Доклад Здравствуйте, уважаемые преподаватели, члены жюри, участники заседания и слушатели! Вашему вниманию представляется доклад на тему: "Генно-инженерные технологии при получении антибиотиков - как один из перспективных методов преодоления антибиотикорезистентности" Доклад подготовила: студентка 3 курса, I медицинского факультета, группы Л1_с_о_209(1), Герашенко Екатерина Александровна Научный руководитель: Боуш Татьяна Николаевна Введение: В XXI веке связи с широким распространением устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к существующим лекарственным препаратам, серьёзными проблемами в лечении микробных и вирусных инфекций, опухолевых заболеваний, потребность в новых антибиотиках чрезвычайно велика. К сожалению одновременное повышение антибиотикорезистентности этих патогенных микроорганизмов существенно тормозит процесс поиска и синтеза новых антимикробных препаратов что не приносит однозначных удовлетворительных результатов, ведь микроорганизмы адаптируются к ним быстрее, чем открываются новые антимикробные вещества: в лабораторных условиях им достаточно несколько недель для адаптации к новому антимикробному препарату. В реальных условиях полная адаптация к новым антибиотикам наблюдается в течение 5 лет, частичная – в течение года и ранее. В этой связи человечество проигрывает в борьбе с микроорганизмами. Согласно оценкам международных экспертов, антимикробная резистентность является причиной более 700 тысяч смертельных случаев ежегодно (в том числе в Европе - 22 тысячи случаев). Предполагается, что к 2050 году эта цифра может увеличиться до 10 млн. человек. В России эта проблема также имеет место. По данным Российского многоцентрового эпидемиологического исследования «ЭРГИНИ», оценочная частота нозокомиальных инфекций в России составляет около 2,3 млн. случаев в год. Но проблемой является не только антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов, но и рост устойчивости штаммов, вызывающих внебольничные инфекции. Статистика: В 2017-2018 гг. 27% изолятов E.coli, выделенных у взрослых пациентов с внебольничными инфекциями, являлись продуцентами ESBL(Extended-spectrum betalactamase) и были устойчивыми к цефалоспоринам 3-4 поколений. Частота устойчивости к амоксициллину/клавуланату составляла 45,1%, к ципрофлоксацину – 38,9%, к котримоксазолу – 38,5%, к эртапенему –2,9%. Подавляющее большинство изолятов A. baumannii устойчивы к ципрофлоксацину (99,0%), амикацину (89,2%) и гентамицину (77,4%). Частота резистентности к тобрамицину и триметоприму/сульфаметоксазолу - 50,6% и 41,2%, соответственно. Доля метициллинорезистентных штаммов S. aureus (MRSA) варьировала от 24,9% до 66,9%, а в 2015-2016 гг. составила 32,4%. E. Faecium характеризуется высокой частотой устойчивости к ампициллину (резистентность 90,9%), а также наличием устойчивых к ванкомицину изолятов (9,1%). Для всех представителей рода Enterococcus отмечается высокая частота устойчивости к гентамицину и ципрофлоксацину – суммарно 60,5% и 68,2%, соответственно. Клинические и материальные последствия антибиотикорезистентности могут стать весьма серьезными: - резко возростет смертность от пока управляемых инфекций (менингит, пневмония, перитонит и пр.). - вновь возникнут эпидемии ревматизма, холеры, малярии и других инфекций. - станет практически невозможным проведение трансплантаций и других высокотехнологичных оперативных вмешательств. - резко возростут прямые и косвенные экономические потери, обусловленные затратами на лечение и нетрудоспособностью. - гораздо более опасными станут биотеррористические атаки. - при бактериемии летальность будет намного выше у пациентов, получающих неадекватную антимикробную терапию, то есть препараты, к которым нечувствительны возбудители (высокий уровень резистентности к пенициллину представляет объективный предиктор летальности от пневмококковой бактериемии у ВИЧ-инфицированных больных [Penicillin resistance]). Поэтому последствия антибиотикорезистентности для системы здравоохранения и экономики носят весьма негативный характер, приводя к значительным затратам, которые трудно выразить в количественном значении ввиду отсутствия исчерпывающих статистических данных по целому ряду стран. Помимо этого, резистентность означает существенную дополнительную нагрузку для самих пациентов (боль, нарушение жизнедеятельности, психологические травмы), которая еще менее поддается расчету. Выделяют четыре основных механизма резистентности антибиотиков: антимикробный агент проникает в клетку, но его мишень (транспептидаза, пептидогликан, рибосома, ДНК-гираза) его не «связывает» и подавления метаболизма не происходит; уменьшение проницаемости оболочки микробной клетки для антибиотика. Антибиотик проникает в клетку, но в незначительных количествах; появление в оболочке клетки системы активного «выброса», проникающего в клетку антибиотика, вследствие чего его внутриклеточная концентрация не может оказываться высокой; ферментативная инактивация антибиотика защитными ферментами. !!! Последний тип защиты микробной клетки наиболее эффективен и является частой причиной неудач антибиотикотерапии. Формирование в бактериальной клетке указанных защитных механизмов обусловлено появлением «генов резистентности» не только в хромосоме. Большое внимание привлекают и внехромосомные (плазмидные) генетические элементы микробной клетки кольцевые молекулы ДНК, имеющие размер в сотни раз меньший, чем хромосомы. Плазмиды, несущие гены резистентности к антибиотикам, получили название R-плазмид (Rфакторы). Основная опасность плазмидной резистентности в генетическом плане состоит в том, что плазмиды передаются из клетки в клетку конъюгацией (аналог полового процесса) без деления клетки, однако плазмида при этом реплицируется. Таким образом, одна клетка может быстро передать резистентность большому количеству клеток. Этому способствует и многокопийность плазмид некоторых типов. Особенно часто плазмидная локализация генов резистентности встречается при ферментативной инактивации антибиотиков. Иногда в одной плазмиде оказываются локализованными несколько генов, кодирующих ферменты, воздействующие на антибиотики разных групп (полирезистентность микроорганизмов). Полирезистентные штаммы возбудителей инфекций представляют серьезную проблему в инфекционной клинике. Подробнее рассмотрим каждый из них: 1. Нарушение проницаемости наружной мембраны грамотрицательных бактерий является одним из важных механизмов устойчивости. Гидрофильные растворённые вещества, преимущественно проходят через заполненные водой каналы поринов, но существуют ограничения для притока различных органических молекул, особенно лекарственных средств. Упорядочение молекул воды в узких пориновых каналах в связи с наличием кислотных и основных аминокислотных остатков на противоположных сторонах стенки канала приводит к затруднённому проникновению через него липофильных молекул. Основной путь для них связан с прохождением через двухслойную липидную мембрану, наружный слой которой состоит целиком из липополисахаридов с очень низкой текучестью. Мутационная потеря основных поринов и сужение диаметра пориновых каналов увеличивает устойчивость к гидрофильным антибиотикам, таким как β-лактамы, при этом питательные вещества, особенно при низких концентрациях, также не проникают в клетку. Но полного прекращения проникновения антибиотиков в клетку при указанных механизмах резистентности произойти не может, поскольку пориновые каналы жизненно необходимы для транспорта в нее питательных веществ, а их полное исчезновение в мембране привело бы к гибели клетки. Среди штаммов, выделяемых в клинике, часто обнаруживаются такие, у которых выявляются сразу два механизма резистентности: ослабление проникновения антибиотика через внешнюю мембрану и ферментативная инактивация антибиотика. В этом случае уровень антибиотикорезистентности особенно высок. 2. Эффлюкс(=система оттока, функционирует с помощью энергозависимого механизма для откачки нежелательных токсичных веществ с помощью специальных откачивающих насосов. Некоторые системы оттока специфичны для определенных лекарств, в то время как другие могут содержать несколько лекарств с небольшими переносчиками множественной лекарственной устойчивости (SMR)) имеет значение как физиологический способ детоксикации внутриклеточных метаболитов, реализации бактериальной вирулентности, межклеточной сигнализации и клеточного гомеостаза. Этот механизм не обеспечивает высокого уровня резистентности к антибиотикам, но увеличивает их минимальную подавляющую концентрацию (МПК), позволяя бактериям достичь значительной устойчивости в совокупности с другими механизмами. Системы активного выведения типа RND (resistance-nodulation-division) наиболее характерны для грамотрицательных бактерий и составляют комплекс из периплазматического белка, например, AcrA, канала наружной мембраны, и белка-насоса, например, AcrB, аналогичного тому, который осуществляет протонный антипорт в цитоплазматической мембране. Подобные эффлюксные системы обеспечивают устойчивость не только к антибиотикам, но и к антимикробным пептидам неспецифической иммунной системы человека, что может расцениваться как новый фактор вирулентности бактерии. Экспрессия генов хромосом, кодирующих RND, вносит значительный вклад в устойчивость грамотрицательных бактерий к веществам с антимикробной активностью, так как в процессе эффлюкса из клетки выводится широкий спектр субстратов, включающий антибиотики, красители, биоцидные вещества, детергенты и антисептики. Синергизм между эффлюксом и нарушенной проницаемостью наружной мембраны приводит к эффективной лекарственной устойчивости. 3. Ферментативной инактивации подвергаются все важнейшие группы антибиотиков: пенициллины, цефалоспорины, аминогликозиды, эритромицин и другие антибиотики. Способность к производству ферментов, разрушающих антибиотики, характерна для всех микроорганизмов, но некоторые ферментативные механизмы устойчивости, найденные у грамотрицательных бактерий, обеспечили им господствующее положение в клинических условиях, в том числе связанное с возможностями внутривидового и межвидового распространения детерминант резистентности через подвижные генетические элементы путём горизонтального переноса. - Устойчивость грамотрицательных бактерий к бета-лактамам обеспечивается ферментами β-лактамазами. Расширенного спектра βлактамазы — ESBL (extended-spectrum beta-lactamases), принадлежащие к классу A, описаны у семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae и рода Acinetobacter, но наиболее часто встречаются у K.pneumoniae. Гены, кодирующие ESBL, обычно находятся на плазмидах вместе с генами, кодирующими устойчивость к аминогликозидам, триметоприм- сульфаметоксазолу, тетрациклинам, хлорамфениколу. Большинство ESBL относятся к SHV или TEM типам, которые произошли от β- лактамаз узкого спектра. Другие редкие виды ESBL включают типы VEB и PER, первые чаще обнаруживают у клинических штаммов K.pneumoniae, A.baumannii, вторые встречаются у P.aeruginosa и A.baumannii. Они отличаются умеренным подавлением ингибиторов β-лактамаз и имипенема. - Среди β-лактамаз класса A число ферментов с карбапенемазной активностью ограничено, наиболее широко из них распространены ферменты GES и KPC. Некоторые варианты GES, проявляют значительное карбапенемазное действие и все в большей степени обнаруживаются в грамотрицательных палочках, в частности у P.aeruginisa, K.pneumoniae. Ферменты KPC расширили географию карбапенемоустойчивых K.pneumoniae благодаря клональному распространению. - AmpC β-лактамазы — индуцируемые цефалоспориназы, закодированные в хромосомах многих видов бактерий; опосредуют устойчивость к пенициллинам, цефалоспоринам и нечувствительны к ингибиторам βлактамаз, но подавляются клоксациллином и азтреонамом. В настоящее время бактерии, у которых отсутствуют хромосомные AmpC, в том числе K.pneumoniae, S.maltophilia, являются носителями плазмид с приобретёнными генами AmpC. Эти плазмиды, часто несут множество других генов устойчивости: к аминогликозидам, хлорамфениколу, хинолонам, тетрациклинам, триметоприму, а также кодируют β-лактамазы, такие как TEM, CTX, SHV, VIM. - Ферменты типа ОХА класса D гидролизуют цефалоспорины третьего и четвёртого поколения, азтреонам, карбапенемы и не ингибируются клавулановой кислотой и тазобактамом. Большинство ОХА кодируются плазмидами и наиболее характерны для A.baumannii. Металло-β-лактамазы (MBL) класса B обладают способностью гидролизовать все бета-лактамы, в том числе карбапенемы, за исключением монобактама — азтреонама, устойчивы к ингибиторам клавуланату и сульбактаму, восприимчивы к хелатирующим агентам; кодируются в основном плазмидами. В настоящее время присутствие MBL регистрируется у P.aeruginosa, A.baumannii, K.pneumoniae. 4. Механизмы резистентности к аминогликозидам чаще связаны с ферментами, модифицирующими субстрат, которые прикрепляют фосфат, аденил или ацетил к молекулам антибиотиков, уменьшая их аффинность с 30S рибосомальной субъединицей. Другой механизм сопротивления аминогликозидам — метилирование 16S рРНК распространён среди грамотрицательных бактерий семейства Enterobacteriaceae и группы неферментирующих бактерий, в том числе P.aeruginоsa и A.baumannii. Гены метилаз расположены в транспозонах плазмид, обеспечивая горизонтальное распространение. Экзогенно приобретённые 16S рРНК метилтрансферазы (16S-RMT) ответственны за устойчивость к аминогликозидам очень высокого уровня. Производство метилаз 16S-RMT часто сопровождается продукцией карбапенемаз и ESBL. 5. Формирование устойчивости к тигециклину часто наблюдается у A.baumannii и K.pneumoniae, особенно при лекарственной устойчивости штаммов. Системы эффлюкса RND-типа и другие могут быть факторами пониженной чувствительности к препарату. Например, эффлюксный комплекс AcrAB был определён в качестве основного механизма бактериальной резистентности к тигециклину у Enterobacteriaceae, способствующего внутренней устойчивости ко многим структурно различным липофильным соединениям, в том числе моющим средствам, красителям и антибиотикам без накопления в периплазме. Полимиксин B и полимиксин E (колистин) — пептидные антибиотики, которые всё чаще используются в качестве препаратов, сохранивших антибактериальную активность в отношении МЛУ P.aeruginosa, A.baumannii, K.pneumoniae. Тем не менее в последнее время было описано появление устойчивости к колистину. 6. Существуют мутационные стабильные механизмы сопротивления и адаптивные, обратимые после удаления селективного давления. Главный из них — модификация липидного компонента внешней мембраны липополисахарида. Мутации, меняющие функции внешней мембраны описаны у K.pneumoniae. Для P.aeruginosa было зафиксировано стабильное увеличение производства наружного мембранного белка H1, оказывающего своё защитное действие при помощи двухвалентных катионов, которые препятствуют действию катионных антибиотиков. Резистентность к колистину А.baumannii возникает через адаптацию ранее восприимчивых изолятов, часто во время лечения данным препаратом. Основной механизм связан с модификациями липополисахарида, вызванными мутациями или инсерциями в генах, кодирующих биосинтез липида, при этом снижается суммарный отрицательный заряд наружной мембраны, уменьшая сродство к колистину, или устраняется сама мишень для этого препарата. 6. Изменение места действия антибиотика Чтобы антибиотики работали, они должны связываться с определенным бактериальным целевым сайтом, который варьируется в зависимости от класса антибиотика. Изменение структуры мишени может привести к неспособности антибиотика связываться со своей мишенью. Например, β-лактамные антибиотики действуют путем связывания со структурами клеточной стенки бактерий, называемыми пенициллин-связывающими белками. Метициллин-резистентные штаммы S. aureus (MRSA) обладают генетическим элементом, называемым стафилококковой кассетной хромосомой mec (SCCmec), которая содержит ген mecA, кодирующий продукцию измененного пенициллин-связывающего белка (PBP2a), который неэффективно связывает β -лактамные антибиотики. В результате MRSA устойчив ко всем доступным в настоящее время пенициллинам, цефалоспоринам и карбапенемам. Изменения в пенициллин-связывающих белках также объясняют резистентность Streptococcus pneumoniae к пенициллину. Другим примером устойчивости к противомикробным препаратам, вызванной измененным сайтом-мишенью, является устойчивость к фторхинолонам (например, ципрофлоксацину, левофлоксацину и моксифлоксацину). Фторхинолоны действуют путем ингибирования белков, называемых ДНК-гиразами (кодируемыми генами gyrA и gyrB) и топоизомеразами (кодируемыми генами parC и parE), которые необходимы для репликации бактериальной ДНК. Мутации в определенных областях генов gyrA или parC (известных как детерминантная область устойчивости к хинолонам) приводят к изменениям ДНК-гиразы или топоизомеразы и, следовательно, приводят к изменению сайта связывания мишени. появляется резистентность к фторхинолонам. Получение антибиотиков на основе генно-инженерных технологий как путь преодоления антибиотикорезистентности Технологические принципы получения рекомбинантных антибиотиков Предусловия: Продуктивность пенициллина у первого лабораторного штамма Penicillium chrisogenum составляла только 2 мг препарата на 1 л культуры и была явно недостаточной для промышленного производства антибиотика. Направленными воздействиями мутагенами, в сочетании с отбором наилучших продуцентов, удалось увеличить продуктивность гриба в 10 000 раз и довести концентрацию пенициллина в культуре до 2%. Путь повышения эффективности штаммов-продуцентов антибиотиков, основанный на получении мутаций, несмотря на колоссальные затраты труда, используется до настоящего времени. Кроме того, получение и клинические испытания новых препаратов обходятся очень дорого, и в продажу поступают только 1-2%, которые имеют терапевтическую ценность и представляют экономический интерес. В этом отношении большие надежды возлагаются на технологии рекомбинантных ДНК. Во-первых, с их помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы с минимальными побочными эффектами. Во-вторых, генноинженерные подходы могут использоваться для увеличения выхода антибиотиков и соответственно для снижения стоимости их производства. Гены, кодирующие соответствующие ферменты, картированы, участки ДНК, ответственные за биосинтез многих антибиотиков, локализованы, геном ряда продуцентов полностью расшифрован. Клонированы гены поликетидсинтаз — больших многофункциональных ферментов, занятых в образовании многих антибиотиков, таких как тетрациклин, турбомицин, полиеновые антибиотики и многие другие. Знание точной локализации генов позволяет посредством применения генно-инженерных методов создавать штаммы продуценты, обладающие разным набором генов биосинтеза, открывает новые перспективы для получения подобными гибридными организмами «гибридных» молекул антибиотиков. Технология рекомбинантных ДНК – перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой. Можно вырезать отдельные участки ДНК, получать нуклеотиды на ДНК синтезаторах, определять последовательность нуклеотидов (разделяя, секвенируя их) сотнями в сутки, изменять выделенный ген, вводить его вновь в геном культивируемых клеток или эмбриона животного, где этот измененный ген начинает функционировать. Для введения рекомбинантной ДНК применяют два основных вектора: плазмиды и бактериофаги. Кроме указанных векторов в генной инженерии применяют космиды – плазмиды, несущие cos-участок (комплементарные липкие концы) ДНК фага лямбда. Наличие cosучастка позволяет проводить упаковку ДНК в головку фага in vitro, что обеспечивает возможность их введения в клетку путем инфекции, а не трансформации. И фазмиды – это гибриды между фагами и плазмидами. Они способны развиваться как фаг и как плазмида. Уступая космидам по клонирующей емкости, фазмиды дают возможность отказаться от переклонирования генов из фаговых в плазмидные векторы. Комбинирование генов поликетидного синтеза было проведено у различных стрептомицетов — продуцентов актинородина, авермектина, эритромицина. Выявлен «минимальный» набор генов, контролирующих образование молекул антибиотиков, в т.ч. длину цепи, степень её восстановленности, циклизацию. Изучены разновидности подобных генов у различных стрептомицетов, выявлены их филогенетические связи. Полученные результаты демонстрируют, что описываемый подход, основанный на комбинировании генов, позволяет эффективно влиять на структуру новых «гибридных» молекул. Вместе с тем гены, участвующие в биосинтезе антибиотиков, весьма многочисленны, локализованы в различных частях хромосомы продуцента, могут иметь плазмидную локализацию, что в совокупности сильно затрудняет их выделение и последующую слаженную организацию работы в новом генно-инженерном продуценте. К тому же для эффективной работы такого гибридного продуцента необходимо учитывать степень его устойчивости к образуемому им антибиотику. В связи с этим параллельно с выделением и клонированием генов биосинтеза проводится выделение и клонирование имеющихся у продуцентов генов устойчивости. Клонированы гены, обусловливающие резистентность S.antibioticus к олеандомицину, Amycolatopsis mediterranei к гликопептидному антибиотику балхимицину, другим антибиотикам. Яркой иллюстрацией возможности создания «гибридных» препаратов, являются работы в области генно-инженерных антибиотиков полиенов. Например, антибиотик S44HP, полученный генно-инженерной модификацией продуцента нистатина Streptomyces noursei, обладает гидрофильным участком лактонового кольца, аналогичным исходному препарату нистатину, а по своей гидрофобной части оказывается полным аналогом другого антибиотика — амфотерицина В. Генетически модифицированные антибиотики полиены могут быть с успехом использованы в качестве основы для создания новых химически модифицированных производных. Важно отметить, что, несмотря на очевидные достижения в этой области, работа по созданию генно-инженерных продуцентов путём выделения и клонирования всех генов, ответственных за успешный биосинтез антибиотика, оказывается чрезвычайно трудоёмкой и не гарантирует положительного результата. Вот почему в создании ценных с практической точки зрения продуцентов по-прежнему не утратил значения метод слияния протопластов (протопласт включает цитоплазму, ядро, все органеллы и клеточную мембрану.То есть протоплазму и мембрану). Проводя манипуляции не с отдельными генами, а с целыми геномами или блоками генов у недостаточно изученных с генетической точки зрения штаммов, исследователи добиваются существенного и нередко полезного изменения их свойств. Использование на ранних этапах поиска процедуры протопластирования клеток продуцентов, в том числе в сочетании с УФ-облучением, оказывает воздействие на продуктивность микроорганизмов и в конечном итоге на обнаружение образуемых им биологически активных метаболитов. Благодаря успехам в изучении биохимических основ вторичного метаболизма, выявлению генетической природы образования многих антибиотиков, стало возможным проведение целенаправленных перестроек генома продуцентов, приводящих к существенному изменению биосинтеза ими вторичных метаболитов, увеличению активности продуцентов и созданию новых «гибридных» антибиотиков. Ингибирование мутаций. Мутации, придающие устойчивость к антимикробным агентам, являются неизбежным следствием ошибок ДНК-полимеразы. Ингибирование белков бактерий, играющих активную роль в мутациях собственных геномов, или подавление их дерепрессии может представлять собой принципиально новый подход в борьбе с развитием резистентности. В сочетании с ошибками ДНК-полимераз у бактерий возможны повреждения ДНК, возникающие от регидратации, воздействия антибиотиков, химических окислителей, теплового шока, ультрафиолетового излучения, дезинфицирующих веществ, включения чужеродной ДНК в свой геном. В ответ на стресс ряд ферментов участвуют в гомологичной рекомбинации и в репарации повреждённой ДНК как, например, белок RecA, описанный у А.baumannii. Включение ингибиторов продукции этих ферментов в новые дезинфицирующие средства может препятствовать ответу бактериальных клеток на повреждения ДНК, подавляя индуцированный мутагенез и гомологичные рекомбинации в больничных условиях. Горизонтальная передача бактерицидных генов. Эта антибактериальная терапевтическая технология с использованием донорских клеток аттенуированной E.coli, несущей бактерицидные гены в конъюгативной плазмиде, была успешно применена для лечения ожоговых ран мышей, инфицированных А.baumannii. Экспрессия генов в плазмиде E.coli подавлялась, но становилась дерепрессированной при их передаче реципиентным микроорганизмам путём конъюгации, в результате чего в бактериальных клетках А.baumannii нарушался белковый синтез, что приводило к их гибели. Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из десятков ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза – задача не из легких. Однако, с помощью генетических или биохимических экспериментов можно идентифицировать, а затем выделить один или несколько ключевых ферментов биосинтеза, определить их Nконцевые аминокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные зонды. Этот подход использовался для выделения из P. chrysogenum гена синтетазы изопенициллина N. Этот фермент катализирует окислительную конденсацию 5(L-а-аминоадипил)-L-цистеинил-D-валина в изопенициллин N, ключевое промежуточное звено в биосинтезе пенициллинов, цефалоспоринов и цефамицинов. Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить, проводя генно-инженерные манипуляции с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Одна из плазмид Streptomyces, pIJ2303, несущая фрагмент хромосомной ДНК S. coelicolor длиной 32,5 т.п.н., содержит все гены ферментов, ответственных за биосинтез из ацетата антибиотика актинородина. Эту плазмиду вводили либо в штамм АМ-7161 Streptomyces sp., синтезирующий родственный антибиотик медермицин, либо в штаммы В1140 или Tu22 S. violaceoruber, синтезирующие также родственные антибиотики гранатицин и дигидрогранатицин. Каждый из 4-х антибиотиков формирует разный рН и соответнно цвет культуральной среды. Появление характерной окраски после трансформации штаммов АМ-7161, B1140 и Тu22 плазмидой, несущей гены, кодирующие ферменты биосинтеза актинородина, свидетельствует о синтезе в данных штаммах этого антибиотика. Трансформанты штамма АМ-7161 Streptomyces sp. и штамма В1140 S. violaceoruber, содержащие плазмиду рIJ2ЗОЗ, синтезируют антибиотики, кодируемые и плазмидой, и своей хромосомной ДНК.Однако, при трансформации штамма Тu22 S. violaceoruber плазмидой pIJ2303 наряду с актинородином синтезируется новый антибиотик – дигидрогранатиродин, а при трансформации штамма АМ-7161 Streptomyces sp. плазмидой pIJ2315 синтезируется еще один новый антибиотик – медерродин А.Эти новые антибиотики вероятно, образуются в том случае, когда промежуточный продукт одного пути биосинтеза служит субстратом для фермента другого пути. Детально изучив генетические и биохимические составляющие биосинтеза поликетидного (образуюшихся в результате ферментативной конденсации карбоновых кислот) антибиотика эритромицина в клетках Saccharopolyspora erythraea, удалось внести специфические изменения в гены, ассоциированные с биосинтезом этого антибиотика, и синтезировать производные эритромицина с другими свойствами. Вначале была определена первичная структура фрагмента ДНК S. erythraea длиной 56 т.п.н., содержащего кластер (группа расположенных рядом на хромосоме повторов одного и того же или родственных генов, входящих в состав единого мультигенного семейства) генов ery. Затем двумя разными способам модифицирована эритромицин-поликетидсинтаза. Для этого либо удаляли участок ДНК, кодирующий бета-кеторедуктазу, либо вносили изменение в участок ДНК, кодирующий еноилредуктазу. Эти эксперименты показывают, что если идентифицировать и охарактеризовать кластер генов, кодирующих ферменты биосинтеза определенного поликетидного антибиотика, то, внося в них специфические изменения, можно будет направленно изменять его структуру. Кроме того, вырезая и соединяя те или иные участки ДНК, можно перемещать домены поликетидсинтазы и получать новые поликетидные антибиотики. 6-дезоксиэритронолид B-синтаза или DEBS была идентифицирована как поликетид-синтаза 1-го типа. DEBS содержится в Saccharopolyspora erythraea и отвечает за синтез макролидного кольца, которое является предшественником антибиотика эритромицина. Там было три категории поликетидсинтаза идентифицированных до настоящего времени, тип 1, 2 и 3. Тип один синтазы привлекать большие многодоменные белки, содержащие все участки, необходимые для поликетида синтеза. Синтазы второго типа содержат активные центры, распределенные между несколькими меньшими полипептидами, а синтазы третьего типа представляют собой большие мультибелковые комплексы, содержащие модули, которые имеют один активный центр для каждой стадии синтеза поликетида. В случае DEBS есть три больших многофункциональных белка, DEBS 1,2 и 3, каждый из которых существует как димер из двух модулей. Каждый модуль состоит как минимум из кетосинтазы (KS), ацильного белка-носителя (ACP) и ацилтрансферазы (AT), но может также содержать кеторедуктазу (KR), дегидротазу (DH) и энолредуктазу (ER) для дополнительных восстановительных реакций. Комплекс DEBS также содержит загрузочный домен в модуле 1, состоящий из белка-носителя ацила и ацилтрансферазы. Конечная тиоэстераза действует исключительно для прекращения синтеза поликетида DEBS и циклизации макролидного кольца. Также ученые взяли на вооружение систему CRISPR/CAS9 (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами), позаимствованную у бактерий. У бактерий CRISPR/CAS9 играет роль иммунной системы. Благодаря присутствию в геноме последовательностей, совпадающих с ДНК врагов бактерий – бактериофагов, бактерии опознают бактериофагов на раннем этапе инфекции, и белок Cas9 разрезает ДНК фагов. Механизм этого похож на механизм РНК-интерференции. После предыдущих инфекций аналогичным бактериофагом в геноме остаются фрагменты его ДНК. С них синтезируется РНК. По принципу комплементарности эта РНК взаимодействует с геномом нового фага, белок Cas9 с помощью других белков распознает эту структуру и разрезает ее. Если искусственно синтезировать нужную РНК, комплементарную любой заранее выбранной последовательности, и ввести ее в клетки вместе с конструкцией, кодирующей белок Cas9, то любая ДНК в клетке будет разрезаться в выбранном месте. Синтезировали генетические конструкции, кодирующие белок Cas9 и последовательности, комплементарные генам, которые отвечают за патогенность и устойчивость к антибиотикам у золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus). Эти конструкции они упаковали в бактериофаги и заразили этими бактериофагами безвредные штаммы S. aureus, патогенные штаммы и устойчивые к антибиотику штаммы. Оказалось, что бактерии непатогенного штамма не пострадали, патогенного погибли, а устойчивые утратили устойчивость. Непатогенные и неустойчивые штаммы после такой обработки уже не могли стать патогенными или устойчивыми, захватив плазмиду из окружающей среды, потому что конструкция оставалась в клетках навсегда. CRISPR/Cas9 – это, «по сути, молекулярные ножницы», которые разрезают ответственные за иммунитет к антибиотикам гены бактерий, убивая их таким образом. Технология приносит результат при использовании бактериофагов – вирусов, которые атакуют бактерий. Бактериофагов и CRISPR/Cas9 можно настроить так, чтобы они атаковали только бактерии с генами устойчивости к лекарствам и не трогали полезные и неопасные бактерии. Смогли запрограммировать с помощью CRISPR/Cas9 бактериофагов на атаку бактерий Escherichia coli, которые могут вызывать желудочные колики, рвоту и диарею. Новый метод лечения с использованием CRISPR/Cas9 будет больше похож «на работу снайпера». Более точечный подход к лечению имеет несколько преимуществ. Потеря полезных микроорганизмов приводит к распространению опасных, устойчивых к медикаментам бактерий. Новые исследования полезных бактерий доказывают, что они играют гораздо более важную роль в нашем здоровье, чем считалось раньше, но использование мощных антибиотиков нейтрализует эту пользу. Перенести эту технологию из лаборатории в массовое производство мешают несколько серьезных проблем. Бактериофаги недостаточно хорошо изучены, чтобы доказать регуляторам безопасность и эффективность их использования на живых людях. Также со временем вредные бактерии выработают иммунитет и к бактериофагам с Crispr точно так же, как они научились противостоять антибиотикам. Одно из возможных решений этой проблемы – постоянно обновлять бактериофагов, чтобы обгонять развитие бактерий. Огромный потенциал CRISPR побудил многих ученых искать способы решения других медицинских проблем, вызванных генетическими мутациями, например, лечить с помощью технологии рак и наследственные заболевания. Однако эта тема требует основательного изучения. Одна из главных проблем в том, что CRISPR может отклонять от курса и «отрезать» не те гены, что в теории может принести дополнительный вред. Кроме того, эксперты опасаются новых, пока еще неизвестных, последствий модификации вирусов и бактерий с помощью CRISPR. Crispr-модифицированные бактериофаги уже существуют – например, бактериофаги, атакующие бактерий-возбудителей холеры. Это означает, что риск не так уж высок. При создании рекомбинантных штаммов Streptomyces (основного микроорганизма, используемого для получения антибиотиков) важно понять, что трансформация и отбор трансформированных клеток не должны быть слишком сложными. Однако, в отличие от E. Coli, Streptomyces существует не в виде изолированных клеток, а в виде протяженных мицелл, поэтому перед трансформацией необходимо разрушить клеточную стенку и высвободить отдельные протопласты. Без этого будет невозможно отличить трансформированные клетки от нетрансформированных, поскольку видимые колонии на твердой среде будут образовываться из группы клеток, а не из индивидуальной клетки. Соответственно колонии, растущие в присутствии селективного антибиотика, будут представлять собой смесь трансформированных и не трансформированных клеток. Проникновение плазмидной ДНК в протопласты Streptomyces облегчается в присутствии полиэтиленгликоля. После трансформации протопласты сначала высевают на твердую среду, чтобы образовалась клеточная стенка, а затем для отбора трансформированных клеток переносят на селективную среду, обычно содержащую неомицин, либо тиострептон. Актиномицеты являются продуцентами большинства промышленно важных антибиотиков. Известно, что один из эффективных путей воздействия на геном актиномицетов – это протопластирование их клеток. Показано, что протопластирование может влиять на уровень антибиотической активности. Метод слияния протопластов различных штаммов может служить для получения рекомбинантов, способных синтезировать новый антибиотик, или обладающих более высоким уровнем образования антибиотика. Биотехнология данного процесса следующая: мицелий отмывают от питательной среды, промывают специальными средами путем центрифугирования; проводят лизис в питательной среде, содержащей 20 % сахарозу и лизоцим в концентрации 1–2 мг/мл; нелизированный материал отделяют центрифугированием при 1000 об/мин; протопласты осаждают путем центрифугирования при 3000 об/мин; протопласты высевают на питательные среды и инкубируют при (27 ± 1) °С в течение 15 суток. Кроме того, с помощью генной инженерии можно не только создавать новые антибиотики, но и увеличивать эффективность синтеза уже известных. Лимитирующим фактором в промышленном производстве антибиотиков с помощью Streptomyces часто является количество доступного клеткам кислорода. Вследствие плохой растворимости кислорода в воде и высокой плотности культуры Streptomyces его часто оказывается недостаточно, рост клеток замедляется, и выход антибиотика снижается. Решить эту задачу можно двумя способами: во-первых, изменить конструкцию ферментера, в котором выращивается культура Streptomyces, а во-вторых, используя методы генной инженерии, создать штаммы Streptomyces, более эффективно использующие имеющийся кислород. Эти два подхода не исключают друг друга. Одна из стратегий, которая используется некоторыми аэробными микроорганизмами для выживания в условиях недостатка кислорода, состоит в синтезе гемоглобинподобного продукта, способного аккумулировать кислород и доставлять его в клетки. Например, аэробная бактерия Vitreoscilla синтезирует гомодимерный гемсодержащий белок, функционально подобный эукариотическому гемоглобину. Ген гемоглобина Vitreoscilla был выделен, встроен в плазмидный вектор Streptomyces и введен в клетки этого микроорганизма. После его экспрессии на долю гемоглобина Vitreoscilla приходилось примерно 0,1 % всех клеточных белков Streptomyces coelicolor даже в том случае, когда экспрессия осуществлялась под контролем собственного промотора гена гемоглобина Vitreoscilla, а не промотора Streptomyces. Трансформированные клетки Streptomyces coelicolor, растущие при низком содержании растворенного кислорода (примерно 5 % от насыщающей концентрации) синтезировали в 10 раз больше актинородина на 1 г сухой клеточной массы и имели большую скорость роста, чем нетрансформированные. Этот подход можно использовать и для обеспечения кислородом других микроорганизмов, растущих в условиях недостатка кислорода. Исходным материалом при химическом синтезе ряда цефалоспоринов – антибиотиков, обладающих незначительным побочным эффектом и обладающий высокой антибактериальной активностью, – является 7-аминоцефалоспорановая кислота (7АСА), которая в свою очередь синтезируется из антибиотика цефалоспорина С. К сожалению, природных микроорганизмов, способных синтезировать 7АСА, до сих пор не выявлено. Предложен путь биосинтеза 7АСА за счет включения специфических генов в плазмиду гриба Acremonium chrysogenum, который в обычных условиях синтезирует только цефалоспорин С. Один из этих генов был представлен кДНК гриба Fusarium solani, кодирующий оксидазу D-аминокислот, а другой происходил из геномной ДНК Pseudomonas diminuta и кодировал фермент – цефалоспоринацилазу. В плазмиде гены находились под контролем промотора Acremonium chrysogenum. На первом этапе нового биосинтетического пути цефалоспорин С превращается в 7- -(5-карбокси-5-оксопентанамид) цефалоспорановую кислоту (кето-AD- 7АСА) при помощи оксидазы D-аминокислот. Часть этого продукта, вступая в реакцию с пероксидом водорода, одним из побочных продуктов, превращается в 7-(4-карбосибутанамид) цефалоспорановую кислоту (GL-7ACA). И цефалоспорин С, и кетоAD-7АСА, и GL-7ACA могут подвергаться гидролизу цефалоспоринацилазой с образованием 7АСА, однако только 5 % цефалоспорина С напрямую гидролизуется до 7АСА. Исходя из полученных данных установлено, что для образования 7АСА с высоким выходом необходимы оба фермента. Заключение: Генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Методика по клонированию включают следующие биотехнологические этапы: 1. Рестриктазное расщепление из организма-донора нужных генов нативной ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК); 2. Быстрая расшифровка всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющая определить точные границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую геном; 3. Обработка рестрикционными эндонуклеазами вектора для клонирования, который может реплицироваться в клетке-хозяине; 4. Сшивание ДНК-лигазой двух фрагментов ДНК с образованием новой рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК»; 5. Введение этой конструкции в клетку-хозяина (реципиента), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. После трансформации бактериальная клетка воспроизводит фрагмент клонируемой ДНК миллионами идентичных клеток; 6. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки); 7. Получение специфического белкового продукта, синтезированного клетками-хозяевами. Таким образом, технология рекомбинантных ДНК включает целый набор процедур, благодаря которым удается клонировать фрагменты ДНК, содержащие специфические гены. Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся при сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5′–концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят: 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию; 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка – продукта клонированного гена; 3) гибридизацию с зондом, комплементарным какому-либо участку искомого гена. Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорскую ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов лямбда и З1-го, а также плазмиды F. Для получения фрагментов ДНК, кодирующих эукариотические белки, на очищенной мРНК как на матрице синтезируют комплементарную цепь ДНК с помощью обратной транскриптазы; эта цепь в свою очередь используется в качестве матрицы для синтеза второй цепи. После ферментативной обработки эту двухцепочечную комплементарную ДНК встраивают в вектор. Независимо от того, какая именно стратегия клонирования используется, после идентификации клонированной последовательности необходимо показать, что она представляет собой нативный структурный ген. Таким образом, развитие исследований в биотехнологии, создание новых штаммовпродуцентов антибиотиков, включая рекомбинантные, производство высокоэффективного оборудования даст возможность пополнить номенклатуру антибиотиков и их лекарственных форм.
