МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОЦЕНКЕ АЛЛЕРГИЗИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
advertisement
Введение Настоящие методические рекомендации являются частью общей программы оценки безопасности фармакологических веществ и способствуют унификации и оптимизации методических подходов по выявлению аллергизирующего действия потенциальных лекарственных веществ в эксперименте на животных с целью получения информативных и сопоставимых результатов. Использование стандартных методов при изучении аллергизирующих свойств фармакологических веществ особенно вновь синтезированных, дает возможность врачам более рационально назначать лекарства больным и тем самым снизить число аллергических осложнений лекарственной этиологии. Материалы экспериментальной оценки фармакологического вещества, полученные по рекомендуемой программе, могут быть включены в протокол КИ, в проект инструкции по его медицинскому применению, а также, в некоторых случаях, могут быть использованы при решении вопроса о судьбе препарата наряду с фармакологическими и химиотерапевтическими данными. 1. Общие положения Под аллергизирующими свойствами понимают способность того или иного вещества вызывать при введении в организм состояние повышенной чувствительности (гипер- чувствительность, сенсибилизация) [1]. В основе патогенеза наиболее тяжелых аллер- гических осложнений, развивающихся по 1 типу гиперчувствительности, лежит активация Th2 хелперов и продукция цитокинов IL-4, IL-5 и IL-13, с последующим синтезом IgE-антител, имеющих высокое сродство к тучным клеткам и базофилам [3]. Антиген вступает во взаимодействие с фиксированными на тучных клетках IgE-антителами, что приводит к активации клеток и секреции медиаторов аллергии (гистамина, серотонина и др.). Согласно классификации P.G.H.Gell и P.R.A.Coombs имеется еще 4 типа гиперчувствительности, в основе которых лежат другие иммунопатологические механизмы [14]. Типы гиперчувствительности 1. Анафилактический тип — реакция между фиксированными на клетке антителами (AT) IgE и специфическим антигеном (АГ) с последующим высвобождением медиаторов из клеток-мишеней. К этому типу реакций относятся анафилактический шок, отек Квинке, крапивница, определенные виды бронхиальной астмы. 2. Цитотоксический тип — реакция AT (IgM или IgG) с компонентами клеточной оболочки. Разрушение клетки происходит в присутствии комплемента (гемолитическая анемия, агранулоцитоз, лейкопения, тромбоцитопения). 3. Аллергические реакции, связанные с образованием иммунных комплексов в крови или тканях и активацией комплемента (феномен Артюса, сывороточная болезнь, увеит, лекарственная лихорадка, аллергический васкулит). 4. Клеточный тип — реакция сенсибилизированных лимфоцитов со специфическим АГ. Механизм действия по типу гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (аллергические дерматиты). В настоящее время клеточный тип гиперсенсибилизации от- носят к иммунопатологическим реакциям. 5. Прямая стимуляция антителами функции клеток (стимуляция рецептора тиреостимулирующего гормона щитовидной железы при тиреотоксикозе). Механизм, по которому может развиваться аллергическая реакция, зависит от многих факторов — природы АГ, дозы, пути введения, кратности и продолжительности введения, наличия адъювантов, подбора животных, физикохимической структуры фармакологического вещества, способности соединяться с белками в организме и др. В зависимости от этого аллергические реакции развиваются по «немедленному» или «замедленному» типу. Реакции «немедленного» типа развиваются быстро, в течение нескольких мин (1–20 мин), в их механизме участвует реакция антиген—антитело в тканях и жидких тканевых средах. Реакции «замедленного» типа — реакции между АГ и сенсибилизированными Т-лимфоцитами с последующим развитием (через 24– 48 ч.) аллергического воспаления. Реакциям «немедленного и «замедленного» т и п о в с о о т в е т с т ву ю т р а з н ы е с т а д и и а л л е р г и ч е с к и х р е а к ц и й : иммунологическая, патохимическая, патофизиологическая. При подборе тестов для исследования фармакологических веществ на аллергизирующее действие необходимо руководствоваться следующими принципами: информативность, экономичность, воспроизводимость, оптимальное сочетание методов аллергодиагностики in vivo и in vitro, использование таких методов, которые бы позволяли выявить разные типы аллергических реакций. 2. Условия проведения эксперимента Учет сенсибилизирующих свойств обязателен и проводится после оценки токсичности всех новых фармакологических веществ. Исследованию подлежат субстанции и все лекарственные формы. Особенно тщательной проверке должны быть подвергнуты вещества, содержащие белковые примеси и высокомолекулярные соединения. Если лекарственная форма содержит вспомогательные вещества (стабилизаторы, растворители и т. п.), не разрешенные для применения в медицинской практике и не изученные ранее на этот вид активности, то каждое из этих веществ исследуют отдельно. При комбинации нескольких фармакологических веществ в одной лекарственной форме (фиксированная комбинация) изучают аллергенность комбинации в целом и каждого ингредиента в отдельности, если он не был ранее разрешен для применения в медицинской практике. При изменении состава лекарственной формы, технологии ее изготовления или со- става вспомогательных веществ необходимо заново испытать новую комбинацию на аллергенность. При решении вопро с а об исследовании неоригина льного фармакологического вещества следует исходить из наличия достаточно обоснованных литературных сведений экспериментального и ретроспективного характера о способности оригинального лекарственного вещества и ЛП вызывать состояние сенсибилизации и степени ее проявления или отсутствии таковой. В случае наличия этих данных, а также при идентичности по качественному и количественному составу предлагаемой и разрешенной лекарственных форм можно ограничиться представлением экспертного заключения. 2.1. Контрольный препарат Изучение сенсибилизирующих свойств нового фармакологического вещества, относящегося к известному фармакологическому классу, проводят в сравнении со стандартным лекарственным веществом. При необходимости изучения неоригинального фармакологического вещества исследование, как правило, проводят в сравнении с оригинальными образцами. Для оценки реактивности экспериментальных животных можно использовать позитивный контроль, т.е. животных, которым вводят какой-либо эталонный аллерген (например, овальбумин, 2,4,6т р и н и т р о ф е н и л с ул ь ф о к и с л о т а , 2 , 4 , 6 - т р и н и т р ох л о р б е н з о л , 2 , 4 динитрохлорбензол, пикрилсульфокислота и др.). 2.2. Характеристика фармакологического вещества К моменту исследования необходимо располагать сведениями о физикохимических свойствах фармакологического вещества; составе готовой лекарственной формы; дозах (летальная и эффективная, рекомендуемая для КИ); признаках интоксикации, специфических для данного вещества; рекомендуемых способах введения; профиле фармакологического действия; показаниях и схемах применения препарата в клинике. Желательно также иметь данные о фармакокинетике фармакологического вещества. Состав исследуемого фармакологического вещества определяется проектами временных фармакопейных статей на субстанцию и лекарственную форму в соответствии с требованиями Минздравсоцразвития России. Изучаемые образцы должны соответствовать проекту временной фармакопейной статьи. 2.3. Растворители и разбавители фармакологических веществ Наиболее распространенными растворителями фармакологических веществ являются дистиллированная вода и изотонический раствор натрия хлорида. При работе с водонерастворимыми веществами возможно использование 1% этилового спирта, ацетона, 1% раствора крахмала. При накожных аппликациях применяют ланолин, вазелиновое или растительное масло. 2.4. Исследуемые дозы При исследовании сенсибилизирующих свойств фармакологических веществ наиболее оптимальным является исследование двух уровней доз. Минимальная доза — эффективная доза для данного вида животных (ЭД50), максимальная — на порядок выше рекомендуемой для КИ или субтоксическая доза для данного вида животных (ориентировочно 10 ЭД50), не выходящая за интервал терапевтической широты действия лекарственного вещества. В случаях, когда реальная терапевтическая доза вещества не известна, для сенсибилизации животных можно использовать дозы, последовательно на порядок меньше, чем ЛД50 (1/10, 1/100 1/1000 от ЛД50) при соответствующем способе введения. Эффект сенсибилизации оценивается как в реакциях in vivo, так и в тестах in vitro. При постановке кожных проб рабочую дозу определяют на интактных животных. Разрешающей дозой считается та концентрация фармакологического вещества или испытуемого препарата (тест-препарат), которая при внутрикожном введении на тестируемом участке кожи (для растворимых веществ) или нанесении в виде мази (для нерастворимых веществ) не вызывает кожно-раздражающего действия. Реактивность кожи выявляют введением растворителя в том же объеме, что и тест-препарат. Для оценки свойств тест-препарата в тестах in vitro дозы подбирают в исследованиях с кровью интактных животных, используя несколько разведений аллергена. В этом случае добавление аллергена в рабочей дозе в кровь интактных животных не должно увеличивать спонтанного уровня повреждения клеток крови, в частности лимфоцитов. 2.5. Лабораторные животные Исследования проводят на следующих видах лабораторных животных: морские свин- ки (масса тела 250–300 г), белые крысы популяции Wistar (масса тела 200–225 г), мыши линии Balb/c, C57BI/6, СВА (масса тела 18–20 г). В некоторых случаях (в зависимости от задач эксперимента) возможно применение беспородных мышей, крыс и кроликов. Наиболее чувствительным, в видовом отношении, животным является морская свин- ка. В исследованиях используются морские свинки-альбиносы или животные, имеющие достаточно большие участки белой кожи. Разброс в экспериментальных группах по исходной массе не должен превышать ±10%. Чувствительность самцов и самок к одному и тому же препарату может быть неодинакова, поэтому желательно проведение эксперимента на животных обоих полов. Исследования проводят на молодых, здоровых и половозрелых животных. Животные должны пройти карантин не менее 10–14 дней. В целях стандартизации перед исследованием животных не кормят в течение суток. Животные должны получать стандартную диету, представленную в виде сертифицированного комбикорма или набора натуральных кормов. Число животных в каждой группе должно быть достаточным (не менее 10), чтобы оценить характер, частоту и степень проявления аллергизирующих свойств и провести статистическую обработку экспериментальных данных. Вместе с тем при оценке сенсибилизирующего действия необходимо проводить описание индивидуальных реакций, даже если они статистически недостоверны. Результаты экспериментов обрабатываются методами вариационной статистики по критерию Стьюдента. 3. Выявление развития сенсибилизации при различных путях поступления фармакологических веществ в организм Пути введения и способы применения фармакологического вещества в эксперименте выбираются соответственно предполагаемым путям введения и способам его применения человеком. Для препаратов, использующихся перорально, следует применять внутрижелудочный способ введения. Для некоторых препаратов (ингаляционные анестетики, мази, капли) целесообразно изучение аллергенных свойств в условиях предполагаемого применения (эпикутанный метод, конъюнктивальная проба, ингаляция аэрозоля). 3.1. Эпикутанная сенсибилизация Наиболее разработанным является метод эпикутанной сенсибилизации (см. раздел 3.4). По этому методу получены многочисленные корреляции результатов на лабораторных животных и людях — добровольцах. Однако в каждом отдельном случае могут возникнуть трудности в определении оптимальной схемы эксперимента (число аппликаций, концентраты наносимого на кожу фармакологического вещества и др.). Поэтому проведению исследований по эпикутанной сенсибилизации обязательно предшествует изучение раздражающего действия фармакологического вещества. 3.2. Конъюнктивальная проба Конъюнктивальная проба является очень чувствительным тестом и в ряде случаев позволяет выявить реакцию животных на аллерген при слабой аллергизации и отрицательных кожных тестах. При наличии хорошей растворимости фармакологического вещества постановка ее обязательна. 3.3. Ингаляционное введение фармакологического вещества Определение сенсибилизирующих свойств фармакологических веществ, предна- значенных для ингаляционного применения, осуществляется при распылении тест- препарата дозирующими баллончиками или ингаляторами непосредственно в носоглоточную полость на протяжении 4 недель по 5 раз в неделю. Тестирование проводят после 10 ингаляций, а также после месячного воздействия. Для этой цели наиболее адекватным является метод, позволяющий выявить влияние сенсибилизирующих свойств фармакологических веществ на чувствительность гладких мышц трахеобронхиальной цепочки в эксперименте на морских свинках. 3.4. Пероральное введение фармакологических веществ Морским свинкам в ротовую полость или в желудок через мягкий пластмассовый зонд вводят по 1—2 капли водного раствора тест-препарата или взвеси в 1% крахмальном геле в течение 30 дней. Тестирование сенсибилизирующих свойств проводят на 10, 15, 30-й дни от начала введения испытуемого препарата. Для выявления сенсибилизирующих свойств при данном способе введения фарма- кологического вещества рекомендуется использовать реакции: непрямой дегрануляции тучных клеток или базофильных лейкоцитов, кожные пробы. 4. Методы выявления сенсибилизации Единого метода, с помощью которого можно зарегистрировать аллергизирующее действие фармакологических веществ, не существует. Отсюда следует, что система исследований потенциальных ЛП на аллергенность должна включать в себя набор методов аллергодиагностики in vivo и in vitro, из которого в каждом конкретном случае можно выбрать оптимальное сочетание тестов, позволяющих выявлять разные типы гиперчувствительности. Из специфических методов оценки сенсибилизирующих свойств фармакологических веществ можно рекомендовать следующие технически простые и хорошо воспроизводимые. I. Тесты in vivo Оценка анафилактогенной активности в реакции общей анафилаксии (анафилактический шок) 2. Кожные тесты: а) активная кожная анафилаксия; б) пассивная кожная анафилаксия; в) реакция гиперчувствительности «замедленного» типа на мышах или морских свинках; г) метод накожных аппликаций. 3. Конъюктивальная проба. II. Метод in situ Метод оценки чувствительности гладких мышц трахеобронхиальной цепочки к исследуемым препаратам в эксперименте на морских свинках. III. Тесты in vitro Реакция непрямой дегрануляции тучных клеток или базофильных лейкоцитов. Возможности выявления сенсибилизации не ограничиваются предложенными методиками, так как в настоящее время с целью обнаружения аллергизирующих свойств разработано и широко применяется множество других методов исследований, в том чис- ле определение магния в сыворотке крови, колориметрический метод определения гистамина в крови и органах животных, определение массы и клеточности подколенных лимфоузлов, так называемый PLNA тест и т.д. Следует отметить, что наиболее информативными являются методы, с помощью которых можно определить специфические для данного лекарственного вещества иммуноглобулин E, патологическая роль которого доказана в развитии наиболее серьезных аллергических осложнений. Из диагностических методов in vitro наиболее чувствительными являются методы иммуноферментного анализа и проточной цитометрии [7, 9]. Наиболее оптимальный подбор тестов зависит от направленности фармакологического действия вещества. Выявлению сенсибилизации к фармакологическим веществам может способствовать также и оценка некоторых специфических показателей, таких как увеличение абсолютного числа или относительного количества эозинофилов и базофилов, концентрация в сыворотке крови биогенных аминов (гистамин, серотонин и др.), эозинофилия тканей и др. Исходя из длительной апробации перечисленных методов при экспериментальной оценке сенсибилизирующих свойств лекарственных веществ и учитывая удовлетворительную корреляцию данных, полученных в эксперименте, с результатами КИ на людях, можно рекомендовать их какосновные в целях унификации исследований аллергозов и накопления экспериментальных данных. Эти тесты доступны для серийных исследований. Ре зульт аты, полученные с их помощью, хорошо воспроизводимы. 4.1. Оценка анафилактогенной активности Оценка анафилактогенной активно сти является обязательным исследованием при изучении аллергизирующих свойств новых лекарственных веществ. При изучении высокомолекулярных и белковых соединений, препаратов, содержащих медиаторы аллергического воспаления (гистамин, серотонин, лейкотриены и др.) или новых препаратов известных групп, которые по литературным данным имеют высокий процент аллергических осложнений I типа, необходимо изучать возможную сенсибилизацию не менее чем по 2-м методам из представленных в этом подразделе. 4.1.1. Реакция общей анафилаксии (анафилактический шок) Морским свинкам вводят исследуемый препарат в эффективной терапевтической дозе (1 группа) и в дозе, в 10 раз ее превышающей (2-я группа): первая инъекция под- кожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. Разрешающая инъекция — внутрисердечно или внутривенно на 14–21-й дни после сенсибилизирующей инъекции. Разрешающая доза должна быть равна суммарной сенсибилизирующей дозе. Разрешающая инъекция на 14–21-й дни вводится и контрольной группе животных, которым вводили только растворитель. Учет интенсивности анафилактического шока — в индексах по Weigle [20]. 4.1.2. Активная кожная анафилаксия При изучении активной кожной анафилаксии сенсибилизация та же, что и при изучении общей анафилактической реакции [18]. На 14–21-й дни на выстриженных участках спины морским свинкам внутрикожно вводят препарат в д ву к р ат н ы х р а з в ед е н и я х , в ко н ц е н т р а ц и я х , н е в ы з ы в а ю щ и х кожнораздражающего действия. Через 20 мин морским свинкам вводят внутривенно по 0,5 мл 1% раствора синего Эванса. Через 30 мин животных подвергают эвтаназии эфиром и определяют размеры синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения препарата (при положительной реакции диаметр пятна не менее 6 мм). В данной серии исследований вводить препарат внутрикожно нужно микрошприцами, при правильном введении образуется так называемая лимонная корочка. Если на месте введения через некоторое время появляется кровь, то необходимо ввести препарат в другое место. Для контроля реактивности кожи обязательно вводить тому же животному на другом выстриженном участке 0,05 мл растворителя (стерильный изо- тонический раствор натрия хлорида). Для удобства прочтения реакции места введения можно обводить разноцветными фломастерами. Разрешающие инъекции препарата и синего Эванса вводят также контрольным животным, которым в дни сенсибилизации групп животных, получавших препарат, вводили только растворитель. У таких животных в месте внутрикожного введения препарата диаметр окрашенного пятна не должен превышать 2–3 мм. Возможно воспроизведение активной кожной анафилаксии и на мы- шах. 4.1.3. Реакция общей анафилаксии на овальбумин Вторая модель реакции общей анафилаксии выбрана на основе экспериментальных доказательств аллергизирующих свойств овальбумина, селективно стимулирующего Th2 хелперы с последующей секрецией IL-4, IL-5, IL-13 и синтеза IgE антител [17]. Данный метод позволяет выявить усиление или ослабление I типа гиперчувствительности под воз- действием исследуемого соединения. Интактных морских свинок иммунизируют овальбумином или для получения более слабой системной анафилаксии раствором белка куриного яйца (БКЯ, основным аллергенным компонентом которого является овальбумин). Для получения реакции общей анафилаксии животных контрольной и получавших препарат групп иммунизируют перорально 1% БКЯ в дозе 1 мл на 250 г массы тела в течение трех дней (растворенный в физиологическом растворе БКЯ морским свинкам вводят через мягкий пластмассовый зонд) [11]. Через 12 дней после начала иммунизации БКЯ животным получавших препарат групп в течение трех дней в/б вводят исследуемое соединение не ме- нее чем в 2-х дозах, контрольным животным — соответствующий объем физиологического раствора. На следующие сутки животным получавших препарат групп внутрибрюшинно вводят препарат в изучаемых дозах, контрольным животным — физиологический раствор. Через 1 ч животным всех групп внутрисердечно вводят овальбумин или БКЯ в дозе 1 мг на 300 г массы тела, после чего регистрируют развитие анафилактической реакции. В контрольной группе у всех животных, иммунизированных БКЯ, развивается анафилактический шок различной степени тяжести (обычно легкий и умеренный). Вычисление анафилактического индекса по Weigle [20] проводят по следующей фор- муле: (N ×4)+(N1 ×3)+(N2 ×2)+(N3 ×1)+(N4 ×0), N +N1 +N2 +N3 +N4 где N — число морских свинок, у которых наступила смерть; N1 — число морских свинок, у которых развился тяжелый шок; N2 — число морских свинок, у которых развился умеренный шок; N3 — число морских свинок, у которых развился слабый шок; N4 — морские свинки, у которых не наступило шока. При гибели всех животных в группе индекс Weigle составляет 4(++++). При тяжелом шоке — 3(+++), при умеренном шоке — 2(++), при слабом шоке — 1(+). 4.1.4. Пассивная кожная анафилаксия Для получения сывороток, содержащих аллергенспецифический IgE к овальбумину, используют мышей Вalb/с массой 18–20 г. Сенсибилизацию мышей осуществляют путем внутрибрюшинного введения каждому животному 150 мкг трижды перекристаллизованного овальбумина (Sigma) в 0,5 мл физиологического раствора в смеси с 7,5 мг (Aluminum Hydroxide Gel, Sigma) Al(OH)3) [15]. В ходе эксперимента, начиная со дня сенсибилизирующей инъекции, группам мы- шей, получающим препарат, трехкратно внутрибрюшинно вводят исследуемое соединение не менее чем в двух дозах, контрольным животным — соответствующий объем растворителя. Взятие крови у мышей и выделение сыворотки осуществляют на 10 день после сенсибилизации. Для постановки ПКА используют нелинейных крыс самцов или крыс самцов линии Вистар массой 150–200 г. Животным внутрикожно вводят микрошприцом по 30 мкл физиологического раствора (контроль) и по 30 мкл последовательных двукратных раз- ведений (начиная с разведения 1:4 до 1:32) сывороток мышей контрольной и получающих препарат групп, содержащих аллергенспецифический IgE к овальбумину. Инъекцию овальбумина в разрешающей дозе делают крысам в хвостовую вену через 24 ч после пассивной сенсибилизации кожи. Антиген вводят из расчета 100 мкг овальбумина на 100 г массы тела в 1 мл 0,5% раствора синего Эванса на физиологическом растворе. Интенсивность ПКА оценивают через 30 мин по прокрашиванию участков кожи, для чего животных подвергают эвтаназии под эфирным наркозом цервикальной дислокацией, кожу отсепаровывают и выраженность реакции определяют по диаметру прокрашенного участка, измеряемому на внутренней поверхности кожи. Реакция считается положительной, если диаметр синего пятна был не менее 5–6 мм, а контроль был не больше 2–3 мм. 4.2. Реакция гиперчувствительности замедленного типа на мышах Изве стно, что интенсивно сть реакций гиперчувствительно сти замедленного типа (ГЗТ) к химическим соединениям и их длительность зависят от сроков формирования и сочетанного действия различных субпопуляций Тсупрессоров, подавляющих ГЗТ. Поэтому при индукции ГЗТ путем введения мышам химических аллергенов в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), при котором не происходит формирования Т-супрессоров, возможно усиление кожных аллергических реакций и выявление аллергенных свойств даже слабых химических аллергенов на нелинейных мышах массой 18–20 г. Мышей сенсибилизируют однократно путем внутрикожного введения в основание хвоста 60 мкл эмульсии препарата в ПАФ — дозы, эквивалентиой 10 мМ раствору в ПАФ в соотношении 1:1. Для приготовления такой эмульсии используют раствор Хенкса с рН 7,5. Для выявления сенсибилизации через 5 сут мышам в подушечку задней лапы вводят 40 мкл 10 мМ раствора тест-препарата в растворе Хенкса. Через 6–22–24 ч после тестирования измеряют величину отека с помощью инженерного микрометра МК-0-25. Разница в толщине обеих лапок характеризует величину отека, по которой можно судить об интенсивности реакции ГЗТ [12]. Контрольных животных сенсибилизируют эмульсией ПАФ с раствором Хенкса по той же схеме, что в группе животных, получавших исследуемый препарат. В каждой группе должно быть не менее 10 животных. В том случае, если тест-препарат становится аллергеном в процессе метаболизма, например пенициллин, тестирование проводят мак- симальной концентрацией вещества, эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ). Учет реакции проводят через 48–72 ч. ПАФ: 1 мл ланолина, 3 мл вазелинового масла, 5 мг убитой прогреванием вакцины БЦЖ, 50 мкл твина-20. 0,5 мл дистиллированной воды. НАФ: те же самые компоненты, за исключением убитой прогреванием вакцины БЦЖ. В качестве метода выбора может быть использована реакция ГЗТ на морских свинках. 4.3. Реакция гиперчувствительности замедленного типа на морских свинках Животных получающих препарат групп сенсибилизируют однократно, в подушечки всех лапок или 2-х задних лапок, тест-препаратом в смеси с ПАФ в объеме 0,5 мл, в со- отношение 1:1. Испытуемый препарат вводят 2 группам животных в дозах: терапевтическая доза и в 10 раз ее превышающая [4]. Контрольным животным аналогичным способом вводят только ПАФ. На 21-й день исследования животным на выстриженный участок спины внутрикож- но (в/к) вводят разрешающую дозу препарата. Разрешающей дозой при в/к введении будет являться та концентрация препарата, которая у интактных животных не вызывает раздражающего действия. Для контроля реактивности кожи на другой выстриженный участок кожи вводится в/к 0,05 мл растворителя (фосфатный буфер рН 7,2 или стерильный изотонический раствор натрия хлорида). Через 1, 24 и 48 ч определяют наличие положительной реакции. Реакцию оценивают на наружной поверхности кожи по шкале С.В. Суворова через 24 ч и оценивают в баллах по следующей шкале [10]: — видимой реакции нет; — бледно-розовая эритема по всему участку или по его периферии; — ярко-розовая эритема по всему участку или его периферии; — красная эритема по всему участку; — инфильтрация и отек кожи (утолщение кожной складки) при наличии или отсутствии эритемы; — эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъязвления (некроз), возможны геморрагии, образование корочек. Следует отметить, что гиперергическая реакция, оцениваемая в 5 баллов, развивается крайне редко и в ряде случаев через 3–4 сут. 4.4. Метод накожных аппликаций На выстриженный участок кожи боковой поверхности туловища морских свинок- альбиносов, ближе к середине туловища, наносят по 3 капли раствора испытуемого вещества, приготовленного на дистиллированной воде или других растворителях (ацетон, этиловый спирт, вазелиновое масло и др.). Если вещество нерастворимо, то наносят по 0,5 г мази, приготовленной на вазелине или ланолине. Дозы для эксперимента определяют в соответствии с разделом 1.5. Вещество наносится на протяжении 2 нед по 5 раз в неделю. Реакцию кожи учитывают ежедневно по шкале оценки кожных проб [2, 5]. Этот эксперимент позволяет выявить опасность развития неаллергического контактного дерматита в зависимости от дозы изучаемого фармакологического вещества. Исследование сенсибилизирующего действия вещества проводят путем 20 повтор- ных накожных аппликаций на участок боковой поверхности туловища размером 2×2 см по 5 раз в неделю. Если наносят жидкость, то ее дозируют пипеткой и берут по 3 капли (1 мл водного раствора — 60 капель, ацетона — 40, вазелинового масла — 51). Если при- меняют мазь, то ее наносят равномерным слоем на весь участок аппликации с помощью глазной стеклянной лопаточки. Более 20 накожных аппликаций проводить не следует, так как они могут оказать гипосенсибилизирующее действие, особенно если фармакологическое вещество является слабым аллергеном. Первое тестирование проводят после 10 аппликаций и в случае выявления аллергии дальнейшее нанесение вещества можно прекратить. При отрицательном или сомнительном результате число аппликаций обязательно доводят до 20, после чего животных тестируют повторно. 4.5. Конъюнктивальная проба Сенсибилизацию животных осуществляют в соответствии со способом введения тестируемого препарата в клинике. Для постановки пробы 1 каплю водного раствора аллергена вводят глазной пипеткой с вытянутым тонким концом под верхнее веко получающим препарат и контрольным морским свинкам, во второй глаз (контрольный) вводят 1 каплю воды. Закапывание удобно производить при положении животного лежа головой вниз [5]. Реакции учитывают через 15 мин (быстрая реакция) и через 24–48 ч (гиперчувствительность замедленного типа) и оценивают по следующей шкале (в баллах): 1 — легкое покраснение слезного протока; 2 — покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице; 3 — покраснение всей конъюнктивы и склеры. Реакция сопровождается зудом и при расчесывании лапками возможно развитие гнойного офтальмита. Подбор концентрации аллергена осуществляется путем закапывания различных концентраций в глаз несенсибилизированного животного. 4 . 6 . М е т од о ц е н к и ч у в с т в и т е л ь н о с т и гл а д к и х м ы ш ц трахеобронхиальной цепочки морских свинок при ингаляционном пути введения тест-препарата Сразу же после эвтаназии морских свинок готовят изолированную трахеобронхиальную цепочку из 16–20 отдельных колец трахеи, связанных по стороне хряща тонкой шелковой ниткой таким образом, чтобы участки гладких мышц, соединяющих хряще- вые концы отдельных колец, находились на одной линии и составляли продольную полоску длиной 3–4 см. Приготовленную цепочку помещают в отдельный сосуд — «баню», который заполняют 10 мл питательного раствора Кребс—Гензелейта с температурой 35–37 °C [13]. Состав раствора в г/л Н2О: NaCl — 6,87, КСl — 0,42, СаСl2 — 0,28, NaHPO4 — 0,15, MgSO4 × 7H2O — 0,29, NaHCO3 — 2,1, глюкоза — 1,0. Через питательный раствор в течение всего исследования пропускают газовую смесь, состоящую из 95% О2 и 5% СО2. Исследуемые вещества вносят в «баню» в объеме 0,1— 0,2 мл, затем цепочку многократно отмывают свежими порциями питательного раствора. Повторно вещества в исследуемых концентрациях вносят через 15—20 мин. Определяют концентрацию препаратов, которые вызывают пороговое сокращение цепочки. Ее чувствительность к каждому веществу выражают в микрограммах на миллиметр. 4.7. Непрямая реакция дегрануляции тучных клеток (РДТК) Постановку РДТК осуществляют следующим образом [3, 8]. Для получения тучных клеток крыс животных подвергают эвтаназии кровопусканием, вводят внутрибрюшинно 5–8 мл подогретого до 37 °С раствора Тироде без глюкозы, после легкого массажа брюшной стенки в течение 1–1,5 мин делают ножницами по средней линии разрез длиной 1,5–2 см, переворачивают тушку разрезом вниз и собирают экссудат, стекающий с петель кишечника в смоченную гепарином пробирку. Препараты готовят на обезжиренных предметных стеклах, окрашенных 0,3 % спиртовым раствором нейтрального красного и высушенных при комнатной температуре. К 0,03 мл взвеси тучных клеток добавляют 0,03 мл сыворотки получавшего препарат животного и 0,03 мл специфического аллергена (например, исследуемого фармакологического вещества). Исследуемое фармакологическое вещество должно быть растворимо в воде. Разведение фармакологического вещества обычно составляет 1:100 или более, чтобы в контроле на антиген дегрануляция тучных клеток не превышала 5 %. Далее препараты покрывают покровным стеклом, края которого смазывают вазелином, затем инкубируют 15 мин в термостате при 37 °С. Препараты микроскопируют под увеличением × 20. Оценку результатов проводят дифференциальным способом учета, подсчитывают показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) по формуле: где a, b, c, d — количество (среднее из трех повторений) дегранулированных клеток со- ответственно степени дегрануляции (слабовыраженной, умеренной, резкой и степени полностью дегранулированных клеток). В каждой камере подсчитывают 100 клеток, если ПДТК превышает 0,2. При постановке реакции необходимо учитывать следующие контроли: перитонеальной взвеси тучных клеток, аллергена и сыворотки. В контрольных пробах до нужного объема доводят растворителем (фосфатный буфер рН 7,2): необходимо учитывать отсутствие подбора оптимальных доз антигена и исследуемой сыворотки, нарушение рН среды. В качестве метода выбора может быть использована реакция дегрануляции базофильных лейкоцитов кролика (непрямой тест Шелли). 5. Псевдоаллергические реакции Известно, что многие лекарственные вещества и химические вещества высвобождают медиаторы, в том числе гистамин, неспецифически, в результате прямого действия на ТК и базофильные лейкоциты. Такой механизм гистаминолиберации характерен для так называемых псевдоаллергических р е а к ц и й , а ве щ е с т ва , в ы з ы ва ю щ и е э т и р е - а к ц и и , н а з ы ва ют с я неиммунологическими активаторами (конканавалин А, 48/80, дек- стран и др.) [9, 15, 16]. В настоящих методических рекомендациях предлагается также использовать метод определения процента гистаминолиберации из ТК крыс по реакции конденсации медиатора с ортофталевым альдегидом. Для этой цели адекватным методом является метод Шор. 5.1. Реакция воспаления на конканавалин А у мышей Реакция воспаления на Кон А (псевдоаллергическая реакция) основана на способ- ности Кон А неспецифически, т.е. без участия реагинов с аллергенами на мембранах клеток-мишеней, в результате прямого действия на рецепторы мембран тучных клеток и базофильных лейкоцитов высвобождать медиаторы воспаления (гистамин, серотонин, лейкотриены и др.) [7]. Исследования проводят на мышах-самцах линии СВА или беспородных мышах мас- сой 18–20 г. Исследуемое фармакологическое вещество вводят рекомендуемым для кли- нического применения способом не менее чем в 2 дозах: терапевтически эффективной (для мышей) и субтоксической. Животным контрольной группы аналогичным способом вводят соответствующий объем растворителя. Через 1 ч (или через время максимальной концентрации препарата в крови) мышам, получавшим препарат, и контрольной групп субплантарно (в подушечку задней стопы) вводят Кон А в дозе 100 мкг/20 г массы тела (20 мкл раствора в концентрации 5 мг/мл), в контралатеральную конечность — тот же объем изотонического раствора натрия хлорида. Таким образом, Кон А вводят в концентрации, значительно превышающей оптимальную (1–10 мкл/мл) в исследованиях по изучению митогенной активности. Через 1 ч мышей подвергают эвтаназии, определяют массу лап и подсчитывают индекс реакции воспаления (Ир) по формуле: где Роп — масса стопы задней лапы, в подушечку которой вводили Кон А, Рк — изотониче- ский раствор натрия хлорида. Статистически достоверная разница между данными получавших препарат и контрольной групп, превышающая 20%, считается значимой. 5.2. Метод Шор Работа выполняется на интактных крысах популяции Wistar (1–2 животных для ис- следования одного вещества). После декапитации животному внутрибрюшинно вводят 5–10 мл подогретого до 25 °С раствора Хенкса, аккуратно массируют живот в течение 90 с. Вскрывают брюшную полость по средней линии и отсасывают взвесь ТК пипеткой или сливают в пробирки [19]. Эритроцитов не должно быть. Тучные клетки осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000–1500 об/мин и готовят в растворе Хенк- са 10 мл взвеси ТК с концентрацией 105 кл/мл. Для подсчета клеток используют 0,1 % раствор нейтрального красного. Выявление гистаминолибераторного действия исследуемого вещества: а) в предварительном эксперименте подбирают нетоксическую дозу фармакологического вещества; б) с целью инкубации с исследуемым веществом ТК разливают в 2 параллельные пробирки по 1 мл в указанной концентрации. К взвеси добавляют по 100 мкл тестпрепарата в нетоксической для ТК концентрации. Пробирки слегка встряхивают и инкубируют в течение 10 мин при температуре 37 °С. Для остановки процесса гистаминолиберации в пробирки добавляют по 1,5 мл охлажденного раствора Хенкса, центрифугируют 5–10 мин при 1000–1500 об/ мин и надосадок сливают в чистые пробирки для определения выделившегося гистамина. К осадкам добавляют 0,1 мл 1% раствора трилона Х-100, выдерживают при комнатной температуре 5–7 мин, добавляют 2,5 мл раствора Хенкса. В качестве контроля используют: 1-я пробирка — стандартный раствор гистамина (1 мкг/мл 100 % содержание гиста- мина); 2-я пробирка — раствор Хенкса (флюоресценции не должно быть); 3-я пробирка — 1 мл взвеси ТК в концентрации 105; 4-я пробирка — 1 мл рабочего раствора Хенкса. 3-я и 4-я пробирки ставятся для проверки чистоты реактивов. Исследуемое вещество оценивают на степень спонтанной флюоресценции или способность ее ингибиции. 5.3. Реакция конденсации с ортофталевым альдегидом (ОФА) В четыре опытные пробирки (2 — с надосадочной жидкостью и 2 — с тучными клетка- ми, лизированными трилоном) и контрольные 3-ю и 4-ю добавляют по 0,2 мл 3М NaOH и 0,1–0,2 мл ОФА. Обязательно встряхивают каждую пробирку сразу же после добав- ления ОФА. Через 4 мин добавляют 0,15 мл 1,5% Н3РО4 (среда должна быть кислая). Флюориметрия — через 10 мин после стабилизации раствора ортофосфорной кислотой, измеряют флюоресценцию на спектрофлюориметре Хитачи НРр-4. Сначала измеряют величину свечения контрольных проб, затем опытных образцов [13]. Процент выхода гистамина рассчитывают по формуле: где А — процент выделившегося гистамина из ТК (надосадочная жидкость); В — процент гистамина, оставшегося в ТК (осадок ТК). Определение рабочей зоны тест-препарата осуществляется опытным путем. Обычно это уже 10-4–10-6 молей. К 900 мкл суспензии ТК в концентрации 106 добавляют 100 мкл исследуемого вещества (инкубируют 10– 15 мин в термостате при 37 °С). Затем подсчи- тывают живые клетки по исключению трипанового синего (каплю клеточной суспензии при комнатной температуре смешивают с каплей 0,1 % раствора трипанового синего и через 1– 3 мин подсчитывают число погибших, т. е. окрашенных клеток), количество погибших клеток не должно превышать 5 %. Ставится контроль на отсутствие спонтанной дегрануляции: ТК + трипановый синий — мертвые клетки ≤ 5 %. 6. Оценка сенсибилизирующих свойств лекарственных средств Степень аллергенной активности фармакологического вещества устанавливается в зависимости от ряда критериев, определенных в эксперименте на животных: величина сенсибилизирующей дозы, степень развития аллергического состояния, частота и характер проявления аллергической реакции, величина титра сенсибилизации и др. Результаты исследования позволяют сделать следующие выводы. Если число сенсибилизированных животных в группе по одному из использованных тестов составляет менее 50 %, то наблюдаемые эффекты рассматриваются как проявление индивидуальной чувствительности. Если число сенсибилизированных животных в получавших препарат группе составляет 50% и более, то фармакологическое вещество относится к потенциальным аллергенам, что следует учитывать при оценке степени потенциальной опасности развития аллергоза в клинической практике. Если обнаружено, что изученное фармакологическое вещество вызывает псевдоаллергические реакции, необходимо продолжить исследования для установления дозы, которая не вызывает неспецифического выброса гистамина, и внести эти сведения в проект инструкции. Работа по изучению потенциальной аллергенности фармакологических веще ств с использованием описанных методов требует хорошей профессиональной подготовки и должна проводиться иммунологами и научными работниками, прошедшими необходимую стажировку в специальных лабораториях. Заключение Данные методические рекомендации характеризуют процедуру проверки, но не являются пособием для освоения методов. Материалы оформляются в виде научного отчета в соответствии с ГОСТ 7.32-2001 и Приказом Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010 г. No 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» с предоставлением в таблицах как первичных данных по каждому веществу, так и статистически обработанных результатов. К отчету необходимо приложить аналитические паспорта или нормативные документы на референтные и тестируемые вещества. Литература 1. Адо А.Д. // Общая аллергология. — М.: Медицина, 1978. — 462 с. 2. Алексеева О.Г., Дуева Л.А. //Аллергия к промышленным химическим соединениям. — М.,Медицина, 1978. — 271 с. 3. Гущин И.С. //Аллергическое воспаление и его фармакологический контроль. — М.: Фармарус Принт, 1998. — 250 с. 4. Иммунологические методы // Под ред. Г. Фримеля. — М.: Медицина,1967. — 472 с. 5. Кудрина Г.П., Шашкина Л.Ф., Иванова В.М. и др. // Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств. — М., 1988. 6. Любимов Б.И., Коваленко Л.П. // Опыт оценки безопасности фармакологических средств в России (1991–1996). Проблемы и перспективы. Тез. докл. симп., 12–13 ноября 1996–1997 г. 7. Никитин В.М. //Справочник методов иммунологии. — Кишинев, 1982. — 303 с. 8. Радунская С.Ф. — Тест непрямой дегрануляции тучных клеток крыс для оценки специфической активности неинфекционных аллергенов: Дисс. ... канд. мед. наук. — М., 1982. — С. 54–59. 9. Руководство по иммунофармакологии // Под ред. Дейла М.М., Формена Д.К. — Медицина, М., 1998. — 332 с. 10. Суворов С.В. // Профилактика профессиональных заболеваний кожи рабочих железнодорожного транспорта как комплексная гигиеническая проблема. — М., 1974. — С. 103–122. 11. Хлопушина Т.Г., Кринская А.В., Коваленко Л.П. и др. — Влияние з и кс о р и н а н а ф а р м а ко к и н е - т и к у а н т и п и р и н а у и н т а к т н ы х и сенсибилизированных морских свинок // Бюл. экспер. биол. и мед., 1991. — No 7. — С. 67–69. 12. Черноусов А.Д. // Гигиена труда и профессиональные заболевания. 1987. — No 6. — С. 45–48. 13. Юденфред С. // Флюоресцентный анализ в биологии и медицине. — М.: Мир, 1965. — С. 45–48. 14. Сеll P.G.H., Coombs P. R. A. // Clinical aspects of immunology. — Oxford, Edinburg, 1975. — 1754 P. 15. Faquim-Mauro E.L., Macedo M.S. Induction of IL-4-dependent, anaphylactic-type and of IL4-Independent, non-anaphylactic-type IgG2А antibodies is modulated by adjuvants// Int. Immunology. — 2000. — Vol. 12. — No. 12. — P. 1733—1740. 16. Khosravi E. et al.- Allergic conjunctivitis and uveitis models: Reappraisal with some marketed drugs // Inflamm. Res. — 1995. — Vol. 44. — P. 47–54. 17. Kimber I., Kerkvliet No.I., Taylor S.L. et al. Toxicology of protein allergenicity: prediction and characterization // Toxicol. Sci. — 1999. — Vol. 48. — P. 157–162. 18. Ovary Z. Immediate reaction in the skin of experimental animals provoked by antibody antigen interactions// Progr. Allergy. — 1958. — Vol. 5. — P. 459. 19. Shore P.A., Burkhalter A., Coch V.U.J. A method for the fluorometric assay of histamine in tissues // J.Pharmacol.Exp. Ther. — 1959. — Vol. 127. — P. 182–186. 20. Weigle W.O., Cochrane C.G., Dixon F.J. Anaphylactogenic properties of soluble antigen-antibody complexes in guinea pig and rabbit // J.Immunol. — 1960. — Vol.85. — P.469– 477.
