МЕТОДЫ ГУМАННОЙ ЭВТАНАЗИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ. ПЕРСПЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СОВРЕМЕННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ. ВАХРУШИН Е.В. 05.08.2021 Методы гуманной эвтаназии лабораторных животных. Перспективность использования современных технологий. Вахрушин Е.В. «Сострадание к животным так тесно связано с добротой характера, что можно с уверенностью утверждать: кто жесток с животными, тот не может быть добрым человеком». А. Шопенгауэр. Существует ряд причин, по которым лабораторные животные выводятся из эксперимента и должны быть подвергнуты процедуре эвтаназии, неотъемлемой частью которой является максимально гуманный подход и правильно подобранный метод. Данная статья объединяет в себе основные методы эвтаназии и выделяет допустимые и наиболее гуманные из них, применяемые при работе с лабораторными животными, и в первую очередь с мелкими грызунами. В международной практике существует ряд нормативных документов и директив, которые задают вектор развития гуманного обращения с лабораторными животными. Среди основных документов можно отметить: o Руководства и материалы Федерации европейских научных ассоциаций по лабораторным животным (FELASA, англ. Federation of European Laboratory Animals Science Associations) и Международного совета по науке о лабораторных животных (ICLAS, англ. International Council for laboratory Animal Science). o Директива N 2010/63/ЕС Европейского парламента и Совета Европейского Союза "О защите животных, использующихся для научных целей" (Принята в Страсбурге 22.09.2010). o Руководство по проведению эвтаназии животных «AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition» (США). o Руководство по эвтаназии лабораторных животных, использующихся в научных исследованиях «CCAC Guidelines on: euthanasia of animals used in science» (Канада). Руководящие принципы действующих директив основываются на понимании необходимости соблюдения исследователем биоэтических принципов, известных как концепция «Трех R» (replacement, reduction, refinement) при планировании эксперимента и работе с использованием лабораторных животных, которая гласит: o o o Replacement (Замена). Используйте альтернативные методы испытаний, например, на тканевых культурах (in vitro) в тех случаях, где это возможно. Также на помощь может прийти компьютерное моделирование уже известных процессов и их параметров. При невозможности проведения исследований без использования животных переходите ко второму «R»; Reduction (Уменьшение, сокращение). Сокращайте количество экспериментов до такого числа животных, при котором возможно сделать выводы о применении того или иного препарата или же продолжить в дальнейшем работу с использованием статистической обработки результатов и компьютерного моделирования процессов. Проводите тщательный анализ литературы на предмет осуществления подобных экспериментов с целью их неповторения; Refinement (Улучшение, совершенствование). Совершенствуйте практику работы с животными, для того чтобы снизить или вообще исключить негативные (болевые, вызывающие дискомфорт и стресс) воздействия на животное, в том числе и из-за возможных ошибок персонала. Применяйте неинвазивные (бесконтактные) процедуры там, где это возможно, улучшайте условия содержания животного во время эксперимента, после его проведения, а также обращайте внимание на соблюдение принципов гуманной безболезненной эвтаназии. Согласно принципам гуманной экспериментальной практики, выделяют основные требования, применяемые к эвтаназии лабораторных животных: эвтаназия должна проходить безболезненно и приводить к быстрой потере сознания; сопровождаться остановкой сердца, дыхания и окончательной потерей функций мозга; применяемые методы должны быть надёжными, необратимыми и сводить к минимуму боль и эмоциональный стресс, испытываемые животным до момента потери сознания. В связи с этим методы эвтаназии разделяют на следующие категории: o Допустимые – методы, позволяющие проводить эвтаназию животного безопасно и безболезненно (гуманно) для животного, а также безопасно для персонала; o Условно-допустимые – методы, предполагающие соблюдение определённых условий для проведения эвтаназии, в том числе с использованием высокотехнологичного оборудования; o Недопустимые – методы, негуманные при любых условиях, либо при которых существует большой риск для персонала. При этом, применяемые в работе методики могут быть классифицированы и отнесены по-разному на допустимые, условно-допустимые и недопустимые в рекомендациях разных стран. К примеру, эвтаназия кроликов с использованием контролируемой подачи CO2 согласно Европейской Директиве 2010/63/EU недопустима (см. Таблицу 1) [1], тогда как руководство по проведению эвтаназии животных AVMA (США) допускает использование углекислого газа для эвтаназии кроликов [2]. Следует принять во внимание, что в России согласно ГОСТу 33215-2014 эвтаназия животных должна проводиться с использованием методов, которые соответствуют принципам, изложенным в Рекомендациях Европейской комиссии по эвтаназии экспериментальных животных [3]. Таблица 1. Таблица допустимых и недопустимых методов эвтаназии согласно Европейской Директиве 2010/63/EU [1]. При выборе метода и соответствующей методики эвтаназии необходимо учитывать различные факторы: видовая принадлежность животного, его размер, вес, возраст, физиологические особенности, а также навык персонала и специфику эксперимента. Стоить принять во внимание и тот факт, что разные методики могут оказать воздействие как в целом на организм, так и на отдельные органы грызуна, что может повлиять на получаемые результаты исследований. Поэтому перед экспериментом крайне важно провести оценку метода эвтаназии, отталкиваясь от следующих критериев [4]: o Совместимость с видом, возрастом и состоянием здоровья; o Способность конкретного метода вызывать потерю сознания и смерть без причинения боли, страданий и беспокойства; o Время, требуемое для потери сознания; o Надежность и необратимость; o Совместимость с проводимым экспериментом; o Возможность последующей оценки и использования тканей; o Исключение вероятных ошибок персонала; o Безопасность для персонала при выполнении процедуры; o Эмоциональный эффект, оказываемый на персонал; o Возможность использования специализированного оборудования. На практике наибольшее применение получили методы эвтаназии с использованием инъекционных препаратов (напр. барбитуратов и их производных, комбинации диссоциативных агентов), с применением ингаляционных средств (углекислый газ, закись азота, изофлуран и др.), а также физические методы при исключительном условии квалификации персонала. Инъекции производных барбитуратов по характеру воздействия приводят к угнетению центральной нервной системы и при передозировке (чаще всего используется трехкратное увеличение дозы) наблюдается глубокая анестезия с последующей остановкой сердца. Однако, вероятны болезненные ощущения у животного при внутрибрюшинной инъекции, Рис. 1 [2]. Среди физических методов наиболее часто применяется цервикальная дислокация. В этом случае, при эвтаназии мышей и крыс, большой и указательный пальцы помещаются с обеих сторон шеи у основания черепа или накладывают металлический ограничитель у основания черепа, при этом другой рукой делают рывок за основание хвоста или задних конечностей, производя отрыв позвоночника от черепа [4]. Любой из вышеперечисленных методов требует обязательной подготовки персонала. Рис. 1. Пример введения внутрибрюшинной инъекции. Все мероприятия и процедуры, проводимые при эвтаназии грызунов, должны не только соответствовать виду животного, но и планироваться заранее во избежание возникновения дистресса. Сюда можно отнести транспортировку или переноску животного к месту процедуры, обращение с животным, исключение проведения процедуры совместно с другим видом. К примеру, проводя процедуру эвтаназии мышей и крыс в одном помещении не стоит начинать с хищников – крыс, так как после этого мыши могут учуять выделяемые крысами феромоны и испытывать чувство страха и паники. Умерщвление животных не должно производиться в помещении, где содержатся другие животные, и в присутствии последних. В монографии Н.Н. Каркищенко дается оценка различных методов эвтаназии по 5-ти бальной шкале, как показано в Таблице 2 [5]. Приемлемость методов оценивается по следующим показателям: o Скорость действия агента o Эффективность метода o Удобство метода o Риск для оператора o Гуманность В таблице приведены основные характеристики приемлемых методов эвтаназии лабораторных животных (химические методы, ингаляционные средства, физические методы) и их оценка в баллах. Таблица составлена на основании рекомендаций, которые были разработаны рабочей группой FELASA, как дополнение к Директивам Совета Европы 86/609 ЕЭС и опубликованы в разных изданиях, например: Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 1// Laboratory Animals 1996, vol. 30, No.4, P. 298-316; Part 2//Ibid. 1997. Vol. 31, No.1, P. 132. Таблица 2. Характеристики приемлемых методов эвтаназии лабораторных животных [5]. Как следует из представленных данных, наиболее эффективными и гуманными методами эвтаназии лабораторных животных являются химические методы, в особенности с использованием инъекционных препаратов, как самый быстрый, надежный и оптимальный метод эвтаназии, так как не вызывает болезненности или страха у животного. При этом оптимальным способом умерщвления животного является передозировка наркотических средств – введение препарата в летальной дозе, втрое и более превышающей наркотическую. Ингаляция летучими анестетиками хотя и показывает высокую эффективность, однако требует использования анестезионных систем. В этом случае газовая ингаляция применяется по открытому, полуоткрытому, и полузакрытому контуру. Открытый контур применяется в виде маски с адсорбирующими материалами, смоченными анестезирующей жидкостью. Полуоткрытый контур предотвращает повторное вдыхание выдохнутых газов. Полузакрытый контур использует выдыхаемые газы для дыхания. Ингаляционные системы с полуоткрытым контуром рекомендованы для лабораторных животных до семи-восьми килограммов. В них минимальное “мертвое” пространство и животное затрачивает минимум усилий для полноценного дыхания. Для лабораторных животных больше восьми килограммов традиционно приспосабливают педиатрические (медицинские) устройства, которые легко эксплуатировать. Наиболее доступный и легко автоматизируемый ингаляционный способ эвтаназии лабораторных животных – это ингаляция CO2. Углекислый газ обладает быстрым успокаивающим, болеутоляющим и анестезирующим эффектом, легко доступен, недорог, взрывобезопасен, не горюч и не представляет опасности для персонала. Крайне важно учитывать влияние проведения эвтаназии и на состояние персонала. Постоянное участие в процедурах эвтаназии животных всегда откладывает отпечаток на эмоциональное и психическое состояние специалиста. Это может проявляться в виде угнетения, замкнутости, отчужденности и, как следствие, может приводить к черствой работе с животными в дальнейшем. В связи с этим, рекомендуется проводить ротацию кадров с определённой периодичностью, устраивать разъяснительные беседы и организовывать обучения. В настоящее время наблюдается курс на минимизацию участия человека в работе с лабораторными животными, а именно использование различных технологий, способных снимать показатели деятельности животного (температура, пульс, насыщение крови кислородом, активность и др.) при помощи неинвазивных методов измерения. Эти технологии имеют ряд преимуществ, как с точки зрения безопасности при работе с животными, биоэтики, так и с точки зрения исключения ошибок персоналом. Тот же вектор имеет место быть и при проведении эвтаназии. Существующие методики и технологии неинвазивного и безболезненного умерщвления животных позволяют проводить процедуру по отработанным стандартным операционным процедурам (СОПам), сводя к нулю вероятность ошибки или ненадлежащего обращения с животными. Принимая во внимание все вышеперечисленные факторы и рекомендации, различные лаборатории и исследовательские центры начали активно изучать возможность проведения эвтаназии с использованием автоматизированных систем с подачей углекислого газа (CO2). Выбор углекислого газа среди других возможных и допустимых газов (аргон, азот, закись азота, угарный газ) обусловлен доступностью, невысокой себестоимостью и относительной безопасностью. Умерщвление животных с помощью профессиональных и автоматизированных CO2- камер для эвтаназии относится к условно-допустимому методу, так как требует соблюдения ряда обязательных «условий» для корректности проводимого процесса. Основные методические рекомендации по использованию углекислого газа были изложены Национальным институтом здоровья, Управление защиты лабораторных животных (National Institutes of Health, Office of Laboratory Animal Welfare). Отталкиваясь от этих рекомендаций, определён ряд критических параметров и условий при использовании автоматизированных систем для безопасной и безболезненной эвтаназии лабораторных грызунов: o Использование углекислого газа только из баллона. Не допускается использование сухого льда или других веществ с неконтролируемым выделением CO2. o Возможность визуального контроля процесса (использование прозрачных боксов). o Защита от случайного изменения параметров эвтаназии персоналом. Программа эвтаназии должна быть защищена паролем, допуск к которому имеют заведующие лабораторией либо руководство. o Возможность экстренной остановки процесса с незамедлительным удалением газа из камеры. При проведении ряда экспериментов животные могут более чутко ощущать наличие углекислого газа в камере, что приводит к волнению и возбуждению животных. В таком случае следует незамедлительно остановить процесс эвтаназии и либо выбрать другой допустимый метод, либо изменить скорость подачи углекислого газа в камеру. o Невозможность одновременной эвтаназии грызунов разных подвидов. o o Исключение предварительного заполнения камеры. Было доказано, что животные ощущают резкое изменение концентрации CO2 в воздухе, что может привести к дистрессу. Постепенное контролируемое заполнение камеры углекислым газом (10-30% от объема в минуту). Заполнение камеры углекислым газом со скоростью свыше 30% объема в минуту вызывает стресс у грызунов, вплоть до болезненных ощущений. Тогда как заполнение камеры со скоростью менее 10% объема в минуту может не вызвать потерю сознания животного, что также приводит к болезненным ощущениям и состоянию беспокойства. Подобрав сочетание скорости подачи газа к объему камеры, животные не испытывают стресс и засыпают. o Соблюдение благоприятных физических параметров и условий к микроклимату с целью избегания стресса и волнения у животных: исключение шума, вибрации, увеличения давления и грязи. Камера должна быть чистой и продезинфицированной. В идеале, животные должны подвергаться эвтаназии непосредственно в той клетке, в которой они обитают. o Смерть животного обязательно должна быть подтверждена после проведения эвтаназии (что касается в принципе всех методов эвтаназии). o Программируемость циклов. Процесс эвтаназии с использованием автоматизированных систем с подачей CO2 должен быть разбит на несколько циклов: фаза предварительной фумигации камеры с определённой скоростью подачи до потери сознания животного; фаза полного заполнения камеры до 100%; фаза выдержки; фаза удаления CO2 из камеры. Весь процесс должен проводиться исключительно с соблюдением техники безопасности при работе с углекислым газом. o Рис. 2 Установка для проведения эвтаназии лабораторных животных Эвтанайзер В заключение необходимо отметить, хотя на сегодняшний день нет единых гармонизированных требований по гуманной эвтаназии животных, а соответствующие рекомендации в разных странах могут отличаться, но имеющиеся различия весьма незначительны и основополагающими остаются рекомендации, излагаемые в Европейской директиве 2010/63/EU [1] и Руководстве по эвтаназии AVMA от 2020 года [2]. При этом многие исследовательские центры и лаборатории отмечают перспективность использования современных технологий и автоматизированных систем с подачей CO2 газа для эвтаназии лабораторных грызунов. Данный метод является неинвазивным, приводит к безболезненной эвтаназии (животное умирает во сне) и минимизирует участие персонала и возможные ошибки. ЛИТЕРАТУРА 1. Directive 2010/63/EU of the European parliament and of the council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. 2. AVMA. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. 3. ГОСТ 33215-2014. Межгосударственный стандарт. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными правила оборудования помещений и организации процедур. 4. Рыбакова А.В., Макарова М.Н. Методы эвтаназии лабораторных животных в соответствии с Европейской Директивой 2010/63/EU. // Международный вестник ветеринарии – №2 – 2015 г. – С. 96-107. 5. Каркищенко Н.Н. Основы биомоделирования. – М.: Изд-во ВПК, 2005. – 608 с. – URL: http://www.scbmt.ru/mag/osn-bio/section_v.pdf
