Введение Всем организмам присущ постоянный обмен веществ с окружающей их внешней средой. Для осуществления процессов питания и размножения клеток необходимы определенные условия и в первую очередь наличие питательных материалов, из которых клетки синтезируют составные части своего тела и получают путем окисления различных веществ необходимую энергию. Биологические свойства микроорганизмов обусловлены их физиологией – процессами питания, дыхания, размножением и ростом, взаимодействием с окружающей средой. Знания питательных потребностей микроорганизмов в различных веществах позволяют определять культуральные и биохимические свойства про- и эукариотов, проводить идентификацию бактерий и микроскопических грибов, ставить диагноз на инфекционные болезни, изучать патогенез инфекционных болезней, выбирать тактику лечения животных и профилактики болезней, разрабатывать технологии промышленного производства биопрепаратов. 1. Назначение и цели применения питательных сред Питательные среды - это субстанции, содержащие различные вещества, необходимые для размножения и роста микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Питательные среды применяют для наращивания биомассы микроорганизмов, выделения их в чистой культуре, изучения биологических свойств, для длительного сохранения свежевыделенных и производственных культур. В питательные среды должны входить соединения, служащие источниками углерода, азота, фосфора, витаминов и других компонентов, необходимых для жизнедеятельности микроорганизмов. 2. Принципы питания микроорганизмов Бактерии и микроскопические грибы, как и другие микроорганизмы, нуждаются для своего размножения и роста в питательных веществах, в состав которых должны входить все те химические элементы, которые необходимы для построения клеточного материала, для активности ферментов и для работы транспортных систем. Кроме того, питательные вещества должны поставлять микроорганизму материал, используемый для генерирования биологически полезной энергии. Питание микроорганизмов - это процесс, в ходе которого клетка получает из окружающей среды компоненты, необходимые для ее роста и размножения (рис. 1). Биогенные элементы – 95% С, О, N, H Макроэлементы – 4,99% P, S, Cl, K, Mg, Ca, Na Микроэлементы – 0,01% Fe, Cu, I, Co, Mo и др. Рис. 1. Химические элементы, входящие в состав бактериальной клетки Белки микроорганизмов подразделяются на протеины и протеиды. Протеины (простые белки) – состоят из аминокислот. Протеиды (сложные белки) – состоят из аминокислот и других веществ (полисахариды, нуклеиновые кислоты, липиды) и называются нуклеопротеидами, глюкопротеидами, липопротеидами. Структурные белки (структурообразующие) микроорганизмов входят в состав структурных компонентов клетки. Функциональные (регуляторные) белки микроорганизмов (ферменты) участвуют в обмене веществ. Белки бактерий обуславливают: 1. Ферментативную активность. 2. Видовую принадлежность. 3. Приспособляемость. 4. Вирулентность. 5. Антигенность. 6. Иммунногеность. Углеводы микроорганизмов подразделяются на: 1. Моносахариды (простые) - энергия. 2. Дисахариды (простые) - энергия. 3. Полисахариды (сложные) – глюкопротеиды, липополисахариды (ЛПС). ЛПС по своей сути являются эндотоксинами и О-антигенами. Липиды микроорганизмов - фосфолипиды, стероиды, воск, каротиноиды, липопротеиды, тейхоевые кислоты и др. выполняют следующие функции: 1. Запас питательных веществ в цитоплазме. 2. Входят в состав цитоплазматической мембраны и создают полупроницаемость оболочки. 3. Определяют устойчивость бактерий к кислотам, щелочам, спиртам (возбудитель туберкулеза). Бактериальные клетки не имеют специальных органов питания, т.е. являются голофитными и всеядными. Вещества поступают в бактерии только в растворенном виде. Источником водорода и кислорода в питательных средах для микроорганизмов служит вода, источником азота - органические и неорганические соединения. Источником углерода для патогенных бактерий являются, главным образом, различные углеводы: моно- и дисахара, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли. Кроме органогенов, бактериям необходимы неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, а также микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Многие микроорганизмы нуждаются в факторах роста, т.е. в веществах, которые они сами не могут синтезировать. Факторы роста необходимо добавлять в питательные среды в готовом виде. К факторам роста относятся различные витамины, источником которых в питательных средах являются прибавленные к питательной среде продукты растительного и животного происхождения. Питательные вещества могут усваиваться бактериями только при определенной реакции среды, т.к. проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды. Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова, и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды. Поступление питательных веществ в микробную клетку может происходить следующими способами: 1. Облегченная диффузия - осмос. 2. Простая диффузия (пассивный транспорт) – осмос и белкипереносчики. 3. Активный транспорт – ферменты-пермеазы. 4. Перенос (транслокация) радикалов - с затратой энергии и расщеплением субстрата. 3. Разделение микроорганизмов на группы по типам питания Классификация микроорганизмов по типам питания основана на 3 параметрах: 1. По потребности микроорганизмов в углероде. 2. По источнику получения энергии. 3. По потребности в факторах роста. По потребности в углероде Автотрофы (органотрофы) Метатрофы (сапрофиты) Гетеротрофы (литотрофы) Паратрофы (паразиты) Рис. 2. Классификация микроорганизмов по потребности в углероде Автотрофы (от греч. autos - сам, trophe - пища) – это микроорганизмы, обладающие способностью создавать органические вещества из неорганических, и не нуждающиеся в сложных органических углеродосодержащих соединениях. Синтез составных частей своего тела осуществляется у автотрофов путем усвоения СО2, воды и простых азотистых соединений (аммиака и его солей, солей азотистой кислоты). В питании бактерий-автотрофов большое значение имеют азот и его соединения. По характеру азотистого питания автотрофы подразделяются на 4 группы: 1) азотфиксирующие микроорганизмы (способны усваивать молекулярный азот атмосферы, т.е. фиксирующие азот из воздуха); 2) аммонифицирующие, нитратредуцирующие и нитритредуцирующие микроорганизмы, усваивающие минеральные формы азота (ассимилирующие неорганический азот солей аммония, нитратов или нитритов); 3) развивающиеся в присутствии отдельных аминокислот и их смеси; 4) культивируемые в белковых питательных средах. К микроорганизмам автотрофного типа питания принадлежат нитрофицирующие бактерии, многие серобактерии, а также азотфиксирующие бактерии (Azotbacter), некоторые виды Сlostridium, которые усваивают азот из атмосферы. Синтез сложных веществ происходит у них за счет энергии, получаемой окислением аммиака до нитратов (Nitrosommonas) и нитритов (Nitrobacter), а серы, сульфидов, тиосульфатов - до серной кислоты (Thiobaillus thiooxidans). Некоторые виды микроорганизмов - анаэробные пурпурные и зелёные серобактерии (Thiorhdaceaaae, Chlorobacteriaceae) содержат хлорофилл и используют солнечную энергию для фотосинтеза. Автотрофные бактерии в процессе синтеза всех органических веществ, используют углекислоту в качестве единственного источника углерода и не в состоянии усваивать более сложные соединения углерода, а следовательно, не могут быть патогенными для человека и животных. Гетеротрофы (от греч. Heteros - другой) – это микроорганизмы, нуждаются для своего питания в углероде как биологического, так и не биологического происхождения (углеводы, углеводороды, аминокислоты, органические кислоты и др.), различных азотистых соединениях (нитраты, аммиак), неорганических веществах (калий, магний, марганец, железо, фосфаты, сульфаты), микроэлементах и витаминах. Гетеротрофы разделяются на сапрофиты (метатрофы) и паразиты (паратрофы): а) сапрофиты (от греч. sapros - гнилой, phyton - растение), живут за счет органических веществ, находящихся во внешней сре- де. К ним относится большинство видов бактерий, населяющих нашу планету. б) паразиты (от греч. parasitos - нахлебник, живущий на поверхности или внутри другого организма-хозяина и питающийся за его счёт). Эту группу составляет сравнительно небольшое количество видов микроорганизмов, приспособившихся в ходе эволюции к паразитическому образу жизни. Они осуществляют своё питание за счёт органических соединений животных и человека. Однако такое подразделение гетеротрофов на сапрофитов и паразитов не является абсолютным, т.к. резкую грань между этими подгруппами микроорганизмов не всегда можно установить. Отдельные виды патогенных для человека микробов могут существовать во внешней среде как сапрофиты и, наоборот, некоторые сапрофиты при неблагоприятных условиях могут вызывать у людей и животных различные заболевания. В настоящее время установлено, что некоторые микроорганизмы, раньше считавшиеся типичными гетеротрофами, хорошо растут в синтетических средах с сернокислым аммонием и добавлением витаминов. Многие патогенные бактерии, культивируемые на средах, содержащих кровь, асцитическую жидкость, сыворотку и т.д., можно выращивать в синтетических средах. По источнику получения энергии Фототрофы Хемотрофы Фотоавтотрофы Хемоавтотрофы Хемолитотрофы Фотогетеротрофы Хемогетеротрофы Хемоорганотрофы Рис. 3. Классификация микроорганизмов по источнику получения энергии Фототрофы – это фотосинтезирующие микроорганизмы, способные использовать энергию света. Хемотрофы - это микроорганизмы, нуждающиеся в химических источниках энергии, и получающие энергию за счет окислительновосстановительных реакций. На основе этих критериев все микроорганизмы по источнику получения энергии можно разделить на 4 группы: 1. Фотоавтотрофы – используют свет как источник энергии и СО2 в качестве основного источника углерода. Эта категория включает в себя большинство фотосинтезирующих организмов: высшие растения, водоросли и многие фотосинтезирующие бактерии. 2. Фотогетеротрофы – используют свет в качестве источника энергии и какое-нибудь органическое вещество как основной источник углерода. Сюда относятся некоторые пурпурные и зеленые водоросли. 3. Хемоавтотрофы – используют химический источник энергии и СО2 в качестве основного источника углерода. Они получают энергию в результате окисления таких неорганических веществ, как Н3NO2, Н2, восстановленные формы серы (H2S, S, S2O3) или окись железа. В эту группу входят только представители бактерий. 4. Хемогетеротрофы – используют химический источник энергии и органическое вещество в качестве основного источника углерода. И углерод и энергия обычно могут быть результатом одного и того же органического соединения. К хемогетеротрофам относятся все многоклеточные животные, простейшие, грибы и подавляющее большинство бактерий. Внутри этой очень сложной группы возможны дальнейшие подразделения. Одно из них основано на том, в каком химическом состоянии органический материал поступает внутрь клетки. Осмотрофы (бактерии и грибы) получают питательные вещества в растворенном виде, а фаготрофы (простейшие) могут поглощать твердые частички пыли путем фагоцитоза. В дополнение к этой классификации в зависимости от природы доноров электронов микроорганизмы подразделяются на фототрофные литотрофы и, соответственно, хемотрофные литотрофы, т.е. использующие в качестве доноров электронов неорганические соединения, а также, соответственно фото- и хемоорганотрофы, использующие только органические соединения. К последним принадлежит значительное большинство бактерий, в том числе и патогенные для человека и животных виды. По потребности в факторах роста Ауксотрофы Прототрофы Рис. 4. Классификация микроорганизмов по потребности в факторах роста Кроме углерода, азота и других химических элементов, многие бактерии нуждаются в факторах роста (витамины, основания нуклеиновых кислот и другие биологически активные вещества). По этому признаку микроорганизмы можно разделить на две группы: 1. Ауксотрофы, для которых в среде необходимо наличие одного или нескольких факторов роста. Они не способны синтезировать какое-либо из необходимых им соединений и потребляют их в готовом виде из окружающей среды или организма хозяина (человека, животного). Чаще всего ими являются патогенные или условно-патогенные микроорганизмы. 2. Прототрофы, которые в факторах роста не нуждаются и способны синтезировать все необходимые им органические соединения (углеводы, аминокислоты и др.). Патогенные бактерии Гетеротрофы - используют в качестве источника углерода органические соединения биологического происхождения Паратрофы - способны утилизировать продукты метаболизма внутри живой клетки Ауксотрофы - нуждаются в факторах роста и витаминах Хемоорганотрофы получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций органических соединений Рис. 5. Характеристика патогенных бактерий по типу питания Патогенные бактерии по типу своего питания являются гетеротрофами, паратрофами, ауксотрофами и хемоорганотрофами. 4. Подбор состава питательных сред Главная цель при подборе питательно среды для выращивания любого микроорганизма состоит в том, чтобы создать сбалансированную смесь необходимых питательных веществ в таких концентрациях, при которых рост будет наилучшим. На первый взгляд может показаться, что нужно сделать среду наиболее богатой, добавив в нее вещества в большом избытке. Однако, во-первых, в повышенных количествах многие питательные вещества начинают подавлять рост или оказываются токсичными. При высоких концентрациях подобный эффект дают такие органические субстраты как соли жирных кислот, например уксусной и даже сахара. Подавлять рост могут и некоторые неорганические компоненты, если они окажутся в избытке. Во- вторых, даже если микроорганизмы и могут расти в среде с высоким содержанием питательных веществ, то в результате метаболической активности растущей популяции среда в конце концов настолько изменяется, что условия будут весьма неблагоприятными и популяция станет физиологически аномальной или просто погибнет. Это может быть обусловлено и сильным изменением рН, накоплением токсичных органических метаболитов, а в случае строгих анаэробов – исчерпанием запасов кислорода. Таким образом, разумно ограничивать рост культуры, вводя питательные вещества в лимитирующем количестве. Таблица 1. Экстракты, настои и лизаты, применяемые в составе питательных сред Экстракт Прессованные дрожжи Настой Картофельный Сухие дрожжи без железа Сердце крупного рогатого скота Отруби Кукуруза Печеночный Лизат Автолизат хлебных дрожжей Автолизат сухих дрожжей Печеночный Автолизат отрубей Мясной Автолизат гороха Диализат дрожжей При изготовлении питательных сред целесообразно составить сначала их минеральную основу, содержащую все те питательные вещества, которые можно дать любому организму в неорганической форме. Затем в эту основную среду можно ввести добавки – источник углерода, источник энергии, источник азота и необходимые ростовые факторы. Состав этих добавок зависит от потребностей выращиваемых микроорганизмов и от целей их культивирования. 5. Определение потребностей питания микроорганизмов На питательной среде должны быть созданы оптимальные условия для роста и размножения микроорганизмов. Питательная среда должна содержать вещества, необходимые для роста и размножения микроорганизмов, а также для построения клетки (источники азота, углерода, водорода и кислорода); неорганические соединения в виде различных солей; бактериальные витамины (так называемые "факторы роста"); воду. Однако наличие всех указанных субстратов само по себе, без учёта физико-химических свойств среды, не обеспечивает оптимальных условий для существования микроорганизма. Такими основными свойствами сред являются рН, окислительно-восстановительный потенциал, вязкость, влажность, осмотические свойства. Так как различные виды бактерий характеризуются значительными различиями в обмене веществ, то естественно, что для их выращивания используются разные питательные среды. При составлении питательных сред особо важное значение имеет вопрос об источниках углерода и азота, так как кислород, водород и сера могут потребляться микроорганизмами из воды и сульфатов. Удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов Выбор сырьевых источников для конструирования питательных сред Дифференциация питательных сред по целевому назначению Оптимизация питательных сред Стандартизация питательных сред Рис. 6. Принципы, лежащие в основе конструирования питательных сред Основные этапы определения потребностей гетеротрофных бактерий в питательных веществах заключаются в следующем: 1. Бактерии следует выращивать в такой среде, о которой известно, что она способна поддерживать их рост. 2. Если начинают выращивать бактерии на комплексной среде, то варьируют концентрации всех компонентов (от нуля до самой большой, при которой они находились в исходной среде), чтобы определить их оптимальные концентрации. 3. Определив оптимальные концентрации, сначала заменяют основной сложный компонент среды, поставляющий азот (например, казеин), на полную смесь аминокислот в тех же концентрациях, которые использовали в средах для аналитического определения веществ. 4. Если эта смесь обеспечивает рост бактерий, поочередно варьируют концентрацию каждой аминокислоты от нуля до концентрации, превышающей ту, которая установлена в среде для аналитического определения. Таким образом определяют оптимальную концентрацию каждой аминокислоты в присутствии других. Если же наблюдается ингибирующий эффект, то аминокислоту исключают из состава среды. 5. Заменяют сложный фактор роста, например, дрожжевой экстракт, полным набором известных витаминов и затем варьируют отдельно уровень каждого компонента смеси, как и в случае ами- нокислот. Если в исходной среде в качестве источника аминокислот и витаминов используют дрожжевой экстракт, то стараются заменить его полным набором известных витаминов и затем варьируют в среде уровень каждого компонента отдельно. 6. Если бактерии не растут на полученной таким образом среде, то это можно объяснить тем, что они нуждаются в не идентифицированном факторе роста, или тем, что нарушено соотношение известных факторов роста. Можно также предполагать потребность бактерий в известных факторах роста (пептидах, производных витаминов, жирных кислотах, нуклеотидах, неорганических ионах и др.), которые содержатся в неочищенных компонентах комплексной среды, но отсутствуют в смесях испытываемых синтетических веществ. 7. Если работу начинают с использованием синтетической среды и не наблюдают хорошего роста бактерий на втором этапе, то заменяют источник азота на 10%-ный гидролизат казеина. Если это способствует росту, поступают как указанно на этапе 4; если же интенсивность роста ещё недостаточна, добавляют к среде 1%-ный дрожжевой экстракт. В случае стимуляции роста поступают как указанно на этапе 5. Многие аэробные и факультативно-аэробные бактерии растут на простых химически определённых (синтетических) средах, не содержащих ростовых факторов или других сложных ингредиентов. Поскольку элементарный состав большей части микроорганизмов очень сходен, можно составить среду, основываясь на этом анализе. Содержание углерода в клетке обычно находится в пределах 45,0-55,0%, азота – 6,0-14,0%, К - 0,5-2,0%, Р – 1,0-3,0%, Mg - 0,11,0%, S - 0,02-1,0%, Са – до 1%. Микроэлементы присутствуют в количествах (на 100 г сухой биомассы): Cu - 0,1-1,0 мг, Fe – 1,0-10,0 мг, Zn - 1,0 мг, Mn - 0-5 мг. Из указанных элементов составляют среду, которая позволяет получить желаемую концентрацию клеток. Для этого требуется выбрать лимитирующий фактор, которым служит источник углерода, поскольку при его исчерпании рост останавливается, в то время как при выборе лимита по другим элементам, например по азоту, может происходить аномальный рост, сопровождающийся большим накоплением липидов. Если принять, что желаемая концентрация клеток - 10 мг/л, а источник углерода - глюкоза, то в аэробных условиях выход клеток составляет примерно 45-50 % (по весу сухой биомассы). В таблице 2 представлен состав среды, подобранный на основе элементарного состава клеток. Таблица 2. Пример синтетической питательной среды (по Miller e.a., 1986) № I 1 2 3 4 5 6 7 II 1 2 III 1 IV 1 2 Ингредиент Группа А Глюкоза К2НРО MgSO*7Н2О CaCl2 Fe2(SO)4 ZnSO*7H2O MnSO*Н2О Группа В (NH)2HPO (NH)H2PO Группа С CHNaO*2H2O Группа D Na2HPO КН2РО Цель применения Концентрация, г/л С, энергия К, Р Mg, S Ca Fe Zn Mn 20,0 1,0 0,4 0,03 12*10 4*10 4*10 N N 4 3 хелатирующее вещество 4 буфер буфер 20 10 В группе А - все необходимые компоненты, кроме азота. В группе В - источники азота в виде аммонийного азота, который предпочитается большинством микроорганизмов, и ионы фосфора, обеспечивающие буферную ёмкость. Функция группы С - хелатора - сохранение ионов металлов в растворе, а также предотвращение их токсических эффектов. Буферные свойства группы D необходимы для поддержания значения рН, близкого к нейтральному (оптимального для большинства бактерий). 6. Добавки, вносимые в питательные среды Для обеспечения роста бактерий с различными метаболическими особенностями в питательные среды вносят различные добавки - факторы роста, детоксицирующие вещества и т.д. Характеристики основных добавок подобного рода приведены ниже. Витаминные добавки. 1. Дрожжевой экстракт. Используют как источник витаминов, пуринов и пиримидинов для сред на основе гидролизатов мяса и казеина. Берут 250 г прессованных хлебных дрожжей, суспендируют в 1000 мл дистиллированной воды, кипятят до отхождения пены (5 минут), фильтруют через бумажный фильтр, к фильтрату добавляют хлороформ и хранят в закрытых емкостях в темноте. Перед стерилизацией экстракт разводят питательной средой 1:10. 2. Тиамин (витамин В1). Оказывает стимулирующее действие на рост стафилококков. Его добавляют в питательную среду в количестве 1-10 мг на 1000 мл. Солянокислый тиамин растворяют в воде. Стерилизуют только фильтрованием. 2. Витамин К необходим для роста неспорообразующих анаэробов Fusobacterium, Bacterioides, а также Mycobacterium. Обычно рекомендуется добавлять в среду в форме менадиона (спиртовой раствор 2-метил-1,4 нафгохинона), который устойчив к автоклавированию, в количестве около 5 мг на 1000 мл среды. 3. Кобаламин (витамин В12) участвует во многих метаболических реакциях бактерий, стимулирует рост Е.coli, Lactobacillus. Стерилизуют автоклавированием, добавляют 1 мг на 1000 мл питательной среды. 4. Биотин (витамин В7) стимулирует рост Clostridium, Staphylococcus, Streptococcus. Слаборастворим в воде, можно автоклавировать. В среде должен быть в концентрации 10-12. 5. N-аминобензойная кислота является предшественником в синтезе фолиевой кислоты. Наличие в среде тиамина, метионина, пуриновых оснований, витамина В12 снижает потребность бактерий в данной кислоте. Оптимальное количество в питательной среде - 250 мкг/1000 мл. 6. Фолиевая кислота участвует в качестве кофактора в синтезе пантотеновой кислоты, метионина, серина, пуринов, тиамина. Аммониевая соль хорошо растворима и устойчива к автоклавированию. Содержание в среде - около 200 мкг/1000 мл. 7. Никотиновая кислота и ее производные. Коферментные формы никотиновой кислоты - NAD и NADP (никотин амидадениндинуклеотидфосфат) участвуют в окислительно-восстановитель- ных реакциях. NAD необходим для роста Heamophilus, некоторых видов Actinobacillus и Pasteurella. Стерилизуют фильтрованием. Оптимальная концентрация в питательной среде 1-5 мг/1000 мл. 8. Витамин B6 (пиридоксин, пиридоксаль) стимулирует рост стрептококков. Устойчив к нагреванию, стерилизуют отдельно от других компонентов среды, чувствителен к свету. Оптимальная концентрация в питательной среде - 5 мг/1000 мл. 9. Железопорфирины являются компонентами транспортных систем бактерий. Гемофильные бактерии не способны синтезировать эти соединения. Для обеспечения их потребности и стимуляции роста неспорообразующих анаэробов используют гемин (Хфактор роста) в концентрации 5-20 мг/1000 мл среды. 10. Кровь, обработанная пепсином, используется для стимуляции роста бактерий рода Haemophilus. Добавляют к средам в количестве 2-5%. Приготовление: 150 мл 0,9% раствора NaCl автоклавируют при 120°С 15 минут в колбе, затем добавляют 6 мл концентрированной НСl, 50 мл дефибринированной крови барана, 1 г пепсина и выдерживают 24 часа в водяной бане при 55°С, перемешивая в течение 2 часов. Затем вносят 12 мл 20%-ного NaOH и далее дробно до рН 7,6, затем внесением HCl понижают рН до 7,0-7,2, вносят 0,5 мл хлороформа. 11. Аминокислоты (алании, аспарагин, солянокислый аргинин, солянокислый гистидин, изолейцин, лейцин, солянокислый метионин, треонин, валин, фенилаланин, серии, пролин, оксипролин и глицин) растворяют в воде, в кислоте или щелочи. Все аминокислоты, кроме глутамина, устойчивы к автоклавированию. Основные растворы аминокислот должны содержать 100-1000 мг вещества на 1000 мл. В состав анаэробных сред как редуцирующее вещество часто включают L-цистеин/цистин из расчета 300-500 мг/1000 мл. Для обеспечения роста стрептококков и пневмококков вносят в среды глутамин из расчета 5-100 мг/1000 мл. 12. Пурины, пиримидины, нуклеотиды и нуклеозиды. Растворы готовят в концентрации 100-1000 мг/100 мл раствора. Для стимулирования роста С.tetani и гемолитических стрептококков добавляют гуанин до 0,6 мг/100 мл, урацил - из расчета 2-5 мг/1000 мл среды; гипоксантин для обеспечения роста С.tetani - 100 мг/1000 мл среды. Аденин, гуанин, тимин и цитозин растворяют в 0,1 N растворе НСl, ксантин и урацил - в 0,1 N растворе NaOH. 13. Жирные кислоты. Сложностью их применения является то, что необходимые концентрации, особенно ненасыщенных жирных кислот, одновременно могут быть и токсическими. Поэтому их используют одновременно с детоксицирующими веществами (белки, альбумины, твины, лецитин). Потребность в стероидах особенно выражена у микоплазм, например в холестерине. Сыворотка крови содержит такие жирные кислоты, как олеиновую, стеариновую и др. Источником водорастворимых липидов вместо сыворотки может служить желчь, которую добавляют в среды для сальмонелл, других энтеробактерий, некоторых псевдомонасов (P.aeruginosa), морганелл в концентрации 0,5-2 г/1000 мл. Желчь крупного рогатого скота, при отсутствии коммерческих препаратов, получают следующим образом: вырезают при убое животных желчный пузырь, желчь переливают в стерильную емкость, выдерживают 60 минут в аппарате Коха, отстаивают, фильтруют и стерилизуют дробно 3 дня подряд по 20 мин. текучим паром. Натриевые соли жирных кислот растворяют в воде, в других случаях их растворяют в 95%-ном этаноле или твине. Вещества, обладающие антитоксическим действием. 1. Активированный уголь обладает способностью адсорбировать и нейтрализовать токсические вещества. Его включают в состав сред для В.pertussis, С.jejuni и др. В казеиново-угольный агар (КУА) для бордетелл добавляют 0,3% активированного угля. 2. Асцитическая жидкость используется как детоксицирующий компонент питательных сред для выращивания стрептококков, пневмококков. Добавляют 10-25 мл на 100 мл питательной среды. 3. Кровь адсорбирует токсины. Обычно используют кровяной агар и бульон. В первом случае к стерильному и охлажденному до 50°С агару добавляют 5-10-20% стерильной дефибринированной крови (барана, кролика и т.д.), перемешивают и разливают по чашкам Петри, пробиркам. В МПБ вносят 1-5% стерильной дефибринированной крови. Нередко, особенно при культивировании анаэробов, в кровяные среды добавляют как универсальный источник энергии глюкозу (до 1%). Раствор глюкозы стерилизуют фильтрованием, дробно текучим паром или при 0,5 атм в течение 30 минут. Кровяные среды, помимо стимуляции роста, дают возможность определения гемолитической активности бактерий. 4. Сыворотка крови обладает антитоксическим действием, придает среде свойство буферности, сорбирует жирные кислоты и является источником активных жирных кислот. Используют при конструировании питательных сред стерильную, без консервантов сыворотку крови крупного рогатого скота, лошадей, кроликов. В питательные среды сыворотку крови вносят в количестве от 0,5 до 50% (объем/объем). Сыворотку рекомендуется инактивировать при 56°С в течение 30 минут. При изготовлении сывороточного агара (рН 7,4-7,6) к остуженной до 45-50°С среде добавляют 525% сыворотки, сывороточный агар для анаэробов обычно дополняют 2% глюкозы. 5. Твин 40, 60, 80 используют в составе сред для обеспечения коллоидных свойств при культивировании Brucella, Pasteurella. Оптимальная концентрация в составе среды 50-100 мг/1000 мл. 7. Классификация питательных сред Питательные среды классифицируют в зависимости от исходных компонентов, консистенции, целевого назначения, химического состава и т.п. Пи та те ль ны е ср ед ы По происхождению: 1. Натуральные 2. Полусинтетические 3. Синтетические По составу: 1. Простые 2. Сложные По консистенции: 1. Жидкие 2. Полужидкие 3. Плотные По назначению: 1. Общеупотребительные 2. Специальные а) дифференциальнодиагностические б) ингибиторные в) элективные г) накопительные д) селективные е) индикаторные ж) консервирующие з) транспортные По масштабам использования: 1. Производственные 2. Лабораторные Рис. 7. Классификация питательных сред В зависимости от исходных компонентов различают следующие типы питательных сред: 1. Натуральные среды (естественные, природные, комплексные, органические среды неизвестного или неопределённого химического состава). Из них выделяют среды животного происхождения (исходные продукты – мясо, рыба, яйца, кровь, сыворотка крови, молоко и т.п.) и среды растительного происхождения (исходные продукты – соя, горох, картофель, морковь и т.п.). Некоторые продукты используют в натуральном виде, но чаще животные и растительные ткани подвергают различной обработке (экстрагированию, ферментативному или кислотному гидролизу). На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в этих средах имеются, обычно, все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны, выяснить, какие вещества образуются по ходу развития микроорганизмов. Это связано с тем, что состав естественных сред очень сложен; кроме того, он не является постоянным, так как существенно колеблется в зависимости от сырья и способа приготовления сред. Это заметно влияет на рост микроорганизмов. Естественные среды неопределенного состава используются для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и др. 2. Полусинтетические среды, кроме веществ известного состава, содержат в незначительных количествах продукты природного происхождения, т.е., в их состав наряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Примером может быть картофельная среда с глюкозой, состав которой зависит от сорта и возраста картофеля. Так, содержание аспарагина и глутамина в клубнях разных сортов картофеля может отличаться более чем в два раза. Среды, содержащие агар, также относятся к полусинтетическим из-за сложности и недостаточной определенности состава агара. 3. Синтетические среды – это среды известного химического состава. В них входят известные химические соединения (соли, углеводы, аминокислоты, витамины и т.д.) в оптимальном количественном соотношении. Синтетические среды готовят из точно определённых количеств органических и неорганических химических соединений известного состава и воды. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть и довольно простыми по составу. Преимущество синтетических сред - постоянный состав и воспроизводимость. Однако, как правило, в них требуется вносить различные добавки, в частности факторы роста. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена. По составу питательные среды подразделяют на простые и сложные: 1. Простые или обычные (универсальные) среды содержат простые по составу и компонентам, легко доступные вещества (пептонная вода, мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), питательная желатина и др.). 2. Сложные (политропные) среды содержат сложные по составу компоненты (кровяной агар, асцитический агар и бульон, свёрнутая сыворотка и др.). По консистенции питательные среды делят на плотные, полужидкие и жидкие: 1. Жидкие среды готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов. Жидкие среды лучше обогащать кислородом, в них легче изучать влияние на культуру различных факторов, определить бактериальную или мицелиальную массу, образование веществ и побочных продуктов. Жидкие среды используют для накопления биомассы микроорганизмов, выделения продуктов микробного синтеза, их составом проще варьировать. 2. Полужидкие среды готовят путем добавления к жидким средам различных уплотнителей (агар-агар, желатина) до получения желеобразной консистенции. Обычно добавляют 0,15-0,4% агара. Примером таких сред служит полужидкий агар, полужидкая среда МРС-2 и др. Мясо-пептонную желатину (МПЖ) готовят путем добавления в МПБ 10-15% желатины. Полужидкие среды разливают в пробирки и культуры сеют уколом в среду. Полужидкие среды используют для длительного хранения микроорганизмов, опреде- ления подвижности бактерий, способности бактерий разжижать желатину (важный дифференцирующий признак) и др. 3. Плотные (агаризованные, твердые) среды готовят, прибавляя к исходным ингредиентам различные уплотнители (агар-агар, желатина, силикагель, карбоксиметилцеллюлоза и др.). Обычно добавляют 2-3% агар-агара. Плотные среды в пробирках, колбах, матрацах и других емкостях можно переносить, не опасаясь замочить ватные пробки или повредить структуру (например, плёнку гриба или некоторых бактериальных культур), которая иногда только одна показательна для исследования. На плотных средах легче проводить микроскопическое изучение культур, легче выявить загрязнение культуры посторонней микрофлорой и выделить чистую культуру из отдельных колоний. Поскольку плотные среды получают главным образом включением в их состав агара, то вместе с ним могут быть внесены в качестве примесей различные катионы, питательные вещества и ростовые факторы в количестве, достаточном для проявления роста некоторых культур. По целевому назначению различают общеупотребительные (основные) и специальные (обогащенные) среды. Специальные среды, в свою очередь, делятся на дифференциально-диагностические, элективные (избирательные), накопительные (среды обогащения, насыщения), ингибиторные, селективные, индикаторные, среды для консервирования. 1. Общеупотребительные питательные среды применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов. В качестве исходных компонентов для приготовления основных сред наиболее часто используют мясную воду, перевар Хоттингера, растительные гидролизаты (МПА, МПБ, МПЖ и др.). 2. Специальные среды - это среды, разработанные с учетом специфических ростовых потребностей ряда бактерий, а также ферментативной активности микроорганизмов. Многие болезнетворные бактерии плохо растут на общеупотребительных питательных средах, поэтому в общеупотребительные питательные среды добавляют кровь, сыворотку крови, углеводы и т.д. Такие среды получили название обогащенных. К ним относятся сывороточный и кровяной агары, сывороточный и кровяной бульоны, растворы углеводов. Специальные среды применяют также для первичной идентификации микроорганизмов, для подавления роста одного вида бактерий и наращивания биомассы другого вида бактерий и т.п. К специальным средам относят дифференциаль- но-диагностические, накопительные, ингибиторные, селективные, элективные, индикаторные, консервирующие. а) дифференциально-диагностические среды предназначены для выявления определенных ферментов у микроорганизмов. В состав этих сред входят основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН среды в результате расщепления субстрата. Дифференциально-диагностические - это сложные среды, на которых микроорганизмы разных видов растут по-разному в зависимости от биохимических свойств культуры. К питательным средам такого типа относят среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина и др. Например, среда Эндо позволяет отличить бактерии, сбраживающие лактозу, от бактерий, не обладающих подобным свойством. Основными компонентами этой среды являются питательный (пептонный) агар, углевод и основной фусин, обесцвеченный сульфитом (реактив Шиффа). Исходная питательная среда окрашена в розовый цвет. Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы до ацетальдегида, последний реагирует с сульфитом и развивается красная окраска соответствующих колоний. Среда Левина в качестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий и исходно окрашена в синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенные в черный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством, бесцветны. Подобные изменения окраски происходят потому, что красители присутствуют в среде не в виде самостоятельных соединений, а в виде комплексов с веществами среды. При кислой рН эти комплексы выпадают в осадок, исходные же красители в этих условиях растворимы, при щелочной рН комплексы красителей бесцветны, тогда как метиленовый синий приобретает синюю окраску. Данная среда позволяет дифференцировать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Salmonella. б) ингибиторные среды – это среды, в которые добавляют вещества, подавляющие рост какого-либо вида (рода, семейства) микроорганизма. в) элективные (избирательные) среды - это питательные среды для избирательного выделения и накопления определенных групп микроорганизмов из материалов, содержащих несколько видов бактерий. Элективные среды чрезвычайно многообразны по своему составу. В них входят компоненты, обеспечивающие преимущественный рост исходного микроорганизма и подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Такие среды применяются главным образом для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания. Элективные среды нашли широкое применение при выделении возбудителей кишечных инфекций. При добавлении малахитовой или бриллиантовой зелени, солей желчных кислот (в частности, таурохолевокислого натрия), значительных количеств хлорида натрия или лимоннокислых солей подавляется рост кишечной палочки, но рост патогенных бактерий кишечной группы не ухудшается. Для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Некоторые элективные среды готовят с добавлением антибиотиков. г) накопительные среды (среды обогащения, насыщения) – это жидкие элективные среды, которые применяют с целью увеличения количества исходного микроорганизма в смешанной популяции. На данных средах определённые группы культур растут быстрее и интенсивнее сопутствующих. При культивировании на этих средах обычно не применяют ингибиторные вещества, а, наоборот, создают благоприятные для определённого, присутствующего в смеси вида, условия. Основой сред накопления очень часто являются желчь и её соли, тетратионат натрия, различные красители, селенитовые соли, антибиотики и др. д) селективные среды предназначены для выращивания строго определённого вида микроорганизма. Для других они неблагоприятны или недостаточно благоприятны. Эти среды служат для выделения бактерий из смешанных популяций и дифференцирования их от сходных видов. В их состав добавляют различные вещества, подавляющие рост одних видов и не влияющие на рост других. Среду можно сделать селективной за счёт величины рН. Примерами являются среда Сабуро для культивирования дрожжей с низким рН, а также среды с рН от 8 до 9 для выделения гнилостной микрофлоры. В последнее время в качестве веществ, придающих средам селективный характер, применяют антибиотики и другие химиотерапевтические вещества. е) индикаторные среды предназначены для санитарно-микробиологического контроля объектов внешней среды, обнаружения определенного вида микроорганизма в материалах после стерилизации, проведения бактериологического контроля качества дез- инфекции, выделения посторонней микрофлоры из биопрепаратов и т.д. Данные среды cодержат какое-либо вещество, ферментируемое определенной группой микроорганизмов, а также субстрат для обнаружения продуктов ферментации (индикатор), по изменению цвета которого судят о расщеплении субстрата. Примером такой среды служит, например, среда Кода для выделения эшерихий с объектов внешней среды. ж) консервирующие (поддерживающие) среды, как правило, служат для первичного посева исследуемого материала. Данные среды содержат вещества, препятствующие размножение любых видов микроорганизмов. Обычно, консервирующие среды – это «бедные» по питательности среды, которые только поддерживают жизнедеятельность микроорганизмов. з) транспортные среды применяются для перевозки микроорганизмов и патматериала. Отсутствие в транспортных средах источника азота угнетает размножение бактерий, а высокое содержание углеводородов обеспечивает источник энергии и более длительное переживание микроорганизмов. Контроль анаэробных условий обеспечивается путем внесения в среду метиленового синего (среда бесцветна при отсутствии кислорода и окрашена в синий цвет в его присутствии). В настоящее время широко используются различные коллекторы с транспортными средами. - коллектор транспортный со средой Стюарт применяется для транспортировки широкого спектра патогенных микроорганизмов (энтеробактерии, псевдоманады, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphteriae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae), а также патматериала. - коллектор транспортный со средой Кери Блейр представляет собой модификацию транспортной среды Стюарта, в которой глицерофосфат, являющийся метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae и др.), заменен неорганическим фосфатом, удален метиленовый синий, и рН среды поднята до 8,4. Среда Кери Блейр специально предназначена для консервации фекальных образцов (энтеробактерий) и анаэробов. Среда Кери Блейра позволяет поддерживать патогенную микрофлору от 48 часов до нескольких дней. - коллектор транспортный со средой Эймс (без активированного угля) - модификация транспортной среды Стюарта. Среда Эймс позволяет поддерживать Escherichia coli, Klebsiella pneu- moniae и другие энтеробактерии, Haemophilus, Corynebacteria, Streptococcus и др. более 72 часов. - коллектор транспортный со средой Эймс (с активированным углем) - позволяет поддерживать патогенную микрофлору в патматериале более 72 часов. - коллектор транспортный со средой для хламидий предназначена для поддержания жизнеспособности хламидий, свободна от азота, содержит глутамат и 1% бычьего сывороточного альбумина. Среда приготовлена на основе буферного солевого раствора с рН 7,0. В ее состав входят также антибиотики, которые ингибируют рост бактерий и грибов. Эта среда может также использоваться для транспортировки риккетсий и микоплазм. По масштабам использования питательные среды подразделяют: 1. Производственные (технологические) среды применяются в микробиологической промышленности для крупномасштабного культивирования микроорганизмов в биореакторах с целью получения различных биопрепаратов. Такие среды готовят на основе сырья растительного или животного происхождения. 2. Лабораторные среды – это среды с ограниченным по объему применением, используемые для выделения и идентификации микроорганизмов, для постановки диагноза, для научных исследований. Чаще всего с этой целью применяют полусинтетические и синтетические питательные среды. Приведенная выше классификация питательных сред во многих случаях условна и не всегда строго обоснована. 8. Техника изготовления питательных сред Существует много питательных сред для культивирования различных микроорганизмов и с каждым годом разрабатываются новые наиболее эффективные среды. По способу приготовления многие питательные среды сходны. Очень часто для приготовления среды необходимо взять все вещества, которые должны входить в ее состав согласно инструкции (прописи), смешать в определенной последовательности и концентрации, простерилизовать. Многие среды выпускаются уже готовыми к использованию (коммерческие питательные среды). Есть сухие питательные сре- ды, которые согласно инструкции необходимо растворить (чаще в дистиллированной воде) и простерилизовать (рис. 8). Рис. 8. Взвешивание сухой питательной среды на электронных весах Для стерилизации сред чаще используют автоклавы с давлением в камере 115 атм (рис. 9). а) б) Рис. 9. Автоклавы марки ВК-75 (а) и ГК-100 (б) Питательные среды готовят в посуде из инертного материала. Необходимо тщательно промывать посуду водой и обязательно проверить её на нейтральность. Следует строго соблюдать порядок внесения ингредиентов и время их внесения, в соответствии с инструкциями и прописью. В противном случае могут выпасть осадки. Устанавливая рН среды, необходимо вносить в нее щелочи или кислоты, не допуская перещелачивания или закисления. Внесение избыточной кислоты ухудшает качество среды, внесение избыточной щелочи может послужить причиной образования осадков после стерилизации. При установлении реакции среды подщелачиванием едким натрием, рН после стерилизации падает на 0,2, а при приготовлении сред с настоем печени, витамин-В-комплексом - снижается на 0,2-0,4. Поэтому при изготовлении питательной среды устанавливают рН на 0,2-0,4 выше заданного, кипятят, пока оно не понизиться на 0,2, снова проверяют рН, исправляют в случае необходимости и подвергают стерилизации в автоклаве. Обязательно проверяют рН в готовой среде после стерилизации при температуре 25°С. Таблица 3. Индикаторы, используемые для определения рН буферным методом Индикатор Интервал рН перехода окраски Цвет в кислой среде Тимолблау 1,2-2,8 Красный Бромфенолблау 3,9-5,6 Желтый Цвет в щелочной среде Рецепт Желтый 0,1 г +2,15 мл 0,1N NaOH + до 250 мл воды Фиоле- 0,1 г + 1,5 мл товый 0,1N NaOH до 250 мл воды Концентрация р-ра индикатора, % 0,04 0,04 Метилрот 4,4-6,0 Красный Бромтимолблау 6,0-7,6 Желтый Нейтральрот 6,8-8,0 Красный Фенолрот 6,8-8,4 Желтый Тимолблау 8,0-9,6 Желтый Фенолфталеин 8,3-10,0 Бесцветн. Тимолфталеин 9,3-10,5 Бесцветн. Желтый 1). 0,1 г+ 3,7 мл 0,1N NaOH + до 500 мл воды 2). 0,1 г + 300 мл спирта + 200 мл воды Синий 0,1 г+ 1,6 мл 0,1N NaOH + до 250 мл воды Желтый 0,1 г + 500 мл спирта + 500 мл воды Красный 0,1 г + 2,85 мл 0,1N NaOH + до 500 мл воды Синий 0,1 г + 2,15 мл 0,1N NaOH + до 250 мл воды Розовый 0,1 г+ 100 мл спирта + 100 мл воды Синий 0,1 г+ 125 мл спирта + 125 мл воды 0,02 0,04 0,01 0,02 0,04 0,05 0,04 Если в состав среды входит глюкоза или другой сахар, имеющий рН 7,9-8,1, то для избежания гидролиза углевода (карамелизации) растворы сахаров стерилизуют отдельно и вносят в среду непосредственно перед посевом. рН-метр ИТ-1101 рН-метр-иономер И-500 Рис. 10. РН-метры После стерилизации питательные среды оставляют для охлаждения при комнатной температуре. При необходимости розлива в чашки Петри среды охлаждают до температуры (50-60)°С. Температура сред, хранящихся в холодильнике, перед посевом микроорганизмов должна быть доведена до комнатной. В производственных условиях контроль качества готовых питательных сред проводится на стерильность и ростовые свойства. Для определения ростовых свойств приготовленной питательной среды используют тест-культуру сибиреязвенного вакцинного штамма, который доводят до концентрации 1000 микробных клеток в 1 мл по стандарту мутности или в камере Горяева. В пробирку со свежеприготовленной питательной средой вносят 0,1 мл сибиреязвенного штамма и помещают в термостат на сутки. Затем берут 5 чашек Петри с МПА, в каждую из которых вносят по 0,1 мл суточной культуры сибиреязвенного штамма, растирают штапелем и ставят в термостат. Через сутки культивирования подсчитывают типичные колонии сибиреязвенного штамма – округлой формы (S-форма), диаметром 5-6 мм, с ровными краями и блестящей поверхностью. В каждой чашке Петри должно вырасти не менее 60 колоний тест-культуры сибиреязвенного вакцинного штамма. Только в этом случае питательная среда считается кондиционной (годной к применению). 9. Приготовление полуфабрикатов питательных сред Основой питательных сред чаще всего являются гидролизаты, автолизаты и экстракты. Приготовление основных компонентов питательных сред: 1. Гидролизаты получают путем химического (щелочной и кислотный) и ферментативного гидролиза сырья растительного и животного происхождения. Для кислотного гидролиза используют, в основном, соляную кислоту, для щелочного – едкий натр, для ферментативного - пепсин (свиные желудки), трипсин (поджелудочная железа свиней, крупного рогатого скота или приплода, внутренности рыб), дрожжевые протеазы, папаин, протеазу плесневых грибов. Степень гидролиза зависит от вида белка, аминокислотного состава белка, от вида фермента, количества воды, от условий перемешивания. При химическом гидролизе происходит разрушение углеводов и гидролизаты окрашиваются в темный цвет (карамелизация), поэтому, такие гидролизаты необходимо осветлять. Гидролизные полуфабрикаты. В настоящее время питательные среды на основе гидролизатов, как достаточно эффективные и экономичные, широко используют в микробиологической практике. Из этой группы наиболее известен перевар Хоттингера - пептический гидролизат, полученный с помощью ферментативного гидролиза. В качестве субстратов для гидролизата применяют кроме мяса и кровяных сгустков казеин, причем гидролизат в зависимости от степени расщепления дифференцируют по номерам (№ 1-5), желатин, рыбу, китовую муку, криль и т.д. Сам процесс гидролиза осуществляется ферментативным путем (пепсин, трипсин и пептидазы, чаще в виде панкреатина, свежей или консервированной поджелудочной железы, протеазы рыб, дрожжей, плесневых грибов) или химическим (кислотным) способом. Коммерческие общеупотребительные сухие питательные среды сконструированы на основе тех или иных гидролизатов. Перевар из кровяных сгустков. Сгустки промывают, взвешивают, берут тройное количество воды, вносят в нее сгустки крови и кипятят 30 минут, помешивая. Затем сгустки вынимают, измельчают, объем жидкости дополняют дистиллированной водой до исходного, далее на 1 кг сгустков добавляют 3 литра отвара, доводят рН до 8,0-8,2, охлаждают смесь до 38-40°С, вносят фарш поджелудочной железы или панкреатин и потом все операции проводят по схеме изготовления перевара Хоттингера из мяса. Перевар из кровяных сгустков отличается высокой питательностью и бу-ферностью. Кислотный гидролизат казеина используют в качестве основы многих видов как промышленных, так и лабораторных питательных сред. Смешивают 1,2 литра НСl (удельный вес 1,19), 600 мл дистиллированной воды, 1200 г сухого казеина, помещают в бутыль, закрывают ватно-марлевой пробкой с бумажным колпачком, прогревают в автоклаве 3 часа при 1,5 атм. Образовавшуюся густую черную массу разводят дистиллированной водой до объема 10 литров, фильтруют, добавляют к фильтрату 40%-ный раствор едкого натра до рН 4,5-4,7, затем вновь добавляют дистиллированную воду до 15 литров, 2% активированного угля, автоклавируют при 110°С 10 мин., фильтруют, вносят 0,5% хлороформа, хранят при 5-8°С. Основной пептон Мартена. Свиные желудки освобождают от жира, пленок, не промывая, режут на куски и пропускают через мясорубку. К 1 кг фарша добавляют 5 литров воды с температурой 50°С, 50 мл концентрированной НСl. Смесь перемешивают, наливают в бутыль и выдерживают при 45-48°С в течение 24 часов, периодически встряхивают. Надосадочный слой осторожно сливают, прогревают при 80°С в течение 10 мин, затем стерилизуют текучим паром 30 мин. Использовать пептон можно через 5 суток. Хранят в прохладном месте. Триптический перевар Хоттингера. Говядину освобождают от жира, сухожилий, костей, мелко рубят, смешивают с водой из расчета 1 кг мяса на 1 литр воды. Смесь кипятят 15-20 мин, затем мясо пропускают через мясорубку, фарш смешивают с бульоном и смесью заполняют на 2/3 бутыли. Устанавливают рН смеси 20%ным раствором бикарбоната натрия на уровне 7,8-8,0, вносят фарш поджелудочной железы из расчета 100 г на 1 литр смеси или панкреатин в количестве 0,5% или более. Поджелудочную железу предварительно очищают от жира, соединительной ткани и дважды пропускают через мясорубку. Через 1-2 часа после внесения фарша поджелудочной железы (поджелудочную железу можно использовать свежую, замороженную или соленую) или панкреатина проверяют рН и корректируют его на уровне 7,4-7,6. Содержимое бутыли перемешивают, вносят на 1 литр смеси 10-30 мл хлороформа, бутыль перемешивают каждые 15-20 мин, затем через 2-3 часа, далее по нескольку раз в день, удаляя на этот период пробку. Бутыль выдерживают в термостате при температуре 46-48°С в течение 4-5 суток. О завершении переваривания свидетельствует: - образование на дне бутылки пылевидного осадка; - жидкость над осадком имеет соломенно-желтый цвет; - перевар легко фильтруется; - реакция на триптофан положительная. Из бутыли берут 3-4 мл перевара, фильтруют, добавляют 3-4 капли бромной воды (приготовление бромной воды: к 100 мл дистиллированной воды добавляют 3-3,5 мл чистого брома). На наличие триптофана указывает розово-фиолетовая окраска жидкости. Гидролизат фильтруют и в фильтрате определяют азот по Кьельдалю. Основной гидролизат обычно содержит 500-800 мг% азота. На рис. 11 представлен один из вариантов приготовления перевара Хоттингера. Мясо крупного рогатого скота средней упитанности освобождают от жира, фасций, сухожилий и перемалывают на мясорубке В соотношении 1:1,5 в воду, подогретую в биореакторе до температуры 60-65°С, добавляют мясной фарш при постоянно включенной мешалке (на 1 кг мясного фарша 1,5 л воды) В полученную смесь добавляют двууглекислый натр и снижают температуру до +45°С. Фарш поджелудочной железы из расчета 300 - 400 г на 1 кг мясного фарша В качестве консервирующего средства в смесь добавляют хлороформ в концентрации 1-2% Гидролиз мяса в течение 5-6 суток при температуре 42°С. После окончания гидролиза перевар подкисляют HCl до рН 4,5-4,7 Перевар фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, разливают в бутылки и стерилизуют 30 минут при давлении 1 атм (120°С) Контроль качества (стерильность, аминный азот) Рис. 11. Приготовление перевара Хоттингера 2. Экстракты – это концентрированные вещества, получаемые путем экстрагирования (извлечения) определенных компонентов из раствора с помощью растворителей, не смешивающихся с этим раствором, но в которых компоненты растворяется лучше, чем в первом растворителе (воде). Экстракты получают из сырья растительного или животного происхождения (дрожжи, печень, сердце, очищенное растительное зерно, зернобобовые, морковь, свекла, картофель и др.). Например, экстракт кормовых дрожжей получают путем экстрагирования из дрожжей водорастворимых витаминов группы В, аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований. Для этого 1 кг прессованных дрожжей разводят в 1 л воды, смесь кипятят 1 ч, трижды отфильтровывают через бумажный фильтр и стерилизуют при 115°С 30 мин. Применяют в составе питательных сред в концентрации 0,2-0,5% к объему среды. 3. Автолизаты – это продукты саморастворения живых клеток и тканей под действием их собственных гидролитических ферментов, разрушающих структурные молекулы. Автолиз микроорганизмов происходит при старении микробной культуры или повреждении клеток различными агентами. Автолизаты применяют в качестве источника органического азота (автолизаты из дрожжей). Автолизат дрожжей. В 1000 мл дистиллированной воды суспендируют 200 г пивных дрожжей, после оседания дрожжей добавляют 2 г одноосновного фосфорнокислого натрия. При помощи 1N NaOH устанавливают рН 6,1, вносят 5 мл хлороформа, смесь выдерживают при 37°С в течение 48 часов, доводят рН до 7,4, кипятят 30 минут, фильтруют через бумагу, стерилизуют. Используют вместо мясной воды. Рис. 12. Автолизат кормовых дрожжей (АКД) Мясная вода. Основой мясо-пеп-тонного питательного бульона и агара является мясная вода, которую готовят следующим образом. Мясо (говядина, оленина) освобождают от жира, фасций, костей, пропускают через мясорубку, к 1 кг фарша добавляют 2 литра дистиллированной воды, кипятят 1 час, отстаивают, фильтруют через полотно или бумагу, доливают водой до исходного объема, разливают по емкостям и стерилизуют 30-40 минут при 120°С. После стерилизации в сосудах образуется осадок, который перед использованием мясной воды удаляют фильтрацией. Печеночная вода. Печень освобождают от фасций, жира, готовят фарш, смешивают его 1:2 с водой и кипятят 30 минут при помешивании, отстаивают, жидкость сливают, дополняют водой до первоначального объема и фильтруют через бумагу. Фильтрат разливают по емкостям, стерилизуют 30-40 минут при 120°С. Растительные гидролизаты. В США широко используют питательный бульон и агар на основе гидролизата сои. В РФ применяют горохово-гидролизатные среды по Бучневу, гидролизаты дрожжей. Основной гидролизат по Бучневу готовят следующим образом. Используют гороховую муку крупного помола, которую замачивают водой с температурой 10-12° С и рН 7,8-8,0 (устанавливают при помощи 1N раствора NaOH) из расчета 60 г муки на 1000 мл воды и 2,5 г натрия хлорида. Экстрагирование проводят в кислото-щелочеустойчивых бутылях в течение 24 часов. В первые 89 часов оседающую муку перемешивают, далее через 15-16 часов после оседания взвеси сифоном осторожно сливают надосадочную жидкость (гороховый настой) и подвергают ее обработке пепсином, а затем панкреатином. Гидролиз горохового настоя пепсином. Настой нагревают до 50°, устанавливают при помощи 1N HCl рН 2,0 и вносят пепсин до конечной концентрации 0,15%; выдерживают смесь 22-24 часа при 37-38°С и в течение этого времени дважды перемешивают. Гидролиз панкреатином. Обработанный пепсином гороховый настой подщелачивают 1N NaOH до рН 8,2, добавляют панкреатин до 0,1%, выдерживают 3,5 часа при 47-50°С, периодически перемешивая. Осветление гидролизата. Сразу после обработки панкреатином гидролизат подкисляют до рН 5,0-5,2 при помощи 1N HCl, ки- пятят 15 минут, отстаивают 20-25 минут, надосадочную жидкость сливают сифоном и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Фильтрат подщелачивают 1N NaOH до рН 7,8, кипятят 15 минут, вновь фильтруют и стерилизуют 30 минут при 0,8-1 атм. Гороховый гидролизат используют в качестве основы для приготовления горохово-гидролизатного бульона (0,25% пептона) или аналогичного по составу горохово-гидролизатного плотного или полужидкого агаров, которые можно обогащать глюкозой (0,5%), азотнокислым аммонием (0,5%). Приготовление агара. Агар необходимо приготовить так, как указано в инструкции. Определенную навеску порошка среды суспендируют в 1 л дистиллированной воды, тщательно перемешивая. Суспензию нагревают, часто перемешивая, и кипятят в течение 1 мин до полного растворения порошка. Варят агар или в колбах или в специальных аппаратах-средоварках (рис. 13). Рис. 13. Аппарат - средоварка MediaClave Автоклавируют агар при температуре 121oС в течение 15 мин. После автоклавирования агар охлаждают до температуры 4550oС на водяной бане, затем вносят необходимые добавки, например, кровь, и тщательно перемешивают. Приготовленный агар разливают в стерильные чашки Петри на ровном, строго горизонтальном рабочем столе. На чашку диаметром 100 мм расходуется 25 мл агара, диаметром 90 мм – 20 мл, чтобы толщина среды в чашке была 4,0 ± 0,5 мм. Агар застывает при комнатной температуре. Чашки с застывшим агаром подсушивают с приоткрытыми крышками в термостате при температуре 35oС в течение 10-30 мин, чтобы удалить избыток конденсата. Рис. 14. Модуль автоматический, разливочный для чашек Петри ADD-Mini SS Petri (500 чашек в час) Модуль автоматический, разливочный предназначен для автоматического наполнения чашек Петри готовой питательной средой. Рис. 15. Автоматическая система приготовления и розлива питательных сред S8000 При получении скошенного агара, его разливают по 5 мл в пробирки, закрывают ватно-марлевыми пробками и помещают на приспособление для скашивания. Рис. 16. Рост бактерий на МПА в чашках Петри и в пробирках на скошенном агаре Хранят приготовленные чашки и пробирки с агаром в холодильнике при температуре 2-8оС в течение 10-15 дней. Перед ис- пользованием хранившихся чашек и пробирок с агаром необходио убедиться, что поверхность агара сухая. Для этой цели их предварительно нагревают до комнатной температуры. Стерильность приготовленного агара в чашках Петри и пробирках проверяется путем их инкубации в термостате при температуре 30-35оС в течение 24 ч или более. В условиях рутинной работы лаборатории допустимо не контролировать рН приготовленного агара. 10. Уплотнители питательных сред Плотные и полужидкие питательные среды готовят на основе жидких питательных сред путем добавления к ним уплотнителей. Агар-агар — полисахарид, является наиболее распространенным уплотнителем. Его экстрагируют из некоторых морских водорослей. Агар-агар содержит агарозу, агаропектин и различные примеси. Для целей культивирования бактерий пригоден агарагар квалификации «бактериологический», «очищенный» и «специальный». Обычно агар добавляют к средам в количестве 2-3% (плотные среды) или 0,15-0,4% (полужидкие среды). Для выращивания некоторых бактерий более подходят среды с 1,5% агара (влажные или мягкие среды). Растворять агар перед автоклавированием в среде желательно в водяной бане, так как нередко при нагревании на открытом пламени агар пригорает и карамелизуется. Готовые агаровые среды разливают в пробирки и чашки Петри. Желатина — белок из хрящей, кожи, костей животных. Малопригоден в качестве уплотнителя сред, так как плавится при 2326°С, т.е. переходит в жидкое состояние при температурах, которые необходимы для культивирования большинства патогенных бактерий, кроме того, расщепляется протеолитическими ферментами многих бактерий. Используется для приготовления полужидких питательных сред, например, мясо-пептонной желатины. Достаточно известен как уплотнитель сред силикагель (кремнекислый гель), но его используют в основном при конструировании синтетических сред, культивировании автотрофных бактерий, определении потребности бактерий в источниках углерода, витаминах. Рекомендуется следующая процедура приготовления сред с силикагелем. Готовят раствор силиката калия: к 100 мл 7%-ного КОН добавляют 10 г силикагеля или кремниевой кислоты, нагревают до растворения компонентов, стерилизуют в автоклаве, смешивают 20 мл стерильной питательной среды двойной концентрации с 20 мл раствора силиката и вносят 20%-ный раствор о-фосфорной кислоты в количестве, необходимом для установления рН 7,0 (доза фосфорной кислоты определяется в предварительных опытах). Смесь сразу разливают в чашки Петри. 11. Фильтрование и осветление питательных сред Жидкие питательные среды пропускают через двойной ребристый фильтр из фильтровальной бумаги (предварительно смачивают водой) или фильтровальное полотно. Агаровые среды в расплавленном состоянии фильтруют через ватно-марлевый фильтр из гигроскопичной ваты. Желатиновые среды фильтруют через бумажный, смоченный горячей дистиллированной водой, фильтр. Осветление агара проводят добавлением сыворотки крови или яичного белка. На 1-2 литра агара с температурой 50°С вносят белок одного куриного яйца, предварительно размешанный 1:2 в холодной воде или 25-50 мл сыворотки крови, затем среду тщательно перемешивают и кипятят 10-15 минут. Сформировавшийся осадок отделяют фильтрованием, прозрачную среду разливают по пробиркам и колбам. Прозрачный агар можно получить, оставляя сваренную на текучем пару (1 час) среду в теплом месте до застывания. Нижнюю часть среды с осадком удаляют, прозрачный слой измельчают, расплавляют текучим паром (1-1,5 часа), корректируют рН, фильтруют. Нежелательно подщелачивать готовый агар, так как после стерилизации может вновь выпасть осадок. Необходимо учитывать, что многократное кипячение и автоклавирование снижает уплотняющие свойства агара. 12. Рецептуры питательных сред и растворов, применяемых в бактериологических лабораториях при диагностике инфекционных болезней животных В условиях бактериологических лабораторий используются коммерческие питательные среды, а также среды и растворы, приготавливаемые непосредственно в лаборатории по мере необходимости. Консерванты Глицериновый Состав: - натрия хлорид (NаСl) 0,85 %-ный раствор — 1000 мл; - глицерин нейтральный — 500 мл; - натрия гидрофосфат, безводный (Na2HPO4) 20 %-ный раствор — 150 мл. Приготовление. Смешивают первые два ингредиента и добавляют раствор гидрофосфата натрия в таком количестве, чтобы довести рН до 7,8-8,0, затем разливают в пробирки или флаконы по 10 мл, стерилизуют в автоклаве при 1120 С в течение 15 мин или текучим паром 3 дня подряд. После стерилизации доводят рН до 7,6-7,8. Фосфатно-буферный Состав: - калия дигидрофосфат (КН2РО4) — 0,45 г; - натрия гидрофосфат, безводный (NaHPO4) — 5,34 г; - вода дистиллированная — 1000 мл. Приготовление. Ингредиенты смешивают, разливают по 10 мл в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве 30 мин при 1210 С. Буферный глицерино-солевой Состав: - натрия хлорид (NaCl) — 4,2 г; - калия гидрофосфат (К2НРО4) — 3,1 г; - калия дигидрофосфат (КН2РО4) — 1,0 г; - глицерин нейтральный — 300 мл; - вода дистиллированная — 700 мл. Приготовление. Ингредиенты растворяют, перемешивают, смесь разливают в стерильные пробирки по 5 мл и автоклавируют 30 мин при 1120 С. Целесообразно для контроля качества хранения раствор слабо подкрашивать феноловым красным. Изотонический раствор хлорида натрия (физиологический раствор) Состав: - натрия хлорид (NaCl) — 8,5 г; - вода дистиллированная — 1000 мл. Приготовление. Соль растворяют при подогревании, фильтруют, разливают в пробирки по 5-7 мл, стерилизуют 30 мин при 121° С. Полужидкий голодный агар (ПГА) (для хранения и пересылки культур) Состав: - бульон питательный, содержащий 0,6-0,9 % общего азота (рН 7,2-7,4) — 1000 мл; - агар — 2-4 г. Приготовление. Агар расплавляют в горячем бульоне, фильтруют, разливают по 8-10 мл в пробирки или в мелкие ампулы, стерилизуют при 1210С. Применение: культуру засевают 1-2 уколами в толщу среды, помещают в термостат и после 18-20 часов выращивания выросшие культуры оставляют для хранения. Ватные пробирки в пробках заливают парафином или заменяют на стерильные корковые, ампулы запаивают. Штаммы хранят при 4-60С, пересевают через 2-3 месяца. Транспортная среда (для забора и хранения патматериала) Состав: - калия гидрофосфат (К2НРО4) - калия дигидрофосфат (КН2РО4) - сахароза - вода дистиллированная — 2,088 г; —1,088 г; — 48,46 г; — 1000 мл. Приготовление. РН приготовленной среды доводится до 7,0, разливается в пробирки или колбы и автоклавируется при 115°С 15 мин. Хранить при 4°С до применения 1-2 мес. Среды обогащения и накопления Селенитовая среда (для накопления сальмонелл) Состав: - натрия гидроселенит (NaHSeO3) без примеси теллура — 14 г; - пептон — 15 г; - натрия гидрофосфат, безводный (NaHPO4) — 7 г; - натрия дигидрофосфат, безводный (NаH2PO4) — 3 г; - лактоза — 4 г; вода дистиллированная — 1000 мл. Приготовление. Среды готовят из двух основных растворов: Раствор № 1. Определяют пропорцию Na2HPО4 и NaH2PO4 с используемым образцом пептона и гидроселенита натрия для установления рН в пределах 6,9-7,1, для чего регулируют соотношение фосфатов. После установления соотношения фосфатов, к раствору № 1 добавляют пептон и лактозу. Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром два дня по 30 мин. Количество фосфатов в рецепте среды дано в расчете на безводные препараты. При отсутствии таковых, заранее заготовленные навески «выветривают» в термостате в течение 15-16 суток. Раствор № 2. Раствор гидроселенита натрия 10 %-ный готовят на стерильной дистиллированной воде перед употреблением. Перед началом работы в каждый флакон с 50 мл основного раствора (раствор № 1) добавляют 2 мл раствора гидроселенита натрия (раствор № 2), асептически разливают по 5—7 мл в стерильные пробирки и закрывают плотно пробками. Дальнейшая стерилизация не нужна. Основной раствор для приготовления селенитовой среды можно хранить в холодильнике 1-2 месяца. Для приготовления среды следует использовать высококачественный пептон («Рихтер», «Опофа» или жидкий аминопептид - отечественный заменитель импортного пептона). Желчный бульон (среда обогащения для сальмонелл) Состав: - мясо-пептонный бульон — 800 мл; - желчь крупного рогатого скота — 200 мл. Приготовление. Желчь крупного рогатого скота наливают в колбу и нагревают 1 ч текучим паром. После отстаивания фильтруют через ватномарлевый фильтр и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. К 800 мл МПБ добавляют 200 мл желчи, разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. Среда Мюллера (для накопления сальмонелл) Состав: - химически чистый мел (СаСО3) — 4,5 г; - мясо-пептонный бульон — 90 мл; - раствор Люголя — 2 мл; - раствор тиосульфата натрия — 10 мл. Приготовление. К 4,5 г простерилизованного сухим жаром химически чистого мела (СаСО3) добавляют 90 мл МПБ или бульона Хоттингера и стерилизуют 30 мин при 1210С. Перед посевом к бульону с мелом асептически добавляют 2 мл раствора Люголя (иодид калия – 25 г, йод кристаллический – 20 г, вода дистиллированная - до 100 мл) и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия – 50 г, вода дистиллированная - до 100 мл). Смесь перемешивают и разливают по пробиркам. Среда Кауфмана (для накопления сальмонелл) Состав: - среда Мюллера — 100 мл; - желчь — 5 мл; - 0,1%-ный водный раствор бриллиантового зеленого — 5 мл. Приготовление. К 100 мл стерильной среды Мюллера асептически добавляют 5 мл стерильной желчи (желчь стерилизуют дробно, текучим паром 3 дня подряд по 20 мин) и 5 мл 0,1%-ного водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают по пробиркам. Не стерилизуют. Магниевая среда (для накопления сальмонелл) Состав: - пептон — 4,2 г; - хлорид натрия — 7,15 г; - хлорид магния (MgCl2·6H2O) — 35,7 г; - дигидрофосфат калия (КН2РО4) — 1,43 г; - дрожжевой диализат — 9 мл; - 0,5%-ный водный раствор бриллиантового зеленого — 0,9 мл; - дистиллированная вода — 980 мл; Приготовление. Готовят 2 раствора. Раствор 1) К 890 мл дистиллированной воды добавляют 4,2 г пептона, 7,15 г хлорида натрия, 1,43 г дигидрофосфата калия (КН2РО4) и 9 мл дрожжевого диализата. Раствор 2) В 90 мл дистиллированной воды растворяют 35,7 г хлорида магния (MgCl2· 6H2O). Оба раствора смешивают и добавляют 0,9 мл 0,5 %-го водного раствора бриллиантового зеленого. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 1120 С. Среда ЭТ-1 (для накопления сальмонелл и эдвардсиелл) Состав: - мясо-пептонный бульон - глюкоза - 5%-ный спиртовой раствор розоловой кислоты — 1000 мл; — 2 г; — 2 мл; Приготовление. К 1000 мл МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,4-7,6) добавляют 2 г глюкозы и 2 мл 5%-го спиртового раствора розоловой кислоты. Смесь кипятят на водяной бане 15-20 мин, добавляют 25000ЕД полимиксина и асептически разливают по пробиркам. Для приготовления 5%-го спиртового раствора розоловой кислоты 0,5 г розоловой кислоты растворяют в 10 мл спирта-ректификата, после чего добавляют 90 мл дистиллированной воды. Среда Минка (для накопления эшерихий, обладающих адгезивными антигенами) Приготовление. Готовят 5 растворов. Раствор 1) - фосфатный буферный раствор (рН 7,5). Берут 1,36 г калия фосфорнокислого однозамещенного (КН2РО4), 10,1 г натрия фосфорнокислого двузамещенного (NaHPO4· 7H2O) и растворяют в дистиллированной воде до конечного объема 1000 мл. Стерилизуют 30 мин при 1150С. Раствор 2) 10 г сульфата магния (MgSO4·7H2O); 1 г хлорида марганца (MnCl2·4H2O); 0,135 г хлорного железа (FeCl3·6H2O) и 0,4 г хлорида кальция (CaCl2·H2O) растворяют в дистиллированной воде до объема 1000 мл. Стерилизуют 30 мин при 1150С. Раствор 3) 5 мл гидролизата лактальбумина (или казеиноводрожжевого гидролизата) растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. Раствор 4) 5 г глюкозы растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. Раствор 5) 26 г агара «Дифко» растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Стерилизуют 30 мин при 1150С. Полученные растворы асептически соединяют в следующем соотношении: раствор 1 – 500 мл; раствор 2 – 1 мл; раствор 3 – 20 мл при 500С; раствор 4 – 20 мл; раствор 5 – 460 мл при 500С. Все растворы стерилизуют отдельно. Готовую среду Минка не стерилизуют. Казаминовую кислоту в составе среды Минка можно заменить казаминовым дрожжевым гидролизатом (ФКДГ) или гидролизатом лактальбумина (ГЛА) в тех же соотношениях. Среда П-1 (для накопления протеев) Состав: - бульон Хотингера — 1000 мл; - маннит — 1 г; - желчные соли по Олькеницкому — 5 г; - дигидрофосфат калия (КН2РО4) — 0,8 г; - 50 %-ный водный раствор мочевины — 10 мл; - 0,01 %-ный водный раствор кристаллвиолета — 20 мл. Приготовление. В 1000 мл стерильного бульона Хотингера растворяют 1 г маннита, 5 г желчных солей по Олькеницкому, 0,8 г дигидрофосфата калия (КН2РО4), 20 мл 0,01 %-го водного раствора кристаллвиолета. Кипятят на водяной бане 15-20 мин. Добавляют 10 мл 50 %-го водного раствора мочевины и 1000000 ЕД полимиксина. Асептически разливают по пробиркам. Приготовление желчных солей по Олькеницкому. К 1000 мл бычьей (свиной) желчи добавляют 40 г NaOH и автоклавируют 3 ч при 1,5 атм. Добавляют 100 мл 20%-го раствора хлорида бария (ВаСl2·2Н2О), автоклавируют 1 ч при 1000С и оставляют на 12-18 ч при комнатной температуре. Затем сливают, промывают водой и добавляют 40%-й водный раствор NaOH (до щелочной реакции). Полученный раствор солей высушивают при 1150С. Среда К-1 (для накопления клебсиелл) Состав: - хлорид натрия — 5 г; - сульфат магния (MgSO4·7H2O) — 0,2 г; - гидрофосфат калия (К2НРО4) — 2 г; - дигидрофосфат калия (КН2РО4) — 2 г; - раффиноза — 2 г; - 1,6 %-ный щелочной раствор бромтимолового синего — 2 мл; - 0,01 %-ный водный раствор кристаллвиолета — 20 мл; - дистиллированная вода — 1000 мл. Приготовление. В 1000 мл стерильной дистиллированной воды растворяют 5 г хлорида натрия, 0,2 г сульфата магния (MgSO4·7H2O), 2 г дигидрофосфата калия (КН2РО4), 2 г гидрофосфата калия (К2НРО4), 2 г рафинозы, 2 мл 1,6 %-го щелочного раствора бромтимолового синего, 20 мл 0,01 %-го водного раствора кристаллвиолета. Кипятят 15-20 мин на водяной бане, добавляют 4 мл 50 %-го раствора мочевины и асептически разливают по пробиркам. Для приготовления 1,6%-го щелочного раствора бромтимолового синего в 80 мл дистиллированной воды растворяют 1,6 г бромтимолового синего и 20 мл 0,25 Н раствора NaOH. Бульон с 0,2% глюкозы (для интенсивного образования капсулы у клебсиелл) Состав: - мясо-пептонный бульон — 1000 мл; - глюкоза — 2 г. Приготовление. Берут 1000 мл МПБ или бульона Хоттингера (рН 7,2-7,4). В небольшом его объеме, нагретом до 40-500С, растворяют 2 г глюкозы и смешивают с оставшимся бульоном. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 1120С. Среда Ющенко - Дунаева (для накопления иерсиний) Состав: - хлорид натрия — 8,5 г; - 1/15 М раствор гидрофосфата натрия (Na2HPO4·12H2O) — 3 мл; - 1/15 М раствор дигидрофосфата калия (К2НРО4) — 7 мл; - дистиллированная вода — 990 мл. Приготовление. В 990 мл дистиллированной воды растворяют 8,5 г NaCl, добавляют 3 мл 1/15 М раствора гидрофосфата натрия (Na2HPO4·12 H2O) и 7 мл 1/15 М раствора дигидрофосфата калия (К2НРО4). Устанавливают рН 7,2, фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют 10 мин при 1160С или 30 мин текучим паром. Среды для первичной идентификации микроорганизмов Трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому (для первичной идентификации энтеробактерий) Состав: - агар питательный сухой — 25 г; - лактоза — 10 г; - сахароза — 10 г; - глюкоза — 1 г; - аммоний-железо сульфат ((FeSO4)∙(NH4)2SO4∙6H2O)) — 0,2 г; - натрий тиосульфат (Na2S2O3∙5H2O) — 0,3 г, - мочевина — 10 г; - феноловый красный (0,4 %-ный водный раствор) — 4 мл; - вода дистиллированная — 1000 мл. Приготовление. Соли предварительно растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды. Углеводы и мочевину также растворяют в небольших объемах воды при подогревании в водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в оставшемся объеме воды при нагревании и помешивании. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают рН - 7,2-7,4. Добавляют индикатор, хорошо перемешивают, разливают в пробирки по 6-7 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Скашивают, оставляя столбик 2-2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета. Агар Клиглера (для первичной идентификации энтеробактерий) Состав: - панкреатический гидролизат казеина — 20 г; - экстракт дрожжей — 6,0 г; - натрия хлорид — 5,0 г; - натрия тиосульфат — 0,3 г; - натрия метабисульфит — 0,5 г; - натрия карбонат — 0,8 г; - железа окисного цитрат — 0,3 г; - феноловый красный — 0,05 г; - агар — 11,0 г. Приготовление. 55 г коммерческой сухой среды размешивают в 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения. Кипятить нужно до полного расплавления агара (3-4 мин), затем разлить в пробирки по 6 мл, автоклавировать 30 мин при 112°С. Среду скосить так, чтобы в нижней части пробирки был столбик высотой 2,5-3,0 см. Готовая среда имеет темно-красный или бурый цвет. Среда для теста на окисление-ферментацию Среда предназначена для установки путей расщепления углеводов бактериями. У энтеробактерий расщепление углеводов происходит ферментацией, у псевдомонад – окислением. Существуют бактерии, у которых метаболизм углеводов полностью отсутствует. Состав: - пептон — 2 г; - NaCl — 5 г; - K2НРО4 — 0,3 г; - агар — 3 г; - 1 %-й водный раствор бромтимоловый синий — 3 мл; - глюкоза —10 г; - вода дистиллированная — 1000 мл. Приготовление. Все вещества, входящие в состав среды, растворяют при подогревании в водяной бане, фильтруют, разливают в пробирки по 56 мл и стерилизуют при 1180 С 10 мин (рН 7,1-7,2). Среда с KNO3 для определения редукции нитратов Cреда предназначена для подтверждения принадлежности испытуемого штамма к энтеробактериям и для дифференциации грамотрицательных бактерий от грамположительных. Под восстановлением нитратов подразумевается способность бактерий редуцировать соли азотной кислоты (нитраты (NO-3) и нитриты (NO-2)) с выделением аммиака (NO3) или свободного азота (N2). Процесс редукции нитратов энтеробактерии осуществляют с помощью фитонитратредуктазы. Состав: - калий нитрат (КNO3) - пептон — 0,2 г; — 5 г; - вода дистиллированная — 1000 мл. Приготовление. Ингридиенты смешивают, устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 1200С 15 мин. Дифференциально–диагностические среды Агар Эндо (для дифференциации энтеробактерий) Состав: - питательный агар сухой — 26,5 г; - витаминный препарат «ЭКД» — 1,22 г; - фуксин основной — 0,23 г; - сахар молочный — 10,7 г; - динатрия фосфат — 0,48 г; - сульфит натрия безводный — 0,83 г; - натрий углекислый — 0,03 г; - вода дистиллированная — 1000 мл. Приготовление. Выпускается в сухом виде. Берут 40 г. (точную навеску см. на упаковке) агара Эндо и растворяют в 1 л дистиллированной воды, кипятят до полного расплавления агара 2-3 мин, фильтруют и снова доводят до кипения. Остудить до температуры 45-50°С, разлить в стерильные чашки Петри слоем 3-4 мм, после застывания подсушить при температуре (37±1)°С в течение 40-60 минут. Готовая среда чувствительна к свету, поэтому после приготовления она не подлежит продолжительному хранению. Лучше использовать свежеприготовленную среду. Подсушивать и хранить среду следует в темном месте. Колонии лактозоположительных штаммов красные, лактозоотрицательных – бесцветные или слегка розоватые. Для подавления роения (подвижности) бактерий рода Ргоtеus, к 100 мл готовой среды Эндо добавляют 3 мл медицинской желчи. Агар Плоскирева (для дифференциации энтеробактерий) Состав: - панкреатический гидролизат кильки — 10,4 г; - натриевые соли желчных кислот — 3,46 г; - агар — 6,94±1,0 г; - сухой питательный бульон — 8,62 г; - сахар молочный — 7,3 г; - натрия гидроцитрат двузамещенный — 8,5 г; - нейтральный красный — 0,05 г; - бриллиантовый зеленый — 0,0002 г; - динатрия фосфат обезвоженный — 2,1 г; - натрий сериоватистокислый безводный — 5,1 г; - йод — 0,13 г; - сода кальцинированная — 2,4 г; - вода дистиллированная — 1000 мл. Приготовление. Выпускается в сухом виде. 55 г (точную навеску см. на упаковке) агара Плоскирева размешать в 1 л дистиллированной воды, прокипятить 2-3 мин до полного расплавления агара, разлить в не стерильные чашки Петри слоем 5-6 мм, оставить их открытыми в течение 1,5 ч при температуре 18-25 °С для застывания и подсушивания. Готовая среда прозрачная или розовато-желтого цвета. Лактозоположительные сальмонеллы образуют колонии красного цвета, лактозоотрицательные – бесцветные. Среда Левина (для дифференциации энтеробактерий) Состав: - 2%-ный агар Хоттингера —100 мл; - 0,5%-ный водный раствор метиленового синего —2 мл; - 2 %-ный раствор эозина — 1,5 мл; - лактоза — 2 г; - двуосновной фосфорнокислый калий (КН2РО4) — 0,2 г. Приготовление. К 100 мл расплавленного и охлажденного до 60-700С 2%-го агара Хоттингера (рН 7,2-7,4) добавляют 2 мл 0,5%-го водного раствора метиленового синего (подогретого на водяной бане до 60-700С), 1,5 мл 2 %-го раствора зозина, 2 г лактозы и 0,2 г двуосновного фосфорнокислого калия (КН2РО4). Перемешивают, разливают по чашкам, подсушивают. Перед добавлением в среду раствора красителей стерилизуют текучим паром 3 дня по 30 мин. Готовая среда имеет фиолетовый цвет. Колонии эшерихий синего или черного цвета, сальмонелл бесцветные или розовые, протея – оранжевые, с измененным цветом среды вокруг колонии. Висмут-сульфит агар (для дифференциации сальмонелл) Состав: - панкреатический гидролизат кильки — 16,6 г; - агар микробиологический — 16,4 г; - Д(+)- глюкозы — 4,7 г; - агароид — 7,6 г; - висмут лимоннокислый — 2,24 г; - сульфит натрия безводный — 4,28 г; - соль Мора — 1,32 г; - динатрия фосфат обезвоженный — 3,63 г; - бриллиантовый зеленый — 0,017 г; - сода кальцинированная — 0,63 г; - натрия хлорид — 2,6 г; - вода дистиллированная — 1000 мл. Приготовление. Выпускается в сухом виде. 59 г (точную навеску см. на упаковке) висмут-сульфит агара размешать в 1 л дистиллированной воды, прокипятить до полного расплавления агара 3-5 мин, взболтать, разлить в нестерильные чашки Петри слоем 4-5 мм, оставить их открытыми в течение 80100 мин при температуре 20-25оС для застывания и подсушивания среды. Готовая среда имеет зеленоватую окраску. Сальмонеллы, продуцирующие сероводород, образуют черные колонии с металлическим блеском и прокрашиванием агара под колонией в черный цвет. Сальмонеллы, не продуцирующие сероводород, образуют бесцветные или зеленовато-коричневые колонии. Среда Штерна (для дифференциации сальмонелл) Состав: - бульон Хоттингера —1000 мл; - 10 %-го насыщенного спиртового раствора основного фуксина —2,5 мл; - 10 %-го водного раствора сульфита натрия — 16,6 мл; - глицерин — 10 г. Приготовление. К 1000 мл МПБ или бульона Хоттингера добавляют 2,5 мл 10%го насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 16,6 мл 10 %-го водного раствора сульфита натрия (Na2SO4) и 10 мл глицерина. Разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при 1120 С. Готовая среда имеет желтую окраску. Если испытуемая культура относится к Salmonella typhimurium, которая способна ферментировать глицерин, то среда приобретает фиолетовый оттенок. Среда Биттера (для дифференциации сальмонелл) Состав: - трехосновной лимоннокислый натрий — 0,5 г; - пептон — 0,05 г; - хлорид натрия — 5 г; - рамноза (или арабиноза) — 5 г; - дистиллированная вода — 1000 мл. Приготовление. В 1000 мл дистиллированной воды растворяют 0,05 г пептона, 0,5 г трехосновного лимоннокислого натрия (цитрат натрия), 5 г хлорида натрия, 5 г рамнозы (или арабинозы). Кипятят на водяной бане 3-5 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Разливают по пробиркам и стерилизуют 30 мин при 112 0С или текучим паром 3 дня по 30 мин. Если испытуемая культура относится к сальмонеллам, способным ферментировать рамнозу или арабинозу (S.typhimurium), то при добавлении к суточной культуре (выращенной на данной среде) 2 капель 0,5%-го спиртового раствора метилового красного среда приобретает красную окраску. Среды с аминокислотами (для определения способности энтеробактерий в анаэробных условиях расщеплять левовращающие аминокислоты – лизин, аргинин, орнитин) Состав: - пептон — 5 г; - глюкоза — 1 г; - лизин (или аргинин, или орнитин) — 10 г; - 1,6%-ный спиртовый раствор бромкрезолового пурпурного (или бромтимолового синего) — 0,6 г; - 0,1%-ный спиртовый раствор крезолового красного — 5 мл; - дистиллированная вода — 600 мл. Приготовление. В 600 мл дистиллированной воды растворяют 5 г пептона и 1 г глюкозы, устанавливают рН 6,0-6,1. Приготовленный раствор разливают по 150 мл в четыре колбы. В каждую из трех колб вносят по 10 г одной из аминокислот. Четвертая колба остается в качестве контрольной. Содержимое всех колб кипятят на водяной бане 5-10 мин, устанавливают рН 6,0-6,1. Во все четыре колбы вносят по 0,6 мл 1,6%го спиртового раствора бромкрезолового пурпурного или бромтимолового синего и по 5 мл 0,1%-го спиртового раствора крезолового красного. Разливают в агглютинационные пробирки по 2-3 мл. Стерилизуют 30 мин при 1100С. Состав 1,6%-го спиртового раствора брокрезолового пурпурного: бромкрезоловый пурпурный – 1,6 г, спирт этиловый 960 – 100 мл. Состав 0,1%-го спиртового раствора крезолового красного: крезоловый красный – 0,1 г, спирт этиловый 960 – 100 мл. Для проведения теста в пробирки, содержащие аминокислоту, и в контрольную пробирку засевают испытуемую культуру, после чего заливают стерильным вазелиновым маслом (слоем толщиной 10 мм) и инкубируют. Учет проводят в течение 4 суток. При положительной реакции среды с аминокислотами приобретают фиолетовую или синюю (если в качестве индикатора взят бромтимоловый синий) окраску, в контрольных пробирках среда имеет желтую окраску. Среды Гисса (пестрый ряд) (для определения способности бактерий ферментировать различные углеводы) Готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.). Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО2, СН4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными – с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды. На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет. Селективные среды Среда Блаурокка (для выделения и культивирования бифидобактерий) Состав: - печеночный экстракт — 1000 мл; - агар-агар — 0,75 г: - пептон сухой — 10 г; - лактоза — 10 г; - цистин — 100 мл; - NaCl — 5 г. Приготовление. Берут 0,5 кг свежей говяжьей печени, очищают от пленок, измельчают и заливают 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение часа. Затем содержимое отстаивают и фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят дистиллированной водой до первоначального объема. В полученный печеночный экстракт добавляют растопленный агар-агар, пептон и цистин, устанавливают рН -8,1-8,2 (для подщелачивания используют 18-20%-ный раствор NaOH) и кипятят 15 мин. Затем отстаивают 30 мин и фильтруют. Фильтрат доводят дистиллированной водой до 1 л и добавляют лактозу. Среду разливают по флаконам 50-100 мл и стерилизуют 50 мин текучим паром и 30 мин при 0,5 атм. Перед употреблением среду разливают в пробирки по 10-15 мл и прогревают в водяной бане 40 мин при 1000 С. Среда МРС-2 (полужидкая) (для выделения и культивирования лактобактерий) Состав: - агар — 0,3% к объему среды; - марганец сернокислый пятиводный — 50 мг; - цистеин солянокислый — 200 мл; - магний сернокислый семиводный — 200 мг; - калий фосфорнокислый двузамешенный — 2 г; - глюкоза — 20 г; - пептон сухой ферментативный — 10 г; - твин-80 — 1 мл; - автолизат дрожжевой — 50 мл; - молоко коровье по Богданову (2:1) — 500 мл; - вода дистиллированная — 300 мл. Приготовление. 50,0 мг марганца сернокислого, 200 мл цистеина солянокислого, 200 мг магния сернокислого, 2,0 г калия фосфорнокислого двухзамещенного, 20,0 г глюкозы растворяют в 200 мл дистиллированной воды в порядке записи. Отдельно растворяют 10 г пептона в 100 мл кипящей дистиллированной воды, добавляют 1 мл твина-80. Смешивают обе части среды. Добавляют 50 мл дрожжевого автолизата, 0,5 л молока по Богданову и 0,3%-ного агар-агара. Устанавливают рН=6,2-6,6 20%-ным раствором NаОН и ледяной уксусной кислотой. Нагревают до кипения. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают в пробирки и стерилизуют 30 мин при 100° С и 20 мин при 1100 С. Кровяной агар (5 %-ный) (для выделения и культивирования гемолитических культур) Состав: - 2%-ный мясопептонный агар — 95 мл; - дефибринированная или цельная кровь — 5 мл. Приготовление. Расплавляют определенное количество 2%-ного мясопептонного стерильного агара, охлаждают его до температуры 45°С и прибавляют дефибринированную или цельную стерильно взятую кровь (к 95 мл агара добавляют 5 мл крови). Добавляют кровь при соблюдении правил стерильности. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри, дают ей застыть и подсушивают в термостате. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет. Шоколадный агар (агар с гретой кровью) (для выделения и культивирования гемофилов) Готовят шоколадный агар двумя способами: 1). К 100 мл расплавленного и охлажденного до 80°С питательного агара (рН 7,4) добавляют 10 мл дефибринированной крови лошади или человека (без консервантов), тщательно перемешивают, после чего помещают в водяную баню и, постоянно встряхивая, держат при температуре 70°С-80°С до тех пор, пока цвет агара не станет шоколадным (25-30 мин.). 2). 5 мл дефибринированной крови кролика и 100 мл питательного агара тщательно взбалтывают и ставят на 2-3 минуты в водяную баню при 80°С. Затем добавляют еще 5 мл крови и вновь ставят в водяную баню на 2-3 минуты. Шоколадный агар должен иметь светло-коричневую окраску. При слишком слабом прогреве агар будет иметь коричнево-красный цвет, при слишком сильном - темно-коричневый. Среду разливают в чашки Петри. Прогревание крови способствует освобождению из эритроцитов факторов роста Х (гемин) и V (никотинамидадениндинуклеотид), необходимых для культивирования гемофилов. Желточно-солевой агар (для выделения и культивирования стафилококков) В качестве основы используют элективный солевой агар для стафилококков. По прописи, указанной на этикетке, готовят 1,8-2% агар (рН 7,2-7,4). К расплавленному и охлажденному до 45-50°С агару, соблюдая правила асептики, добавляют 20% желточной взвеси (асептически извлеченный из яйца желток взбалтывают с 200 мл изотонического раствора хлорида натрия). Смешивают тщательно агар с желточной взвесью, разливают по 20 мл в чашки Петри. Хранят в холодильнике в течение двух недель. В таблице 4 представлены рецептуры основных и специальных питательных сред, наиболее часто применяемых в лабораторной диагностике инфекционных болезней животных. Таблица 4. Основные и специальные питательные среды для бактериологических исследований 1. Основные (общеупотребительные) питательные среды № 1 Название среды 2 Наименование ингредиента 3 Кол-во рН Режим ингре- сре- стеридиента ды лизации (г, мл) 4 5 6 1 Пептонная вода Дист. вода Пептон NaCl 1000 10 5 7,6- Автокл. 7,7 при 115о 30 мин 2 Мясопептонный бульон Мясопептонный агар Водопр.вода Мясная вода NaCl Пептон Водопр.вода Мясная вода Пептон NaCl Агар-агар 500 500 5 10 500 500 10 5 25 7,7 3 7,7 Автокл. при 115о С 30 мин Автокл. при 115о С 30 мин Примечание 7 Фильтруется через бумажный фильтр Фильтруется через бумажный фильтр Осаждается яичным белком, фильтруется через ватно-марлевый фильтр 4 Мясопеченочный агар Водопр.вода Мясная вода Печен. вода Пептон NaCl Глицерин Глюкоза Агар-агар 500 250 250 10 5 20 10 25 7,3- Автокл. 7,4 при 115о С 30 мин 5 Мясопечоночный бульон Водопр.вода Мясная вода Печен. вода Пептон NaCl Глицерин Глюкоза 500 250 250 10 5 20 10 7,3- Автокл. 7,4 при 115о С 30 мин 2 3 4 5 6 1 Среда КиттаТароцци (для анаэробов) Водопр.вода Мясная вода Печен. вода Пептон NaCl 275 275 250 10 3 8,4 Автокл. при 115о С 30 мин 7 Бульон на переваре Хотингера (100мг% ам.азота) Бульон на переваре Хотингера (200мг% ам.азота) Дрожже- Перевар Хотингера (100 мг% ам.аз.) NaCl 7,88,0 Автокл. при 115о С 30 мин 7,67,8 Автокл. при 115о С 30 мин 7,4- Автокл. 8 9 1000 5 Перевар Хотингера (200 мг% ам.аз.) NaCl 1000 5 Водопр.вода 500 6 Осаждается яичным белком, фильтруется через ватно-марлевый фильтр. Глюкозу добавляют перед фильтрацией. Осаждается яичным белком, фильтруется через ватно-марлевый фильтр. Глюкозу добавляют перед фильтрацией. 7 Разливается в пробирки с кусочками печени, сверху наслаивается вазелиновое масло Фильтруется вой мясопептонный бульон Дрожжевой агар Дрож.экстракт Мясная вода Пептон NaCl Водопр.вода Дрож.экстракт NaCl Пептон Агар-агар 100 400 10 5 900 100 5 10 25 11 Картофельный агар Водопр.вода Картофель Пептон Глицерин Глюкоза NaCl 12 Раствор Рингера Дист. вода СаСI2 КСI NaCl 10 1 2 13 Тиогликолевая среда 2. 14 3 7,6 при 115о С 30 мин через бумажный фильтр 7,47,6 Автокл. при 115оС 30 мин 1000 500 10 30 10 5 7,0 Автокл. при 115о С 30 мин Осаждается яичным белком, фильтруется через ватно-марлевый фильтр Ингредиенты добавляются в картофельный бульон. После застывания среды осадок срезается. 1000 0,25 0,42 9,0 Не устанавл 4 5 6 7 Гидролизат 7,3 Автокл. Гидролизат казеина 15 при и тиогликоДрожжевой 121оС левую кислоэкстракт 10% 5 20 мин. ту добавляют Агар-агар 0,752 после фильГлюкоза 5 трации Цистин 0,752 Тиогликолевая кислота 0,3 Дистил. вода 1000 2. Питательные среды для изучения метаболизма микроорганизмов Среда Мясная вода 1000 7,0 Автокл. В готовую Булира Пептон 12,5 при среду добавNaCl 5 115оС ляют 0,1% р-р Маннит 7,5 30 мин нейтральрота. Разливают в пробирки с 15 16 17 18 19 1 Среда Гисса (сахара) Пептонная вода для сахаров, полужидкая МПА с 0,2% крахмала МПБ с 0,2% KNO3 Мясопептонная желатина 2 20 Среда Кларка 21 Среда Симмонса 22 Агар с мочевиной Пептон.вода Сахар (требуемый) Индикатор Андредэ 100 Дист. вода Пептон NaCl Агар 1000 10 5 3 МПА Крахмал 1000 2 МПБ KNO3 1000 2 МПБ Желатина 1000 7,4 100-150 7,7 0,5 Автокл. при 115оС 30 мин 1 3 4 Дист. вода Глюкоза Пептон КН 2РО4 Дист. вода NH4H2PO4 MgSO4·7H2O Цитрат натрия 3-х основной Агар-агар Бромтимолблау 0,2 % 1,7-2% агарная основа Глюкоза 1000 5 5 5 1000 1,5 0,2 газовками. Сахар к объёму – 0,5%, реактив Андредэ – 1 мл на 100 мл. Разливается в пробирки по 5 мл. 7,7 5 Автокл. при 1100С 20 мин. Осаждается (1 белок на 1 л среды). Разлить по 9-10 мл. 6 7 7,2 Автокл. при 115оС 30 мин 7,3 Стерил. 2-х кратно теку- 3 20 10 1000 3 Разливается в стерильн. пробирки. 23 Среда Балчева 24 Среда с сернокислым железом (для опред. сероводо-рода) 1 2 3 Молоко 10% р-р Na2HCO3 4 7,2 чим паром по 15-20 мин. Автокл. Разливается при 115оС в пробирки 30 мин по 6 мл 7,3 Дробно 3 дня по 20 мин. текучим паром. Разливается в стерильн. пробирки. 5 6 7 1000 7,1- Дробно Молоко До 7,2 3 дня по освободить сла20 мин. от сливок бощетекучим лочной паром. р-ции 26 ЛакмуМолоко 1000 Не совое Лакмусовая 50-100 устамолоко настойка До сла- навл. 10% р-р бощеNa2HCO3 лочной р-ции 3. Питательные среды для культивирования энтеробактерий 25 Молоко 50% р-р мочевины 20 Бромтимолблау 50 Дист. вода 500 Мясная вода 125 Пептон 7,5 Цистин 0,1 NaCl 1,5 NаН2РО4 1 Na2SO4 0,5 Железо лимонно-аммиачное зеленое FeNH4C6H5O7 0,5 Феноловый 0,0025 красный Агар-агар 0,5 2% агарная основа 1000 Fe2SO4 0,2 Na2S2O3·5H2O 0,3 Глюкоза 1 Фенолрот 0,2% 12 27 Среда Киллиама МПБ 0,1% водн. р-р бриллиантовой зелени 1000 Раствор 1) Пептон 4,2 NaCl 7,0 KH2PO4 1,5 Дрожжевой экстракт 10 Вода дист. 890 Раствор 2) MgCI2 36 Вода дист. 90 Раствор 3) 0,1% водный р-р брилли5 антовой зелени 4. Питательные среды для культивирования кампилобактерий 29 Полужид- Водопр.вода 500 7,3 Автокл. кий агар Мясная вода 250 при по ВГНКИ Печон. вода 250 1150С (0,15Пептон 10 30 мин 0,2% NaCl 5 агара) Агар-агар 2 Аминопептид 50 28 Магниевая среда Р-р бриллиантовой зелени добавляют непосредственно перед употреблением из расчета 1:10000, 1:150000 на 100 мл МПБ Не Автокл. Р-р 1) раствоуста- при ряют при кинавл. 1120С пячении, за30 мин тем добавляют р-ры 2) и 3). 1 2 3 4 30 Твердый агар по ВГНКИ (2,5% агара) 31 Полужидкий агар по Водопр.вода Мясная вода Печен. вода Пептон NaCl Агар-агар Аминопептид Водопр.вода Мясная вода Печен. вода 500 250 250 10 5 25 50 500 250 250 5 7,3 6 Автокл. при 1150С 7 32 33 34 35 1 36 ВГНКИ с 1% р-ром глицерина Полужидкий агар по ВГНКИ с 3,5% NaCl Пептон 10 30 мин NaCl 5 Агар-агар 2 Глицерин 10 Водопр.вода 500 7,3 Автокл. Мясная вода 250 при Печен. вода 250 1150С Пептон 10 30 мин NaCl 35 Агар-агар 2 ПолуВодопр.вода 500 7,3 Автокл. жидкий Мясная вода 250 при агар с Печен. вода 250 1150С 0,02% Пептон 10 30 мин цистеиNaCl 5 на Цистеин 0,02 Агар-агар 2 ПолуВодопр.вода 500 жидкий Мясная вода 250 агар по Печон. вода 250 ВГНКИ с Пептон 10 10% NaCl 5 желчи Желчь 100 Агар-агар 2 5. Питательные среды для культивирования бруцелл МясоПечен. вода 500 7,4- Автокл. Осаждается пептонМясная вода 500 7,5 при яичным белный пече- Пептон 10 1150С ком (1 белок ночноNaCl 5 30 мин на 1 л) глюкозно- Глицерин 20 глицерин. Глюкоза 10 агар Агар-агар 20 МППГГА 2 Мясопептонный печеночноглюкозноглицерин. бульон МППГГБ 3 4 5 Печен. вода Мясная вода Пептон NaCl Глицерин Глюкоза 500 500 10 5 20 10 7,47,5 6 Автокл. при 1150С 30 мин 7 Осаждается яичным белком (1 белок на 1 л) 37 Агар Альбини 38 Печеночноглюкозно-глицериновый агар Печен.глюкоз.глицериновый бульон Сывоточнодекстрозный агар 39 40 41 1 Печеночносывороточный и печеночноаминопептидный агар 2 Дист. вода Дрож.экстракт Пептон NaCl NaSH·2 H2O Агар-агар Глюкоза Печен. вода Пептон NaCl Агар-агар Глюкоза Глицерин Печен. вода Пептон NaCl Глюкоза Глицерин Дист. вода Пептон NaCl Мясная вода Агар-агар Глюкоза или декстроза Печен. вода Пептон NaCl Агар-агар 20% р-р соды двууглекислой Глюкоза Глицерин 3 1000 20 20 5 0,1 30 1 1000 10 5 25 10 20 1000 10 5 10 20 835 10 5 165 20 10 1000 10 5 20 7,27,3 Автокл. при 1150С 30 мин 7,2 Автокл. при 1150С 30 мин 7,2 Автокл. при 1150С 30 мин 7,8 7,2 Автокл. при 1150С 30 мин 17 10 20 4 5 6 Глюкозу и бисульфат натрия дрбавляют перед разливом Перед употребл. добав. сыворотку 10% и р-р декстрозы 1%, стерилиз. фильтрация Перед употреблением добавить сыворотку КРС - 1020% или аминопептид - 10-15% 7 6. Питательные среды для культивирования микобактерий 42 КартоВодопр.вода 1100 7,0 Автокл. фельКартофель 500 при ный бу- Пептон 10 1150С льон NaCl 5 30 мин Глицерин 30 43 Среда Петроньяни 44 Среда Френсиса 45 4% глицериновая вода 46 Картофельная среда Павловского Среда Левенштейна 47 1 48 2 Глюкоза 10 Молоко Крахмал Пептон Картофель Глицерин 2% водный р-р малахитовой зелени Яйца цельн. 300 12 2 2 24 Мясная вода Пептон NaCl Глицерин Дист. вода Глицерин 1000 40 5 100 1000 40 Дист. вода MgSO4·7H2O MgC6H5O7 Аспарагин Глицерин Крахмал 2% водн. р-р малахитовой зелени KH2PO4 Яичная масса 600 0,24 0,6 3,6 12 30 Не устанавл. В аппарате для свертывания сывороток при 850С 40 мин. 2 дня 20 8 Автокл. при 1150С 30 мин 7,2 Автокл. при 1100С 30 мин В пробирку наливается 4%-ная глицериновая вода (рН =7,0) и кладется картофель, нарезанный мелкими кусочками, предварительно выдержанный в течение 1 часа в 10% растворе соды. 3 Полужид- KH 2 PO 4 кая сре- Na2HPO4 да на ос- MgSO4 нове по- Na2C6H5O7·2H2O 7,4 В аппарате свертывания сыворотки при 850С 40 мин. 2 дня Смесь перемешивается со стеклянными бусами 20 2,4 1000 4 1,5 2,5 0,5 1,5 5 6 Не Автокл. уста- 1200С навл. 30 мин 7 За 3 дня перед употреблением на 700 мл сре- 49 лусинтетической среды Школьниковой Среда Гельберта FeNH4C6H5O7 L-аспарагин Глицерин 0,05 1 30 Яйца цельн. Желтки Молоко Картофельный отвар 2% водн. р-р малахитовой зелени Солевой р-р 6 4 100 100 ды – 100 мл 20% сахарозы и 100 мл сыворотки КРС Не В аппара- Перемешиуста- те свер- вается в навл. тывания колбе с бусыворотки сами, разлипри 800С вается по 40 мин. 2 пробиркам дня 7,2 100 Солевой р-р Солевой Разливают р-р и кар- во флаконы КН2РО4 1 тофель- по 110 мл Na2C6H5O7·2H2O 1 ный отMgSO4·7H2O 1 вар автоПептон 6 клавируГлицерин 30 ют до Дист.вода 1000 1200 С и выключ. Картофель1 кг картофеля кипятят в 2 л дистилный отвар лированной воды 15 мин. Отстаивают, и верхний слой фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Разливают во флаконы по 110 мл. Молоко центрифугируют или предваМолоко рительно отстаивают в холодильнике, снимают сливки, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы по 110 мл. Стерилизуют в автоклаве паром при 1 атм. 10 мин. или в аппарате Коха 2 дня текучим паром 30-40 мин. 1 50 2 Среда Калфи- 3 Яичные желтки 4 150 5 6 7 8,2 30 мин. текучим Перед добавлением мала- на 51 Глицерин Картофельный отвар 10% р-р Na2Н РО4 MgSO4·7H2O 2% водн. р-р малахитовой зелени Дист.вода Среда Шула Na2НРО4 KH 2 PO4 MgSO4·7H2O Na2C6H5O7·2H2O 52 1 Среда финн-II 2 паров 7 50 20 2 20 750 1,25 0,75 0,15 1,25 0,025 хит. зелени подщелачивают 5% KOH до светло-зеленой окраски ½ картофельного клубня натереть на терке + 200 мл дист. воды, подщелачивают бромтимолблау до зеленой окраски Не Автокл. уста- при навл. 1200С 30 мин FeNH4C6H5O7 10% р-р гидролизата казеина 25 Глицерин 15 2% водн. р-р малахитовой зелени 1 Дист.вода 1000 Яичная масса 12 яиц Не Автокл. Солевой р-р уста- при MgSO4·7H2O 0,5 навл. 1200С Na2C6H5O7·2H2O 1 20 мин FeNH4C6H5O7 0,05 KH2PO4 20 NH4C6H7O7·H2O 20 Натрий глутаминово-кислый однозамещенный 10 Глицерин 20 Дист.вода До 1 л 3 4 5 6 7 53 54 55 56 57 58 Среда Сотона Аспарагин 5 Не Автокл. Глицерин 50 уста- при Лимонная навл. 1200С кислота 4 20 мин K2HPO4 5 MgSO4·7H2O 0,5 Fe2(SO4)3 0,05 (NH4)2C6H5O7 2 ZnSO4 0,1 Дист.вода До 1 л Среда Пептон 9 7,5 Автокл. Микобактин ГарольNaCl 4,5 при добавляют да Агар-агар 15,3 1200С после устаМясной экс25 мин новки рН по тракт 2,7 каплям Микобактин 27 Яичн.желтки 6 шт 2% водн. р-р малахитовой зелени 5,1 Дист.вода 870 7. Среды для культивирования микоплазм Бульон Пептон 500 8,2 Автокл. Фильтруем Мартена Мясная вода 500 при через буNaCl 5 1150С мажный 30 мин фильтр Агар Пептон 500 8,2 Мартена Мясная вода 500 NaCl 5 Агар-агар 30 Бульон Водопр.вода 500 8,4 Автокл. Осаждается Эдвара Сердеч.вода 500 при яичным белПептон 10 1150С ком (1 белок NaCl 5 30 мин на 1 л), фильтруется через ватно-марл. фильтр Бульон Гидролизат 200 7,8 Автокл. из пере- бычьего при вара сердца 1150С бычьего Мясная вода 400 30 мин сердца Водопр.вода 400 NaCl 5 1 2 3 4 5 59 Среда на основе ферментативного мышечного гидролизата ФГИ-С Дист. вода Р-р Хенкса NaCI KCI CaCI2·2H2O MgSO4·7H2O NaHCO3 MgCI·6H2O 20 1000 8,08,2 Автокл. при 1150С 30 мин 7,8 Автокл. при 1100С 30 мин 60 61 62 63 64 8,0 0,4 0,185 0,2 0,35 0,1 Na2HPO4·2H2О 0,05 KH2PO4 0,06 Глюкоза 1,0 Агар «Дифко» 3 0,3% агар Бульон из из пере- перевара вара бы- бычьего чьего сердца 1000 сердца Агар-агар 3 2% агар Бульон из из пере- перевара вара бы- бычьего чьего сердца 1000 сердца Агар-агар 20 Среда 1,5-2% агар Хейфли- «Дифко» 700 ка Сыворотка крови лошади инактивированная 200 Дрожжевой экстракт 100 Среда Пептон Мар500 ВИЭВ тена жидкая Мясная вода 500 Плотная Пептон Мар- 500 6 7 Перед употреблением добавляют дрожжевой экстракт (10%) и сыворотку КРС или лошади (10-20%) Можно просветлить белком куриного яйца 8,0 Автокл. при 1150С 30 мин Сыворотку добавляют после стерилизации 8,0 Автокл. при 1200С 30 мин Перед употреблением добавляют 20% стерил. сыворотку и 10% дрожжевой экстракт среда ВИЭВ 1 2 65 Среда Л.Шпиткович 66 67 68 69 70 71 тена Мясная вода Агар-агар 500 20 3 4 5 6 7 Дист. вода 1000 6,7 Автокл. Бакто-агар с при триптолозой 20 7,8 1150С Мальтоза 25 30 мин NaCl 5 Na2НРО4 2,5 Фенолрот 0,024 Дрожжевой экстракт 10 Среда Бульон «Диф8,0 Чалко» 22,5 квиста Глюкоза 10 Дифосфопиридиннуклеотед 0,02 Цистеин гидрохлорид 20 Фенолрот 50 Дист. вода 1000 8. Среды для культивирования микроскопических грибов Среда Водопр.вода 1000 Не Автокл. Глюкоза доЧапека NaNO3 2 уста- при бавл. после жидкая KH2PO4 1 навл. 1150С кипячения, MgSO4·7H2O 0,5 30 мин фильтруется KCI 0,5 через бумажГлюкоза 30 ные фильтры Агар Жидкая сре1000 Чапека да Чапека Агар-агар 25 СуслоВодопр.вода 500 7,8 Автокл. При разливе агар Сусло 500 при 1100С добавить 3% Агар-агар 25 30 мин агара СуслоВодопр.вода 500 агар с Сусло 500 пептоАгар-агар 25 ном Пептон 5 СуслоВодопр.вода 500 агар с Сусло 500 фермент. Агар-агар гидроли- ФГМ-С затом мышц (ФГМ-С) 25 5 1 2 3 4 5 72 Суслоагар с ферментативный казеиново-дрожжевой гидролизатом (ФКДГ) Агар Сабуро Водопр.вода Сусло Агар-агар ФКДГ 500 500 25 5 7,8 Среда для культивирования возбудителя копытной гнили овец Модифицированная среда Водопр.вода Печен. вода Гидролизат Хоттингера Пептон NaCl Глюкоза 1000 500 Водопр.вода Мясная вода Печен. вода Пептон 375 375 250 10 73 74 75 76 77 6 Автокл. при 1100С 30 мин 7 При разливе в матрасы добавить 3% агара Водопр.вода 1000 6,2 Автокл. Пептон 10 при Мальтоза 40 1150С (глюкоза) 30 мин Агар-агар 18 КартоВодопр.вода 1000 Не Автокл. фельОчищенный уста- при ный агар картофель 200 навл. 1150С Агар-агар 20 30 мин Среда Водопр.вода 1000 Ван-Ин- NaNO3 0,5 терсона KH2PO4 0,5 9. Среды для культивирования анаэробов 7,6 Автокл. при 1150С 30 мин 8,4 Автокл. при 1100С 30 мин 200 10 5 5 Разливается по 9 мл в пробирки с кусочками КиттаТароцци с кусочками мозга овцы 1 78 79 80 2 NaCl Агар-агар 3 мозга овцы, сверху заливается вазелиновым маслом 5 1 4 5 6 7 10. Среды для культивирования коринебактерий Среда № ФКДГ 20 7,6- Автокл. 1 для Твин-80 0,006 7,7 при Na2C6H6O7·2H2O 0,05 культи1200С Na HPO ·2H O 2 4 2 вирова2,5 30 мин ния кори- KH2PO4 1,0 небакте- NH4CI 5 NaHCO3 рий 0,5 MgCI2·6H2O ВИЭВ 0,3 MgSO4·7H2O 0,01 Среда № ZnSO4·7H20 0,006 Не 2 для FeSO4·7H2O 0,015 устакультиCaCI2·4H2O 0,015 навл. Na2MgO4·2H2O 0,075 вирования кори- CuSO4·2H2O 0,045 небакте- ЭДТА 0,005 Дист. вода рий 1000 ВИЭВ 11. Среда для культивирования гемофильных бактерий Среда Бульон ХотНе Вместо ДПН для куль- тингера (200 устаможно взять тивиромг% ам.аз.) 1000 навл. 10% дрожвания Дифосфожевой эксH. periпиридиннуктракт pneumo- леотид 30 niae Глюкоза 4 ZnSO4·7H20 10 мкг/мл 13. Термины и определения Автолиз, аутолиз, самопереваривание (от греч. аυτο - сам и lysis - растворение разложение, распад) — саморастворение живых клеток и тканей под действием их собственных гидролитических ферментов, разрушающих структурные молекулы. Происходит в организме при некоторых физиологических процессах (например, метаморфоз, автотомия и др.), в очагах омертвения, а также после смерти. Автолиз микроорганизмов происходит при старении микробной культуры или повреждении клеток различными агентами. Автолизат - это продукт автолиза, содержащий вещества, подвергшиеся воздействию гидролитических ферментов клеток. Агар-агар - это смесь двух кислых полисахаридов, выделяемых из красных морских водорослей Ahnfeltia plicata и применяемый для уплотнения питательных сред. Гидролиз (от греч. hydro - вода и lysis - разложение) - один из видов обменного разложения между растворенным веществом и растворителем, взаимодействие веществ с водой с образованием различных соединений. Гидролизат – это продукт гидролиза (расщепление вещества с помощью воды) - одного из методов деструкции белков, в результате которого происходит разрыв пептидных связей белковой молекулы, присоединение воды и образование азотистых соединений. Гидролизат казеина - продукт, получаемый при кислотном гидролизе белка молока - казеина. Содержит раствор аминокислот и простейших пептидов. Содержание общего азота 0,7-0,95%; аминный азот составляет 40-60% общего азота, содержание триптофана не менее 15 мг в 100 мл. Прозрачная жидкость желтокоричневого цвета со специфическим запахом и рН 5,7-6,7. Применяют в качестве источника белка в составе питательных сред. Перевар – это пептический гидролизат мяса, вносимый в питательную среду как источник органического азота. Среды питательные – это субстанции, содержащие различные вещества, необходимые для размножения и роста микроорганизмов и культур клеток. Среды натуральные – это питательные среды неопределенного химического состава, приготовленные на основе сырья животного или растительного происхождения. Среды полусинтетические – это питательные среды, в которые наряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Среды синтетические – это питательные среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях и наиболее часто применяемые для исследования обмена веществ микроорганизмов. Среды простые – это питательные среды, содержащие 2-3 компонента. Среды сложные (политропные) - это питательные среды, содержащие 5 и более компонентов. Среды жидкие – это питательные среды, которые готовят без добавления уплотнителей. Среды полужидкие – это питательные среды, которые готовят путем добавления к жидким средам различных уплотнителей до получения желеобразной консистенции. Обычно добавляют 0,15-0,4% агар-агара. Среды плотные – это питательные среды, которые готовят путем добавления к жидким средам различных уплотнителей до получения плотной (твердой) консистенции. Обычно добавляют 23% агар-агара. Среды общеупотребительные – это питательные среды, применяемые для культивирования относительно неприхотливых микроорганизмов. Среды специальные - это питательные среды, разработанные с учетом специфических ростовых потребностей ряда бактерий, а также ферментативной активности микроорганизмов. Среды дифференциально-диагностические – это питательные среды, предназначенные для выявления определенных ферментов у микроорганизмов. В состав этих сред входят основная питательная среда, обеспечивающая рост изучаемого микро- организма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН среды в результате расщепления субстрата. Дифференциально-диагностические - это сложные среды, на которых микроорганизмы разных видов растут по-разному в зависимости от биохимических свойств культуры. Среды ингибиторные – это питательные среды, в которые добавляют вещества, подавляющие рост какого-либо вида (рода, семейства) микроорганизма. Среды элективные (избирательные) - это питательные среды для избирательного выделения и накопления определенных групп микроорганизмов из материалов, содержащих несколько видов бактерий. В них входят компоненты, обеспечивающие преимущественный рост исходного микроорганизма и подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Среды накопительные (среды обогащения, насыщения) – это питательные среды, которые применяют с целью увеличения количества исходного микроорганизма в смешанной популяции. На данных средах определенные группы культур растут быстрее и интенсивнее сопутствующих. Среды селективные – это питательные среды, предназначенные для выращивания строго определённого вида микроорганизма. Для других они неблагоприятны или недостаточно благоприятны. Эти среды служат для выделения бактерий из смешанных популяций и дифференцирования их от сходных видов. Среды индикаторные – это питательные среды, предназначенные для санитарно-микробиологического контроля объектов внешней среды, обнаружения определенного вида микроорганизма в материалах после стерилизации, проведения бактериологического контроля качества дезинфекции, выделения посторонней микрофлоры из биопрепаратов и т.д. Данные среды cодержат какое-либо вещество, ферментируемое определенной группой микроорганизмов, а также субстрат для обнаружения продуктов ферментации (индикатор), по изменению цвета которого судят о расщеплении субстрата. Среды консервирующие (поддерживающие) – это среды, которые применяют для первичного посева исследуемого материала, поддержания и длительного хранения культуры микроорганизма. Среды транспортные – это среды, применяемые для перевозки микроорганизмов и патматериала. Отсутствие в транспорт- ных средах источника азота угнетает размножение бактерий, а высокое содержание углеводородов обеспечивает источник энергии и более длительное переживание микроорганизмов при транспортировке. Среды производственные (технологические) - это питательные среды, применяемые в микробиологической промышленности для крупномасштабного культивирования микроорганизмов в биореакторах с целью получения различных биопрепаратов. Такие среды готовят на основе сырья растительного или животного происхождения. Среды лабораторные – это питательные среды с ограниченным по объему применением, используемые для выделения и идентификации микроорганизмов, для постановки диагноза, для научных исследований. Чаще всего с этой целью применяют полусинтетические и синтетические питательные среды. Среды для анаэробов – это среды, содержащие в своем составе редуцирующие или адсорбирующие кислород субстанции. Среды с крахмалом – это питательные среды, применяемые для выявления способности исследуемых микроорганизмов выделять в среду амилолитические ферменты (амилазы). Стерилизация – это уничтожение всех микроорганизмов химическими или физическими агенами на поверхности, предмете, в объеме жидкости или газа. Субстрат – это вещество, превращение которого катализируется специфическим ферментом. Сырье – это исходные материалы, используемые для получения готового продукта. Термостойкость – это способность материала противостоять нагреву до температуры, при которой происходит необратимое изменение его качества (разрушение физической или химической структуры), Термостабильность – это способность материала длительное время выдерживать нагревание при определенной температуре без изменения свойств продукта (без его разложения). Термолабильность – общее название нетермостойких и нетермостабильных материалов. Фильтрование - это разделение твердой и жидкой фаз суспензии при пропускании ее через пористую перегородку (мембрану). Цветные среды Гисса - это среды, предназначенные для определения сахаролитических ферментов микроорганизмов и выяснения возможности развития бактерий за счет тех или иных углеродсодержащих веществ. Экстракция (от лат. extraho - извлекаю) - метод извлечения вещества из раствора или сухой смеси с помощью растворителя (экстрагента). Для извлечения из раствора применяются растворители, не смешивающиеся с этим раствором, но в которых вещество растворяется лучше, чем в первом растворителе. Экстракт (вы́тяжка) - концентрированное извлечение из сырья растительного или животного происхождения, представляющее собой подвижные, вязкие жидкости или сухие массы. Экстракт кормовых дрожжей – это концентрированное вещество, получаемое путем экстрагирования из кормовых дрожжей водорастворимых витаминов группы В, аминокислот, пуриновых и пиримидиновых оснований и применяемое в составе питательных сред в концентрации 0,2—0,5 % веса на объем. 14. Список использованной литературы 1. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических методов исследований. М.: «Медицина», 1980. 2. Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам. - Москва: Медицина, 2003. 3. Методическое руководство по приготовлению и контролю бактериологических питательных сред.- Тбилиси.- 1977. 4. Раскин Б.М., Исаева З.А. Применение метода оценки качества питательных сред по показателям процессов культивирования микроорганизмов /Процессы культивирования патогенных микроорганизмов. - Москва, 1981 г. 5. Семёнов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. - Москва: Агропромиздат, 1990. 6. Скородумов Д.И., Субботин В.В., Сидоров М.А., Костенко Т.С. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных.- М., 2005. 7. Тарков М.И. Микробиологические методы оценки искусственных питательных сред. - Кишинёв: Штиинца, 1972 г. Содержание Введение……………………………………………………………..3 1. Назначение и цели применения питательных сред……….3 2. Принципы питания микроорганизмов………………………..3 3. Разделение микроорганизмов на группы по типам питания………………………………………………………6 4. Подбор состава питательных сред………………………….10 5. Определение потребностей питания микроорганизмов…11 6. Добавки, вносимые в питательные среды…………………15 7. Классификация питательных сред…………………………..18 8. Техника изготовления питательных сред…………………..25 9. Приготовление полуфабрикатов питательных сред……..29 10. Уплотнители питательных сред………………………….…36 11. Фильтрование и осветление питательных сред…………37 12. Рецептуры питательных сред и растворов, применяемых в бактериологических лабораториях при диагностике инфекционных болезней животных………………..38 13. Термины и определения……………………………………..71 14. Список использованной литературы………………………75
