Лекция МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ. 1. 2. 3. 4. Литература Методы микробиологического контроля лекарственных средств: учебное пособие / М.Р. Карпова, Л.С. Муштоватова, О.П. Бочкарева, Е.В. Попова, И.Ф. Зверева, А.В. Грицута; под ред. Л.С. Муштоватовой. – Томск: Изд-во СибГМУ, 2017. – 249 с. https://www.books-up.ru/ru/excerpt/metody-mikrobiologicheskogo-kontrolya-lekarstvennyhsredstv-7614872/?page=5 Гунар О.В., Сахно Н.Г., Новик Е.С., Булгакова Г.М., Колосова Л.В., Буйлова И.А., Рощина М.В. Развитие микробиологических методов анализа лекарственных средств // Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2016. №1. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/razvitie-mikrobiologicheskih-metodov-analizalekarstvennyh-sredstv (дата обращения: 19.12.2023). https://www.youtube.com/watch?v=ELSvpg3uFGM Система обеспечения качества в фармацевтическом производстве Производитель лекарственных средств должен организовать их производство так, чтобы: •обеспечить их соответствие назначению, регистрационному досье; • исключить риск для пациентов, связанный с недостаточной безопасностью, эффективностью, качеством. Для выполнения таких требований на предприятии должна быть организована фармацевтическая система обеспечения качества. Обеспечение качества – это совокупность организационных мероприятий, предпринимаемых в целях гарантии соответствия качества ЛС их назначению. Система обеспечения качества в производстве ЛС предполагает: 1. Четкое определение обязанностей руководства; 2. Создание ЛС путем планирования, разработки, исследования и внедрения с учетом требований правил надлежащей производственной и надлежащей лабораторной практики; 3. Составление четкой документации на все производственные и контрольные операции; 4. Производство, поставку и использование надлежащего сырья и упаковочных материалов, выбор и мониторинг поставщиков; 5. Изготовление, проверку и хранение готовой продукции в надлежащих условиях, исключающих риск получения некачественной продукции; 6. Качество продукции на протяжении всего срока годности при хранении, реализации и последующем обращении; 7. Выпуск ЛС в обращение только после того, как Уполномоченное лицо удостоверит, что каждая серия продукции была произведена и проконтролирована в соответствии с требованиями регистрационного досье и другими требованиями в отношении производства; 8. Проведение самоинспекции и/или аудита (контроля сторонней организации) качества, которые повышают эффективность системы обеспечения качества. Система обеспечения качества в фармацевтическом производстве Фармацевтическое предприятие должно разработать руководство по качеству, содержащее описание системы управления качеством, включая обязательства ключевого персонала. Качество, безопасность и эффективность ЛС должны быть подтверждены на всех этапах его разработки, испытания, производства и реализации. Этапы обращения нового Система требований ЛС Доклинические испытания GLP – Good Laboratory Practice – лабораторная практика надлежащая Клинические испытания GCP – Good Clinical клиническая практика Промышленное производство GMP - Good Manufacturing Practice – надлежащая производственная практика Хранение GSP - Good Storage Practice – надлежащая практика хранения лекарственных средств. Оптовая продажа GDP - Good Distribution Practice – надлежащая практика оптовой реализации Practice – надлежащая Поступление к потребителю GPP – Good Pharmacy Practice – надлежащая аптечная через аптечную сеть практика Надлежащая производственная практика (GMP) – часть системы обеспечения качества, которая направлена на обеспечение высокого уровня качества, безопасности и эффективности ЛС и гарантирование того, что ЛС изготовлено в соответствии со своей формулой (составом), не содержит посторонних включений, маркировано надлежащим образом, упаковано и сохраняет свои свойства в течение всего срока годности. Надлежащая производственная практика устанавливает требования к системе управления качеством, контролю качества, персоналу, помещениям и оборудованию, документации, производству продукции и проведению испытаний, порядку отзыва продукции и организации самоинспекций. - к Лекарственные средства – это продукция, которой предъявляются высокие требования по безопасности и эффективности в процессе их разработки, испытаний, производства и реализации. В РФ основополагающим документом, регламентирующим производство лекарственных средств является национальный стандарт ГОСТ Р 52249 и Государственная фармакопея Российской Федерации, определяющая показатели качества выпускаемых лекарственных субстанций и изготовленных из них препаратов Основные положения GMP: • Все производственные процессы должны быть четко определены и описаны, систематически проверяться и пересматриваться с учетом накопленного опыта; • Все инструкции и процедуры должны быть даны в письменной форме ясно и однозначно, к относиться конкретным и предметам обеспечивать возможность выполнения операций; • Во время процесса производства необходимо вести записи (вручную использованием и/или с устройств), записывающих которые подтверждают выполнение всех стадий процесса в соответствии с установленными процедурами и инструкциями, а также что количество и качество продукции на каждом этапе соответствуют запланированным; • Любые отклонения должны быть запротоколированы и исследованы, должны быть приняты соответствующие корректирующие и предупреждающие действия; • Предприятие должно иметь в наличии: обученный персонал, имеющий необходимую квалификацию, подходящие площади и помещения, необходимое оборудование, соответствующие исходные материалы, упаковочные материалы, этикетки, соответствующие условия хранения и транспортирования продукции; • На каждую производственную серию продукции должны вестись протоколы, позволяющие проследить историю серии; • При оптовой реализации продукции должен быть сведен к минимуму риск снижения ее качества; • Должна быть организована система отзыва любой серии реализованной продукции, а также система расследования рекламаций на качество продукции, выявления несоответствий и принятия мер к предотвращению случаев несоответствия. Система обеспечения качества в фармацевтическом производстве Неотъемлемая часть обеспечения качества ЛС – валидация. Валидация – документально оформленные действия, которые в соответствии с принципами надлежащей производственной практики доказывают, что определенная процедура, процесс, деятельность или система приводят к ожидаемым результатам с заранее критериями установленными 030-2013. приемлемости (ТКП «Надлежащая производственная практика») Валидируются как процессы, так и методики испытаний. Уровень микробной чистоты – один из основных показателей качества фармацевтической продукции. По этому показателю все препараты делят на: • Стерильные – препараты, в которых не допускается содержание жизнеспособных клеток микроорганизмов (~ 20 % от общего количества ЛС); •Нестерильные – препараты, в которых допускается содержание живых микроорганизмов, требования к количеству и качественному составу которых зависит от лекарственной формы и способа введения препарата и нормируется соответствующей документацией (ГФ РБ, ФСП РБ) (~ 80 % от общего количества ЛС). Важность микробиологического контроля в фармацевтическом производстве обусловлена последствиями присутствия микроорганизмов как в стерильных, так и в нестерильных ЛС, создающими опасность для здоровья и жизни человека. Роль микроорганизмовконтаминантов ЛС в патологии человека: •Могут приводить к серьезным инфекционным заболеваниям или к отравлению организма вследствие образования токсинов; •Могут приводить к биодеградации ЛС, в частности действующих веществ (АФИ), - в результате происходит снижение либо отсутствие терапевтического действия препарата; •Способствуют появлению и распространению лекарственной устойчивости – способности сохранять жизнедеятельность несмотря на контакт с химиопрепаратами. Природа заболеваний, вызываемых микроорганизмамиконтаминантами ЛС: •Неинфекционные: обусловленные продуктами биодеградации АФИ •Инфекционные: вызываемые проникновением в организм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Токсикозы заболевания, энтерально вызываемые экзотоксинами действующими (S. aureus, микроорганизмов C.botulinum.) -Токсикоинфекции — заболевания, вызываемые эндотоксинами микроорганизмов (B. cereus, род Klebsiella). Возникновение, развитие и исход заболевания зависят: •от уровня микробной контаминации; •вирулентности микроорганизмаконтаминанта; •резистентности человека; •способа введения препарата. Для стерильных ЛС наличие микроорганизмов даже в малом летальным, количестве может стать учитывая беспрепятственное попадание микроорганизмов в кровь или на слизистые оболочки, при условии ослабленного иммунитета человека. При местном применении вероятность развития инфекционного процесса резко возрастает при обширных повреждениях тканей в результате травмы, ожога, хирургического вмешательства. Например: Staphylococcus aureus при попадании с контаминированным ЛС •на кожу или слизистые может вызывать гнойно-воспалительные процессы •при ингаляционном введении – стафилококковую пневмонию •при пероральном введении – токсикоинфекцию •при попадании в кровяное русло – генерализованную инфекцию (сепсис). Вывод: нормирование относительно стерильности и микробиологической чистоты ЛС, регламентированное требованиями фармакопеи, предназначено для защиты потребителей ЛС от возможных последствий их контаминации микроорганизмами. Источники и пути микробной контаминации в фармацевтическом производстве Лекарственное сырье и готовые препараты могут обсеменяться микроорганизмами на различных этапах их технологического изготовления, а также при хранении. микроорганизмов в сферу производства являются: •Технологическое оборудование, коммуникации; •Сырье и вспомогательные материалы на всех стадиях производства, хранения и транспортировки; •Упаковочные материалы; •Вода, используемая в производстве; •Технологический и вентиляционный воздух; •Персонал, занятый в производстве; •Посевной материал, питательная среда, добавки, пеногасители и др. (для продуктов, получаемых с использованием процессов микробного синтеза и биотехнологических подходов). Историческая справка Оценка вероятности микробной контаминации нестерильных лекарственных средств во всем мире стала проводиться после фактического доказательства возможности инфицирования потребителей препаратами, загрязненными патогенными микроорганизмами. • В 1966 г. в Швеции была зарегистрирована вспышка инфицирования сальмонеллезом, возникшая в результате использования загрязненного препарата. Пострадали более 200 человек. • Установлено негативное продуктов деструктивное влияние жизнедеятельности бактерий и грибов на стабильность и эффективность лекарственных препаратов. • ВОЗ принимает рекомендации по введению максимально допустимого уровня микробной контаминации нестерильных лекарственных средств. •Конец 60-х годов 20-го века - нормы по микробиологической чистоте лекарственных средств начали устанавливаться в нормативных документах Великобритании, Европы и США. •Для разработки условий проведения микробиологических исследований лекарственных средств были привлечены специалисты-микробиологи в области методологии испытаний в пищевой и санитарной микробиологии. •Но определенные физико-химические и биологические свойства лекарственных средств требовали введения новейших подходов к определению их микробиоты. •С 1968 г. постепенно вносились изменения, в том числе в методы и условия проведения микробиологических исследований по контролю качества лекарственных средств. •В странах бывшего Советского Союза контроль ЛС по микробиологическим показателям долгое время проходил по требованиям инструкций 70-х годов ХХ столетия, которые, в отличие от рекомендаций ВОЗ, включали другие подходы к методологии выявления микробиоты в ЛС, что не согласовывалось с требованиями ведущих фармакопей мира. Тем не менее: По результатам анализов, выполненных в период с 1973 по 1975 гг. из 5000 препаратов 65% не предъявляемым удовлетворяло уровню требованиям по обсемененности, 12% - содержали патогенные микроорганизмы. - В 1979г. только 30% проверенных препаратов не соответствовали требованиям и лишь 0,9% содержали патогенные микроорганизмы. •1989 г. - первые шаги в направлении создания микробиологического контроля ЛС, выход Государственной фармакопеи СССР ХІ издания (выпуск 2), которая впервые содержала требования к определению качества лекарственных средств по показателям «Стерильность» и «Микробиологическая которые соответствовали чистота», рекомендациям ВОЗ. •1996 г. - дополнения № 1 к ГФ ХІ, которое стало основным документом, на котором базировался микробиологический контроль фармацевтической продукции отечественных предприятий. •За последние 30 лет в европейских странах и США неоднократно менялись требования, предъявляемые к нестерильным лекарственным средствам по показателю «Микробиологическая чистота». Результатом этой работы стали международные и национальные стандарты (Фармакопея США, Европейская фармакопея, Британская фармакопея, ГФ РБ, ГФУ, ГФ XII), четко регламентирующие требования к уровню содержания в фармацевтической продукции микроорганизмов и проведение исследований по определению микробиологической чистоты лекарственных средств. Микробиологическая контаминация продукта происходит через воду, нестерильную посуду, воздух производственных помещений, руки персонала и т.д. Выявление загрязнения осуществляется в ходе микробиологического мониторинга. Данный вид контроля проводится как в чистых помещениях, так и в контролируемых зонах на производстве и в лабораториях. Программа мониторинга должна иметь статус обязательного к исполнению документа и содержать следующую информацию: – план и описание помещений, точек проб отбора; – установление критических точек (открытый продукт, частое вмешательство оператора и т. д.); – периодичность и время взятия проб; – ссылки на методики отбора проб, проведения испытаний, оценки результатов; – установление ответственности за определенные операции; – установление лимита тревоги (ЛТ) и лимита действия (ЛД). Особенно важен мониторинг среды при производстве стерильных лекарств, в частности, препаратов, производимых в асептических условиях. Здания, помещения, производственные линии и оборудование Одним из ключевых принципов GMP является соответствие места расположения, проектирование, строительство и эксплуатация чистых помещений, оборудования и инженерных систем характеру выполняемых работ, так как это гарантирует очистку воздуха чистых помещений и защищает население от возможных вредных выбросов химической и биологической природы. В свою очередь, чистые помещения обеспечивают необходимую степень защиты производимых лекарственных препаратов от воздействия окружающей среды. Необходимое оборудование позволяет гарантировать качество препаратов, очистки и устранения остаточных загрязнений с поверхностей; исключается возможность загрязнения препарата продуктами разложения и элементами конструкций (частицы металла, уплотнений и т. п.). Инженерные системы обеспечивают соответствующее функционирование чистых помещений и оборудования, служат для подготовки воды, воздуха, сжатого воздуха и инертных газов, используемых в технологическом процессе. Помещения. В процессе производства существует риск перекрестного загрязнения исходных материалов или продуктов в ходе неконтролируемого выделения пыли, газов, испарений, аэрозолей или микроорганизмов из материалов (продукции) и от остаточных загрязнений на оборудовании и одежде людей. Для предотвращения перекрестного загрязнения необходимо осуществлять производство в специально выделенных зонах (обязательное для пенициллинов, живых вакцин, бактериальных препаратов из живых микроорганизмов и некоторых других биологических препаратов) или разделять циклы производства во времени с соответствующей уборкой помещения и оборудования между циклами. Лица, не имеющие права допуска работы в этих помещениях, не допускаются в них. В помещении не должно быть труднодоступных для очистки мест. Все открытые поверхности в чистых зонах должны быть гладкими, непроницаемыми, без трещин и изломов, что обеспечит возможность многократной обработки моющими и дезинфицирующими средствами. Для предотвращения попадания загрязнения из пространства подвесные потолки должны быть герметичными. Все чистые помещения должны быть максимально защищены от проникновения насекомых или животных. В зонах, используемых для асептического производства, запрещается устанавливать канализационные трубы. В чистых помещениях более низких классов при удалении стоков следует предусматривать гидрозатворы для предотвращения обратного потока. Количество помещений для переодевания, душевых и туалетов должно соответствовать численности персонала. Недопустим выход из туалета непосредственно в производственные и в складские помещения. Помещения для переодевания должны обеспечивать физическое разделение различных этапов переодевания, чтобы свести к минимуму загрязнение технологической одежды частицами и микроорганизмами. Последняя часть помещения в оснащенном состоянии должна иметь тот же класс чистоты, что и зона, в которую она ведет. Устройства для мытья рук следует, как правило, устанавливать только в передней части комнаты для переодевания. Комнаты отдыха и приема пищи должны быть отделены от остальных . помещений Воздушные потоки не должны представлять риска для загрязнения продукта. Необходимо организовать эффективную обработку и обтекание рециркулирующего воздуха контролируемой зоны. Соседние помещения различных типов должны иметь перепад давления воздуха 10–15 Па (рекомендуемое значение), чтобы воздух перемещался от более чистых к менее чистым смежным помещениям. При работе с патогенными, высокотоксичными, радиоактивными материалами или живыми вирусами, бактериями могут потребоваться специальные способы подготовки воздуха и обеспечения перепада давления. Для некоторых операций может потребоваться деконтаминация оборудования и обработка удаляемого воздуха Необходимо предусмотреть систему аварийного оповещения об отказе системы подготовки воздуха и установить датчики перепада давления между зонами. Значения перепада давления регулярно фиксируются в специальном журнале. В зонах складирования все поступающие материалы, готовая продукция обязаны пройти карантин и должны храниться раздельно (каждое наименование) до получения разрешения на использование или отгрузку в условиях хранения, установленных производителем. Все складские зоны должны быть аттестованы, иметь «валидацию условий хранения», которая подтвердит приемлемость поддержания заявляемых условий хранения. Для отбора проб исходных материалов выделяется отдельная зона – конструкция, эксплуатация которой должна соответствовать заявленному классу чистоты производственных помещений. Например, если производство таблеток осуществляется в зонах класса D, то и складская зона отбора проб должна соответствовать классу D. Помещения для животных необходимо изолировать от остальных зон и организовать отдельную систему вентиляции и отдельный вход. Оборудование. Оборудование и производственные линии должны использоваться строго по назначению. К основным производственным инженерным системам относятся: система подготовки воздуха для чистых помещений, системы подготовки воды очищенной и воды для инъекций, чистого пара, сжатого воздуха и инертных газов. На каждую систему должны быть разработаны инструкции по эксплуатации и обслуживанию, составлены программы и график производственнопрофилактических работ. Все работы с критическим оборудованием (стерилизаторы, системы подготовки и фильтрации воздуха, воздушные и газовые фильтры, системы приготовления, хранения и распределения воды и пр.) и . инженерными системами должны документально фиксироваться • • Ленты конвейеров не должны пересекать зону А (В) и рабочую зону с меньшей чистотой воздуха. В противном случае, ленту необходимо непрерывно стерилизовать. Трубопроводы для очищенной воды и воды для инъекций необходимо обрабатывать согласно инструкции, в которой указаны пределы микробной загрязненности и меры по ее устранению, если обнаружены превышения норм этого показателя. Упаковочные линии, печатные машины для упаковки должны находиться в чистом состоянии и не содержать продукции или документов, относящихся к предшествующей работе. Продукция различных видов не должна упаковываться в непосредственной близости друг от друга при отсутствии физического разделения зон. Все критическое оборудование подлежат аттестации и плановому техническому обслуживанию. Их повторный ввод в действие должен быть разрешен в установленном порядке. После очистки и дезинфекции оборудования необходимо осуществлять контроль наличия остатков предыдущего продукта или моющих средств, маркировку этого оборудования с указанием статуса чистоты. В зависимости от статуса на каждой единице оборудования необходимо размещать этикетку «Очищено», «В работе» или «Подлежит очистке». Для наглядности рекомендуется использовать этикетки красного, желтого и зеленого цветов Источники и пути микробной контаминации в фармацевтическом производстве Зависимость микробной контаминации от сырья Классификация сырья по происхождению: • Синтетическое; • Природное - минеральное - растительное -животное Синтетическое сырье – сырье, получаемое методами химического синтеза Минеральное сырье – полезные ископаемые, извлекаемые из недр земли (калийные и натриевые соли, мел, известь и др.) Наиболее загрязнено сырье природного происхождения (животного и растительного). Источники и пути микробной контаминации в фармацевтическом производстве Пути попадания микроорганизмов в Качественный состав микробиоты органы и ткани животных: животного сырья: • Нормальная (собственная) - бактерии (аэробы, факультативные микробиота (микробиота анаэробы. Представители группы совокупность различных видов микроорганизмов, населяющих кишечной палочки, родов Proteus, определенную среду обитания); Aeromonas, Salmonella, Clostridium, • При жизни животных гематогенным Bacillus); путем (травмы, в результате -вирусы (аденовирусы, энтеровирусы, снижения иммунитета вследствие длительного голодания, вирус герпеса у обезьян, используемых утомленности и т.п.); для получения вакцин); • После гибели животных и в процессе -прионы - особый класс инфекционных обработки агентов, представленных белками с - с инструментов, рук, одежды рабочих аномальной третичной структурой и не при разделке туши; содержащих нуклеиновых кислот. - при хранении; - при транспортировке. Прионы способны увеличивать свою Признаки поражения сырья животного численность, используя функции живых происхождения микроорганизмами: клеток (в этом отношении прионы схожи - изменение цвета; с вирусами): катализируют конформа- изменение консистенции; ционное превращение гомологичных им - появление налета; нормальных клеточных белков в себе - появление характерного запаха. подобные. Прионы вызывают нейродегенеративные заболевания, так как образуют внеклеточные скопления в центральной нервной системе и формируют амилоидные бляшки, которые разрушают нормальную структуру нервной ткани. Разрушение характеризуется образованием «дыр» (полостей) в нервной ткани, и ткань принимает губчатую структуру. Заболевания, вызываемые прионами: 1.У крупного рогатого скота: - губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота («коровье бешенство»); 2. У людей: -болезнь Крейтцфельдта — Якоба (прогрессирующее дистрофическое заболевание коры большого мозга, базальных ганглиев и спинного мозга); Герстмана-Штраусслера- синдром (прогрессирующей Шейнкера атаксией, к которой мозжечковой присоединяются паркинсонизм, гиперкинезы, парезы, глухота, атрофия зрительного нерва); - фатальную семейную бессонницу. Все известные прионные заболевания поражают головной мозг и другие нервные ткани, в настоящее время неизлечимы и в конечном итоге смертельны. В производстве нельзя применять клетки нервной ткани как потенциально опасный источник прионов. Источники и пути микробной контаминации в фармацевтическом производстве •Подземные органы ( сбор весной или осенью): корни, корневища, корневища с корнями, клубни, луковицы, клубнелуковицы •Надземные органы (сбор в фазу цветения): трава, побеги, листья, цветки, бутоны, почки, кора, плоды, семена, ягоды Биологически активные вещества, содержащихся в лекарственном сырье: алкалоиды, гликозиды, витамины, дубильные вещества, сапонины, слизи, флавоноиды, жирные масла, камеди, пектины, смолы, органические кислоты, полисахариды, эфирные маслаи др. Качественный состав микробиоты лекарственного растительного сырья: - эпифитная микробиота; - фитопатогенная микробиота. Эпифитная микробиота – микроорганизмы, развивающиеся в норме на поверхности растения и не наносящие ему вреда: -не проникают внутрь тканей растения; -растут за счет обычных выделений растений и органических загрязнений их поверхности; - многие устойчивы к фитонцидам, высушиванию, ультрафиолетовому облучению; - в некоторых случаях составляют конкуренцию фитопатогенным микроорганизмам. Представители: Erwinia herbicola, Pseudomonas fluorescens, Bacillus mesenthericus и др. Фитопатогенная микробиота – микроорганизмы - возбудители заболеваний растений: • бактерии (вызывают бактериозы): -Род Erwinia- вызывает болезни типа ожога, увядания, мокрой гнили. -Род Pseudomonas– вызывает бактериальную пятнистость (на листьях образуются пятна различной окраски и размеров). -Род Xanthomonas – вызывает сосудистые бактериозы (закупорка сосудов, увядание и гибель), поражает листья, вызывает пятнистость. -Род Corynebacterium – сосудистые и паренхиматозные заболевания, бактериальный рак. -Род Agrobacterium – вызывает образование опухолей (корончатые галлы). •грибы (вызывают микозы): фузариозы, мучнистая роса, парша, головня, спорынья, гнили, пятнистости и др. •вирусы (вызывают вирусные заболевания): мозаика, желтуха, карликовость, морфологические изменения и др. Признаки поражения ЛРС микроорганизмами: • изменение цвета (пожелтение, потемнение, пятнистость); • появление налета; • размягчение, разрушение отдельных участков тканей; • деформация; • характерный запах и др. Результат поражения ЛРС микроорганизмами: • изменение клеточных структур и химического состава тканей; • снижение содержания биологически активных веществ. Вода как источник контаминации Последствия применения Назначение воды в фармацевтическом производстве контаминированного ЛРС: сырье (компонент готовых •отсутствие терапевтического • основное лекарственных средств и питательных сред); эффекта; •развитие аллергических реакций; • вспомогательное сырье (обработка помещений и оборудования, приготовление растворов •возникновение инфекционных заболеваний; дезинфектантов и антисептиков, выделение и очистка биологически активных веществ - БАВ); •развитие токсических реакций. В фармацевтическом производстве используют: Пути попадания микроорганизмов в органы и ткани растений: •прижизненное инфицирование: в результате механических повреждений, через устьица; заготовки и •на всех этапах сбор, первичная хранения: обработка, сушка, измельчение, упаковка, получение резаного сырья, растительных порошков, брикетов и гранул, хранение и транспортировка. • • • • Питьевую воду из центральных систем хозяйственно-питьевого водоснабжения (в процессах микробного синтеза); Очищенную воду (получают из воды питьевой обмена, методами дистилляции, ионного обратного осмоса, электродиализа); Высокоочищенную воду (получают из воды питьевой методами подвижного обратного осмоса, ультрафильтрации, деионизации) Воду для инъекций (получают из воды очищенной) – в производстве стерильных лекарственных средств. Источники и пути микробной контаминации в фармацевтическом производстве Качество воды регламентируется Государственной монографиями фармакопеи РБ (ГФ РБ). •Микробиологическая чистота воды очищенной: общее количество аэробных микроорганизмов (ОКА) 100 КОЕ/мл; •Микробиологическая чистота воды высокоочищенной: ОКА – 10 КОЕ/100 мл •Микробиологическая чистота воды для инъекций: ОКА – 10 КОЕ/ 100 мл •Микробиологическая чистота воды питьевой: ОКА 50 КОЕ/мл (СанПин) Микроорганизмы-контаминанты воды: бактерии, грибы, простейшие, водоросли и вирусы. Меры по предупреждению контаминации воды микроорганизмами: •на стадии подготовки воды: правильная организация системы водоподготовки, в т.ч. - выбор материала трубопроводов (нержавеющая сталь, стекло, полимерные материалы особого изготовления или др. инертные материалы) соединение и расположение трубопроводов должно обеспечивать возможность стерилизации путем пропускания чистящих и стерилизующих растворов со скоростью не менее 1,5 м/с в трубах наибольшего диаметра. Источники и пути микробной контаминации в фармацевтическом производстве • - на стадии хранения воды: хранят в закрытых емкостях, изготовленных из инертных материалов (полипропилен, тефлон, нержавеющая сталь и др.) - воду для инъекций хранят при температуре от 3°С до 7°С или от 80°С до 95°С - в случае длительного хранения воды для инъекций необходимо организовать ее циркуляцию при температуре в интервале 85-90°С - установить и подтвердить время хранения, обеспечивающее сохранение свойств воды в пределах действующих нормативных документов. Зависимость микробной контаминации объектов производства от воздуха Типы воздуха производственных помещений: •атмосферный (поступает без предварительной очистки); (подается через •вентиляционный системы специальные воздухоподготовки); •технологический (очищенный от механических частиц и стерилизованный воздух): используется для аэрирования при культивировании клеток-продуцентов, для передвижения технологических жидкостей и сыпучих материалов из одних емкостей в другие, для сухожаровой стерилизации материалов первичной упаковки. Источники и пути микробной контаминации в фармацевтическом производстве Причины попадания микроорганизмов в объекты производства с воздухом: •первичная высокая контаминация атмосферного воздуха; •неэффективная работа системы воздухоподготовки. В зависимости от уровня требований, предъявляемых к микробной чистоте воздуха, уже на стадии проектирования выбирают необходимое число ступеней очистки. Вспомогательные вещества как источник микробной контаминации Причины •получение в ненадлежащих условиях; •нарушение требований к хранению и транспортировке. Упаковочный материал и его роль в микробной контаминации лекарственных средств Виды упаковочных материалов: • первичная (индивидуальная) упаковка – непосредственно контактирует с лекарственным средством и обеспечивает длительную защиту препарата от воздействия окружающей среды (ампулы и флаконы из стекла, тюбик-капельницы из полиэтилена, контурные ячейковые упаковки из поливинолхлорида, фольги алюминиевой и др.); • вторичная упаковка – объединяет некоторое количество первичных упаковок (пачка); • транспортная упаковка - служит для доставки продукции к месту хранения или реализации. Причины контаминации упаковочного материала: - неправильно выбранный материал для его изготовления (материал должен быть устойчив к биодеградации); - нарушение условий хранения (стеклянные флаконы и ампулы при хранении во влажных условиях контаминируются бациллами и грибами); - адаптивная способность микроорганизмов использовать упаковочный материал в качестве субстратов в метаболических процессах. Зависимость микробной контаминации от персонала Человек – активный источник контаминации микроорганизмами, а также механическими частицами. Причины: • человек – носитель разнообразной и многочисленной микробиоты (постоянной и случайной); • технологические операции выполняются людьми, страдающими заболеваниями ЖКТ, кожи, дыхательных путей, а также имеющими повышенную потливость, либо, наоборот, сухость кожных покровов; • отсутствие или неудовлетворительное состояние технологической одежды; • несоблюдение персоналом требований к личной и производственной гигиене, а также несоблюдение правил поведения в ходе выполнения технологического процесса; Пути попадания микроорганизмов от персонала в сферу производства: •воздушно-капельный (с выделениями полости рта и верхних дыхательных путей); •воздушно-пылевой и контактный пути с участков кожи, не защищенных одеждой (лица, шеи, рук, волосяного покрова); •воздушно-пылевой и контактный путь с индивидуальной технологической одежды. Количество выделяемых клеток микроорганизмов человеком: -из верхних дыхательных путей при чихании – до 105 кл/мл - со слюной – до 108 кл/мл - с секретом полости носа – до107 кл/мл Зависимость количества выделяемых человеком микробных и механических частиц от характера выполняемых в процессе производства движений (в мин.): - не двигаясь – до 104 частиц -в положении сидя с легкими движениями рукой и головой – до 105 частиц - при интенсивной работе – до 106 частиц •Вывод: неукоснительное соблюдение правил поведения при выполнении технологических операций (особенно при работе в асептических условиях). Источники и пути микробной контаминации в фармацевтическом производстве Посевной материал как источник микробной контаминации Природа посевного материала: • микроорганизмы (эукариоты и прокариоты); • растительные клетки; • животные клетки. Контаминанты посевного материала: - бактерии - грибы - вирусы - фаги Причины контаминации посевного материала: - несоблюдение правил асептики при работе с культурами-продуцентами 2. Производство стерильных лекарственных препаратов К производству стерильных препаратов предъявляются особые требования, которые направлены на сведение к минимуму риска загрязнения микроорганизмами, пирогенами и взвешенными частицами конечного продукта. Особо загрязняющими веществами являются сенсибилизирующие вещества, биологические препараты, содержащие живые микроорганизмы, цитотоксины, некоторые гормоны. Наиболее опасное загрязнение – это загрязнение инъекционных препаратов, а также препаратов, предназначенных для приема в больших дозах и/или в течение продолжительного времени. Процессы производства стерильных лекарственных средств подразделяются на две категории: – финишная стерилизация (т. е. стерилизация в герметичной первичной упаковке); – процессы, осуществляемые в асептических условиях на одном или всех этапах производства. Для производства стерильной продукции чистые помещения (зоны) классифицируются в соответствии с требованиями к производственной операции и требованиями к окружающей ее среде для сведения к минимуму риска загрязнения продукта или материалов микроорганизмами. Чистые зоны при производстве стерильных лекарственных средств подразделяются на четыре типа: А – зона для проведения операций, представляющих высокий риск для качества продукции, например зоны наполнения, укупорки, вскрытия ампул и флаконов, соединения частей оборудования в асептических условиях. В таких зонах обычно используется однонаправленный (ламинарный) поток воздуха, который контролируется и подтверждается при аттестации. В – зона, непосредственно окружающая зону А, предназначена для асептического приготовления и наполнения; С и D – чистые зоны для выполнения менее ответственных стадий производства стерильной продукции. Изолирование производственных помещений позволяет снизить риск микробного загрязнения продукции из окружающей среды. Изолятор предназначен для проведения операций с высоким риском для качества продукции. Допускается наличие рабочих зон внутри изолятора без ламинарного потока воздуха. Это помещение должно контролироваться и соответствовать зоне D. Класс чистоты помещения (зоны) устанавливает пределы содержания частиц: - микробных в производстве нестерильных ЛС - микробных и механических в производстве стерильной продукции. Чистые помещения (зоны) при производстве стерильных ЛС подразделяются на 4 класса: • Класс А: локальная зона для проведения операций, представляющих высокий риск для качества продукции. Например, зона наполнения (розлива) стерильных растворов. Как правило, такие условия обеспечиваются ламинарным потоком воздуха на определенном месте. Ламинар-бокс — лабораторный прибор для работы с объектами в стерильных условиях. Представляет собой шкаф, оборудованный осветителями, ультрафиолетовыми лампами и системой подачи стерильного воздуха. Стерильный воздух подаётся в бокс ламинарным потоком (равномерное движение воздуха без завихрений). Используется при микробиологических, молекулярно-биологических работах, работах с культурами клеток, тканей и органов. • Класс В: чистая зона, непосредственно окружающая зону класса А, и предназначенная для асептического приготовления и наполнения. • Классы С и D: чистые зоны для осуществления менее критичных стадий производства стерильной продукции (приготовление растворов, подлежащих стерилизующей фильтрации, операции с первичной упаковкой). При выполнении операций в асептических условиях необходим микробиологический мониторинг производственной среды. Микробиологический мониторинг – один из наиболее важны х видов лабораторного контроля процесса асептического производства, предоставляющий информацию о качестве окружающей среды асептического технологического процесса, позволяющий предотвратить выпуск потенциально загрязненного продукта, а также предупредить возможность такого загрязнения в будущем за счет выявления неблагоприятных тенденций. Микробиологический мониторинг является неотъемлемой частью GMP при производстве лекарств. Пределы микробной контаминации установлены только для эксплуатируемого состояния. «Оснащенное» состояние – условие, когда чистое помещение (зона) полностью подготовлено, оборудование установлено и готово к работе, но персонал отсутствует. – условие, при котором (зоны) и оборудования режиме с определенным Система обеспечения качества в фармацевтическом производстве Объекты микробиологического мониторинга • Воздух помещений • Технологическое оборудование • Рабочие поверхности • Руки персонала в перчатках • Одежда персонала •Контейнеры, в которых хранится продукт • Вода и др. Частота отбора проб зависит от класса чистоты помещения: -зоны класса А – каждую рабочую смену -зоны класса В – каждую смену или ежедневно - зоны класса С – 2 раза в неделю - зоны класса D – еженедельно Система обеспечения качества в фармацевтическом производстве Программа микробиологического мониторинга включает: • Определение микробной контаминации воздуха (КОЕ/м3); • Контроль критических поверхностей, непосредственно контактирующих со стерильным материалом, рук и одежды персонала, работающих в асептических производственных зонах; •Оценку эффективности дезинфекции; помещений и оборудования; • Проверку активности дезинфектантов; •Контроль эффективности работы стерилизующих воздушных фильтров; • Оценку качества стерилизации; •Валидацию методов микробиологического контроля. Контроль микробной контаминации воздуха 1.Пассивный метод: заключается в экспозиции плотной питательной среды в открытых чашках Петри. Открытые чашки Петри располагают в нескольких точках. Микроорганизмы, присутствующие в воздухе, со временем осаждаются на поверхность агара. Время экспозиции составляет от 15 мин до нескольких часов. После экспозиции чашки Петри инкубируют при определенных температурных условиях, подсчитывают число выросших колоний и их видовую принадлежность. Метод широко распространен, но главным недостатком метода является возможность выявления только больших быстрооседающих частиц и неопределенность в объеме отобранной пробы. Система обеспечения качества в фармацевтическом производстве 2.Активный метод: с использованием специальных приборов - щелевых импакторов и аэрозольных пробоотборников. Портативный пробоотборник RCS Принцип работы: разгон воздушного потока с помощью многосопловой решетки до высокой линейной скорости и инерционное осаждение микроорганизмов на плотную питательную среду в чашке Петри (или на агаровую полоску), установленную перпендикулярно воздушному потоку. После отбора пробы извлекается чашка Петри, закрывается крышкой и помещается в термостат для инкубации. После инкубации проводится подсчет колоний на поверхности питательной среды. Концентрация микроорганизмов в единице объема воздуха определяется путем деления числа колоний на объем отобранной пробы. Устройство прибора позволяет отбирать различные объемы воздуха: 25 л, 100л, 250л и т.д. Система обеспечения качества в фармацевтическом производстве Контроль микробной контаминации поверхностей Репрезентативной считается проба, снятая с поверхности площадью от 24 до 30 см2. 1. Метод смыва с поверхностей: Смывы с поверхностей проводят стерильным ватным тампоном, укрепленном на стеклянном или металлическом держателе, вмонтированном в ватно-марлевую пробку пробирки. В пробирке должно содержаться приблизительно 2 мл стерильной воды для инъекций. После взятия пробы проводят несколько раз по поверхности среды питательной в двух параллельных чашках Петри со средой для бактерий и со средой для грибов. Чашки инкубируют, после чего проводят подсчет колоний на двух параллельных чашках, делают мазки, фиксируют их и окрашивают по Граму, микроскопируют. Делают выводы. 2.Метод контактных пластин: Контактные пластины – агаризованная питательная среда, разлитая на специальные пластины или в чашки Петри таким образом, чтобы поверхность агара выступала над краем чашки Петри. Стерильная поверхность питательной среды накладывается на исследуемую поверхность. После инкубации в соответствии со сроками и температурой для используемых сред проводят подсчет колоний и микроскопируют окрашенные по Граму мазки. Метод контактных пластин подходит для тестирования гладких и ровных поверхностей (рабочий стол, стены, пол или одежда персонала). Система обеспечения качества в фармацевтическом производстве Контроль контаминации персонала (перчаток и одежды) 1.Определение микробной контаминации перчаток персонала. Отпечатки пяти пальцев каждой руки (в перчатках) делают на поверхность плотной питательной среды для бактерий и для грибов (параллельно). Чтобы касание было полным, рекомендуется сделать скользящее движение пальцами по всей поверхности агара. Чашки инкубируют и проводят подсчет выросших колоний микроорганизмов. 2. Определение микробной контаминация одежды персонала. Обычно определяется на предплечьях с помощью контактных пластин. Также проверяются бахилы. Можно применять метод смыва тампоном. Для этого делают смывы увлажненным тампоном с 4 участков площадью по 25 см2 каждый на нижней части двух рукавов, верхней передней поверхности комбинезона (халата) и шлеме. Рекомендованные пределы микробной контаминации при микробиологическом мониторинге чистых помещений (зон) в эксплуатируемом состоянии Класс чисто ты Рекомендованные пределы микробной контаминации Проба воздуха, КОЕ/м3 Седиментац ия на чашку d=90 мм, КОЕ/4 часа Контактн ая пластина (d=55 мм), КОЕ/плас тина Отпечато к пяти пальцев в перчатке, КОЕ/перч атка А <1 <1 <1 <1 В 10 5 5 5 С 100 50 25 - D 200 100 50 - Все выявленные в процессе проведения мониторинга микроорганизмы подлежат обязательной макроскопической и микроскопической идентификации. Идентификация дает возможность контаминации, предположить источник основываясь на преимущественном распространении микроорганизмов во внешней среде. При обнаружении споровых бактерий или грибов необходимо проводить дополнительную дезинфекцию помещений. Мероприятия по созданию помещений нормированных классов чистоты: 1.Строительно-планировочные мероприятия; 2.Подготовка вентиляционного воздуха; 3.Санитарная подготовка оборудования; 4.Подготовка и правила поведения персонала. Неотъемлемой составляющей системы обеспечения качества являются: контроль санитарно-гигиенического состояния производства, основного и вспомогательного сырья, производственного процесса и готовой продукции, которые проводятся в соответствии с программой производственного контроля. Программа производственного контроля – документ предприятия-изготовителя, определяющий порядок и периодичность контроля санитарно-гигиенического состояния производства лекарственных средств, сырья, производственного процесса и готового продукта. Программа разрабатывается ответственными лицами предприятия, утверждается руководителем предприятия изготовителя. Ответственность за разработку программы производственного контроля и ее выполнение несет руководитель производственной микробиологической лаборатории. Производственный контроль проводится в производственных лабораториях, имеющих разрешение на работу, выданное федеральными органами исполнительной власти в области санитарноэпидемиологического благополучия населения. В соответствии с Федеральным законом Российской Федерации от 8.08.2001 № 128 «О лицензировании отдельных видов деятельности», производственные лаборатории, осуществляющие работы с санитарно-показательными микроорганизмами, должны иметь лицензию на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний IV группы патогенности. Значительную часть требований к качеству фармацевтической продукции и к условиям производства контролирует микробиолог: стерильность, микробное обсеменение сырья и нестерильных лекарственных средств, соблюдение правил производственной гигиены, предусмотренных GMP. Микробиологическая лаборатория обеспечивает контроль качества, осуществляя микробиологический мониторинг всех этапов производственного процесса: – входной контроль сырья, – контроль хранения и упаковки, – контроль процесса производства, – контроль готового продукта (приемо-сдаточный контроль), – контроль утилизации. Обязательным пунктом в микробиологическом мониторинге является контроль и оценка микробиологического состояния производственной среды (рис. 1). Основной микробиологический мониторинг включает отслеживание контаминации: – воздуха – активным методом (при помощи прибора) и пассивным (седиментационный метод); – оборудования чистых помещений – метод отпечатков на агаровую среду, метод взятия мазков с поверхности; – работников – метод отпечатков; – упаковочного материала; – химических субстанций, применяемых для производства лекарственных препаратов; – лекарственного растительного сырья; – воды очищенной и воды инъекционной; – готовых лекарственных препаратов. Во всех случаях речь идет о культивационных методах на агаровой среде с подсчетом количества колоний. На асептических производствах также контролируется: – стерильность первичной упаковки; – микробиологическая нагрузка инъекционного препарата перед фильтрацией; – cтерильность дезсредств; – эффективность методов стерилизации; – описание мер, которые должны быть приняты при превышении лимитов. При определении стратегии контроля по каждому объекту необходимо выбрать критические точки и параметры контроля, объем испытаний, которые позволили бы обеспечить качество выпускаемой продукции. В большинстве случаев используется три схемы организации контроля качества – усиленный, нормальный и ослабленный контроль. Например, если есть точная информация о поставщике, об уровне его производства и накопленном опыте работы, имеющихся знаний для внутрипроизводственного контроля, результатам рассмотрения ежегодного обзора качества, то можно ограничиться ослабленным контролем. Микробиологический контроль нестерильных лекарственных средств Основные задачи микробиологического контроля нестерильной продукции: 1.Имеются ли в образце жизнеспособные микроорганизмы (бактерии, грибы)? (качественный анализ) 2.Если да, то в каком количестве? (количественный анализ) 3. Что именно? (идентификационный анализ). Для ответа на поставленные вопросы используют только фармакопейные методы. Микробиологические требования к нестерильной продукции: -должна содержать ограниченное количество микроорганизмов; -не должна содержать определенные виды микроорганизмов; -допустимое количество и виды микроорганизмов зависят от лекарственной формы и пути введения препарата; нестерильные лекарственные формы Нестерильными называют лекарственные формы, в которых допускается содержание определенного количества непатогенных микробов. Основные лекарственные формы: настои, настойки, порошки, пилюли, мази, капли и др. Признаки порчи нестерильных лекарственных препаратов: смена цвета, неприятный запах, помутнение, осадок, пленка, изменение консистенции. Лекарственные средства, что не требуют стерилизации, содержат микроорганизмы, поэтому их исследуют на микробную чистоту: проводят количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов в 1г или 1мл препарата, а также проявляет микроорганизмы (бактерии семейства энтеробактерий, синегнойная палочка, золотистый стафилококк), которые не должны быть имеющимися в нестерильных лекарственных средствах . У нестерильных лекарственных формах определяют: 1.Микробное число - количество бактерий и грибов в 1 г (мл). 2.Наявность кишечной палочки, золотистого стафилококка, синегнойной палочки. Нормы микробов в нестерильных лекарственных формах: 1. У 1г (мл) препарата для прийома внутрь не более 1000 бактерий і 100 грибов. 2 В 1г (мл) препарата для местного применения - не более 100 микробов, в т.ч. грибов. 3. У таблетированных препаратах не должно быть патогенной микрофлоры, а общая обсемененность не должна превышать 10 тис. микробных клеток на таблетку. 4. Не допускается наличие кишечной палочки, золотистого стафилококка, синегнойной палочки. В асептических условиях (в стерильной чашке Петри, обоженными ножницами и пинцетом ) из листа или верхнего слоя корневища вырезают кусочек площадью 1 см2 , который помещают в пробирку с 10 мл стерильного физиологического раствора и взбалтывают в течение 5 мин . Из полученного смыва готовят четыре десятиразовым разведения (1:10 , 1:100 , 1:1000 , 1:10000 ) , для посева в связи с большим обсеменением растительного сырья используют два последних ( 1: 1000 и 1: 10000 ) разведения. В стерильную чашку Петри вносят 1 мл смыва , после чего в нее наливают 15 мл расплавленного и остуженного до 45 ° С МПА , перемешивают и после застывания агара посевы инкубируют при 37 ° С 24 - 48 час. Делают подсчет колоний , выросших на поверхности и в глубине агара . Полученное число колоний умножают на степень разведения. Определение микрофлоры в лекарственных формах При исследовании лекарственных форм осуществляют: определения общего микробного числа ( микробная обсемененность ) • определение бактерий группы кишечной палочки • определение дрожжевых и плесневых грибов ; • определение условное - патогенных и патогенных микроорганизмов Общее микробное число ( ОМЧ ) - количество микроорганизмов , содержащихся в 1 г ( мл) препарата , определяют по числу выросших колоний Определение микробной обсемененности растительного лекарственного сырья Критерии приемлемости для микробиологической чистоты нестерильных лекарственных средств. (ГФ РБ т.1, изд-е 2 раздел 5.1.4.) Способ применения ЛС Общее количество аэробов (ОКА), КОЕ/г или КОЕ/мл Общее количество грибов (ОКГ), КОЕ/г или КОЕ/мл Специфические микроорганизмы (в 1г или 1мл ) Неводные ЛС для внутреннего применения 103 102 Отсутствие Escherichia coli Водные лекарственные средства для внутреннего применения Ректальный 102 101 Отсутствие Escherichia coli 103 102 Для кожного, назального, ушного использования Для ингаляционного применения 102 101 102 101 Отсутствие Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa Отсутствие Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Грамотрицательных бактерий, толерантных к желчи Интерпретация критериев приемлемости: Критерии приемлемости для 1 - 10 КОЕ: максимально допустимое число микробиологической чистоты нестерильных = 20; субстанций для фармацевтического - 102 КОЕ: максимально допустимое число использования = 200; (ГФ РБ т.1, изд-е 2 раздел 5.1.4., ЕР) -103 КОЕ: максимально допустимое число = 2000. Общее Общее Критерии выбора микроорганизмов, Назначение количество количество нормирование которых предусмотрено аэробов грибов (ОКГ), Фармакопеей: (ОКА), КОЕ/г или • Опасность для здоровья населения; КОЕ/мл КОЕ/г или •Способность служить критерием оценки КОЕ/мл гигиенического состояния производства, Субстанции предусмотренного правилами GMP; 103 102 •В настоящее время признан достаточным для для получения результатов, адекватно фармацевтиче отражающих качество продукции по ского использования микробиологическим показателям; • Со временем может быть расширен. Критерии приемлемости для микробиологической чистоты нестерильных субстанций для фармацевтического использования (ГФ РБ т.1, изд-е 2 раздел 5.1.4., национальные требования) Назначение Нестерильные субстанции для производства стерильных ЛС, ЛС для местного и ингаляционного применения и Нестерильные субстанции для производства нестерильных ЛС Субстанции природного происхождения, для которых предварительная антимикробная обработка невозможна и для которых уполномоченный орган допускает микробное загрязнение исходного сырья более 103 в 1г или 1 мл Общее количество аэробов (ОКА), КОЕ/г или КОЕ/мл Общее количество грибов (ОКГ), КОЕ/г или КОЕ/мл Суммарно не более 102 103 102 Суммарно не более 104 Специфические микроорганизмы (в 1г или 1мл ) Отсутствие Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, грамотрицательных бактерий, толерантных к желчи, либо бактерий семейства Enterobacteriaceae Отсутствие Escherichia coli Отсутствие Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella (в 10 г или 10 мл), Не более 102 КОЕ грамотрицательных бактерий, толерантных к желчи, либо бактерий семейства Enterobacteriaceae Методы определения микробиологической чистоты нестерильных ЛС (ГФ РБ т.1, изд-е 2 раздел 2.6.12) 1.Метод высева на чашки Петри с питательной средой: - метод глубинного посева - метод поверхностного посева 2. Метод мембранной фильтрации 3.Метод наиболее вероятного числа (наименее точный метод, используется для продуктов с очень низкой бионагрузкой). Принцип: методы основаны на посеве на/в питательные среды определенного количества образца препарата, инкубировании, подсчете выросших колоний и выявлении специфических микроорганизмов, интерпретации полученных результатов. Питательные среды, используемые для определения микробиологической чистоты Микроорганизмы Питательная среда Общее количество аэробов (ОКА) Агаризованная среда на основе гидролизата казеина и соевых бобов (# агаризованная среда №1) Общее количество грибов (ОКГ) Декстрозный агар Сабуро (# агаризованная среда №2) Escherichia coli Бульон на основе гидролизата казеина и соевых бобов, бульон Макконки, агар Макконки Возможность обнаружения микроорганизмов-контаминантов в испытании в присутствии испытуемого продукта (ЛС или АФИ или вспомогательное вещество) должна быть доказана. 1. Проверка пригодности питательных сред А. Проверке подлежит каждая партия приготовленных питательных сред (~ 5% от количества в партии); Б. Проверка стерильности: термостатируют образец каждой серии питательной среды после ее стерилизации в течении 5-ти суток при 30-35°С (если среда используется для выявления бактерий) и 20-25°С (если среда используется для выявления грибов). По истечении заданного срока на (в) питательных средах должны отсутствовать визуально определяемые признаки роста микроорганизмов. В. Проверка ростовых свойств: • Ростовые качества питательных сред обеспечиваются двумя факторами: - наличием питательных веществ (пептиды, углеводы) и факторов роста, таких как аминокислоты, витамины, микроэлементы и пр. - отсутствием ингибиторов роста микроорганизмов, например, остатков протеолитических ферментов, примесей тяжелых металлов, антибиотических веществ, и т.д.; • Контролем при определении ростовых качеств среды служит: - стандартная среда с гарантированными ростовыми свойствами, на котором правильно проявляется количественный и качественный рост микроорганизмов (морфология колоний); - в случае отсутствия стандартной среды для контроля ростовых свойств в качестве контроля используют некоторое количество среды из предыдущей партии. - Селективные и диагностические среды должны избирательно поддерживать рост определенного вида (видов) микроорганизмов, характерным образом его идентифицировать (например, цвет колонии, зона ферментации вокруг колонии) и подавлять другие виды. Выявляемые специфические микроорганизмы Среда Бульон Макконки Escherichia coli Агар Макконки Свойство Тест-штамм Ростовое Escherichia coli Ингибирующее Staphylococcus aureus Ростовое и индикаторное Escherichia coli • Используют эталонные тест-культуры микроорганизмов: - Staphylococcus aureus - Pseudomonas aeruginosa - Bacillus subtilis - Candida albicans - Aspergillus brasiliensis • Каждая партия питательной среды (жидкой и агаризованной) должна быть проверена отдельно для каждого организма: - Агаризованная среда и бульон на основе гидролизата казеина и соевых бобов или агаризованная среда №1 должны быть проверены с использованием всех бактериальных штаммов; - Декстрозный агар Сабуро или агаризованная среда №2 должны быть проверены с использованием Candida albicans и Aspergillus brasiliensis. •Используют суспензии тест-штаммов, содержащие ~ 100 КОЕ/мл : -Каждый штамм выращивают отдельно в пробирках на соответствующей питательной среде (ГФ РБ таблица 2.6.12.-1 для ОКА и ОКГ, 2.6.13.-1 для специфических микроорганизмов). Тест-штаммы аэробных бактерий выращивают при 30-35 °С в течение 18-24 часов; тестштаммы грибов выращивают при 20-25°С в течение 2 суток (Candida albicans), 5 суток (Aspergillus brasiliensis). -Готовят исходную суспензию каждого штамма смывом с поверхности агара буфером (ГФ РБ), для лучшего суспендирования грибных спор используют ПАВ – полисорбат 80 – в количестве 0,05%. -Оптическую плотность исходной суспензии сравнивают с оптической плотностью стандарта мутности 0,5 по МакФарланду (MсFarland). Совпадение оптических плотностей означает, что исходная суспензия содержит ~ 108 КОЕ/мл. -Из исходных суспензий готовят рабочие суспензии серией десятикратных разведений в том же растворителе до концентрации 100 КОЕ/мл. Приготовленные суспензии используют в течение 2 ч. или, при условии хранения при температуре 2-8 °С, в течение 24 ч. -Чашки с агаризованными средами или емкости с жидкими средами инокулируют соответствующим микроорганизмом в количестве ~ 100 КОЕ (1 мл рабочей суспензии с концентрацией 100 КОЕ/мл). Инкубируют в подходящих условиях в течение требуемого для бактерий и грибов времени (ГФ РБ). -Контроль: инокулированные среды из предыдущей партии. -Отрицательный контроль: контролю подвергается растворитель, используемый для приготовления исходной и рабочей суспезий тест-микрорганизмов, путем высева на питательные среды. Не должно наблюдаться роста микроорганизмов. - Учет и интерпретация результатов: Для агаризованных сред: выросших подсчитывают число колоний. Найденное значение не должно отличаться от значения, полученного для предыдущей партии среды более чем в 2 раза. Для жидких сред: должен обнаруживаться отчетливо заметный рост микроорганизмов в сравнении с ростом, который получен с использованием среды из предыдущей партии. Микробиологический контроль нестерильных лекарственных средств Для селективных питательных сред, используемых для выявления специфических микроорганизмов, подтверждают ростовые, ингибирующие рост и индикаторные свойства Испытания на ингибирующие рост свойства питательных сред: Питательную среду инокулируют ~ 100 КОЕ подходящего микроорганизма и инкубируют при определенной температуре в течение определенного периода времени Результат: не должен наблюдаться рост микроорганизмов, для которых данная среда не является селективной. - Испытания на индикаторные свойства. Выполняют методом поверхностного посева, инокулируя каждую чашку ~ 100 КОЕ соответствующего микроорганизма. Инкубируют при определенной температуре в течение периода времени, необходимого для выявления специфического микроорганизма. Результат: Выросшие колонии по индикаторным реакциям (цвету) должны соответствовать описанию в ГФ РБ и должны быть сравнимы с теми, которые наблюдаются на предыдущей партии партии среды. Количество выросших колоний не должно отличаться от значения, полученного для предыдущей партии среды более чем в 2 раза. 2. Проверка наличия/отсутствия антимикробного действия ЛС (АФИ, вспомогательного вещества). 1. Некоторые ЛС (АФИ, вспомогательные вещества) обладают выраженным антимикробным действием: •Специфическое антимикробное действие: антибиотики, антисептики, производные фторхинолонов, сульфаниламиды и др. – т.е. из них, вещества и препараты лечения предназначенные для инфекционных заболеваний. •Неспецифическое антимикробное действие: цитостатики, спирты, S-содержащие препараты, некоторые анальгетики и др. – т.е. вещества и препараты из них, непосредственно не предназначенные для лечения инфекционных процессов, но обладающие сопутствующим антимикробным действием. 2. Наличие антимикробного действия ЛС проверяется в тех же условиях, что и определение микробиологической чистоты, с использованием тест-культур, применяемых для проверки ростовых свойств питательных сред. 3.В основе метода определения антимикробного действия лежит сравнение интенсивности роста тест-микроорганизмов в присутствии и в отсутствие испытуемого продукта (АФИ, вспомогательного вещества, ЛС). 4. Приготовление испытуемого образца: •водорастворимые продукты: растворяют или разводят (обычно в соотношении 1:10) в буфере или питательной среде (ГФ РБ). •нерастворимые в воде продукты: суспендируют (обычно в соотношении 1:10) в буфере или питательной среде (ГФ РБ). •жиры: -продукт растворяют в небольшом количестве стерильного изопропилмиристата или смешивают с небольшим количеством ПАВ, нагретого до 40 - 45°С. При необходимости поддерживают температуру в водяной бане; -добавляют предварительно подогретый до нужной температуры разбавитель до получения разведения продукта 1:10, перемешивают до образования эмульсии. 5.Контроль – растворитель, используемый для приготовления образца ЛС (буфер или питательная среда – ГФ РБ). 6.Инокуляция образца и контроля, высев на питательные среды: •Испытуемый образец и контроль инокулируют суспензией тест-микроорганизма в количестве ~100 КОЕ. •Объем суспензии микроорганизма не должен превышать 1% объема образца или контроля. •Делают высев на чашки Петри глубинным или поверхностным способом, инкубируют. Для каждого микроорганизма используют не менее 2-х чашек. 7.Отрицательный контроль: контролю подвергается растворитель, используемый для приготовления исходной и рабочей суспезий тест-микрорганизмов, путем высева на питательные среды. Не должно наблюдаться роста микроорганизмов. 8.Учет роста и интерпретация результатов: • Подсчитывают количество выросших колоний бактерий и грибов в чашках с добавлением образца препарата и контроля, рассчитывают среднее арифметическое. • Если среднее количество колоний в чашках с испытуемым образцом отличается от среднего количества колоний в чашках с контролем менее чем в 2 раза (процент восстановления – более 50%), то считается, что продукт не обладает антимикробным действием. • В противном случае продукт обладает антимикробным действием, необходимо его устранить (нейтрализовать). 3. Нейтрализация (устранение) антимикробного действия: •Разведения исходного образца. •Добавление нейтрализующего агента (специфического или неспецифического) в растворитель. •Комбинация двух методов. •Мембранная фильтрация. Разведение исходного образца - используют тот же растворитель, что и для приготовления образца ЛС (буфер или питательную среду); - разведение должно проводиться с учетом критериев приемлемости по содержанию микроорганизмов в продукте. Например: если содержание ОКА – 103 КОЕ/г, а ОКГ – 102 КОЕ/г, то последнее допустимое разведение образца для устранения антимикробного действия составит – 1:500 для бактерий и 1:50 для грибов (при посеве 1 мл образца с культурой глубинным способом); - если желаемый результат достигается при используют это минимальном разведении, разведение; - контроль, отрицательный контроль, проведение испытания и интерпретацию результатов аналогично как при «Проверка наличия/отсутствия антимикробного действия ЛС». Добавление нейтрализующего агента - перечень возможных неспецифических нейтрализующих агентов: натрия гидросульфит, глицин, лецитин, полисорбат, тиогликолят, тиосульфат, ионы Mg, Ca; -специфические инактиваторы: β-лактамаза (пенициллиназа) – для β-лактамных антибиотиков (пенициллинов, цефалоспоринов, карбапенемов и монобактамов), парааминобензойная кислота – для сульфаниламидов и др. - необходимо подтвердить эффективность и отсутствие токсичного действия нейтрализующих агентов на микроорганизмы в испытаниях без испытуемого продукта; проведение испытания, учет и интерпретация результатов – аналогично проверке наличия антимикробного действия Не найден подходящий метод нейтрализации : - бактерицидное действие продукта в отношении тестмикроорганизмы. Следовательно, продукт не может быть контаминирован видами данными микроорганизма; - продукт ингибирует только определенные (используемые в испытании) виды микроорганизмов не и ингибирует другие. Испытание проводят с большим коэффициентом разведения с учетом критериев приемлемости для выявления устойчивых штаммов. Определение микробиологической чистоты ЛС (АФИ, вспомогательных веществ) (ОКА и ОКГ) • Количество испытуемого образца: чем больше масса образца, тем выше статистическая достоверность вывода об отсутствии патогенных микроорганизмов. Если иное не указано в частной статье, используют 10 г или 10 мл испытуемого продукта Количество может быть уменьшено - для АФИ, содержание которых в ЛС очень мало ≤1 мг в дозированной единице (таблетке, капсуле) и недозированной единице (мл или г). В этом случае количество испытуемого образца должно быть не 10 менее чем количество, содержащееся в дозированных единицах или 10 г (10 мл) продукта; - для АФИ, количество которых ограничено или объем серии очень мал (1000 мл или 1000г). Количество образца для испытания – 1% от размера серии; - для ЛС, общее количество в серии которых менее 200 единиц (например, для клинических испытаний). Размер отбираемого для контроля образца – 2 единицы. Мембранная фильтрация: -готовят образец из 10 г продукта (растворяют в отношении 1:10 в буфере или питательной среде – ГФ РБ) с учетом результатов испытаний по определению антимикробного действия; -количество образца, эквивалентное 1 г исходного продукта, наносят на каждый из двух мембранных фильтров и немедленно фильтруют, при необходимости промывают; -для определения ОКА один из мембранных фильтров переносят на поверхность агаризованной среды на основе гидролизата казеина и соевых бобов (или №1). Чашки инкубируют в течение 3-5 суток при температуре 30 - 35°С; -для определения ОКГ второй из мембранных фильтров переносят на поверхность декстрозного агара Сабуро (или №2). Чашки инкубируют в течение 5-7 суток при температуре 20-25°С -рассчитывают число КОЕ (ОКА и ОКГ) в 1г или 1 мл испытуемого продукта и делают вывод о соответствии его качества требованиям спецификации. • Метод чашечного подсчета: - готовят образец из 10 г продукта с учетом результатов испытаний по определению и устранению антимикробного действия; - для каждой питательной среды (для выявления ОКА и ОКГ) готовят не менее 2-х чашек Петри для каждого уровня разведений; - посевы делают глубинным или поверхностным способом; - инкубируют посевы аналогично как и для мембранной фильтрации; - для подсчета колоний отбирают чашки с максимальным количеством колоний не более 250 для определения ОКА и не более 50 для определения ОКГ. Рассчитывают среднее арифметическое значение числа колоний для каждого разведения и определяют количество КОЕ в 1 г или 1 мл испытуемого продукта. Делают вывод о соответствии его качества критериям приемлемости. - отрицательный контроль: контролю подвергается растворитель, используемый для приготовления раствора/суспезий испытуемого продукта, путем высева на питательные среды. • Если на агаризованной питательной среде для выявления бактерий обнаруживаются колонии грибов, они рассчитываются как часть общего количества аэробов (ОКА). • Если на агаризованной питательной среде для выявления грибов обнаруживается рост колоний бактерий, они рассчитываются как общее количество грибов (ОКГ). Определение микробиологической чистоты : испытания на наличие специфических микроорганизмов Пример: выявление Escherichia coli (метод чашечного подсчета) 1. Образец готовят аналогично как и для выявления ОКА и ОКГ 2. Испытанию подвергают количество, эквивалентное 1 г или 1 мл продукта 3. Инокулируют подходящее количество бульона на основе гидролизата казеина и соевых бобов, перемешивают, инкубируют при температуре 30-35°Св течение 18-24 ч. 4. Встряхивают контейнер, переносят 1 мл образца, полученного при выполнении п.3, в 100 мл бульона Макконки и инкубируют при температуре 42-44°С в течение 24 - 48 ч. - обогащение Пересевают подходящее количество образца, полученного при выполнении п.4, на чашки с агаром Макконки и инкубируют при температуре 30-35°С в течение 18-72 ч. – индикация Интерпретация результатов: рост 6. характерных колоний свидетельствует о возможном присутствии Escherichia coli. Результат подтверждается идентификационными испытаниями. 7. Продукт выдерживает испытания, если подобные колонии не обнаруживаются или испытания идентификации дают отрицательный результат. При проведении испытания методом мембранной фильтрации приготовленный образец фильтруют через мембранный фильтр, который помещают в бульон на основе гидролизата казеина и соевых бобов, перемешивают, инкубируют при температуре 30-35°С в течение 18-24 ч. далее: аналогично пп. 4-7. 5. Схема определения микробиологической чистоты Проверка пригодности питательных сред (стерильность, ростовые свойства) Проверка наличия/отсутствия антимикробного действия продукта Продукт не обладает антимикробным действием Прямой посев на чашки Петри с агаризованной средой Продукт обладает антимикробным действием Нейтрализация антимикробного действия (разведение, добавление нейтрализующего агента, комбинированный метод, мембранная фильтрация) Прямой посев на чашки Петри с учетом результатов устранения антимикробного действия Мембранная фильтрация и перенос фильтров на поверхность агаризованных сред Инкубирование, подсчет выросших колоний, интерпретация результатов Бактериологическое исследование стерильных лекарственных средств Инъекционные растворы , глазные капли , лекарственные средства для новорожденных , другие лекарственные препараты, стерилизуются в процессе их изготовления , засевают неразведенными в тиогликолевой среда для определения микробной обсемененности и среду Сабуро для выявления дрожжевых и плесневых грибов . Посевы на тиогликолевой среде выдерживают 14 суток при 37 ° С , на среде Сабуро 14 суток при 24 ° С. Учет результатов посевов проводят по отсутствию видимых изменений в посевах . Определение микробной обсемененности готовых лекарств Жидкие лекарственные формы разводят стерильным физиологическим раствором 1:10 ( или 1:100 ) и засевают в объеме 0,5 мл на МПА в чашке Петри. 1г порошка или таблеток помещают в пробирку с 10 мл физиологического раствора и после растворения проводят посев на МПА . Мягкие лекарственные формы (мази , пасты) в количестве 1 г взвешивают в асептических условиях , переносят в пробирки с 10 мл стерильного 1,4 % раствора натрия гидрокарбоната для диспергирования проводимое вращательным движением пробирки между ладонями в течение 2-4 мин . , 0,5 мл полученного раствора засевают на МПА в чашках Петри. Чашки с посевами помещают в термостат на 48 ч, затем подсчитывают число колоний и определяют количество бактерий в 1 мл или 1 г образца . Определение общего количества грибов Определение общего количества грибов проводят на твердой среде Сабуро , на которое засевают 0,5 мл цельного или разведенного 1:10 препарата . Посевы инкубируют при 24 ° С в течение 5 суток , затем подсчитывают число выросших колоний и определяют количество грибов в 1 мл (1 г ) препарата . Качественное определение условно - патогенных и патогенных микроорганизмов 1. 2. Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae ( роды Escherichia , Salmonella , Shigella ) . Посев лекарственных средств проводят на среду Эндо и висмут - сульфитный агар . Идентификацию энтеробактерий осуществляют следующим образом: если в образце обнаружены грамотрицательные неспорю палочки дают отрицательную реакцию на цитохромоксидазы , ферментируют глюкозу и восстанавливают нитраты в нитриты , исследуемый препарат содержит бактерии семейства Enterobacteriaceae . Определение патогенных стафилококков . Определение патогенных стафилококков проводят посевом на желточно - солевой агар . На этой среде патогенные стафилококки вызывают расщепление лецитина , проявляющееся в просветлении вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком по периферии . Выделенную чистую культуру исследуют на наличие плазмокоагулазы . 3 . Выявление Pseudomonas aeruginosa . Осуществляют на среде с глицерином. Синегнойная палочка в этой среде образует зеленоватые флуоресцирующие колонии , выделяющие в среду сине , - зеленый пигмент. 4 . Выявление протея . Проводят посевом на МПА по Шукевичу . Наличие условно - патогенных и патогенных микроорганизмов в лекарственных препаратах недопустимо . Определение пирогенности Пирогенность (повышение температуры тела ) обусловлена наличием в стерильных лекарственных препаратах продуктов распада бактерий ( липополисахаридов ) . Стерильные инъекционные растворы должны быть апирогенны . Определение пирогенности проводят на здоровых кроликах обоих полов, не альбиносы , весом 2,5-3,0 кг , содержащихся на полноценном рационе. Испытываемую дистиллированную воду или лекарственные средства вводят трем кроликам в ушную вену в количествах и растворителях , предусмотренных соответствующими инструкциями . Воду для инъекций и раствор лекарственного средства считают непирогенним если сумма повышений температуры 3 кроликов меньше или равна 1,4 ° С. Если сумма превышает 2,2 ° С, то испытуемые растворы считают пирогенными . В случаях , когда сумма повышений температуры 3 кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,2 ° С , испытания проводят на 5 кроликах . В этом случае раствор считают непирогенним , если сумма повышений температуры у всех 8 кроликов не превышает 3,7 ° С. Микробиологический контроль стерильности лекарственных средств Стерильность – отсутствие живых микроорганизмов. Для стерильных лекарственных форм наличие микроорганизмов, даже в малом количестве, может стать летальным, учитывая беспрепятственное попадание микроорганизмов в кровь или на слизистые оболочки организма, при условии ослабленного иммунитета человека. Впервые тест на определение стерильности лекарственных средств был внесен в фармакопеи Великобритании и США в 1932 и 1936 годах соответственно. Цель испытания на стерильность – подтверждение полного отсутствия жизнеспособных бактерий и грибов в испытуемом объекте (АФИ, ЛС). Испытание применяется для препаратов, которые должны быть стерильны: •ЛС для парентерального применения и (растворы, лиофильно высушенные стерильно расфасованные порошки для инъекций и инфузий); •Офтальмологические ЛС; •Растворы антисептиков для наружного применения; •Мази, гели для наружного применения (для нанесения на раневую поверхность); •АФИ, предназначенные для производства ЛС в форме стерильно расфасованных порошков и др. Однако: удовлетворительный результат испытания свидетельствует лишь о том, что в условиях испытания в испытуемом образце не обнаружено микроорганизмов. Для стерильных продуктов обоснованные и документированные фактические доказательства правильного протекания процесса их приготовления дают большую гарантию по сравнению с испытанием на стерильность. Условия для проведения испытания по определению стерильности: •Испытания на стерильность должны проводиться в тех же условиях, что и асептическое производство: при использовании ламинар-боксов с ламинарным потоком воздуха класса А, расположенной в чистом помещении класса В, или с помощью изолятора. •Подготовка воздуха, подаваемого в чистое помещение, с помощью НЕРА-фильтров (HEPA - High Efficiency Particulate Absorption - высокоэффективная задержка частиц). Эти фильтры служат для практически полной очистки воздуха даже от самых мельчайших частиц , вплоть до 0.1 мкм. • Доступ к помещению должен быть организован через воздушные шлюзы – конструкции с однонаправленными односторонними путями прохождения. Воздушный шлюз предотвращает перемещение воздуха между помещениями. Когда все двери воздушного шлюза закрыты, подаваемый в него воздух разбавляет загрязнения, поступившие из наружного коридора через дверь, либо выделяемые присутствующим персоналом. Микробиологический контроль стерильности лекарственных средств • • • • Испытуемая продукция должна подаваться через передаточные окна. Исполнители должны быть переодеты в стерильную одежду. Исполнители должны пройти соответствующую подготовку. Меры предосторожности, принимаемые против контаминации, не должны влиять ни на один из микроорганизмов, которые могут быть обнаружены в ходе испытания. • Условия, в которых проводятся испытания, должны регулярно контролироваться путем отбора проб воздуха и поверхностей рабочей зоны. Методы определения стерильности: • Мембранная фильтрация – наиболее предпочтительный метод, если испытуемый препарат фильтруется; • Метод прямого посева. Прямой Посев • Преимущества - Быстрый, простой, экономичный - Нефильтруемые образцы • Ограничения - Ограниченный объем образца: низкая чувствительность - Проблемы с антимикробным действием Мембранная Фильтрация • Преимущества Возможность эффективного устранения антимикробного действия - Высокая надежность выявления нестерильности антимикробных препаратов из-за отсутствия разбавления, что имеет место при устранении антимикробного действия. - Возможность фильтрования большого объема - Статистически более достоверен - Более чувствителен: высокая эффективность выявления микробной контаминации при низкой концентрации клеток в единице образца благодаря возможности концентрирования или удержания на мембране даже единичных клеток (1 КОЕ на образец) • Ограничения Нефильтруемые образцы, закупоривание мембраны Питательные среды, используемые для определения стерильности: • Жидкая тиогликолевая среда: снижает окислительно-восстановительный потенциал и способствует росту анаэробных микроорганизмов - Выявление анаэробных бактерий - Аэробных бактерий • Жидкая среда на основе гидролизата казеина и соевых бобов (# среда Сабуро) : - Выявление грибов - Выявление аэробных бактерий. Приготовление питательных сред • Из отдельных ингредиентов в соответствии с ГФ РБ • Из коммерческой дегидратированной среды в соответствии с прилагаемой инструкцией (состав дегидратированной среды должен соответствовать ГФ РБ). Проверка пригодности питательных сред А. Проверке подлежит каждая партия приготовленных питательных сред (~ 5% от количества в партии) Б. Проверка стерильности: термостатируют образец каждой партии питательной среды после ее стерилизации в течении 14-ти суток при 30-35°С для тиогликолевой среды и 20-25°С для среды на основе гидролизата казеина и соевых бобов (# среды Сабуро). По истечении заданного срока на (в) питательных средах должны отсутствовать визуально определяемые признаки роста микроорганизмов. В. Проверка ростовых свойств: 1. Используемые микроорганизмы Жидкая тиогликолевая среда: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium sporogenes. - Жидкая среда на основе гидролизата казеина и соевых бобов (# среда Сабуро): Bacillus subtilis, Candida albicans, Aspergillus brasiliensis. 2. Проведение процедуры: -порции питательных сред инокулируют небольшим количеством каждого из микроорганизмов (не более 100 КОЕ). Способ приготовления рабочих суспензий аналогичен таковому при проверке ростовых свойств питательных сред, используемых для определения микробиологической чистоты. -инкубируют: до 3-х дней при температуре 30 35°С – в случае бактерий и до 5 дней при температуре 20-25°С – в случае грибов; -отрицательный контроль: контролю подвергается растворитель, используемый для приготовления исходной и рабочей суспезий тестмикрорганизмов, путем высева на питательные среды. Не должно наблюдаться роста микроорганизмов. 3. Интерпретация результатов: среды являются пригодными при условии наличия четкого визуально наблюдаемого роста микроорганизмов. Проверка наличия/отсутствия антимикробного действия ЛС: аналогично тому, как при проверке микробиологической чистоты с учетом условий проведения определения стерильности (определение проводится в жидких средах). Определение стерильности ЛС и АФИ 1.Объем выборки для испытания (количество единиц продукции): - метод определения стерильности – разрушающий, поэтому отбор для анализа большого количества единиц продукции экономически невыгоден; - использование для анализа малого количества единиц продукции при большом объеме производственной серии – риск получения неадекватного ответа. Объем выборки зависит от количества единиц продукции в серии и назначения препарата. Микробиологический контроль стерильности лекарственных средств *Минимальное количество единиц продукции для испытания Количество единиц продукции в производственной серии ЛС для парентерального применения - не более 100 контейнеров - 100 – 500 контейнеров - более 200 контейнеров 10% или 4 контейнера, в зависимости от того, что больше 10 контейнеров 2% или 20 контейнеров, зависимости от того, что меньше - более 500 контейнеров Офтальмологические и неинъекционные ЛС - не более 200 контейнеров Минимальное количество единиц продукции для каждой среды (если не обосновано или не разрешено использование других количеств) в другие 5% или 2 контейнера, в зависимости от того, что больше 10 контейнеров *Информация носит ознакомительный характер, не является обязательной Минимальные количества испытуемого продукта, используемые для каждой питательной среды Количество препарата в контейнере Жидкости: - менее 1 мл -1-40 мл - более 40 мл, но не более 100 мл - более 100 мл Твердые вещества (лиофилизированные и стерильно расфасованные порошки) Менее 50 мг 50 мг – 300 мг От 300 мг до 5 г Более 5 г Минимальное количество, которое следует использовать для посева на каждую среду (если не обосновано или не разрешено использование других количеств) Все содержимое контейнера ½ содержимого каждого контейнера, но не менее 1 мл 20 мл 10% содержимого контейнера, но не менее 20 мл Все содержимое каждого контейнера ½ содержимого каждого контейнера, но не менее 50 мг 150 мг 500 мг 2. • - - - Определение стерильности методом прямой инокуляции Водные растворы: Определенное количество испытуемого продукта помещают непосредственно в питательную среду. Объем питательной среды должен в 10 раз превышать объем образца для посева (или объем продукта должен составлять не более 10% объема питательной среды); Если испытуемый продукт обладает антимикробной активностью, испытания выполняют после нейтрализации подходящим нейтрализующим агентом или путем разведения в достаточном количестве питательной среды; При необходимости использования большого объема испытуемого продукта предпочтительно использовать концентрированную питательную среду, приготовленную с учетом последующего разбавления • Масляные жидкости: - Используют питательные среды с добавкой подходящего эмульгатора в концентрации, приемлемость которой была подтверждена предварительно (например, полисорбат 80 в концентрации 10 г/л) • Мази и кремы, гели: - Образец для анализа готовят разбавлением в соотношении ~ 1:10 путем эмульгирования с использованием выбранного эмульгатора в стерильном растворителе (например, в растворе пептона, мясного или казеинового концентрацией 1 г/л) - Приготовленный образец переносят в питательную среду • Инокулированные питательные среды инкубируют в течение не менее 14 дней при 30 - 35°С (тиогликолевая среда для выявления бактерий) и при 20-25°С (среду на основе гидролизата казеина и соевых бобов (# среда Сабуро) для выявления грибов). 3. Определение стерильности методом мембранной фильтрации Установка мембранной фильтрации: - гребенка из нержавеющей стали (1-, 3-х-, 6ти-местная) -фильтродержатели с воронками (пластмассовые, нержавстальные, стеклянные) -мембранные фильтры с номинальным размером пор – 0,45 мкм вакуумный насос -стеклянные колбы Бунзена для использования в качестве приемников фильтрата Трехместная фильтрующая система (открытого типа): - аппарат для фильтрации и мембрану стерилизуют подходящим образом Конструкция аппарата для фильтрации должна обеспечивать проведение процесса фильтрации в асептических условиях, возможность извлечения мембраны и переноса ее в питательную среду (для аппаратов открытого типа) или проведение инкубации после помещения питательной среды в аппарат (для аппаратов закрытого типа) Принцип метода: фильтруют через • Образец фильтр, который мембранный задерживает присутствующие микроорганизмы. • Помещают фильтр с задержанными на нем микроорганизмами в питательную среду и инкубируют. • Если все условия проведения анализа соблюдены, то есть правильно выбраны материал, структура и размер пор фильтра, условия проведения фильтрования, состав питательной среды, температура и время инкубирования, то микроорганизмы быстро размножаются и образуют визуально обнаруживаемый рост (помутнение среды). • Мембранные фильтры, требования: • Микроструктура мембраны и размеры пор должны максимально способствовать прорастанию удержанных на мембране микроорганизмов. • Высокая пористость, позволяющая быстро фильтровать образцы, в том числеи вязкие. • Материал мембраны не должен содержать токсичных для микроорганизмов веществ. Мембраны должны быть стерильно упакованы и готовы к немедленному использованию Мембранные фильтры, оптимальный выбор: • мембранные фильтры с номинальным размером пор не более 0,45 мкм, с установленной способностью к удерживанию бактерий. • фильтры изготавливают из инертных материалов: эфир целлюлозы (нитрат или ацетат целлюлозы) • белые или темные, с нанесенной сеткой для удобства подсчета колоний (для микробиологической чистоты) • стерильно упакованные Микрофотография бактерий на мембранном фильтре Микробиологический контроль стерильности лекарственных средств •Мембранная фильтрация водных растворов -Содержимое контейнера (контейнеров) переносят на мембрану (мембраны) и немедленно фильтруют; -Если раствор обладает антимикробным действием, мембрану промывают путем пропускания через нее определенного объема выбранного стерильного растворителя. Число циклов промывки должно быть не более 5 из расчета по 100 мл/цикл, даже если было показано, что такая промывка не полностью исключает антимикробное действие; - Мембрану целиком переносят в питательную среду или в асептических условиях делят ее на две равные части, каждую из которых помещают в тиогликолевую среду и среду на основе гидролизата казеина и соевых бобов (# среду Сабуро); - Инокулированные питательные среды инкубируют в течение не менее 14 дней при 30 - 35°С (тиогликолевая среда для выявления бактерий) и при 20-25°С (среда на основе гидролизата казеина и соевых бобов (# среда Сабуро) для выявления грибов). Контроль: рост культур микроорганизмов в питательных средах этих же партий (проверка ростовых свойств) Отрицательный контроль: -положительный результат при проверке стерильности питательных сред этих же партий; - проверка на асептичность посева: через простерилизованную установку мембранной фильтрации пропускают заведомо стерильную жидкость и производят посев в питательные среды. •Мембранная фильтрация твердых растворимых веществ -Требуемое количество продукта растворяют в походящем растворителе: растворителе, прилагаемом к ЛС, изотоническом растворе натрия хлорида, нейтральном растворе 1 г/л мясного или казеинового пептона; -Далее испытания продолжают как и для растворов. Контроль: рост культур микроорганизмов в питательных средах этих же партий (проверка ростовых свойств). Отрицательный контроль: -положительный результат при проверке стерильности питательных сред этих же партий; - отсутствие визуального роста при посеве растворителя в питательные среды (для ЛС в форме стерильных порошков, которые предварительно растворяют в растворителе); - проверка на асептичность посева: через простерилизованную установку мембранной фильтрации пропускают заведомо стерильную жидкость и производят посев в питательные среды. Микробиологический контроль стерильности лекарственных средств 4. Наблюдение и интерпретация результатов • На протяжении периода инкубации, а также по его завершении оценивают наличие макроскопических признаков микробного роста в средах • Если признаков микробного роста не обнаруживается, то продукт признают выдерживающим испытание на стерильность • При наличии признаков микробного роста продукт не выдерживает испытание на стерильность • Результаты испытания (нестерильность) могут быть признаны недостоверными лишь при выполнении не менее одного из перечисленных ниже критериев: - данные микробиологического мониторинга зоны проверки стерильности указывают на произошедшие сбои проверка методики, используемой для проведения испытания, привела к обнаружению недочетов - наличие микробного роста в отрицательном контроле - Если результаты испытания признаны недостоверными, испытание повторяют. При отсутствии признаков микробного роста в ходе повторного испытания продукт признают стерильным. При наличии – продукт нестерилен и бракуется. • Если внесение испытуемого материала приводит к помутнению питательной среды, образованию осадка или выпадению хлопьев вследствие чего наличие или отсутствие микробного роста не может быть легко определено визуально, следует через 14 суток после начала инкубации перенести соответствующую порцию инокулированной среды в свежую аналогичную среду и инкубировать первоначальные и повторные посевы еще 4 суток Схема определения стерильности Проверка пригодности питательных сред (стерильность, ростовые свойства) Проверка наличия/отсутствия антимикробного действия продукта Продукт не обладает антимикробным действием Прямой посев Мембранная в жидкие питательные среды фильтрация и перенос фильтров в жидкие питательные среды Продукт обладает антимикробным действием Нейтрализация антимикробного действия (для нефильтруемых и плохофильтруемых препаратов – разведение, добавление нейтрализующего агента, комбинированный метод; для фильтруемых мембранная фильтрация) Прямой посев в жидкие питательные среды с учетом результатов устранения антимикробного действия Мембранная фильтрация и перенос фильтров в жидкие питательные среды Инкубирование, визуальная оценка наличия/отсутствия роста, интерпретация результатов Спасибо за внимание!
