче 17-кетостероидов. О функции мозгового вещества надпочечников судят по содержанию в крови и выделению с мочой катехоламинов. В последние годы при обследовании женщин с проявлениями гиперандрогении и проведении гормональных проб вместо определения 17-кетостероидов в моче исследуют содержание в плазме крови дегидроэпиандростерона и его сульфата и 17-гидроксипрогестерона – предшественников тестостерона и кортизола соответственно и самого тестостерона. Определение прегнандиола также уступило место исследованию прогестерона в крови. Увеличение содержания в крови альдостерона наблюдается при первичном и вторичном гиперальдостеронизме. Первичный гиперальдостеронизм развивается вследствие опухоли коры надпочечников, вторичный у больных сердечной недостаточностью, циррозом печени, нефротическим синдромом. Уменьшение содержания в крови альдостерона наблюдается при болезни Аддисона и, обычно, сочетается со снижением содержания кортизола. Таким образом, уменьшение альдостерона наблюдается при надпочечниковой недостаточности (болезни Аддисона). В то же время увеличение альдостерона наблюдается при болезни Кушинга. Повышение уровня альдостерона в крови у больных первичным и вторичным гиперальдостеронизмом бывает не всегда, поэтому при подозрении на эти состояния необходимо проводить дополнительные исследования. При болезни Кушинга уровень кортизола обычно повышен, но этот показатель может быть и нормальным, а у здоровых людей при стрессе кортизол также может повышаться. Поэтому ориентироваться только на этот показатель при подозрении на данное заболевание нельзя, требуется проведение дополнительных исследований. Низкие показатели альдостерона и кортизола позволяют подозревать недостаточность надпочечников, но для ранней диагностики требуются иссследования, когда эти показатели исследуются до и после стимуляции АКТГ. 131 Расстройства, связанные с дисфункцией надпочечников Недостаточность надпочечников может быть острой и хронической. Острая недостаточность надпочечников может возникнуть при физическом перенапряжении, на фоне инфекционного заболевания, оперативных вмешательств у больного аддисоновой болезнью. Причиной ее могут быть также кровоизлияния в надпочечниках при травме или внезапное прекращение гормональной терапии. Хроническая недостаточность коры надпочечников (аддисонова болезнь, гипокортицизм, бронзовая болезнь). Тяжелое хронически протекающее заболевание, обусловленное частичным или полным выпадением гормональной функции коры обоих надпочечников вследствие их двустороннего поражения. Первичная надпочечниковая недостаточность может быть следствием амилоидоза, двухсторонней опухоли или метастазов рака в надпочечники. В редких случаях аддисонова болезнь может возникнуть вследствие кровоизлияний в надпочечники либо тромбоза их сосудов при инфекционных заболеваниях (грипп или бруцеллез) или токсемии беременных, в результате хронического гнойного воспаления надпочечников, сифилиса и других причин. Аддисонова болезнь может быть также генетически обусловленной. Полагают, что при семейном характере заболевания наследование аддисоновой болезни происходит по аутосомно-рецессивному типу. При аддисоновой болезни аутоиммунного генеза антитела могут быть не только к надпочечникам, но также и к другим органам: щитовидной железе, слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта или яичникам. Нередко эти антитела определяются и у родителей больных, что позволяет предполагать в этих случаях наследственный характер аутоиммунного поражения надпочечников. Аддисонова болезнь генетической природы может возникнуть вследствие врожденной нечувствительности коры надпочечников к АКТГ. Иногда может возникнуть изолированная недостаточность функции клубочковой зоны коры надпочечников – изолированный гипоальдостеронизм. Последний развивается вследствие врожденного дефекта в биосинтезе альдостерона, который проявляется в нарушении образования 18-гидроксилазы и 18-дегидрогеназы, участвующих в превращении кортикостерона в альдостерон. Морфологические изменения в надпочечниках при аддисоновой болезни зависят от причины заболевания. При аддисоновой болезни туберкулезной этиологии наблюдается разрушение коркового и мозгового веществ обоих надпочечников. В них обнаруживают туберкулезные бугорки, очаги распада, обызвествления. При аддисоновой болезни, возникшей вследствие первичной или вторичной атрофии надпочечников, отмечается их гипоплазия, дегенеративные изменения в пучковой и сетчатой зонах коры. Атрофические изменения наблюдаются также в сердце, печени, почках и мышцах. 132 По течению болезни различают типичную форму и атипичные формы: минеральную (по типу гипоальдостеронизма) и беспигментную. Заболевание развивается постепенно. Больные предъявляют жалобы на сильную слабость, быструю утомляемость, потемнение кожи, потерю аппетита, тошноту, рвоту, понос, похудание, боли в мышцах верхних и нижних конечностей, пояснице. Кожа больных чаще всего имеет золотисто-коричневую (дымчато-бронзовую) окраску. Пигментация особенно выражена на открытых частях тела (лицо, ладонные складки, тыльная сторона кистей рук и стоп) и участках, подвергающихся трению одежды (подмышечные и паховые области, локти, колени, поясница, складки кожи). Отмечаются пигментация послеоперационных рубцов, а также усиление пигментации в местах естественного отложения пигмента (соски молочных желез, половые органы). Нарушения функции почек проявляются в уменьшении клубочковой фильтрации и реабсорбции Na + и хлоридов, что особенно выражено во время криза. Нервно-психические расстройства проявляются в повышенной нервной возбудимости или депрессии, бессонице. Иногда может развиться психоз, в ряде случаев – парестезии (мурашки) и судороги. При тяжелой форме заболевания на ЭЭГ нередко обнаруживается преобладание медленной активности типа θ- и ∆-диапазона и отсутствие α-ритма, что свидетельствует о снижении активности коры головного мозга. Грозным осложнением аддисоновой болезни является аддисонический криз (острая недостаточность коры надпочечников). Его развитию способствуют острые инфекции, интоксикации, хирургические вмешательства, беременность, недостаточное лечение аддисоновой болезни. Вследствие недостатка в организме кортизола и альдостерона развиваются дегидратация организма, коллапс, нарушение функции почек, тяжелые гипогликемии, которые в основном и обусловливают проявления этого тяжелого осложнения. При аддисоновой болезни категорически необходима заместительная гормональная терапия (глюкокортикоиды – кортизон, гидрокортизон, преднизолон). При тяжелой форме заболевания больные склонны к развитию аддисонического криза. Клинического эффекта у них можно достигнуть лишь с помощью постоянной заместительной терапии глюкокортикоидами в сочетании с минералокортикоидами (дезоксикортикостерона ацетат, фторгидрокортизон). Болезнь Иценко-Кушинга (болезнь Кушинга) – тяжелое нейроэндокринное заболевание, сопровождающееся гиперфункцией коры надпочечников, связанное с гиперсекрецией АКТГ в результате первичного поражения подкорковых и стволовых структур (таламус, гипоталамус, аденогипофиз) или эктопической продукцией АКТГ опухолями внутренних органов. Термином «болезнь Иценко-Кушинга» принято обозначать патологию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, то есть нейроэндокринное заболевание. От болезни Иценко-Кушинга следует отличать Синдром 133 гиперкортицизма (синдром Кушинга) – термин, используемый для обозначения опухоли надпочечника или эктопированной опухоли различных органов (бронхов, тимуса, поджелудочной железы, печени), секретирующих глюкокортикоиды. Болезнь Иценко-Кушинга возникает при изменении механизма контроля секреции АКТГ. В результате снижения дофаминовой активности, ответственной за ингибирующее влияние на секрецию кортиколиберина и АКТГ и повышение тонуса серотониновой системы, нарушается механизм регуляции функции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и суточный ритм секреции АКТГ и кортизола. При этом перестает действовать механизм «обратной связи» с одновременным повышением концентрации АКТГ, гиперпродукцией кортизола, кортикостерона, альдостерона, андрогенов, пропадает реакция на стресс (рис. 37). Рис. 37. Общий вид девочки при болезни Иценко-Кушинга (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) • • • • Основные признаки болезни: Ожирение, которое является наиболее характерным во внешнем виде больных этой патологией: жир откладывается на плечах, животе, лице, молочных железах и спине. Несмотря на тучное тело, руки и ноги у больных тонкие. Лицо становится лунообразным, круглым, а щеки красными. Розово-пурпурные или багровые полосы (стрии) на коже. Избыточный рост волос на теле (у женщин растут усы и борода на лице). У женщин нарушается менструальный цикл и развивается бесплодие, у мужчин наблюдается снижение сексуального влечения и потенции. 134 • Мышечная слабость. • Ломкость костей (развивается остеопороз), вплоть до патологических переломов позвоночника, ребер. • Повышается артериальное давление. • Нарушается чувствительность к инсулину и возможно развитие сахарного диабета. • Иногда возникают нарушение сна, эйфория, депрессия. • Снижение иммунитета, который проявляется образованием трофических язв, гнойничковых поражений кожи, хронического пиелонефрита, сепсиса и других проявлений. Синдром Кушинга (гиперкортицизм) – клинический синдром, обусловленный эндогенной гиперпродукцией или длительным экзогенным приемом кортикостероидов. Кроме того, к патологии надпочечников относятся: ­ недостаточность коры надпочечноков (гипокортицизм); ­ врожденная гиперплазия надпочечников; ­ феохромоцитома; ­ аденома надпочечников и другие опухоли, отличающиеся широким спектром разнообразных признаков. Подготовка к исследованию. Специальной подготовки к исследованию большинства указанных гормонов не требуется. За 2 недели до исследования альдостерона необходимо прекратить прием мочегонных и сосудорасширяющих средств. Кроме того, нередко в один и тот же день кровь на исследование берут утром натощак и днем, после четырех часов, проведенных на ногах. Половые железы Эти железы – яичники у женщин и яички у мужчин – относятся к смешанным. Их внешнесекреторная функция заключается в образовании и выделении яйцеклеток и сперматозоидов, а внутрисекреторная – в продукции половых гормонов. Яичники – женские половые железы, представляют собой парный орган, выполняющий в организме генеративную и эндокринную функции. Располагается в полости малого таза, имеют овоидную форму, длина составляет 2,5–5,5 см, ширина – 2–2,5 см, масса – 5–8 г. В яичниках образуются и созревают женские половые клетки (яйцеклетки), а также вырабатываются половые гормоны. К ним относятся: эстрогены, прогестерон и андрогены. Кроме этих гормонов вырабатывается релаксин – гормон, размягчающий шейку матки и лонного сочленения в период подготовки к родам, а также ингибин, который тормозит секрецию ФСГ и некоторые другие полипептидные гормоны. Яички – мужские половые железы. Являются парным железистым органом, также выполняющим в организме генеративную и эндокринную функции. Располагается в мошонке, в области промежности. В яичках образуются и созревают мужские половые клетки (сперматозоиды), а также 135 вырабатывается половой гормон – тестостерон и в незначительном количестве дигидроэпиандростерон и андростендион (большая часть их образуется в периферических тканях). Половые гормоны – андрогены (у мужчин) и эстрогены (у женщин) стимулируют развитие органов размножения (половых желез и придаточных частей полового аппарата), созревание половых клеток и формирование вторичных половых признаков. Половые гормоны, вырабатываемые половыми железами и корой надпочечников, распространяются через кровь по всему организму и создают общий фон для регуляции всех звеньев половой системы, включая различные структуры нервной системы. Так называемые «органы-мишени» для каждого гормона обладают «рецепторами гормонов», в которых молекулы гормонов входят в соединение с молекулярными структурами этих клеток. Посредством этого механизма гормоны запускают процессы одновременно в нервной, железистой и других системах организма. Имеются три основные группы половых гормонов, вырабатываемых половыми железами и корой надпочечников: андрогены, а также эстрогены и прогестерон. Синтез половых гормонов начинается с преобразования холестерина в прогестерон, затем из прогестерона образуются андрогены, а из них – эстрогены. Эта последовательность превращения гормонов имеет место в организмах обоих полов, причем все три группы гормонов присутствуют в тканях тел у представителей каждого пола. Но в зависимости от пола, то есть в результате биохимических и гистологических половых различий в структуре желез, накапливаются и выделяются в кровь преимущественно гормоны, свойственные полу организма (рис. 38). Рис. 38. Регуляция репродуктивной функции в мужском организме (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) Определение уровня прогестерона в крови. За процесс овуляции и за весь менструальный цикл в целом несет ответственность группа гормонов 136 репродуктивной сферы. Если баланс этих гормонов находится в норме, то можно предположить, что и овуляция происходит в нормальном режиме. Однако, уровни гормонов у разных женщин не одинаковые. Наиболее точные данные о происшедшей овуляции дает анализ определения уровня прогестерона. Прогестерон, измеренный в крови во второй половине цикла, может дать точный, но, к сожалению, несвоевременный ретроспективный ответ. Если в яичнике активно работает жёлтое тело, то уровень прогестерона в крови значительно повышается (более 20 нмоль/л), но это происходит только после овуляции. Анализ проводят во вторую фазу – через неделю после овуляции, либо за неделю до предполагаемых месячных. Если прогестерон во второй фазе в норме (или даже лучше – выше нормы), то овуляция была. Исключением может быть только случаи, когда фолликул не разрывается из-за толстой оболочки яичника и яйцеклетка не может попасть «наружу», но это выясняется с помощью ультразвукового исследования по наличию свободной жидкости в брюшной полости. Кровь для определения данного гормона следует забирать примерно за неделю до предполагаемых месячных. При «идеальном» менструальном цикле в 28 дней это будет соответствовать 19–21-му дню цикла. Мочевые тесты на измерение уровня лютеинизирующего гормона. Уровни гормонов у разных женщин не одинаковые, сходство заключается лишь в том, что колебания этих соединений у всех здоровых женщин репродуктивного возраста подчиняются единой закономерности. Однократный забор крови на гормоны не сможет дать нам нужную информацию, поэтому важно проследить изменение уровня некоторых гормонов в динамике. Наиболее полезным является определение колебания уровня лютеинизирующего гормона, так как он повышается в крови (и как результат – в моче) за 24–36 часов до овуляции. Однако каждый день сдавать кровь для исследования лютеинизирующего гормона травматично и неудобно. Существуют одноразовые мочевые тесты для домашнего использования, подобные тестам на беременность, разные по устройству и чувствительности. Наиболее чувствительными являются струйные латексные тесты, при использовании которых нет необходимости собирать мочу в емкость, достаточно лишь направить струю при мочеиспускании на диагностический кончик. Отсутствие свободной жидкости может свидетельствовать о том, что произошла лютеинизация фолликула «внутри» яичника. То есть жёлтое тело есть, но яйцеклетка не вышла в брюшную полость и зачатие невозможно. Биохимические методы исследования гормонов яичника. Специальные биохимические гормональные исследования дают более точную информацию о деятельности яичников, но они сложны, поэтому их до сих пор применяют не очень широко. Из биохимических методов следует иметь в виду относительно несложный метод определения эстрогенов в моче по Брауну, позволяющий количественно исследовать содержание эстрона, эстрадиола и эстриола. 137 Обнаруженное соответствие между содержанием гормонов крови и мочи увеличивает диагностическую ценность этого метода. О количестве секретируемого жёлтым телом прогестерона можно судить по экскреции его метаболита – прегнандиола. При биохимическом определении экскреции эстрогенов следует иметь в виду, что присутствие в моче некоторых веществ может исказить истинную количественную картину этих гормонов. Так, во время приема эстрогенов нестероидной структуры (типа синэстрола) последние выделяются вместе с гормонами яичника и мешают их определению. Имеются сведения о том, что наличие сахара в моче и присутствие в ней некоторых фармакологических препаратов также искажают данные, полученные при определении эстрогенов. Так как до настоящего времени нет исчерпывающих сведений обо всех веществах, влияющих на количественную сторону биохимического исследования эстрогенов, следует рекомендовать обследуемым женщинам воздерживаться от любой медикаментозной терапии на все время гормональных исследований. Так как параллельно с изменением гормонов, продуцируемых яичником, происходят циклические изменения в матке, шейке матки и влагалище, то изучение этих органов в определенные дни менструального цикла дает ценные сведения о гормональных взаимоотношениях в организме женщин. К таким методам функциональной диагностики относятся гистологическое исследование соскоба эндометрия, кольпоцитологическое исследование, изучение свойств цервикальной слизи. Большинство из указанных методов просты и могут применяться в динамике на протяжении нескольких циклов. Они позволяют судить о происшедшей овуляции и о наличии (или отсутствии) функции жёлтого тела. Методы исследования желез внутренней секреции Клиническая химия гормонов располагает широчайшим спектром методов исследования: • прямые физико-химические методы (спектрофотометрические, колориметрические, газои жидкостнохроматографические, флюориметрические, полярографические); • биологические пробы in vivo и in vitro; • методики, основанные на связывании гормонов с антителами, транспортными белками крови, рецепторным аппаратом клеток-мишеней обеспечивают высокую специфичность исследования. Методы определения гормонального статуса Определение гормонов является наиболее сложным разделом клинической биохимии, которым занимаются лишь отделения больших клинических медицинских учереждений. В существующих справочниках, рассчитанных на рядовые медицинские лечебно-профилактические учреждения, приводят лишь некоторые, относительно простые методы 138 определения гормонов, исследований (рис. 39). их метаболитов и интерпретация результатов Рис. 39. Определение гормонов в клинической лаборатории (Руководство по физиологии / под. ред. Казакова В.Н., 2016) Для количественной характеристики гормонов в настоящее время используется принцип мечения радиоактивным изотопом, ферментом, флюорофором (радиоконкурентные, иммуноферментные, иммунохимические и другие методы). Выделяют несколько типов радиолигандного тестирования in vitro, в том числе: • радиоиммунологический анализ (РИА); • иммунорадиометрический анализ (ИРМА); • конкурентное белковое связывание (КБС); • радиорецепторное тестирование (РРТ); • радиоэнзиматический анализ (РЭА) и радиореагентный анализ (РРА). В основу этой терминологии положено обозначение используемых реагентов. Общей основой исследований является конкуренция немеченых («холодных») молекул определяемого вещества и молекул этого же вещества, соединенных с радиоактивной меткой, за связывание специфическими биндинг-системами. В качестве биндинг-систем могут выступать: иммунная антисыворотка (РИА), специфические тканевые рецепторы (РРТ), белки разных тканей (КБС) и другие связывающие гормоны реагенты. Радиоиммунологические методы определения гормонов Эти методы являются наиболее чувствительными (позволяют определять пикограммовые количества вещества), менее громоздкими (особенно при наличии соответствующиех наборов), более воспроизводимыми и достаточно специфичными. Поэтому они чаще всего используются в клинической практике. Метод РИА подразумевает ряд основных принципов. Для достижения максимальной воспроизводимости результатов гормон всегда определяется в дублях, а калибровочную кривую строят, используя три параллельные пробы для каждого стандарта. Кроме того, инкубацию проб производят в 139 оптимальных для каждого набора реагентов условиях, что необходимо для установления динамического равновесия между процессами образования и распада иммунных комплексов. Несмотря на высокую чувствительность и простоту радиоиммунологического метода, он не в состоянии заменить все остальные аналитические методы, а для большой группы стероидных гормонов и их метаболитов химические методы по-прежнему остаются актуальными. Не утратили значения в силу своей специфичности и отдельные биологические методы определения гормонов. В клинической практике просматривается тенденция к комплексным исследованиям, поскольку отдельно взятый тест часто малоинформативен и позволяет судить лишь об одном звене гормональной системы. Исследование гормонов методом иммуноферментного анализа При использовании этого метода для точности и достоверности результатов следует иметь в виду ряд ограничений. За 1 месяц до исследования необходимо прекратить прием гормональных препаратов, за 24 часа – исключить алкоголь, курение, тепловые процедуры (сауна, баня), физические тренировки, введение радиоактивных и рентгенконтрастных веществ. Для определения уровня гормонов щитовидной железы необходимо исключить использование препаратов, содержащих йод. Для определения уровня половых гормонов необходимо исключить половые связи (в любом их проявлении) за 24 часа. Для исследования гормонов репродуктивной панели необходимо указать день менструального цикла или срок беременности. 140 Задания для самоконтроля 1. Пациент страдает сахарным диабетом. Утром, в спешке, не позавтракав, ввёл себе обычную дозу инсулина. Через 20 минут почувствовал недомогание, сильное головокружение, наступил ступор. Какое развилось состояние? A. Гипогликемия B. Гипергликемия C. Кетонемия D. Лактатемия E. Ацидоз 2. Пациент 62 лет, жалуется на боль в сердце, начавшуюся 10 часов назад. Врач предположил начинающийся инфаркт миокарда. Какой фермент необходимо определить в крови для подтверждения данного предположения? A. Кислую фосфатазу B. Щелочную фосфатазу C. Холинэстеразу D. Лактатдегидрогеназу E. Креатинкиназу 3. В отделение поступил пациент 62 лет с желтухой. Лабораторное обследование крови выявило значительное повышение активности ферментов щелочной фосфатазы и глутамилтранспептидазы. Какой вид желтухи у больного? A. Лекарственная B. Алкогольная C. Обтурационная D. Гемолитическая E. Паренхиматозная 4. У пациента выявлено наличие глюкозы в моче при нормальной концентрации ее в плазме крови. Какой процесс нарушается и является наиболее вероятной причиной такого состояния? A. Секреция инсулина B. Клубочковая фильтрация C. Канальцевая секреция D. Канальцевая реабсорбция E. Секреция глюкокортикоидов 5. В КДЛ для прохождения медицинского осмотра обратился пациент 24 лет. Молодой человек активно занимается спортом. Какой вид обмена веществ в первую очередь отобразит длительная мышечная нагрузка? A. Минеральный B. Белковый C. Липидный D. Пигментный E. Углеводный 141 6. Пациентке врач назначил тест толерантности к глюкозе. Получены результаты: глюкоза сыворотки крови натощак 6,5 ммоль/л, а концентрация глюкозы сыворотки через 2 часа после начала теста 7,0 ммоль/л. Как интерпретировать полученный результат? A. Нарушенная гликемия натощак B. Полученный результат считается отрицательным – диабета нет C. Компенсированный СД D. Нарушение толерантности к глюкозе E. Некомпенсированный СД 7. В лабораторию из инфекционного отделения была доставлена кровь. Уровень общего билирубина в сыворотке – 150 мкмоль/л. Какой лабораторный тест используют для дифференцировки вида желтухи? A. Фракции билирубина B. Количество ретикулоцитов C. Сывороточное железо D. Активность аминотрансфераз E. Активность кислой фосфатазы 8. В КДЛ из кардиологического отделения поступила кровь больной 53 лет для определения общей ЛДГ. Результат оказался повышенный в три раза. За счет какой изоформы предположительно повысился уровень ЛДГ в сыворотке пациентки? A. ЛДГ1 B. ЛДГ2 C. ЛДГ3 D. ЛДГ4 E. ЛДГ5 9. Пациенту в карете скорой помощи было проведено качественное определение миоглобина. Для ранней диагностики какого заболевания используется этот тест? A. Инфаркта миокарда B. Вирусного гепатита C. Гемолитической анемии D. Миозита E. Печеночной недостаточности 10. Мужчина 56 лет обратился к врачу с жалобами на снижение массы тела, общую слабость на протяжении последних 6 месяцев. Все это время мочевыделение у него было обильнее, чем обычно, особенно по ночам. При обследовании выявлена анемия, давление 180/110 мм рт.ст. В моче обнаружен белок, в сыворотке крови: натрий – 130 ммоль/л (135–145 ммоль/л), калий – 5,2 ммоль/л (3,5–5,0 ммоль/л), кальций – 1,92 ммоль/л (2,2–2,6 ммоль/л), мочевина – 43,0 ммоль/л (2,5–5,5 ммоль/л), щелочная фосфатаза – 205 Е/л (30–150 Е/л), гемоглобин – 91 г/л (130–160 г/л). Предполагаемый диагноз: 142 A. Хроническая почечная недостаточность B. Острая почечная недостаточность C. Острая печеночная недостаточность D. Анемия хронического заболевания E. Хроническая печеночная недостаточность 11. У пациентки 43 лет на УЗИ обнаружен узел в щитовидной железе. По данным гистологического исследования был установлен диагноз «медуллярный рак». Какой из перечисленных гормонов вырабатывается щитовидной железой и является маркером данного вида рака? A. Тироксин B. Трийодтиронин C. Тиреокальцитонин D. Тиреоглобулин E. Тетрайодтиронин 12. У беременной обнаружили аутоиммунный тиреоидит. После родов новорожденный был поставлен на диспансерный учет педиатром по месту жительства. Какая патология может развиться у ребенка в данном случае? A. Эндемический зоб B. Гипертиреоз C. Опухоль ЩЖ D. Склерозирование ЩЖ E. Кретинизм 13. У женщины 36 лет провели резекцию обеих долей щитовидной железы. Пациентку поставили на учет с целью выявления рецидива тиреотоксикоза. Какие комбинации диагностических тестов наиболее целесообразно использовать для оценки адекватности терапии тиреотоксикоза? A. Свободный Т4 и ТТГ B. ТТГ, АТ-ТПО C. АТ-ТПО, АТ-ТГ D. Свободный Т4, общий Т4 E. Свободный Т3, общий Т3 14. У пациентки 60 лет диагностирован аутоиммунный тиреоидит, приводящий к аутоагрессии иммунной системы к ткани железы. Какое из перечисленных веществ является диагностическим тестом повреждения фолликулярных клеток щитовидной железы при данной патологии? A. Тиреоглобулин B. Тиреотропный гормон C. АТ-ТПО D. Паратгормон E. Кальцитонин 15. У пациента 65 лет выявлен гипотиреоз. Эндокринолог назначил L-тироксин. Какой тест необходимо регулярно проводить для корректировки дозы препарата? A. Свободный Т4 143 B. Общий Т4 C. ТТГ D. Свободный Т3 E. Общий Т3 16. На приеме гинеколог рекомендовал беременной (10 недель гестации) обследоваться на предмет нарушений функции щитовидной железы. Какие тесты необходимо сдать пациентке? A. ТТГ, общие Т3 и Т4 B. ТТГ, АТ-ТПО, АТ-ТГ C. ТТГ, АТ-ТПО, общий Т4 D. ТТГ, свободный Т4, АТ-ТПО E. ТТГ, свободный Т4, АТ-ТГ 17. В лечебно-профилактический санаторий прибыла группа работников химического комбината. Врач санатория должен определиться с назначаемой диетой, физиотерапевтическими процедурами и возможной тактикой лечения. С какого гормона необходимо начинать диагностику в данной группе с целью исключить тиреоидную патологию? A. Свободного Т4 B. ТТГ C. Общего Т3 D. Свободного Т3 E. Общего Т4 18. У пациента 32 лет на МРТ головного мозга была обнаружена тиротропинома. Какие изменения лабораторных показателей будут наблюдаться у данного больного? A. Снижен свободный Т4, повышен ТТГ B. Повышен свободный Т4, снижен ТТГ C. Снижены ТТГ и свободный Т4 D. Повышены ТТГ и свободный Т4 E. ТТГ и свободный Т4 в пределах нормы 19. Пациентка 38 лет обратилась к врачу с жалобами на повышенную утомляемость, слабость на фоне увеличения массы тела. Выяснилось, что она в течение 4 месяцев самостоятельно принимала интерферон в связи с риском ОРВИ. Врач предположил, что данные симптомы связаны с приемом препарата. Какие исследования позволят подтвердить это предположение? A. Свободный Т4 и ТТГ B. ТТГ и АТ-ТПО C. АТ-ТПО и АТ-ТГ D. АТ-ТГ и ТТГ E. АТ-ТПО и свободный Т4 20. У пациента 53 лет при лабораторном обследовании был обнаружен сниженный уровень ТТГ и свободного Т4. Для какой патологии может быть характерна такая картина? A. Гипоталамо-гипофизарная опухоль 144 B. Тиреотоксикоз C. Аутоиммунный тиреоидит D. Гипотиреоз E. Медуллярный рак 145 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нет ни одной врачебной специальности, в которой не использовались бы методы лабораторной диагностики. Лабораторные исследования играют огромную роль для врача-клинициста при постановке окончательного диагноза, проведении комплексной терапии или ее контроле, а также для профилактики развития патологии. Современные представления о патогенезе многих заболеваний в той или иной степени основаны на достижении клинической лабораторной диагностики. Развитие медицинских технологий на базе современных открытий в физике, химии и электронике привело к резкому возрастанию количества и качества лабораторных исследований. Ежегодно мы наблюдаем появление новых и совершенствование старых методов диагностики, а, следовательно, повышается потребность в квалификации врачей-лаборантов, что в свою очередь ведет за собой повышение требований к качественному преподаванию этой дисциплины. Важно, чтобы студенты с помощью данного учебного пособия успешно освоили принципы рационального использования лабораторных алгоритмов при различных формах патологии, умели интерпретировать полученные результаты лабораторных исследований на основе целостного представления о физиологических и патофизиологических процессах в организме. 146 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 1. Гематологический атлас: настольное руководство врача-лаборанта / Козинец Г.И., Сарычева Т.Г., Луговская С.А. и др. – М.: Практическая медицина, 2015. – 192 с. 2. Камышников В.С. Клинические лабораторные тесты от А до Я и их диагностические профили [Текст]: справочное пособие. – 5-е изд. – Москва: МЕДпресс-информ, 2014. – 320 с. 3. Кишкун А.А. Клиническая лабораторная диагностика: учебное пособие. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. – 976 с. 4. Клиническая лабораторная диагностика: руководство. В 2 томах. Том 1. / Под ред. В.В. Долгова. 2012. – 928 с. 5. Клиническая лабораторная диагностика [Электронный ресурс]: учебное пособие / Кишкун А.А. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2015. – http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785970435182.html 6. Лабораторная гематология / Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е., Долгов В.В. – М. – Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2006. – 224 с. 7. Медицинские лабораторные технологии: руководство по клинической лабораторной диагностике: в 2 т. / В.В. Алексеев и др.; под ред. А.И. Карпищенко. – 3-е изд., перераб. и доп. – Т.1. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 472 с. 8. Медицинские лабораторные технологии: руководство по клинической лабораторной диагностике: в 2 т. / В.В. Алексеев и др.; под ред. А.И. Карпищенко. – 3-е изд., перераб. и доп. – Т.2. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. – 792 с. 9. Медична паразитологія: Атлас: Навч. посібник / Ю.І. Бажора, А.Д. Тимченко, М.М. Чеснокова, В.В. Костюшов, О.Л. Тимчишин; За ред. Ю.І. Бажори. – Одеса: Одес. держ. мед. ун-т, 2001. – 110 с. – Рос. мова. 10.Методы клинических лабораторных исследований: учебник / под ред. В.С. Камышникова. – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: МЕДпресс-информ, 2009. – 752 с. 11.Натрус Л.В. Клиническая лабораторная диагностика [Электронный ресурс]: учеб. пособие / Л.В. Натрус, Т.В. Третьякова; Донецкий мед. ун-т. Каф. анестезиологии, ИТ, МНС, лаб. диагностики ФИПО. – Донецк, 2012. 12.Научная электронная библиотека (НЭБ) eLibrary http://elibrary.ru 13.Паразитические черви-возбудители гельминтозов человека (атлас): учебное пособие / Агаркова Л.Д., Маслодудова Е.Н., Рязанцева А.Е., Нагорнюк Г.Г., Коноплянко Е.В., Крикунова Н.В., Штирц А.Д. – Донецк-ДонНУ, ДоноблСЭС, 2010. – 100 с. 14.Руководство по физиологии (вопросы фундаментальной и клинической физиологии) Том 6 [Электронный ресурс] / Под редакцией академика НАМНУ В.Н. Казакова. – Донецк, 2016. 147 15.Электронный каталог WEB-OPAC Библиотеки ГОО ВПО ДОННМУ ИМ. М. ГОРЬКОГО http://katalog.dnmu.ru 16. ЭБС «Консультант студента» http://www.studmedlib.ru 148 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АДГ – антидиуретический гормон АДФ – аденозиндифосфат АИТ – аутоиммунный тиреоидит АКТГ – адренокортикотропный гормон АЛТ – аланинаминотрансфераза АМФ – аденозинмонофосфат АНД – антикоагулянты непрямого действия АСТ – аспартатаминотрансфераза АТ-ТГ – антитела к тиреоглобулину АТ-ТПО – антитела к тиреопероксидазе АТФ – аденозинтрифосфат АФП – альфа-фетопротеин АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время БАВ – биологически активные вещества ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ГГТ – гаммаглутамилтранспептидаза ГЦ – гомоцистеин ГЭБ – гематоэнцефалический барьер ДВС – диссеминирующее внутрисосудистое свертывание ДГЭА –дегидроэпиадростерон ДТЗ – диффузный токсический зоб ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЖДА – железодефицитная анемия ЖКТ – желудочно-кишечный тракт ИБ – иммуноблоттинг ИМ – инфаркт миокарда ИРМА – иммунорадиометрический анализ ИФА – иммуноферментный анализ КА – коэффициент атерогенности КБС – конкурентное белковое связывание КДЛ – клинико-диагностическая лаборатория КО – контрольные образцы КФК – креатинфосфокиназа ЛГ – лютеинизирующий гормон ЛДГ – лактатдегидрогеназа ЛПВП – липопротеиды высокой плотности ЛПНП – липопротеиды низкой плотности ЛПОНП – липопротеиды очень низкой плотности ЛППП – липопротеиды промежуточной плотности МАТ – моноклональные антитела МДС – миелодиспластический синдром МИЧ – международный индекс чувствительности 149 МНО – международное нормализованное отношение МЦ – менструальный цикл НК – нуклеиновые кислоты НМГ – низкомолекулярные гепарины НФГ – нефракционный гепарин НЭЖК – неэстерифицированные (свободные) жирные кислоты ОИМ – острый инфаркт миокарда ОПН – острая почечная недостаточность ОЦК – объем циркулирующей крови ПВ – протромбиновое время ПДФ – продукты деградации фибрина ПИФ – прямая иммунофлюоресценция ПСА – простатспецифический антиген ПЦР – полимеразная цепная реакция РИА – радиоиммунологический анализ РИФ – реакция иммунофлюоресценции РМП – реакция микропреципитации РН – реакция нейтрализации РНК – рибонуклеиновая кислота РРА – радиореагентный анализ РРТ – радиорецепторное тестирование РСК – реакция связывания комплемента РФМК – растворимые фибринмономерные комплексы РЭА – раково-эмбриональный антиген СА – раковый антиген СД – сахарный диабет СКФ – скорость клубочковой фильтрации СМЖ – спинномозговая жидкость СОЭ – скорость оседания эритроцитов СРБ – С-реактивный белок СТГ – соматотропный гормон ТВ – тромбиновое время ТГ – триглицериды ТКТ – тиреокальцитонин ТРГ – тиреотропин-рилизинг-гормон ТСГ – тироксинсвязывающий глобулин ТТГ – тиреотропный гормон УЗИ – ультразвуковое исследование ФАТ (PAF) – фактор активирующий тромбоциты ФСГ – фолликулостимулирующий гормон ХМ – хиломикроны ХМЛ – хронический миелолейкоз ХПН – хроническая почечная недостаточность ХС – холестерин 150 ЦМВ – цитомегаловирус ЦНС – центральная нервная система ЦП – цветовой показатель ЩЖ – щитовидная железа ЩФ – щелочная фосфатаза ЭДТА – этилендиаминтетраацетат ЭЭГ – электроэнцефалография CMV – цитомегаловирус EBV (ВЭБ) – вирус Эпштейна-Барр GRА – гранулоциты НвА1с – гликозилированный гемоглобин HbF – фетальный гемоглобин HCT – гематокрит HGB – концентрация гемоглобина HSV – вирус простого герпеса LYМ – лимфоциты MCH – среднее содержание гемоглобина в эритроците MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроците MCV – средний объем эритроцитов MID – средние клетки MON – моноциты MPV – средний объем тромбоцитов PDV – ширина распределения тромбоцитов по объему РСТ – тромбокрит PLT – тромбоциты RBC – эритроциты RDW – распределение эритроцитов по объему, ширине ТХ – тромбоксан WBC – лейкоциты 151 ЭТАЛОНЫ ОТВЕТОВ ГЛАВА 1 1-Е, 2-С, 3-А, 4-С, 5-С, 6-А, 7-А, 8-D, 9-Е, 10-А, 11-A, 12-B, 13-A, 14-B, 15-C, 16-A, 17-C, 18-E, 19-B, 20-A, 21-A, 22-A, 23-A, 24-C, 25-B, 26-А, 27-B, 28D, 29-C, 30-B ГЛАВА 2 1-B, 2-B, 3-C, 4-B, 5-B, 6-A, 7-C, 8-C, 9-C, 10-A, 11-А, 12-B, 13-D, 14-A, 15-А, 16-С, 17-В, 18-D, 19-D, 20-С ГЛАВА 3 1-A, 2-Е, 3-C, 4-D, 5-B, 6-A, 7-A, 8-A, 9-A, 10-A. 11-С, 12-Е, 13-А, 14-С, 15-С, 16-D, 17-В, 18-D, 19-С, 20-А 152 ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА Авторы: Дмитрий Юрьевич Кустов Алла Васильевна Мельник Елена Викторовна Зоркова и др. Учебное пособие ГОСУДАРСТВЕННАЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ДОНЕЦКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. ГОРЬКОГО» 283003, г. Донецк, пр. Ильича, 16 Подписано в печать________________Формат 60x84/8 Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Cambria Усл. печ. л. 17,79 Уч.-изд. л. Заказ № Тираж 300 экз. Отпечатано в типографии ФЛП Кириенко С.Г. ДНР, 283014, г. Донецк, пр. Дзержинского, 55\105. Свидетельство о государственной регистрации физического лица-предпринимателя №40160 серия АА02 от 05.12.2014 г.
