Дебабов Биокатализ

ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ, 2011, том 1, № 4, с. 376–394
УДК 577.152.35
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НИТРИЛОВ
© 2011 г. В. Г. Дебабов#, А. С. Яненко
Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно4исследовательский
институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов,
Россия, 117545, Москва, 14й Дорожный проезд, д. 1
Поступила в редакцию 10.11.2010 г.
Принята в печать 03.02.2011 г.
Известны два пути ферментативного гидролиза нитрилов до карбоновых кислот. Под дей;
ствием нитрилаз нитрилы превращаются в карбоновые кислоты в одну стадию с присоедине;
нием двух молекул воды. Под действием нитрилгидратазы нитрилы превращаются в амиды,
которые далее под действием амидаз гидролизуются до карбоновых кислот. В обзоре рассмот;
рены строение, субстратная специфичность, механизмы действия и промышленный потен;
циал этих трех ферментов. Приведены примеры успешного использования нитрилгидроли;
зующих ферментов в крупномасштабном промышленном производстве акриламида и нико;
тинамида в мире и в России, а также в промышленном получении α;оксикислот (гликолевой
и R;миндальной). Стерео; и региоселективность ферментов позволяет использовать их при
синтезе хиральных синтонов при производстве важных фармацевтических препаратов (ста;
тинов, антимитотических агентов, ингибиторов ферментов).
Ключевые слова: ферментативный гидролиз нитрилов, нитрилгидратазы, амидазы, нитрила;
зы, применение в органическом синтезе.
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Введение
2. Ферменты, участвующие в конверсии нитрилов
2.1. Нитрилгидратазы
2.2. Нитрилазы
2.3. Амидазы
3. Каталитический потенциал ферментов для конверсии нитрилов
3.1. Хемоселективность
3.2. Регио (E/Z)селективность
3.3. Энантиоселективность
4. Практическое применение ферментативного гидролиза нитрилов для получения амидов и
кислот
4.1. Биоакриламид
4.2. Акрилат аммония
4.3. α4Оксикарбоновые кислоты
4.4. Оптически активные 24метил4 и 2,24диметилциклопропанкарбоновые кислоты и их амиды
5. Заключение и будущие перспективы
1. ВВЕДЕНИЕ
Нитрилы, или органоцианиды, (структурная формула R;CN) являются естественными широ;
ко распространенными соединениями живой природы. Они синтезируются растениями в каче;
стве предшественников гормонов (фенилацетонитрил), запасных веществ (цианогликозиды и
цианолипиды) и др. [1].
#
Автор для связи (тел.: +7 (495) 315;37;47, +7 (495) 315;12;47; факс: +7 (495) 315;05;01; эл. почта: debabov@geneti;
ka.ru, [email protected], [email protected]).
© ООО МАИК “НАУКА/ИНТЕРПЕРИОДИКА”, 2011
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НИТРИЛОВ
377
Синтетические нитрилы в свою очередь широко используются в органическом синтезе в ка;
честве предшественников для получения различных амидов и кислот. Традиционный химиче;
ский процесс гидролиза нитрилов требует жестких условий (кислые или щелочные значения рН,
температура, превышающая 100°С) и сопровождается образованием нежелательных побочных
продуктов и значительных количеств отходов. Альтернативным процессом является биокатали;
тический гидролиз нитрилов, который происходит при мягких условиях (нейтральные значения
рН и комнатная температура), затрагивает селективно только нитрильные группы, и, в некото;
рых случаях, является стерео; и/или региоселективным, что особенно важно при синтезе биоло;
гически активных соединений.
В настоящее время в природе известны два пути гидролиза нитрилов до соответствующих кар;
боновых кислот. Первый путь включает последовательное действие двух ферментов – нитрил;
гидратазы [ЕС 4.2.1.84] и амидазы [ЕС 3.5.1.4]. Нитрилгидратаза присоединяет к нитрилу одну
молекулу воды, превращая его в амид, амидаза гидролизует амид до кислоты (схема 1). Второй
путь – одностадийное превращение нитрила в органическую кислоту с присоединением двух
молекул воды с помощью фермента нитрилазы [ЕС 3.5.5.1] (схема 1). Все эти ферменты – нит;
рилгидратазы, нитрилазы и амидазы – в последние годы привлекают значительное внимание
исследователей и химиков;синтетиков в качестве биокатализаторов для применения в органиче;
ском синтезе. В настоящее время свыше 10 каталитических процессов с участием нитрил;гидро;
лизующих ферментов уже используются в промышленности.
RCN
нитрил
RCONH2
амид
нитрилгидратаза
+ H2O
+H
ам 2 O
ид
аза
O
H 2 аза
+2 рил
т
ни
RCOOH
кислота
Схема 1. Два пути ферментативного гидролиза нитрилов до карбоновых кислот.
Цель данного обзора – рассмотреть современные данные о механизме действия ферментов
метаболизма нитрилов, их свойствах и особенности практического применения в химической и
фармацевтической индустрии.
2. ФЕРМЕНТЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В КОНВЕРСИИ НИТРИЛОВ
2.1. Нитрилгидратазы
Впервые нитрилгидратаза была обнаружена в клетках бактерий Rhodococcus rhodochrous J;1
(ранее называемой Arthrobacter sp. J;1) в 1980 г. [2]. К настоящему времени изучены десятки фер;
ментов из различных видов бактерий, но и сегодня Rhodococcus и другие актиномицеты являются
наиболее распространенными источниками новых нитрилгидратаз [3]. В целом, именно прока;
риотические организмы, в первую очередь бактерии, являются основным резервуаром нитрил;
гидратаз. Компьютерные поиски новых нитрилгидратаз в геномных последовательностях, пред;
ставленных в публичных базах данных, впервые позволили идентифицировать нитрилгидратазу
также и у эукариотического организма Monosiga brevicollis (UniRef database, UniProt identifier
A9V2C1). Однако анализ последовательности гена позволяет предполагать возможность гори;
зонтального переноса генов нитрилгидратазы из протеобактерий [4].
Все до сих пор изученные нитрилгидратазы имеют общее строение. Это гетеродимерные бел;
ки, состоящие из α и β субъединиц с молекулярными массами около 22 kDa и 28 kDa, соответ;
ственно. При повышении концентрации димеры αβ часто образуют тетрамеры и олигомеры
более высокого порядка. Нитрилгидратазы – это металлоферменты, имеющие в своем активном
6 ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
378
ДЕБАБОВ, ЯНЕНКО
центре негемовое железо (Fe3+) – или кобальт (Co3+). В зависимости от иона металла, входящего
в состав активного центра фермента, нитрилгидратазы распределены на две группы – железосо;
держащие (Fe;тип) и кобальтсодержащие (Со;тип). Оба типа нитрилгидратаз отличаются по
субстратной специфичности и уровню активности, хотя имеют достаточно высокую гомологию
в аминокислотных последовательностях белков, особенно, в областях, относящихся к активно;
му центру. Известно несколько ферментов, которые в своем составе содержат и другие ионы
(Zn или Cu), однако отсутствуют доказательства участия этих металлов в каталитической актив;
ности [5, 6].
Нитрилгидратазы Fe;типа обладают интересной особенностью. Эти ферменты, синтезиро;
ванные в бактериях, выращенных в темноте, не активны и подвергаются активации при освеще;
нии видимым светом [7–9]. Методами оптической спектроскопии, хроматографии и масспек;
трометрии было показано, что нитрилгидратазы в неактивном состоянии содержат молекулу
окиси азота, присоединенную к атому железа [10]. При световом облучении окись азота уходит
из активного центра, что сопровождается локальными конформационными изменениями и ак;
тивацией фермента [11]. Это первый известный случай регуляции бактериального фермента
окисью азота, хотя физиологическое значение этой регуляции до сих пор не ясно. Долгое время
считалось, что нитрилгидратазы кобальтового типа не подвержены фоторегуляции, однако поз;
же было установлено, что окись азота также подавляет активность этих ферментов, но при кон;
центрациях в 10 раз больших, чем в случае с нитрилгидратазами Fe;типа [12].
Интересно, что окись углерода ведет себя подобно окиси азота по отношению к нитрилгидра;
тазам кобальтового типа, т.е. ингибирует фермент, и неактивный комплекс подвергается фотоак;
тивации видимым светом, но при этом окись углерода не подавляет активности нитрилгидратаз
Fe;типа при любых концентрациях [12].
В 1997 г. Huang и соавторы [13] получили кристаллическую структуру фотоактивированной
нитрилгидратазы из Rhodococcus sp. R312 с разрешением 2.3 Å, а в следующем году была решена
структура нитрилгидратазы из Rhodococcus sp. N771 с разрешением 1.7 Å [11]. Оба фермента от;
носятся к Fe;типу. Вскоре были установлены структуры и двух нитрилгидратаз Co;типа [14, 15].
Все исследованные белки имели схожую структуру. Они представляли собой ассиметрические
единицы, образованные (αβ)2 гетеродимерами. Атом металла локализуется в центральной канав;
ке, образованной поверхностями двух разных субъединиц. Канал между растворителем (водой)
и активным центром формируется поверхностями двух субъединиц, включающих 5 аминокис;
лотных остатков от α;субъединицы и 4 – от β;субъединицы. Этот канал у нитрилгидратазы из
Rhodoccocus sp. N771 имеет длину в 10 Å и ширину в 4 Å, что явно недостаточно для транспорта
субстрата. По;видимому, доступность субстрата обеспечивается динамическими асциляциями
структуры белка в процессе катализа. Все белковые лиганды, координирующие атом металла,
расположены в α;субъединице. Лиганды относятся к трем цистеиновым тиолатам (αCys109,
αCys112, αCys114) и двум атомам азота главной полипептидной цепи (αSer113, αCys114), в ше;
стой позиции в неактивной форме нитрилгидратаз Fe;типа расположена окись азота. Остатки
αCys112 и αСys114 Rhodococcus sp. N771 пострансляционно окислены до цистеин сульфиновой
(SO2H) и цистеин сульфеновой (;SOH) кислот, соответственно [14]. Атом металла распологается
в центре октаэдра так, что связи с лигандами направлены к его углам, при этом 4 лиганда лежат
почти в одной плоскости (αCys112, αCys114) и два амидных атома азота главной цепи (αSer113 и
αCys109), а связь с атомом серы остатка Cys109 расположена аксиально (перпендикулярно)
относительно плоскости расположения остальных лигандов (схема 2). Шестая связь, также ак;
сиальная к плоскости, либо занята молекулой окиси азота (в неактивном состоянии ферментов
Fe;типа), либо свободна и служит для соединения с субстратом в активированном ферменте.
Предполагается, что в активной форме ферментов Fe; и Co;типа место шестого лиганда занима;
ет вода. Структура активного центра нитрилгидратаз, содержащих кобальт, очень сходна со
структурой железосодержащих ферментов, небольшое отличие заключается в замене остатка
αSer113 на остаток треонин.
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НИТРИЛОВ
ser113
HO
379
O
N
O
N
S cys114
C
O
O
N
O
S cys112
C
O
S cys109cys109
Схема 2. Схематическое изображение активного центра нитрилгидратазы Fe;типа в неактивном состоянии
(с присоединенной окисью азота). При активации окись азота уходит, оставляя место для взаимодействия фер;
мента с субстратом. 4 Лиганда: сера цистеина 114 и цистеина 112, и амидные атомы азота главной полипептид;
ной цепи цистеина 109 и серина 113 лежат в одной плоскости.
До сих пор не ясно, почему при таком сходстве некоторые ферменты включают в свой актив;
ный центр железо, а другие – кобальт. Тем более, что проведены успешные опыты по замене
железа на кобальт, например, в нитрилгидратазе из Rhodococcus sp. N771, с частичным сохране;
нием активности фермента [16], что говорит об одинаковом строении активного центра и, веро;
ятно, механизме катализа.
Предметом длительного изучения являются механизмы посттрансляционной модификации
нитрилгидратаз – включение атомов металла и окисление цистеинов.
Исследование структуры генов, кодирующих нитрилгидратазы бактерий, показало, что гены,
кодирующие α; и β;субъединицы фермента, находятся в оперонах, содержащих еще некий ген,
функция которого необходима для полноценной сборки белка. Продукт этого гена назван акти;
ватором [17]. Для железосодержащих нитрилгидратаз Rhodococcus sp. N771 [18], Pseudomonas chlo4
raraphis B32 [19], Pseudomonas putida 5B [20] и Rhodococcus sp. N774 [21] показано, что эти гены не;
обходимы для функциональной экспрессии. Наличие такого сорта генов было показано и для
кобальтсодержащих нитрилгидратаз [22–24].
Недавно на примере низкомолекулярной нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous J1 был по;
дробно изучен механизм созревания фермента, получивший название “самообмена субъеди;
ниц” (self;subunit swapping) [25]. Авторы показали, что экспрессия в гетерологичной системе
только структурных генов α; и β;субъединиц нитрилгидратазы приводит к неактивному фер;
менту, не содержащему кобальта. Но если экспрессировать в той же системе полный оперон,
содержащий кроме генов, кодирующих α; и β;субъединицы еще и ген активатор (nhlE), то обра;
зуется полноценный фермент с содержанием кобальта 0.88 ± 0.04 моль/моль αβ димера. При
очистке ферментов из клеток, несущих полный оперон, были обнаружены белки состава αβ, α2β
и αe2. Белок αe2 не обладал нитрилгидратазной активностью, но содержал кобальт (0.87 ±
± 0.03 моль/моль αe2). Этот белок был назван холо;αe2. Если in vitro смешать αe2 с неактивной
нитрилгидратазой, не содержащей кобальта, и провести совместную инкубацию, то фермента;
тивная активность в смеси растет и достигает максимума через 12 часов инкубации. Полученные
результаты можно было объяснить двумя путями: 1) либо кобальт от αe2 передавался на α;субъ;
единицу α2β2, либо 2) происходил обмен субъединицами между двумя белками. Опыты с мутант;
но;мечеными белками показали, что справедлив второй механизм, который и получил название
“self subunits swapping” [25] (схема 3).
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
6*
380
ДЕБАБОВ, ЯНЕНКО
I
II
αI
e
Co+2
αI
e
αI
e
αIβ
IV
III
αIIβ
αIe
(αIIβ)2
αIe2
αIβ
αIβ
αIβ
αIIe2
Схема 3. Схема посттрансляционного созревания кобальтсодержащей нитрилгидратазы Rhodococcus rhodoch4
rous J1 [25]. I – синтез отдельных полипептидных единиц; II – образование субъединичных комплексов,
где αI – субъединица, не содержащая металла и модификаций; III – вхождение Co+2 в состав α;субъединицы
в комплексе αe2, его окисление до Co+3 и окисление двух цистеинов до сульфеновой и сульфиновой кислот.
Модифицирование α;субъединицы обозначена как αII; IV – обмен α;субъединицами αI и αII между αIβ и αIIe2
и образование полноценного фермента (αIIβ)2.
Далее авторами было показано, что окисление цистеинов происходит именно в белке αe2 и не
осуществляется в αβ или α2β2 белках, синтезированных в отсутствии белка NhlE.
Движущей силой обмена субъединиц, вероятно, могут служить два солевых мостика, образуе;
мых между депротонированными цистеинсульфиновой и цистеинсульфеновой остатками α;субъ;
единицы (CysSO2 и CysSO–) [26] и двумя аргининами β;субъединицы, которые имеют консерва;
тивное положение во всех нитрилгидратазах (R52 и R157). В дальнейшей работе авторов было уста;
новлено, что NhlE белок обладает двумя активностями – способностью внедрять кобальт и
способностью окислять цистеины, т.е. он функционирует как металлошаперон, включая функцию
окисления, и как шаперон, обеспечивающий обмен субъединицами. Было показано, что атомы
кислорода при окислении цистеина происходят из воды, а не из молекулярного кислорода [27].
Недавно было показано, что по такому же механизму идет созревание высокомолекулярной
нитрилгидратазы R. rhodochrous J1. В этом процессе в качестве белка;шаперона выступает белок
NhhG [28].
Для практических целей оказалось возможным собирать полноценный белок в гетерологичных
системах экспрессии, например, в E. coli и без помощи белков активаторов. Сборку белка и его мо;
дификацию обеспечивают, например, шапероны GroESL E. coli [29], при этом удельная активность
белка, собранного в гетерологичной системе, не отличается от нативного природного белка.
Существует несколько гипотез относительно механизма гидролиза нитрилов нитрилгидрата;
зами. Почти все предложенные гипотезы рассматривают ион металла в активном центре фер;
мента в качестве кислоты Льюиса. Huang и др. [13] предложили три схемы, согласно которым в
активации нитрила принимают участие функциональные группы из “трех сфер” активного цен;
тра. По первой схеме нитрил непосредственно связывается с ионом металла, что активирует его
для последующей гидратации (первая сфера, т.е. субстрат выступает как один из лигандов метал;
ла). Затем активированный атом углерода нитрила подвергается нуклеофильной атаке водой.
Согласно второй схеме, атом углерода подвергается нуклеофильной атаке связанным с металлом
гидроксид ионом (вторая сфера). В третьей схеме, связанный с металлом гидроксид ион активи;
рует молекулу воды (третья сфера), которая и действует как нуклеофил, атакуя атом углерода
нитрила. Последний механизм не включает связанных с ферментом промежуточных продуктов,
что исключает обмен лигандами вокруг иона металла.
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НИТРИЛОВ
381
Существует большое число доказательств в пользу первого механизма, т.е. прямого взаимодей;
ствия нитрила с ионом металла активного центра. Показано, что аналог субстрата иодацетонитрил
прямо взаимодействует с ионом металла [30]. Рентгеноструктурные исследования комплекса нит;
рилгидратазы из P. thermophila с масляной кислотой (слабый конкурентный ингибитор) показали,
что карбоксильный кислород связывается прямо с металлом [31]. На прямое связывание нитрилов
с металлом указывают и данные адсорбционных спектров и спектров ЭПР [32].
В каталитическом процессе, несомненно, участвуют модифицированные тиольные остатки.
Было показано, что реконструированная в анаэробных условиях (в атмосфере аргона) нитрил;
гидратаза, не обладала каталитической активностью и такая активность появлялась при аэроб;
ной инкубации фермента. При этом наблюдалось окисление цистеинов αС112SO2H и
αС114SOH [33]. Интересно, что окисление αС114SOH до αС114SO2H приводило к полной по;
тере активности фермента, что было показано при необратимом ингибировании нитрилгидрата;
зы Rhodococcus sp. N771 2;циано;2;пропил;гидроксипероксидом [34].
На сегодняшний день наиболее обоснованным механизмом действия нитрилгидратазы явля;
ется механизм, предложенный Хошимото с соавторами [35], так как он опирается на прямые
рентгеноструктурные данные по изучению механизма превращения изонитрилов в амины, ката;
лизируемого той же нитрилгидратазой. Эти авторы обнаружили, что нитрилгидратаза из Rhodo4
coccus sp. N771 может превращать изобутилизонитрил в изобутиламин [36]. При этом оказалось,
что связывание изонитрила с ферментом было почти такое же как и у нитрила (величины Km
сравнимы), но скорость превращения в амин (Vmax), была в 10000 раз меньше. Воспользовавшись
этим обстоятельством, авторы провели изящную работу по последовательной во времени рент;
генографии промежуточных продуктов ферментативной реакции [35]. Эти результаты позволи;
ли прямым методом доказать координацию изонитрила с металлом активного центра фермента.
Учитывая сходство Km для нитрила и изонитрила, эти результаты являются еще одним аргумен;
том прямого взаимодействия нитрилов с атомом металла. Согласно предложенному механизму
углерод координированного металлом нитрила (или изонитрила) подвергается нуклеофильной
атаке молекулой воды, активированной кислородом сульфенильной группы цистеина 114.
При этом остаток Cys114SO– служит каталитическим основанием. В случае нитрилов промежу;
точное имидатное соединение перегруппировывается в амид, а в случае изонитрила в амин и
окись углерода (схема 4). Исследования и расчеты, выполненные на модельных комплексах,
имитирующих активный центр нитрилгидратазы, показали, что только сульфенильный кисло;
род может выступать в качестве нуклеофила [37].
A.
R
R
+
O
N
N
N
H
C
C
O−
Fe+3
R
H
Fe+2
R
H
Fe+2
C
O
C
O
Fe+2
O
S
O
O−
Fe+3
S
cys114
cys114
cys114
H N H
H
H
S
S
H N
O
C
O
R
S
cys114
cys114
B.
R
R
C
C
O
O−
Fe+3
C
H
N
N
R
H
Fe+2
O
H
Fe+2
S
S
C
N
O
R
H
O
S
H
O
R
C O
H N H
H N
Fe+2
O
S
O−
Fe+3
S
cys114
Схема 4. Схема механизма катализируемого нитрилгидратазой превращения изонитрилов в амины (A) и нит;
рилов в амиды (B) [35]. S;O – цистин;сульфеновая кислота в положении α114, которая в свободном ферменте
депротонирована.
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
382
ДЕБАБОВ, ЯНЕНКО
Необходимость модификации второго остатка цистеина до сульфиновой кислоты объясняет;
ся, вероятно, тем, что этот остаток вместе с другими цистеинами образует конформацию “клеш;
ни” или “раскрытой руки” (“claw setting”), способствующую захвату субстрата и его координа;
ции с металлом [11]. Вышеприведенный механизм в целом поддерживается теоретическими рас;
четами, которые подтверждают роль кислорода сульфенильной группы как основания,
отбирающего протон от воды атакующей углеродный атом нитрила. Этот теоретический расчет
приписывает атому металла скорее не свойства кислоты Льюиса, активирующей нитрил, а функ;
цию стабилизации анионного имидатного промежуточного соединения [38].
2.2. Нитрилазы
Нитрилазы (ЕС.3.5.5.1) – ферменты, способные гидролизовать органические нитрилы до
карбоновых кислот и аммония. Первая нитрилаза описана в 1962 г. [39]. Этот фермент, изолиро;
ванный из ячменя, превращал индол;3;ацетонитрил в растительный гормон – ауксин (индолил;
3;уксусную кислоту). В отличие от нитрилгидратаз, нитрилазы обнаружены у всех видов орга;
низмов, включая бактерии, грибы, археи, растения и млекопитающие [40–42].
По аминокислотной гомологии нитрилазы отнесены к суперсемейству белков, также назван;
ным нитрилазным. Кроме нитрилаз в это суперсемейство входят другие ферменты, гидролизую;
щие СN связь, включая амидазы, карбомоилазы, N;ацетилтрансферазы и др. [43]. Члены
суперсемейства нитрилаз имеют специфическую пространственную организацию. Мономеры
этих белков имеют 4;слойную структуру сэндвича – αββα (α – спираль, β – слой). Так как до сих
пор не удалось установить структуру ни одной из нитрилаз с помощью рентгеноструктурного
анализа, то эта пространственная структура приписывается нитрилазам на основании гомологии
с членами других семейств суперсемьи [44]. По своей четвертичной структуре нитрилазы –
гомоолигомерные белки [45]. Большинство нитрилаз существуют в растворе в форме неактив;
ных димеров, которые способны ассоциироваться, образуя активные олигомеры [46]. Олигоме;
ризация может инициироваться присутствием субстрата (субстратная активация); высокими
концентрациями фермента или изменением физико;химических условий: нагреванием, высо;
кими концентрациями солей (KCl, MgSO4, NH4Cl, (NH4)2SO4), добавлением органического рас;
творителя [47–50].
Методами электронной микроскопии было показано, что некоторые микробные нитрилазы
могут образовывать регулярные структуры – гомоолигомерные спирали различной длины (де;
сятки мономеров) [46, 51, 52].
Одна из наиболее изученных нитрилаз из бактерий Rhodococcus rhodochrous J1 существует в
трех гомоолигомерных структурах: димер, комплекс размером 480 kDa и регуляторные спирали
различной длины. В растворе эта нитрилаза существует как неактивный димер, который в при;
сутствии субстрата переходит в активный комплекс 480 kDa [50]. Активные спиральные олиго;
меры были найдены для рекомбинантной нитрилазы Rhodococcus rhodochrous J1, изолированной
из бактерии E. coli [52]. При этом было показано, что рекомбинантный фермент подвергается
посттрансляционному протеолизу, при котором отщепляются 39 аминокислот с N конца белка,
что, по;видимому, необходимо для образования активных спиральных олигомеров [52].
Физиологическая роль образования спиральных олигомерных структур не ясна, но они могут
представлять интерес в биотехнологическом плане, так как имеют высокую плотность каталити;
ческих центров.
В основе ферментативной активности нитрилаз лежит каталитическая триада: глутаминовая
кислота – лизин – цистеин (Glu – Lys – Cys) [43]. Предполагается, что реакция начинается с
нуклеофильной атаки тиольной группы цистеина активного центра фермента на атом углерода
нитрильной группы, что приводит к образованию тиоимидата ковалентно связанного с фермен;
том. Далее тиоимидат образует промежуточный тетраэдральный комплекс с присоединением во;
ды (схема 5). При этом глутамат действует как основание и остаток лизина стабилизирует тетра;
эдральное промежуточное состояние [53].
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НИТРИЛОВ
383
Lys
N
H
H
H
Enz SH + RCN
NH
Enz S C R
H2O
O
R
O
N H
C
I
H
Glu
O
H
S
O
O
R C NH2 + Enz
II
Cys
SH
H2O
IV
Lys
N
H
H
O H
R
O
+
C
O
+
Enz SH + R C O−NH4
V
S
NH3
N H
H
Glu
O
O
H
Cys
−
H
III
Схема 5. Предполагаемый каталитический механизм нитрилаз [54]. Сульфгидридная группа цистеина нуклео;
фильно атакует нитрильный углерод субстрата с образованием продукта I. Продукт I с присоединением воды
образует промежуточный тетраэдрический комплекс II. Глутаминовая кислота выступает как основание, а ли;
зин стабилизирует комплекс II. Комплекс II может распадаться на амиды и свободный фермент, особенно в
случае электроно;акцепторных и объемных заместителей. В норме присоединение второй молекулы воды и
стабилизация положительного заряда на атоме азота субстрата приводит к комплексу III, который распадается
с образованием карбоновой кислоты и отщеплением аммиака. Результатом является получение аммонийной
соли карбоновой кислоты и свободного фермента.
Предполагается, что промежуточный комплекс может разрушаться двумя путями, которые
приводят к разным продуктам [54]. Первый путь включает элиминацию из комплекса NH3 c об;
разованием тиоэфира, который реагирует со второй молекулой воды с образованием карбоновой
кислоты и исходной формы фермента. Это обычный путь. Второй путь приводит к элиминации
тиола и образованию амида. Таким образом, в некоторых случаях нитрилаза может катализиро;
вать ту же реакцию, что и нитрилгидратаза. Показано, что для некоторых субстратов амид может
являться главным продуктом реакцией. Например, рекомбинантная очищенная нитрилаза NIT4
из растения Arabidopsis thaliana продуцирует более 60% амида при гидролизе 3;циано;L;аланина
[55]. Интересно отметить, что если гидролиз нитрилов под действием нитрилгидратаз, как пра;
вило, не является энантиоселективным, то образование амидов с помощью нитрилаз происхо;
дит энантиоселективно [56].
Согласно субстратной специфичности, нитрилазы делят на 3 группы: 1) ароматические нит;
рилазы, которые гидролизуют, главным образом, ароматические нитрилы, например, нитрилаза
из бактерий Rhodococcus rhodochrous J1 или грибные нитрилазы [57]; 2) алифатические нитрила;
зы, гидролизующие преимущественно алифатические нитрилы, например, нитрилазы из
R. rhodohrous K22 или Acidovorax faecalis 72W [58]; 3) нитрилазы, гидролизующие преимуществен;
но арилацетонитрилы, например, арилацетонитрилаза из Alcaligenes faecalis JM3 [59]. Эта клас;
сификация широко используется до настоящего времени, хотя некоторые нитрилазы показыва;
ют широкую субстратную специфичность и могут быть отнесены сразу к нескольким классам.
2.3. Амидазы
Амидазы (ЕС. 3.5.1.4) – ферменты, гидролизующие амиды карбоновых кислот до кислот и ам;
мония. Амидазы классифицируют на две группы: алифатические амидазы входят в состав нитри;
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
384
ДЕБАБОВ, ЯНЕНКО
лазной суперсемьи и AS;семья (Amidase signature). Это разделение основано на аминокислотных
последовательностях и особенностях пространственной структуры.
Амидазы, относящиеся к нитрилазной суперсемье, содержат каталитическую триаду Glu, Cys,
Lys [60] и в растворе существуют в виде гомотетрамерных или гомогексамерных структур [61].
Амидазы AS;семейства используют каталитическую триаду Ser, Ser и Lys и содержат очень кон;
сервативную последовательность в 130 аминокислот (AS;последовательность) [62]. В растворе
амидазы AS;семейства существуют в виде гомодимеров или гомооктамеров [63, 64]. Амидазы
широко распространены и встречаются у бактерий, дрожжей, грибов, растений и животных [40].
Механизм каталитической активности амидаз заключается в нуклеофильной атаке фермента
на карбонильную группу амида, что приводит к образованию промежуточного тетраэдрического
комплекса, который с отщеплением аммония превращается в промежуточный ацилферментный
комплекс. Ацилферментный комплекс гидролизуется до карбоновой кислоты и свободного фер;
мента (схема 6) [54]. Как и в случае нитрилаз, амидазы образуют ковалентную связь с субстратом
(в случае амидаз нитрилазного семейства через остаток Cys, а в амидазах AS;семейства через
остаток Ser). Эта ковалентная связь подтверждена рентгеноструктурным анализом [63–65].
O
R C NH2
EXH
H
O
R C NH2
XE
H2O
EXH
R C N
NH
R C XE
NH3
O
R C XE
H2O
O
C
NH2OH
H2O
R
+ EXH
OH
R C NH OH
O
Схема 6. Механизмы реакций, катализируемых амидазами [66].
Амидазы обладают и ацилтрансферазной активностью. Особенно эффективно ацильный
остаток переносится на гидроксиламин (схема 6) [66]. Гидроксамовые кислоты легко детектиру;
ются в присутствии хлорида железа, образуя ярко красный комплекс. Эта реакция часто исполь;
зуется для определения активности амидаз [67].
Интересно, что амидазы могут обладать и нитрилазной активностью. Так было показано, что
высокоочищенная рекомбинантная амидаза из бактерий Rhodococcus rhodochrorus J1, экспресси;
рованная в E. coli, может гидролизовать бензонитрил до бензойной кислоты и аммония [68].
Вместе с этим, гидролиз бензонитрила протекал в 6000 раз медленнее гидролиза бензамида. Замена
Ser195 на Ala195 приводила к полной потере как амидазной, так и нитрилазной активности, что сви;
детельствует о том, что обе реакции протекают в одном и том же активном центре фермента.
Амидазы проявляют достаточно высокую стереоспецифичность. Чаще всего гидролизу под;
вергается S;изомер амида [69–71]. Поиск амидаз с R;специфичностью представляет значитель;
ный интерес для синтеза исходных веществ для фарминдустрии. Такие амидазы были найдены,
например термостабильная амидаза из бактерий Klebsiella oxytoca [72, 73].
3. КАТАЛИТИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ КОНВЕРСИИ НИТРИЛОВ
Ферменты гидролизующие нитрилы имеют большой потенциал в производстве промежуточ;
ных продуктов для синтеза лекарств, пестицидов, ароматизаторов. В этих случаях, как и в случа;
ях крупнотоннажного синтеза, большое значение имеет удельная активность биокатализатора,
его цена, устойчивость к высоким концентрациям субстрата и продуктов, но решающее значе;
ние приобретает хемо;, регио; и энантиоселективность.
3.1. Хемоселективность
С помощью ферментов удается осуществить гидролиз нитрильных групп в составе молекулы,
содержащей функциональные группы, не устойчивые в условиях химического гидролиза.
Например, нитрилаза из Pseudomonas катализирует гидролиз алифатических 2;ацетоксинитри;
лов, не затрагивая эфирную связь [74].
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НИТРИЛОВ
385
Интересный и практически важный случай хемоселективности нитрилаз – это гидролиз
одной из двух нитрильных групп в динитрилах с получением цианкарбоновых кислот. Этот тип
селективности был показан для ароматических нитрилаз [75], арилацетонитрилаз [76] и алифа;
тических нитрилаз [40, 77–79]. Недавно описана нитрилаза из бактерий Pseudomonas fluorescens Pf;5,
обладающая очень высокой удельной активностью именно по отношению к динитрилам [48].
У алифатических динитрилов селективность по отношению к гидролизу одной цианогруппы
убывает с ростом длины цепи, но сохраняется вплоть до 6 углеродных атомов [40].
Моногидролиз динитрилов был использован для синтеза лактамов с 80–90% выходом в две
стадии [40]. На первой стадии образуется аммонийная соль цианкарбоновой кислоты при гидро;
лизе динитрила с помощью целых клеток Acidovorax facilic 72W. На второй стадии – это промежу;
точное соединение без выделения подвергается гидрированию (схема 7) [40].
R
CN
[CH2]n
COO−NH4
[CH2]n
+
нитрилаза
Acidovorax
facilis 72W
R
H2
никель Ренея
R
[CH2]n
O
CN
CN
NH
Схема 7. Двухстадийный процесс получения лактамов из динитрилов.
Из ферментов, гидролизующих нитрилы, нитрилазы обладают наибольшей моноселективно;
стью по отношению к динитрилам, но некоторой селективностью обладают и нитрилгидратазы.
Так нитрилгидратаза из бактерий Rhodococcus erythropolis при гидролизе 2,6; и 2,4;дицианпири;
динов после первых 10 минут реакции образуют амиды цианкарбоновых кислот с выходами 83 и
97%, а через 2 часа главным продуктом являются диамиды пиридиндикарбоновых кислот, а через
118 часов сами пиридикарбоновые кислоты (схема 8) [76].
CN
CONH2
нитрилгидратаза/амидаза
Rhodococcus erythropolis
10 мин
N
N
CN
CN
118 часов нитрилаза
Fusarium solani
2 часа
CONH2
COOH
N
N
CONH2
CN
118 часов
COOH
N
COOH
Схема 8. Биокаталитические превращения 2,6;дицианопиридина.
3.2. Регио (E/Z)4селективность
Многие нитрилазы способны гидролизовать α,β;ненасыщенные нитрилы. В случае исполь;
зования смеси E,Z;изомеров предпочтение отдается, как правило, Е;изомеру, т.е. образуется
преимущественно Е;карбоновая кислота [80, 81, 48].
В работе [81] подробно изучен ферментативный гидролиз (E,Z);2;метил;2;бутенонитрила.
Нитрилаза из бактерий Acidovorax facilis 72W гидролизует только Е;изомер даже при большом
избытке фермента и длительном времени гидролиза. (Е);2;Метил;2;бутеновая кислота в виде
аммонийной соли легко отделяется от (Z);2;метил;2;бутенонитрила. (Е);2;Метил;2;бутеновая
кислота носит название тиглиновой, а ее Z;изомер – ангеликовой. Оба соединения являются
важными промежуточными продуктами при синтезе фармпрепаратов и душистых веществ.
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
386
ДЕБАБОВ, ЯНЕНКО
Интересно, что региоселективностью обладают и нитрилгидратазы и амидазы. В той же рабо;
те смесь (E,Z);2;метил;2;бутенонитрила гидролизовали клетками бактерий Comamonas testoster4
oni, несущими нитрилгидратазную и амидазную активность. Оказалось, что и нитрилгидратаза и
амидаза предпочтительно гидролизуют Е;изомер. После длительного гидролиза Е;нитрил коли;
чественно превратился в Е карбоновую кислоту, а Z;нитрил подвергся только частичному гидро;
лизу до амида (около 15%) [81].
3.3. Энантиоселективность
Наибольшей энантиоселективностью среди рассматриваемых ферментов обладают амидазы,
наименьшей – нитрилгидратазы.
Нитрилазы осуществляют, как правило, энантиоселективный гидролиз нитрилов, но лишь
для определенных субстратов и условий реакции энантиомерный избыток (ее) превышает 90%.
Известен процесс получения (S);ибупрофена из рацемического 2;(4;изобутилфенил)пропио;
нитрила с помощью нитрилазы Acinobacter AK226 с ее >90% [82]. (S);ибупрофен является широ;
ко используемым нестероидным антивосполительным лекарством, причем биологической ак;
тивностью обладает только (S);изомер.
Энатиоселективность нитрилаз зависит от аминокислот, примыкающих к активному центру
фермента. Так замена Trp164Ala в нитрилазе из Alcaligenes faecalis ATCC 8750 превращает высоко
R;специфическую нитрилазу в фермент, гидролизующий (R,S);нитрил миндальной кислоты
преимущественно в S;амид [83]. Найдены аминокислотные замены, влияющие на соотношения
амида и кислоты при гидролизе нитрилов. Так в нитрилазе из Pseudomonas fluorescens EBC191 за;
мена Cys163 на аспарагин или глутамин заметно увеличивает количество амида, а замена на ала;
нин или серин снижает количество амида [84].
В природе существуют нитрилазы как с R; так и с S;специфичностью. Фирма Диверса прове;
ла скрининг на основании ДНК 600 биотопов и обнаружила более 137 уникальных нитрилаз [85].
Среди них были найдены нитрилазы, гидролизующие рацемический 3;гидроксиглутаронитрил,
до оптически активных (S);4;циано;3;гидроксиглутаровой кислоты (фермент 4А2) и (R);4;циа;
но;3;гидроксиглутаровой кислоты (ферменты 1А8 и 1А9) с величинами ее более 90% и более 95%
соответственно. Эти соединения – важные интермедиаты при синтезе лекарства, снижающего
синтез холестерина;липитора (Lipitor), относящегося к классу статинов [85]. В этой же работе
найдены нитрилазы с (S); и (R);селективностью для нитрила миндальной кислоты и для фенил;
ацетальдегидциангидрина.
Нитрилгидратазы. В литературе описано около 20 нитрилгидратаз, обладающих энантиосе;
лективностью [86]. Как правило, эти ферменты обладают низкой энантиоселективностью
(ее 550%) [87–89]. Лишь в редких случаях и для отдельных субстратов удается получить оптиче;
ски чистые амиды. Так, с помощью нитрилгидратазы из Rhodococcus rhodochrous ATCC BAA;870
получен амид γ;фенокси;β;гидроксимасляной кислоты с ее >99% [90], а с помощью нитрилгид;
ратазы Rhodococcus sp. HTUO;6 – амид миндальной кислоты с ее более 95% и конверсией 98.7% [91].
Нитрилгидратазы в бактериях присутствуют совместно с амидазами, которые обладают высо;
кой энантиоселективностью, что делает возможным использование целых клеток в качестве
катализаторов для получения из нитрилов оптических изомеров карбоновых кислот и их амидов.
4. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА НИТРИЛОВ
ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АМИДОВ И КИСЛОТ
Благодаря уникальным свойствам – высокой хемо;, регио; и энантиоселективности, высокой
удельной активности и стабильности, ферменты нитрилгидратазы, нитрилазы и амидазы нахо;
дят все более широкое применение в органическом синтезе. В этом разделе приведено несколько
примеров коммерческого использования этих ферментов для получения амидов и кислот.
4.1. Биоакриламид
Промышленное получение акриламида с помощью биокатализа является впечатляющим
примером того, как биотехнология может изменить традиционные химические производства.
Акриламид является одним из важнейших продуктов химической промышленности. Поли;
меры на основе акриламида широко используются в различных областях народного хозяйства:
для повышения нефтеотдачи пластов, улучшения структуры почв и удержания в ней влаги,
очистки воды (в качестве флокулянтов), производства бумаги и др. Широко известно примене;
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НИТРИЛОВ
387
ние гелей полиакриламида в молекулярной биологии и медицине для электрофоретического
разделения белков, определения последовательности ДНК, для иммобилизации ферментов.
Мировое производство акриламида в 2008 г. превысило 500 тыс. тонн в год.
К настоящему времени в мире реализовано три промышленных способа получения акрила;
мида – сернокислотный, каталитический и биокаталитический [92, 93]. Во всех трех способах
акриламид образуется при гидратации акрилонитрила.
И сернокислотный (устаревший) и Cu;каталитический (наиболее распространенный в мире)
обладают значительными недостатками. Акриламид, полученный гидратацией акрилонитрила
на медно;никелевых катализаторах, содержит в качестве основных примесей ионы металлов пе;
реходной валентности (от растворения катализатора), акриловую кислоту и побочные продукты
реакции по двойной связи акрилонитрила и акриламида. Для получения растворов акриламида
высокого качества требуется многоступенчатая очистка от остаточного акрилонитрила, ионов
металлов и побочных продуктов. Общим недостатком как сернокислотного, так и каталитиче;
ского методов является получение разбавленных (6–20%;ных) водных растворов акриламида,
требующих дорогостоящего вакуумного концентрирования до принятой в мире стандартной то;
варной формы – 40 или 50% растворов акриламида. Кроме того, для традиционных процессов
характерным является образование значительных количеств стоков за счет регенерации приме;
няемых в процессе очистки ионообменных смол, высокие капитальные вложения по созданию
или реконструкции действующих производств, а также сложность самого технологического про;
цесса.
Биокаталитический метод основан на применении в качестве катализаторов гидролиза акри;
лонитрила микробных клеток, обладающих высокой нитрилгидратазной активностью. Предпо;
сылки для развития этого метода появились в 70;ых годах, когда был изолирован штамм бакте;
рий Brevibacterium sp. R312, обладавший способностью трансформировать нитрилы в амиды [94,
95]. А уже в середине 80;х годов прошлого века появилось первое промышленное производство
биоакриламида, созданное японской компанией Nitto Chemical Ltd. [93]. С тех пор достигнуты
значительные успехи в совершенствовании технологии получения биоакриламида. В настоящее
время в мире уже свыше 25% акриламида производиться с помощью биокатализа (в Китае – свы;
ше 40%).
Все используемые в мире промышленные биотехнологии основаны на использовании биока;
тализаторов, имеющих японское, российское или китайское происхождение (таблица). Про;
мышленные биокатализаторы созданы на основе клеток актиномицетов (родококки или накар;
дии), содержащих нитрилгидратазы Со;типа. В отличие от штаммов В23, J1 и RS1, штамм М33
обладает конститутивным синтезом нитрилгидратазы и не требует никаких индукторов [96].
Штамм М33 является мутантом природного штамма М8, полученным с помощью генетических
манипуляций [96]. Было обнаружено, что синтез нитрилгидратазы в штаммах М8 и М33 подвер;
жен сложной регуляции, в том числе углеродной и азотной катаболитной репрессии [97, 98].
Детальное изучение влияния кобальта на нитрилгидратазу в штаммах М8 и М33 позволило
открыть принципиально новый механизм регуляции металло;зависимых ферментов. Ионы
кобальта, входящие в состав простетической группы фермента, усиливали транскрипцию гена
нитрилгидратазы [99]. Такой механизм регуляции позволяет блокировать образование нитрил;
гидратазы уже на ранней стадии, если в среде отсутствуют необходимые условия для активности
фермента.
В результате генетического изменения штамма М33, оптимизации состава сред и режимов
культивирования удалось обеспечить наивысший уровень активности при промышленном куль;
тивировании (таблица). Двухстадийная система культивирования на глюкозе и ацетате позволи;
ла получить культуры с активностью свыше 5000 ед/мл [100].
Еще одним достоинством биокатализатора М33 является низкая амидазная активность (по;
чти в 100 раз ниже, чем у J1), что блокирует дальнейший гидролиз акриламида [96].
В случае биокатализаторов J1 и RS1 проблема остаточной амидазной активности решается пу;
тем снижения температуры процесса до 4°С [101, 102]. Однако при этом одновременно снижает;
ся НГ активность биокатализатора (в 2.3 раза на каждые 10°С) и возрастают энергетические
затраты на поддержание такой температуры, при том что реакция гидролиза имеет экзотермиче;
ский характер. Низкий уровень амидазной активности и высокая термостабильность М33 позво;
ляют проводить процесс при 20°С. Приведенные характеристики дают основание утверждать,
что созданный в ГосНИИгенетика биокатализатор М33 является на настоящий момент лучшим
среди промышленных биокатализаторов. На штамм М33 и разработанные на его основе процес;
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
388
ДЕБАБОВ, ЯНЕНКО
Сравнение промышленных биокатализаторов для получения акриламида
Биокатализаторы*
Показатели
B;23
J1
M33
RS1
Разработчики
Университет Киото, Университет Киото, ГосНИИгенетика, Институт биохими;
Япония
Япония
Россия
ческой инженерии,
Китай
Бактерии продуцен;
Pseudomonas
Rhodococus
Rhodococus
Nocardia sp.
ты НГ
chlororaphis
rhodochrous
rhodochrous
Синтез НГ
Индуцибельный
Индуцибельный
Конститутивный
Индуцибельный
Удельная актив;
85
76
250
НД
ность, ед/мг клеток
Активность культу;
1400
2100
>5000
>10000
ры, ед/мл (20°C)
(лабораторный
уровень)
Температура полу;
4
4
18–20
4
чения АА, °C
Амидазная актив;
Низкая
0.967
0.015
НД
ность, ед/мг
Конечная концен;
27
45
50
45
трация АА, %
* Показатели для B23, J1, M33 и RS1 взяты из работ [93, 96, 102], соответственно.
сы получения амидов выданы патенты России и многих стран мира [103, 104]. С использованием
биокатализатора М33 акриламид производится в РФ (г. Пермь) и в Республике Корея (г. Ульсан).
Комплекс уникальных свойств БК М33 позволяет предельно упростить процесс получения
акриламида. Сегодня промышленная технология получения биоакриламида, разработанная в
ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов совместно с его Саратовским
филиалом (в настоящее время ЗАО “Биамид”) и Саратовским филиалом НИИ полимеров,
выглядит следующим образом: в термостатированную емкость с мешалкой, содержащую очи;
щенную обессоленную воду, помещают рассчитанное количество катализатора (в виде частиц
полиакриламида, содержащих несколько клеток М33) и вводят в реактор акрилонитрил, так,
чтобы его концентрация не превышала 0.5%. В реакторе поддерживается температура 18–20°С.
Через 5–6 часов концентрация акриламида достигает 50%. БК отделяют от раствора с помощью
фильтрации. Готовый продукт представляет собой товарный продукт высокого качества – 50%
раствор акриламида (свыше 99% чистоты), пригодный для полимеризации без дополнительной
очистки [105].
Таким образом, биокаталитический способ получения акриламида выгодно отличается от
разработанных ранее традиционных химических способов – сернокислотного и каталитическо;
го, высокой степенью селективности и конверсии гидратации акрилонитрила, мягкими услови;
ями проведения процесса, чистотой получаемого продукта, низкими энергетическими затрата;
ми, экологической безопасностью. Тенденция замещения традиционной технологии получения
акриламида на биокаталитическую стала устойчивой и необратимой. В настоящее время биотех;
нологический метод получения акриламида используется уже в 4 странах – Японии, России,
Китае и Южной Корее.
Биокатализаторы, разработанные для получения акриламида, вследствие широкой специ;
фичности ферментов нашли применение для получения других амидов.
Фирма Lonza Guangzhou Fine Chemicals (Guangzhou, China) использовала биокатализатор J1
для получения никотинамида (витамин В3) из 3;цианпиридина [106]. Биокатализатор обеспечи;
вает высокую селективность (>99.3%) при 100% конверсии, в то время как при традиционном
процессе гидролиза 3;цианпиридина в щелочных условиях образуется около 4% никотиновой
кислоты в качестве побочного продукта. Общий годовой объем производства никотинамида
превышает 3000 тонн. Показано, что биокатализатор М33 также эффективен для получения ни;
котинамида. В реакторе периодического типа с подпиткой 3;цианпиридином удается за 5–6 ча;
сов получить 450 г/л никотинамида с содержанием никотиновой кислоты менее 0.05% [96].
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НИТРИЛОВ
389
Еще один биокатализатор Pseudomonas chlororaphis B23, который использовался фирмой Nitto
Chem. Ind. для производства акриламида, оказался очень эффективным для получения 5;циано;
валероамида (5;CVAM) из адипонитрила. 5;CVAM является исходным сырьем для синтеза гер;
бицида азафенидина (azafenidin). Продуктивность биокатализатора (клетки В23, имобилизован;
ные в альгинатном геле) превысила 3000 кг 5;CVAM на 1 кг биокатализатора при конверсии 97 и
96% селективности [107]. При использовании в качестве катализатора двуокиси марганца про;
дуктивность не превышала 1 кг на 1 кг катализатора при 25% конверсии.
4.2. Акрилат аммония
Акриловая кислота и ее соли являются самыми востребованными акриловыми мономерами с
объемами производства, превышающими 3 млн. тонн/год [92]. Основным промышленным спо;
собом получения акриловой кислоты в настоящее время является парофазное окисление пропи;
лена [92]. В то же время при небольших объемах производства конкурентоспособным становится
способ получения акриловой кислоты гидролизом акрилонитрила с помощью микробных ката;
лизаторов. Производство акриловой кислоты с помощью биокатализа может быть создано непо;
средственно у потребителя. Такой подход был реализован на предприятии “Ашленд МСП”,
Пермь, которое для собственных нужд (для производства флокулянтов) выпускает сотни тонн
акрилата аммония с помощью биокатализа. В качестве катализатора используются штамм Alcali4
genes sp. C32 и его мутант [108].
4.3. Альфа4оксикарбоновые кислоты
Наиболее простым путем, приводящим к α;оксикислотам, является гидролиз циангидринов
(α;оксинитрилов). Препятствием к использованию циангидринов является их неустойчивость в
водных растворах, приводящая к выделению цианидов, ингибирующих нитрилгидролизующие
ферменты. В случае нитрилгидратазы цианиды, по;видимому, образуют стабильный комплекс с
металлом активного центра. Большинство известных нитрилгидратаз проявляют высокую чув;
ствительность к цианидам (константы ингибирования для цианида варьируют от 0.01 до 20 мM)
[109, 110]. В присутствии циангидринов нитрилгидратазы очень быстро теряют активность.
Вследствие высокой чувствительности нитрилгидратаз к цианидам энзиматический гидролиз
циангидринов до сих пор не имеет промышленного значения. Недавно, были обнаружены штам;
мы, содержащие нитрилгидратазы, устойчивые к 50 мM цианида [111]. Эти ферменты были
использованы для гидролиза ацетонциангидрина и получения α;гидроксиизобутирамида –
синтетического предшественника метакриламида. При оптимальных условиях реакции (4°С и
ступенчатое добавление субстрата) удается получить 140 г α;гидроксиизобутирамида в 1 л за 5 ч
реакции [112]. Использование цианид;резистентных нитрилгидратаз в комбинации с стереосе;
лективными амидазами позволяет получать энантиомеры α;оксикислот [113].
Нитрилазы более устойчивы к действию продуктов спонтанного гидролиза циангидринов.
Уже разработан промышленный процесс получения гликолевой кислоты из гликолонитрила с
помощью нитрилазы (см. далее). Нитрилазы также позволяют получать оптически чистые изо;
меры альфа;оксикислот. Существует два подхода для получения таких изомеров. Первый подход
основан на использовании энантиоселективных нитрилаз [114], которые из рацемической смеси
нитрила позволяют получить только требуемый изомер, например, (R);миндальную кислоту (см.
далее). Второй путь основан на использовании энантиоконсервативных нитрилаз [115], которые
способны трансформировать оптически чистые (R); или (S);изомеры циангидрина в хиральные
(R); или (S);изомеры кислот без изменения оптической активности. Сегодня этот подход широ;
ко используется в органическом синтезе, так как в последние годы созданы биокатализаторы на
основе (R); или (S);оксинитрилаз, которые катализирую процесс стереоселективного получения
(R); или (S);изомеров циангидринов из альдегидов или кетонов и цианида [116].
Гликолевая кислота (Glycolic acid). Гликолевая кислота (ГК) является наиболее простой по
строению α;оксикарбоновой кислотой. ГК используется как мономер в получении биосовме;
стимых и биодеградируемых полимеров (полигликолевая кислота, полимеры на основе сополи;
меризации молочной и гликолевой кислот и др.). Благодаря уникальной способности проникать
в кожу она используется в различных продуктах по защите кожи.
Гликолевая кислота в настоящее время преимущественно производится из формальдегида и
оксида углерода в присутствии кислоты при высокой температуре и давлении [117]. Этот процесс
осложняется образованием нежелательных побочных продуктов, разрушением гликолевой кис;
лоты и спонтанной полимеризацией.
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
390
ДЕБАБОВ, ЯНЕНКО
В настоящее время описан гибридный химико;энзиматический процесс получения ГК из
формальдегида и цианистого водорода (схема 9) [118]. При их взаимодействии в водной среде об;
разуется гликолонитрил, гидролизуемый под действием нитрилазы в гликолат аммония, кото;
рый с помощью ионообменной хроматографии переводится в свободную гликолевую кислоту.
HO
HO O
+
нитрилаза
−
H
C
C
N
H
HCHO + HCN >99%
2
2C C O NH4
>99%
гликолонитрил
гликолат
HO O
H2C C OH
гликолевая
кислота
Схема 9. Гибридный химико;энзиматический процесс получения гликолевой кислоты.
Созданный биокатализатор (иммобилизованные клетки E. coli с рекомбинантной нитрила;
зой) позволяет получать 3.2 М растворы гликолата аммония в реакторах непрерывного действия
и демонстрирует в этих условиях продуктивность, превышающую 1000 г гликолевой кислоты на
1 г клеток по сухому весу [119].
В настоящее время биокаталитический процесс получения гликолевой кислоты реализован
фирмой CrossChem [120]. Конечным продуктом является либо кристаллическая ГК или еe 70%
водный раствор.
(R)@Миндальная кислота. Наиболее интенсивно на протяжении многих десятилетий исследо;
вался процесс гидролиза нитрила миндальной кислоты под действием R;специфических нитри;
лаз, с образованием (R);миндальной кислоты, которая широко используется в разделении энан;
тиомеров. Нитрил миндальной кислоты рацемизуется в водных растворах при нейтральных рН
вследствие обратимого отщепления синильной кислоты, поэтому при гидролизе рацемицеского
нитрила под действием нитрилазы выход (R);изомера кислоты теоретически может составлять
100% (схема 10).
O
C
OH
H
+ HCN
CN
OH
OH
+
CN
COOH
нитрилаза
Схема 10. Биокаталитический способ получения (R);миндальной кислоты.
Процесс впервые был описан Yamamoto еще в 1991 г. с использованием нитрилазы Alcaligenes
feacalis ATCC8750 [121]. С тех пор опубликован ряд работ из различных лабораторий, целью ко;
торых являются достижение высокой удельной активности, стабильности, а главное, устойчиво;
сти нитрилаз к высоким концентрациям субстрата.
Наилучшие результаты получены при клонировании гена нитрилазы Alcaligenes ECU0401 в
клетках E. coli. Рекомбинантные клетки E. coli устойчивы в присутствии 200 мM нитрила мин;
дальной кислоты и могут использоваться многократно, сохраняя 40% первоначальной активно;
сти после 10 циклов. В процессе с постоянным добавлением нитрила можно получать до 80 г/л
(R);миндальной кислоты с ее выше 99% и почти количественным выходом [122].
Концентрированные растворы (R);миндальной кислоты (12–14%) удалось получить благода;
ря использованию новых нитрилаз и оптимизации условий трансформаций, в том числе за счет
поддержания концентрации альдегида в реакционной смеси на низком уровне [123].
Компании Mitsubishi Rayon и BASF анонсировали создание производства (R);миндальной
кислоты на уровне сотен тонн в год. Оптическая чистота продукта превышает 97%.
К сожалению, с помощью энантиоселективного гидролиза удается получить только один изо;
мер – (R);миндальную кислоту. До последнего времени промышленно значимых (S);селектив;
ных нитрилаз не обнаружено.
4.4. Оптически активные 24метил4 и 2,24диметилциклопропанкарбоновые кислоты и их амиды
Впечатляющим примером совместного использования нитрилгидратазы и амидазы является
синтез оптически активных 2;метил; и 2,2;диметилциклопропанкарбоновых кислот и их произ;
водных. Эти соединения являются ключевыми интермедиатами для синтеза курацина (curacin A) –
мощного антимитототического агента и циластатина (cilastatin) – ингибитора почечной дегид;
ропептидазы, обычно вводимого в организм совместно с антибиотиками, пинемом (penem) и
карбопинемом (carbopenem) для предотвращения их деградации в почках.
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НИТРИЛОВ
391
Широкий скрининг бактериальных штаммов позволил обнаружить бактерии Rhodococcus
erythropolis ATCC2544, которые превращали 2,2;диметилциклопропанкарбонитрил в (S);2,2;ди;
метилциклопропанкарбоновую кислоту. Однако продукт обладал оптической чистотой лишь
81.8% [124]. В 2007 г. китайские авторы обнаружили бактерии Delftia tsuruhatensis ZJB;05174, спо;
собные к (R);энантиоселективному гидролизу 2,2;диметилциклопропанкарбоксамида [125].
Амидаза из этого штамма была клонирована в бактерии E. coli и экспрессирована под промото;
ром РНК;полимеразы фага Т7. Рекомбинантный штамм синтезирует большое количество ами;
дазы (5255 ед/л в 100 л ферментере). На базе этого катализатора разработан промышленный про;
цесс получения (S);диметилциклопропанкарбоксамида с ее 99.32% (схема 11) [126].
(R);стереоселективная
амидаза
+
COOH
(R);кислота
CONH2
CONH2
(S);амид
Схема 11. Получение (S);диметилциклопропанкарбоксамида с помощью (R);специфичной амидазы.
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И БУДУЩИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ
Уже сегодня свыше 10 промышленных химических процессов базируются на использовании
нитрилгидролизующих ферментов. С помощью этих ферментов получают как крупнотоннаж;
ные продукты (сотни и тысячи тонн), так и стереоизомеры для синтеза фармпрепаратов (на
уровне граммов и килограммов). Благодаря хемо;, регио; и энантиоселективности нитрилгидро;
лизующих ферментов стало возможным получать соединения, труднодоступные для традицион;
ного органического синтеза.
Основные ограничения применения этих ферментов связаны с их узкой субстратной специ;
фичностью, нестабильностью (по отношению к температуре, рН или присутствию органических
растворителей), а также высокой стоимостью.
Значительная часть этих ограничений может быть принципиально преодолена с использова;
нием современных методов – высокопроизводительного скрининга уникальных ферментов в
природе, генетического конструирования штаммов;сверхпродуцентов нужных ферментов;
улучшения свойств ферментов с помощью сайт;специфического мутагенеза или методов на;
правленной эволюции; а также с помощью иммобилизации клеток или ферментов.
Таким образом можно с уверенностью утверждать, что применение ферментов для гидролиза
нитрилов уже в ближайшем будущем станет стандартной операцией для получения широкого
круга амидов и органических кислот.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Conn E.E. Cyanide in biology / Eds. Vennesland B., Conn E.E., Knowles C.J., Westly Y., Wissing F. (London:
Academic Press, 1981) P. 183.
2. Asano Y., Tani Y., Yamada H. // Agric. Biol. Chem. 1980. V. 44. P. 2251.
3. Cowan D.A., Cameron R.A., Tsokoa T.L. // Adv. Appl. Microbiology. 2003. V. 52. P. 123.
4. Foertner K.U., Doerks T., Muller J., Raes J, Bork P. // PLoS ONE. 2008. V. 3. № 12. P. e3976.
5. Maier4Greiner U.H., Obermaier4Skobranek B.M.M., Estemaier L.M., Kammerloher W., Freund C., Wulfing C.,
Burkert U.J., Matern D.H., Brener M., Eulitz M., Kufrevioglu O.J., Hartman G.R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
1991. V. 88. P.4260.
6. Okamoto S., Eltis L.D. // Mol. Microbiol. 2007. V. 65. №. 3. P. 828.
7. Nakajima Y., Doi T., Saton Y., Fujiwara A., Watanabe I. // Chem. Lett. 1987. V. 9. P. 1767.
8. Bonnet D., Artaud I., Moali C., Petre D., Mansuy D. // FEBS Lett. 1997. V. 409. P. 216.
9. Endo I., Yohda M., Okada M. // Trends Biotechnol. 1999. V. 17. P. 244.
10. Tsujimura M., Dohmae N., Odaka M., Chijimatsu M., Takio K., Yohda M., Hoshino M., Nagashima S., Endo I. //
J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 29454.
11. Nagashima S., Nakasako M., Dohmae N., Tsujimura M., Takio K., Odaka M., Yohda M., Kamiya N., Endo I. //
Nat. Struct. Biol. 1998. V. 5. P. 347.
12. Sari M.4A., Jaonen M., Saroja N.R., Artaud I. // J. Inorg. Biochemistry. 2007. V. 101. P. 614.
13. Huang W.J., Jia J., Cummings J.G., Nelson M.J., Schneider G., Lindqvist Y. // Structure. 1997. V. 5. P. 691.
14. Miyanaga A., Fushinobu S., Ito K., Wakagi T. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 288. P. 1169.
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
392
ДЕБАБОВ, ЯНЕНКО
15. Hourai S., Miki M., Takashima Y., Mitsuda S., Yanagi K. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 312.
P. 340.
16. Nojiri M., Nakayama H., Odaka M., Yohada M., Takio K., Endo I. // FEBS Lett. 2000. V. 465. P. 173.
17. Endo I., Nojiri M., Tsujimura M., Nakasako M., Nagashima S., Yohada M., Okada M. // J. Inorg. Biochem.
2001. V. 83. P. 247.
18. Nojiri M., Yohada M., Okada M., Matsushita Y., Tsujimura M., Yoshida T., Dohmae N., Takio K., Endo I. //
J. Biochem. 1999. V. 125. P. 696
19. Nishiama M., Horinonchi S., Kobayashi M., Nagasawa T., Yamada H., Berru T. // J. Bacteriol. 1991. V. 173.
P. 2465.
20. Wu S., Fallon R.D., Payne M.S. // Appl. Microbiol., Biotechnol. 1997. V. 48. P. 704.
21. Hashimoto Y., Nishiyama M., Horinonchi S., Berru T. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. V. 58. P. 1859.
22. Komeda H., Kabayashi M., Shimizu S. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 15796.
23. Komeda H., Kabayashi M., Shimizu S. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 4267.
24. Яненко А.С. Дис. ... докт. биол. наук. (М: ГосНИИгенетика, 2001).
25. Zhou Z., Hashimoto Y., Shira K., Kobayashi M. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. P. 14849.
26. Nohuchi T., Nojiri M., Takei K., Odaka M., Kamiya N. // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 11642.
27. Zhou Z., Hashimoto Y., Kobayashi M. // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. P. 14930.
28. Zhou Z., Hashimoto Y., Cui T., Washizawa Y., Mino H., Kobayashi M. // Biochemistry, 2010. V. 49. P. 9638.
29. Stevens J.M., Saroja R., Jaonen M., Belghazi M., Schmiter D., Mansuy I., Artand I., Sari M.A. // Protein Expr.
Purif. 2003. V. 29. P. 70.
30. Doan P.E., Gurbiel R.J., Cummins J.C., Nelson M.J., Hoffman B.M. // J. Inorg. Biochem. 1999. V. 74. P. 116.
31. Miyanaga A., Fushinoba S., Ito K., Shoun H., Wakagi T. // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 429.
32. Sugiura Y., Kuwahara J., Nagasawa T., Yamada H. // J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 5848.
33. Murakami T., Nojiri M., Nakayama H., Odaka M., Yohda M., Dohmae N., Takio K., Nagamune T., Endo I. // Protein
Sci. 2000. V. 9. P. 1024.
34. Tsujimura M., Odaka M., Nakayama H., Dohmae N., Koshino H., Asami T., Hosgino M., Takio K.,Yoshida S.,
Maeda M., Endo I. // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 11532.
35. Hashimoto K., Suzuki H., Taniguchi K., Noguchi T., Yohda M., Odaka M. // J. Biol. Chem. 2008. V. 283.
P. 36617.
36. Taniguchi K., Murata K., Murakami Y., Takahashi S., Nakayama H., Hashimoto K., Koshino H., Dohame N.,
Yohda M., Hirose T., Maeda M., Odaka M. // J. Bioscience and Bioeng. 2008. V. 106. P. 174.
37. Yono T., Wasada4Tsatsui Y., Ari H., Yamaguchi S., Funahashi Y., Osawa T., Masada H. // Inorg. Chem. 2007.
V. 46. P. 10345.
38. Hopmann K.H., Guo I.D., Himo F. // Inorg. Chem. 2007. V. 46. P. 4850.
39. Thimann K.V., Mahadevan S. // Arch. Biochem. Biophys. 1964. V. 107. P. 62.
40. Chen J., Zheng Ren4Chao, Zheng Yu4Guo, Shen Yin4Chu // Adv. Biochem Engin. Biotechnol, Berlin Heidel;
berg, 2009. V. 113. P. 37.
41. Martinkova L., Kzen V. // Current Opinion in Chem. 2010. V. 14. P. 130.
42. De Santis G., Zhu Z., Greenberg W.A., Wong K., Chaplin J., Hanson S.R., Farwell B., Nicholson L.W., Rand C.L.,
Weiner D.P. // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 9024.
43. Brenner C. // Cur. Opinion in Structural Biology. 2002. V. 12. P. 775.
44. Kim S., Tiwari M.K., Moon H.J., Yeya M., Ram H.T., Oh D.K., Kim J.W., Lee J.K. // Appl. Microbiol. Biotech;
nol. 2009. V. 83. P. 272.
45. Kobayashi M., Shimizu Y. // FEBS Microbiol. Lett. 1994. V. 120. P. 217.
46. Thuku R.N., Brady D., Benedik M.J., Sewell B.T. // J. Appl. Microbiol. 2009. V. 106. P. 703.
47. Harper D.B. // J. Biochem. 1977. V. 165. P. 309.
48. Stevenson D.E., Feng R., Dumas F., Groleau D., Mihoc A., Storer A.C. // Biotechnol. Appl. Biochem. 1992. V. 15.
P. 283.
49. Hoyle A.J., Bunch A.W., Knowles C. J. // Enzyme and Microbial Technology. 1998. V. 23. P. 475.
50. Nagasawa T., Weiser M., Nakamura T., Iwahara H., Yoshida T., Gekko K. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267.
P. 138.
51. Sewell B.T., Berman M.N., Meyers P.R., Jandhyala D., Benedik M.J. // Structure. 2003. V. 11. P. 1.
52. Thuku R.N., Weber B.W., Varsani A., Sewell B.T. // FEBS J. 2007. V. 274. P. 2099.
53. Yeom S.J., Kim H.J., Lee J.K., Kim D.E., Oh D.K. // J. Biochem. 2008. V. 415. P. 401.
54. Kobayashi M., Goda M., Shimizu S. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 253. P. 662.
55. Piotrowski M., Schönefelder S., Weiler E.W. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 2616.
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЙ ГИДРОЛИЗ НИТРИЛОВ
393
56. Fernandes B.C.M., Mateo C., Kiziak C., Chmura A., Wacker J., van Rantwijk, Stolz A., Sheldon R.A. // Adv.
Synth. Catal. 2006. V. 348. P. 2597.
57. Martinkova L., Vejvoda V., Kaplan O., Kubac D., Malandra A., Cantarella M., Bezonska K., Kren V. // Biotech;
nol. Adv. 2009. V. 27. P. 661.
58. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa T., Yamada H. // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 4807.
59. O’Relly C., Turner P.D. // J. Appl. Microbiol. 2003. V. 95. P. 1161.
60. Pace H., Brenner C. // Genome Biology, 2001. V. 2. P. 1.
61. Перцович С.И., Гуранда Д.Т., Подчерняев Д.А., Котлова Е.К., Яненко А.С., Швядас В.К. // Биохимия.
2005, Т. 70. С. 1556.
62. Chebron H., Bigey F., Arnand A., Galzy P. // Biochem. Biophys. Acta. 1996. V. 1298. P. 285.
63. Ohtaki A., Murata K., Sato Y., Noguchi K., Miyatake H., Dohmae N., Yamada K., Yohda M., Odaka M. // Bio;
chem. Biophys. Acta. 2010. V. 1804. P. 184.
64. Shin S., Lee T.H., Na N.C., Koo H.M., Kim Y.S., Lee H.S., Kim Y.S., Oh B.H. // EMBO J. 2002. V. 21. P. 2509.
65. Shin S., Yan Y.S., Koo H.M., Kim Y.S., Choi K.Y., Oh B.H. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 24937.
66. Fournand D., Arnand A. // J. Appl. Microbiol. 2001. V. 91. P. 381.
67. Backles R.E., Thelen C.J. // Anal. Chem. 1950. V. 22. P. 676.
68. Kobayashi M., Goda M., Shimizu S. // FEBS Lett. 1998. V. 439. P. 325.
69. Snell D., Colby I. // Enzyme. 1999. V. 24. P. 160.
70. Wang M.X., Feng G.Q. // Tetrahedron Lett. 2000. V. 41. P. 650.
71. Doran J.P., Duggan P., Masterson M., Turner P.D., O’Relly C. // Protein Expression Purification. 2005. V. 40.
P. 190.
72. Shaw N.M., Nanghton A.B. // Tetrahedron Lett. 2004. V. 60. P. 747.
73. Pat. WO 9801568.
74. Heinemann U., Kiziak C., Zibek S., Layh N., Schmidt M., Griengel H., Stolz A. // Appl. Microbiol. Biotechnol.
2003. V. 63. P. 274.
75. Kobayashi M., Yanaka N., Nagasawa T., Yamada H. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. V. 29. P. 231.
76. Nakai T., Hasegawa T., Yamashita E., Yamamoto M., Kumasaka T., Ueki T., Nanbu H., Ikenaka Y., Takahashi S.,
Sato M. // Structure. 2000. V. 8. P. 729.
77. Bengis4Garber C., Gutman A. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. V. 32. P. 11.
78. Gavagan J., Fager S., Fallon R., Folsom P., Herkes F., Eisenberg A., Hann E., Di Casimo R. // J. Org. Chem.
1998. V. 63. P. 4792.
79. Effenberger F., Osswald S. // Synthesis. 2001. V. 12. P. 1866.
80. Effenberger F., Osswald S. // Tetrahedron Asymmetry. 2001. V. 12. P. 2581.
81. Hann E., Sigmund A., Fager S., Cooling F., Gavagan J., Bramucci M., Chanhan S., Payen M., Di Cosimo R. // Tetra;
hedron Asymmetry. 2004. V. 60. P. 577.
82. Yamamoto K., Ueno Y., Otsubo K., Kawakami K., Komatsu K.I. // Appl. Envirron. Microbiol. 1990. V. 56.
P. 3125.
83. Kiziak C, Klein J., Stolz A. // Protein Eng. 2007. V. 20. P. 385.
84. Kiziak C., Stolz A. // Appl. Environ. Microbiol. 2009. V. 75. P. 5592.
85. Robertson D.E., Chaplin J.A., De Santis G., Podar M., Madden M., Chi E., Richardson T., Milan A., Miller M.,
Weiner D.P., Wong K., McQuaid J., Farwell B., Preston L.A., Tan X., Snead M.A., Keller M., Mathur E.,
Kretz P.L. Bark M.J., Short J.M. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70. P. 2429.
86. Sosedov O., Baum S., Bûrger S., Matzer K., Kiziak C., Stolz A. // Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 76. P. 3668.
87. Prasad S., Bhalla T.C. // Biotechnol. Adv. 2010. V. 28. P. 725.
88. Fallon R.D., Steiglitz B., Tumer I. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 47. P. 156.
89. Baner R., Knackmuss H;J., Stolz A. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 49. P. 89.
90. Prepechalova I., Martinkova L., Stolz A., Ovesna M., Bezonska K., Kopecky J. // Appl. Microbiol. Biotechnol.
2001. V. 55. P. 150.
91. Knife H.H., Chiba V., Frederick J., Bode M.L., Mathiba K., Steenkamp P.A. // J. Mol. Catal. B. Enzym. 2009.
V. 59. P. 231.
92. Платэ Н.А., Сливинский Е.В., Основы химии и технологии мономеров (М: Наука, 2002).
93. Kobayashi M., Nagasawa T., Yamada H. // Trends in Biotechnol. 1992. V. 10. P. 402.
94. Am. Pat. 400081.
95. Bui K., Arnaud A., Galzy P. // Enzyme Microbiol. Technol. 1982. V. 4. P. 195.
96. Пат. РФ 2053300.
97. Leonova (Pogorelova) T.E., Astaurova O.B., Ryabchenko L.E., Yanenko A.S. // Appl. Biochem. Biotech. 2000.
V. 88. P. 231.
7 ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011
394
ДЕБАБОВ, ЯНЕНКО
98. Астаурова О.Б., Леонова Т.Е., Полякова И.Н., Синеокая И.В., Гордеев В.К., Яненко А.С. // Прикл. био;
химия и микробиология. 2000. Т. 36. С. 21.
99. Pogorelova T., Ryabchenko L., Sunzov N., Yanenko A. // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 144, P. 191.
100. Germ. Pat. 10315376.
101. Yamada H., Kobayashi M. // Biosci.Biotech.Biochem. 1996. V. 60. P. 1391.
102. Liu M., Li C., Huang Y., Gao Y. // Chinese J. Process Engineer. 2004. V. 4. P. 250.
103. Am. Pat. 5827699.
104. Germ. Pat. 4480132.
105. Пат. РФ 2077588.
106. Chassin C. // Spec. Chem. 1996. V. 16. P. 102.
107. Hann E.C., Eisenberg A., Fager S.K., Perkins N.E., Gallagher F.G., Cooper S.M., Gavagan J.E., Stieglitz B., Hen4
nessey S.M., DiCosimo R. // Bioorg. Med. Chem., 1999. V. 7. P. 2239.
108. Пат. РФ 2337954.
109. Nagasawa T., Nanba H., Ryuno K., Takeuchi K., Yamada H. // Eur. J. Biochem. 1987. V. 162. P. 691.
110. Nagasawa T., Takeuchi K., Yamada H. // Eur. J. Biochem. 1991. V. 196. P. 581.
111. Gerasimova T., Novikov A., Osswald S., Yanenko A. // Eng. Life Sci. 2004. V. 4. P. 543.
112. Пат. EP 1730177.
113. Osprian I., Fechter M.H., Griengl H. // J. Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2003. V. 24–25. P. 89.
114. Yamamoto K., Fujimatsu I., Komatsu K.4I. // J. Ferment. Bioengineer. 1992. V. 73. P. 425.
115. Kiziak C., Conradt D., Stolz A., Mattes R., Klein J. // Microbiol. 2006. V. 151. P. 3639.
116. Fechter M.H., Griengl H. Enzyme Catalysis in Organic Synthesis / Eds. Drauz K., Waldmann H. (Weinheim:
Wiley;VCH, 2002) P. 974.
117. Am. Pat. 7198927.
118. Panova A., Mersinger L.J., Liu Q., Foo T., Roe D.C., Spillan W.L., Sigmund A.E., Ben4Bassat A., Wagner A.W.,
O’Keefe D.P., Wu S., Petrillo K.L., Payne M.S., Breske S.T., Gallagher F.G., DiCosimo R. // Adv. Synth. Catal.
2007. V. 349. P. 1462.
119. Wu S., Fogiel A.J., Petrillo K.L., Jackson R.E., Parker K.N., Dicosimo R., Ben4Bassat A., O’Keefe D.P.,
Payne M.S. // Biotechnol. Bioeng. 2008. V. 99. P. 717.
120. Сайт компании CrossChem: http://www.crosschem.net/glycolic_acid.php
121. Yamamoto K., Oishi K., Fujimatsu I., Komatsu K. // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57. P. 3028.
122. Zhang Z.J., Xu J.H., He Y.C., Ouyang L.M., Liu Y.Y. // Bioprocess Biosyst.Eng. 2010. doi10.1007/s00449;010;0473;z
123. Pat. EP 0773297.
124. Yeom S.4J., Kim H.J., Oh D.K. // Enzyme and Microbiol. Technology. 2007. V. 41. P. 842.
125. Zheng R.C., Wang Y.S., Lin Z.Q., Zheng Y.G., Shen Y.C. // Res. Microbiol. 2007. V. 158. P. 258.
126.Yang Z.Y., Ni Y., Lu Z.4Y., Liao X.R., Zheng Y.4G., Sun Z.4H. // Process Biochemistry. 2010. doi:1016/j.proc;
bio.2010.08.005
ОБЗОРНЫЙ ЖУРНАЛ ПО ХИМИИ
том 1
№4
2011