Структура и физико-химические свойства ДНК и хроматина 1.Строение молекулы ДНК: химический состав мономерных звеньев молекулы ДНК, 5'-3' – фософодиэфирная связь, комплементарные пары оснований; связи, удерживающие между собой две полинуклеотидные цепи; стэкинг-взаимодействие. По своему химическому строению ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) является биополимером, мономерами которого являются нуклеотиды. Причем молекула ДНК обычно состоит из двух цепей, закрученных друг относительно друга по винтовой линии и соединенных между собой водородными связями. Цепочки могут быть закручены как в левую, так и в правую (чаще всего) сторону. Каждый нуклеотид ДНК состоит из 1) азотистого основания, 2) дезоксирибозы, 3) остатка фосфорной кислоты. В состав ДНК входят следующие азотистые основания: аденин, гуанин, тимин и цитозин. Аденин и гуанин относятся к пуринам, а тимин и цитозин — к пиримидинам. Иногда в состав ДНК входит урацил, который обычно характерен для РНК, где замещает тимин. Азотистые основания одной цепи молекулы ДНК соединяются с азотистыми основаниями другой строго по принципу комплементарности: аденин только с тимином (образуют между собой две водородные связи), а гуанин только с цитозином (три связи). Азотистое основание в самом нуклеотиде соединено с первым атомом углерода циклической формы дезоксирибозы, которая является пентозой (углеводом с пятью атомами углерода). Связь является ковалентной, гликозидной (C-N). В отличие от рибозы у дезоксирибозы отсутствует одна из гидроксильных групп. Кольцо дезоксирибозы формируют четыре атома углерода и один атом кислорода. Пятый атом углерода находится вне кольца и соединен через атом кислорода с остатком фосфорной кислоты. Также через атом кислорода у третьего атома углерода присоединяется остаток фосфорной кислоты соседнего нуклеотида. Таким образом, в одной цепи ДНК соседние нуклеотиды связаны между собой ковалентными связями между дезоксирибозой и фосфорной кислотой (фосфодиэфирная связь). Образуется фосфат-дезоксирибозный остов. Перпендикулярно ему, навстречу другой цепочке ДНК, направлены азотистые основания, которые соединяются с основаниями второй цепочки водородными связями. Строение ДНК таково, что остовы соединенных водородными связями цепочек направлены в разные стороны. С той стороны, где одна заканчивается фосфорной кислотой, соединенной с пятым атомом углерода дезоксирибозы, другая заканчивается «свободным» третьим атомом углерода. То есть остов одной цепочки перевернут как бы с ног на голову относительно другой. Таким образом, в строении цепочек ДНК различают 5'-концы и 3'концы. Стэкинг-взаимодействия: пары оснований, уложенные в спирали «стопками» удерживаются силамиВан-дер-Ваальса.И несмотря на то, что связи между 2 парами оснований крайне слабые, их большое количество во всей молекуле ДНК является важным фактором её стабилизации. При репликации (удвоении) ДНК синтез новых цепочек всегда идет от их 5-го конца к третьему, так как новые нуклеотиды могут присоединяться только к свободному третьему концу. В конечном итоге (опосредованно через РНК) каждые идущие подряд три нуклеотида в цепи ДНК кодируют одну аминокислоту белка. Открытие строения молекулы ДНК произошло в 1953 году благодаря работам Ф. Крика и Д. Уотсона (чему также способствовали ранние работы других ученых). Хотя как химическое вещество ДНК было известно еще в XIX веке. В 40-х годах XX века стало ясно, что именно ДНК является носителем генетической информации. 2. Физико-химические свойства ДНК: денатурация и ренатурация молекулы, температура плавления, гиперхромный и гипохромный эффекты. ДНК в клетке термодинамически стабильна и спирализована, однако некоторые её области подвергаются «плавлению» (т.е. двойная спираль разматывается) изза происходящих процессов репликации, транскрипции, репарации и рекомбинации. Полное расплетение цепей и их разделение называют денатурацией. Денатурация происходит толькоin vitro. Двухцепочечная ДНК может быть денатурирована воздействием высоких температур или хаотропных агентов, таких как мочевина или гуанидин хлорид. При медленном повышении температуры двойная спираль ДНК денатурирует постепенно, за счет нарушения стэкинг и водородных связей. Две цепи постепенно расплетаются и наконец полностью диссоциируют (разделяются). Температура, при которой половина молекулы ДНК подверглась денатурации, называется точкой плавления Tm. Ренатурацией называется процесс восстановления нативной конформации ДНК. Ренатурация происходит самопроизвольно при охлаждении раствора, в котором содержатся диссоциировавшие цепи ДНК. ДНК и РНК могут образовывать гибриды по принципу комплементарности (например, матричная цепь ДНК и транскрибированная с неёпре-мРНК).Кроме того, если смешать в одном растворе денатурированные цепи ДНК различных видов, они тоже будет образовывать гибриды, но в силу того, что полностью нуклеотидные последовательности этих цепей некомплементарны (ввиду генетической изменчивости и разнообразия), такие гибриды будут считатьсянеполными: помимо спирализованных участков будут образовываться «вздутия», не имеющие спиральной укладки. Степень денатурации можно измерить с помощью абсорбции ультрафиолетовых лучей. Одноцепочечные ДНК при длине волны 260 нм поглощают 12-40%света. Разумеется, области, богатые парами A = T быстрее подвергаются плавлению, чем Г ≡ Ц участки. Различные факторы, нарушающие водородные связи (повышение температуры выше 80 С, изменение рН и ионной силы, действие мочевины и др.), вызывают денатурацию ДНК, ᴛ.ᴇ. изменение пространственного расположения цепей ДНК без разрыва ковалентных связей. Двойная спираль ДНК при денатурации полностью или частично разделяется на составляющие цепи. Денатурация ДНК сопровождается усилением оптического поглощения в УФ области пуриновых и пиримидиновых оснований. Это явление называют гиперхромным эффектом. При денатурации уменьшается также высокая вязкость, присущая растворам нативной ДНК. При восстановлении первоначальной двухспиральной структуры ДНК, в результате ренатурации, поглощение при 260 нм азотистыми основаниями вследствие их ʼʼэкранированностиʼʼ уменьшается. Это явление называют гипохромным эффектом. 3. Характеристика В-формы двойной спирали ДНК и альтернативных двуспиральных структур ДНК, их биологическое значение. B-форма ДНК (B form of DNA) — одно из трех основных конформационных состояний двухцепочечной ДНК (А, В- и Z-ДНК), в которой 2 нити спирали образуют правозакрученную спиральную структуру с диаметром 20 ангстрем. В-ДНК наиболее часто встречается in vivo и характеризуется наличием большой и малой бороздок; в В-ДНК число пар оснований на 1 виток равно 10,5, а расстояние между парами оснований — 0,34 нм. В-ДНК и родственные ей C-ДНК , D-ДНК и T-ДНК принадлежат В-семейству двойных спиралей. В B-форме, как и в А-форме, спираль ДНК, как говорилось выше, является правой. У этого семейства фуранозные кольца имеют конформацию С2'-эндо (или близкую ей С3'-экзо), расстояние между соседними фосфатами увеличивается до 7 А, а угол, описывающий вращение вокруг гликозидной связи С1'-N, оказывается в диапазоне приблизительно в 90-120 град. В В-форме ДНК на виток спирали приходится около 10 пар оснований и расстояние между нуклеотидами вдоль оси спирали составляет от 3,3 до 3,4 А, поэтому у оснований наблюдается лишь небольшой отрицательный наклон приблизительно в 6 град. Эти характеристики и определяют макроскопическую структуру В-ДНК, представленную на Рис. B-ДНК . Пары оснований расположены на оси спирали (смещение от оси около -0,2 А). Так как ось спирали проходит через пары, поэтому в В-ДНК желобки менее выражены, чем в A-ДНК . Их глубина примерно одинакова, но ширина различается (см. ниже Таблицу): минорный желобок узкий, а главный желобок - широкий и открытый. Двойная спираль Уотсона и Крика — это структура B-формы ДНК. Вскоре после их работы с помощью рентгеноструктурного анализа, с помощью рассеяния рентгеновских лучей была определена структура и A-формы ДНК. Вскоре выяснилось, что A-форма ДНК тоже имеет огромное биологическое значение. Оказалось, что двойная спираль, которая создает молекулы РНК, и в растворе, при обычной высокой влажности находится в A-форме, а не в B-форме. Это связано с тем, что РНК отличается от ДНК тем, что сахар, химический элемент структуры ДНК и РНК — это нуклеотид. Нуклеотид состоит из фосфата, сахара и азотистого основания. В том и в другом случае сахар немножко разный: у ДНК он имеет в определенном положении просто водород, а у РНК — гидроксильную группу OH. Поэтому РНК называется рибонуклеиновая кислота, отсюда сокращение РНК. ДНК является носителем генетической информации, записанной в виде последовательности нуклеотидов с помощью генетического кода. С молекулами ДНК связаны два основополагающих свойства живых организмов — наследственность и изменчивость. В ходе процесса, называемого репликацией ДНК, образуются две копии исходной цепочки, наследуемые дочерними клетками при делении, отсюда следует, что образовавшиеся клетки оказываются генетически идентичны исходной. 4. Суперспирализация ДНК. Топологические проблемы, возникающие в ходе матричных процессов. Сверхспирализация ДНК — явление пере- или недоскручивания топологически замкнутых цепей ДНК, в результате которого ось двойной спирали ДНК сама закручивается в спираль более высокого порядка. Под «топологически замкнутыми» понимают молекулы, свободное вращение концов которых затруднено (кольцевые молекулы ДНК либо линейные молекулы, концы которых зафиксированы белковыми структурами)[1]. Образующаяся в результате сверхспирализации ДНК иногда называется суперскрученной. Сверхспирализация важна во множестве биологических процессов, таких как, например, компактизация ДНК. Определённые ферменты, в частности топоизомеразы, обладают способностью изменять топологию ДНК, например для репликации ДНК или транскрипции[2]. Сверхспирализация описывается математическими выражениями, которые сравнивают суперскрученную спираль ДНК с её «расслабленной» формой. Сверхспирализация ДНК может быть положительной и отрицательной. За положительную сверхспирализацию принято принимать такую, при которой ось двойной спирали закручена в том же направлении, что и цепи внутри двойной спирали (по часовой стрелке). Соответственно, сверхспирализация считается отрицательной, если ось двойной спирали закручена против часовой стрелки[3]. ДНК большинства мезофильных организмов отрицательно сверхспирализована. В то же время есть сведения об особой биологической роли положительной сверхспирализации ДНК как мезофильных, так и термофильных организмов. Топологические проблемы раскручивания и репликации ДНК. Процесс раскручивания двойной спирали в репликативной вилке порождает механические и топологические проблемы. В принципе расплетание линейной дуплексной ДНК может происходить благодаря вращению родительской спирали вокруг собственной оси. Однако вращение очень длинных цепей ДНК вокруг длинных же осей во внутриклеточном пространстве механически затруднено. При репликации замкнутых кольцевых ДНК расплетание цепей в вилке создает дополнительные проблемы. По мере раскручивания цепей степень отрицательной сверхспиральности сегаен-тов, находящихся перед вилкой репликации, постепенно уменьщается и в них возникает положительная сверхспирализация. Дальнейшее перемещение вилки вдоль кольца затрудняется и в конце концов блокируется. Это блокирование снимается путем внесения одноцепочечного разрыва. Тем самым образуется щарнир , который дает возможность нереплицироваиному дуплексу, находящемуся перед вилкой, вращаться вместе с ней. Такие разрывы вносятся в ДНК с помощью ферментов, имеющих общее название ДНК-топоизомеразы. Проблема образования топологически связанных молекул возникает также и в области биополимеров. Уже давно известно, что в природе обнаруживаются (причем непосредственно, с помощью электронной микроскопии) ДНК, имеющие структуры катенанов и даже узлов, а образуются они в ходе репликации кольцевых ДНК 5. Топоизомеразы I и II типов, механизм их действия. Топоизомера́зы — класс ферментов-изомераз, которые влияют на топологию ДНК. Топоизомеразы способны релаксировать сверхспирализованные молекулы ДНК путём внесения одно- или двуцепочечных разрывов с последующим восстановлением (лигированием). Вместе с тем в некоторых случаях топоизомеразы могут вносить в ДНК отрицательные супервитки или катенаны. Топоизомеразы, облегчая расплетание цепей ДНК в двойной спирали, играют важную роль в процессах репликации и транскрипции. Показана роль топоизомераз в образовании петель хроматина во время конденсации хромосом. Встраивание вирусной ДНК в хромосомы хозяина и другие формы рекомбинации также требуют присутствия топоизомераз В зависимости от механизма действия топоизомеразы подразделяют на топоизомеразы I типа, вносящие одноцепочечные разрывы без затрат энергии, и топоизомеразы II типа, осуществляющие внесение двуцепочечных разрывов с затратой АТФ. Особое место среди топоизомераз занимает ДНК-гираза, характерная для кишечной палочки E. coli. Топоизомеразы I представляют собой мономерные белки. Они релаксируют ДНК, внося одноцепочечные разрывы без затрат АТФ. Механизм этого таков. Внесение одноцепочечных разрывов происходит за счёт остатка аминокислоты тирозина, который осуществляет нуклеофильную атаку фосфатной группы ДНК, образуя фосфотирозин. Сам фермент при этом связывается с высвободившимся 3'- или 5'-концом цепи. В зависимости от того, к какому концу присоединяется топоизомераза, выделяют: топоизомеразы IA-типа, связывающиеся с 5'-концом; снимают только отрицательную суперспирализацию; топоизомеразы IB-типа, связывающиеся с 3'-концом; снимают как положительную, так и отрицательную суперспирализацию. Такой механизм действия не требует затрат энергии, то есть при работе топоизомераз I типа АТФ не расходуется. Число витков при этом изменяется на 1. Топоизомеразы II функционируют у прокариот в виде тетрамеров, у эукариот — в виде димеров. Они осуществляют АТФ-зависимое расщепление обеих цепей ДНК с последующим переносом цепей через разрыв и его лигированием. Разрыв происходит из-за связывания тирозинов топоизомеразы с ДНК с образованием двух 5'-фосфодиэфирных связей. В образовавшийся разрыв проходит другая двуцепочечная ДНК. Таким образом, число положительных или отрицательных супервитков изменяется на 2 (а не на 1, как у топоизомераз I). Итак, топоизомеразы II могут катенировать и декатенировать узлы ДНК. Относящаяся к этому типу ДНК-гираза вносит отрицательные супервитки. Топоизомеразы II, как и топоизомеразы I, подразделяют на 2 группы: IIA и IIB. Однако анализ структур топоизомераз IА, IIА и IIB выявил их большое структурное сходство, в частности, наличие специального фолда для связывания с ионами металлов. 6. Нуклеосомное строение хроматина. Эухроматин и гетерохроматин. Вдоль нуклеосомной нити, напоминающей цепочку бус, имеются области ДНК, свободные от белковых тел. Эти области, расположенные с интервалами в несколько тысяч пар нуклеотидов, играют важную роль в дальнейшей упаковке хроматина, так как содержат нуклеотидные последовательности, специфически узнаваемые различными негистоновыми белками. В результате нуклеосомной организации хроматина двойная спираль ДНК диаметром 2 нм приобретает диаметр 10—11 нм. (Упаковка в 7 раз). 2) Нуклеомерный уровень.Дальнейшая компактизация нуклеосомной нити обеспечивается гистоном H1, который, соединяясь с линкерной ДНК и двумя соседними белковыми телами, сближает их друг с другом. В результате образуется более компактная структура, построенная, возможно, по типу соленоида. Такая хроматиновая фибрилла, называемая также элементарной, имеет диаметр 20—30 нм. 3) Хромомерный уровень.Следующий уровень структурной организации генетического материала обусловлен укладкой хроматиновой фибриллы в петли. В их образовании, по-видимому, принимают участие негистоновые белки, которые способны узнавать специфические нуклеотидные последовательности вненуклеосомной ДНК, отдаленные друг от друга на расстояние в несколько тысяч пар нуклеотидов. Эти белки сближают указанные участки с образованием петель из расположенных между ними фрагментов хроматиновой фибриллы. Участок ДНК, соответствующий одной петле, содержит от 20 000 до 80 000 п. н. Возможно, каждая петля является функциональной единицей генома. (Упаковка в 680 раз). 4) Хромонемный уровень. Образуется за счет сближения в линейном порядке хромомерных петель с образованием хромонемной нити. 5) Хромосомный уровень. Образуется в результате спиральной укладки хромонемы. Отдельные участки интерфазной хромонемы подвергаются дальнейшей компактизации, образуя структурные блоки, объединяющие соседние петли с одинаковой организацией. Они выявляются в интерфазном ядре в виде глыбок хроматина. Возможно, существование таких структурных блоков обусловливает картину неравномерного распределения некоторых красителей в метафазных хромосомах, что используют в цитогенетических исследованиях. Неодинаковая степень компактизации разных участков интерфазных хромосом имеет большое функциональное значение. В зависимости от состояния хроматина выделяют эухроматиновые участки хромосом, отличающиеся меньшей плотностью упаковки в неделящихся клетках и потенциально транскрибируемые, и гетерохроматиновые участки, характеризующиеся компактной организацией и генетической инертностью. В их пределах транскрипции биологической информации не происходит. Различают конститутивный (структурный) и факультативный гетерохроматин. Конститутивный гетерохроматин содержится в околоцентромерных и теломерных участках всех хромосом, а также на протяжении некоторых внутренних фрагментов отдельных хромосом. Он образован только нетранскрибируемой ДНК. Вероятно, его роль заключается в поддержании общей структуры ядра, прикреплении хроматина к ядерной оболочке, взаимном узнавании гомологичных хромосом в мейозе, разделении соседних структурных генов, участии в процессах регуляции их активности Примером факультативного гетерохроматина служит тельце полового хроматина, образуемое в норме в клетках организмов гомогаметного пола (у человека гомогаметным является женский пол) одной из двух Х-хромосом. Гены этой хромосомы не транскрибируются. Образование факультативного гетерохроматина за счет генетического материала других хромосом сопровождает процесс клеточной дифференцировки и служит механизмом выключения из активной функции групп генов, транскрипция которых не требуется в клетках данной специализации. В связи с этим рисунок хроматина ядер клеток из разных тканей и органов на гистологических препаратах различается. Примером может служить гетерохроматизация хроматина в ядрах зрелых эритроцитов птиц. Репликация ДНК 7. Механизм реакции полимеризации ДНК и его катализ. Экзонуклеазные активности ДНК-полимераз и их роль в обеспечении точности воспроизведения ДНК. Реплика́ция ДНК — процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Репликацию ДНК осуществляет сложный ферментный комплекс, состоящий из 15—20 различных белков, называемый реплисомой. Репликация проходит в три этапа: инициация репликации, элонгация, терминация репликации. Регуляция репликации осуществляется в основном на этапе инициации. Это достаточно легко осуществимо, потому что репликация может начинаться не с любого участка ДНК, а со строго определённого, называемого сайтом инициации репликации. В геноме таких сайтов может быть как всего один, так и много. Репликон — это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта. Репликация начинается в сайте инициации репликации с расплетания двойной спирали ДНК, при этом формируется репликационная вилка — место непосредственной репликации ДНК. Суть репликации днк заключается в том, что специальный фермент разрывает слабые водородные связи, которые соединяют между собой нуклеотиды двух цепей. В результате цепи ДНК разъединяются, и из каждой цепи «торчат» свободные азотистые основания (возникновение так называемой вилки репликации). Особый фермент ДНКполимераза начинает двигаться вдоль свободной цепи ДНК от 5'- к З'-концу (лидирующая цепь), помогая присоединиться свободным нуклеотидам, постоянно синтезируемым в клетке, к З'-концу вновь синтезируемой цепи ДНК. На второй нити ДНК (отстающая нить) новая ДНК образуется в виде небольших сегментов, состоящих из 1000—2000 нуклеотидов (фрагменты Оказаки). Для начала репликации ДНК фрагментов этой нити требуется синтез коротких фрагментов РНК как затравок, для чего используется особый фермент — РНК-полимераза (праймаза). Впоследствии праймеры РНК удаляются, в образовавшиеся бреши встраивается ДНК с помощью ДНК полимеразы I. Таким образом, каждая цепь ДНК используется как матрица или шаблон для построения комплементарной цепи. Основные ферменты репликации ДНК: ДНК-полимераза - фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с отрезком цепи нуклеотидов. Лигаза - фермент, катализирующий соединение двух молекул с образованием новой химической связи (лиᴦᴎҏование). ДНК-лигазы -- ферменты, катализирующие ковалентное сшивание цеᴨȇй ДНК при репликации. ДНК хеликазы - ферменты раскручивающие двуцепочечную спираль ДНК. ДНК-топоизомеразы-ферменты, изменяющие стеᴨȇньсверхспиральности и тип сверхспирали. Путём одноцепочечного разрыва они создают шарнир, вокруг которого нереплецированный дуплекс ДНК, находящейся ᴨȇред вилкой, может свободно вращаться. Это снимает механическое напряжение, возникающее при раскручивании двух цеᴨȇй в репликативной вилке, что является необходимым условием для её непрерывного движения. Праймаза - фермент, обладающий РНК-полимеразной активностью; служит для образования РНК-праймеров, необходимых для инициации синтеза ДНК в точке ori и дальнейшем для синтеза отстающей цепи. 8.Характеристика ДНК-полимераз E.coli: размеры, субъединичный ферментативные активности и участие в процессах репликации и репарации. состав, http://www.chemnet.ru/rus/teaching/kolman/238.htm В настоящее время процесс репликации у прокариот достаточно изучен, в то время как многие аспекты эукариотической репликации остаются неясными. Однако с большой долей вероятности можно утверждать, что в большинстве клеток этот процесс протекает в основном одинаково. На схеме показана простейшая схема репликации у бактерии Escherichia coli. В бактериях репликация начинается со специфической точки в кольцевой ДНК (область начала репликации) и продолжается в обоих направлениях. В результате образуются две репликативные вилки, которые продвигаются в противоположных направлениях, т. е. обе цепи реплицируются одновременно. На схеме исходная ДНК окрашена в голубой и фиолетовый цвета, а вновь синтезирующаяся — в розовый и оранжевый. В функционировании каждой вилки принимают участие множество различных белков, из которых здесь указаны наиболее важные. Каждая репликативная вилка включает по крайней мере две молекулы ДНКполимеразы III, ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомеразы (гиразы), которые раскручивают плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликазы, которые расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи. Поскольку матричная цепь всегда читается в направлении 3'→5' , только одна из цепей может считываться непрерывно. Другая цепь считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. В результате на матрице вначале синтезируются короткие фрагменты новой цепи ДНК, так называемые фрагменты Оказаки (OF), названные так по имени их первооткрывателя. Каждый фрагмент начинается с короткой РНК-затравки (праймера), необходимой для функционирования ДНКполимеразы. Праймер синтезируется специальной РНК-полимеразой («праймаза»), ДНКполимераза III достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев. Синтез этого фрагмента далее прерывается, и новый синтез начинается со следующего РНК-праймера. Индивидуальные фрагменты Оказаки первоначально не связаны друг с другом и все еще имеют РНК на 5'-концах. На некотором расстоянии от репликативной вилки ДНК-полимераза I начинает замещать РНК-праймер последовательностью ДНК. В завершение остающиеся одноцепочечные разрывы репарируются ДНК-лигазой. В образованной таким образом двойной спирали ДНК только одна из цепей синтезирована заново. Поэтому говорят, что репликация ДНК происходит по полуконсервативному механизму. 9. Структура ДНК-полимеразы III E.coli, функции ее отдельных субъединиц. Модель работы димерной полимеразы; координация синтеза ДНК на комплементарных нитях. Клетки Е. coli содержат три различных ДНК-полимеразы, обозначаемые I, II и III. Наиболее широко распространенная из них - это ДНК-полимераза I, тот фермент, который был описан выше. Хотя Корнберг показал, что этот фермент способен реплицировать в пробирке целую молекулу ДНК мелкого вируса с образованием биологически активной дочерней ДНК, мы знаем, что ДНК-полимераза I - это не главный фермент, осуществляющий элонгацию ДНК в клетке. ДНК-полимераза I действительно принимает участие в репликации, но, особым образом. Рис. 28-9. Холофермент ДНК-полимеразы III. Он состоит из собственно полимеразы (субъединица а) и ряда других субъединиц. В интактных клетках Е. coli за элонгацию цепи ДНК отвечает главным образом ДНКполимераза III. Она функционирует в форме большого комплекса с мол. массой ~ 550 000, называемого холоферментом ДНК-полимеразы III (рис. 28-9). Этот комплекс содержит в своем составе ион Zn2+ и требует для работы наличия ионов Mg2+. Ему также необходимы матрица и затравка, без которых он не может инициировать процесс репликации. Подобно ДНК-полимеразе I, он удлиняет ДНК в направлении 5'→3', присоединяя новые нуклеотиды к 3'-концу цепи-затравки. Холофермент состоит из нескольких субъединиц. Субъединица ß, или кополимераза III, необходима для узнавания и связывания цепи-затравки, роль которой выполняет родительская ДНК. Как только холофермент присоединяется к правильному месту инициации, кополимераза III высвобождается из комплекса. Элонгацию цепи дочерней ДНК осуществляет оставшийся комплекс ДНК-полимеразы III. Оба фермента - ДНК-полимераза I и ДНК-полимераза III-обладают тремя ферментативными активностями. Кроме полимеразной активности они имеют 5'→3'- и 3'→5'-экзонуклеазные активности, т. е. они могут отщеплять концевые нуклеотиды с любого конца цепи ДНК. Позже мы увидим, в чем смысл экзонуклеазных активностей ДНК-полимераз. Функция ДНК-полимеразы II пока неизвестна. Модель работы димерной полимеразы (ДНК-пол.III); координация синтеза ДНК на комплементарных цепях Элонгация репликации. Модель полуконсервативной прерывистой репликации ДНК в репликативной вилке представлена на рис. Дуплекс родительской молекулы ДНК расплетает АТР- зависимая хеликаза. Образующиеся одноцепочечные участки покрывает SSB-белок. ДНК-пол.III движется по одной из матричных цепей в направлении раскрывания вилки и синтезирует ведущую цепь ДНК. По другой, матричной цепи в том же направлении движется праймосома (комплекс белков, осуществляющий инициацию репликации). Время от времени, входящая в состав праймосомы праймаза (белок Dna G), Синтезирует РНК-затравки для отстающей цепи. Вторая молекула холофермента ДНК-пол. III удлиняет эти затравки до тех пор, пока не достигнет предыдущей затравки, т.е. она синтезирует фрагменты Оказаки длиной от 1000 до 2000 н. Удаление сегментов РНК с 5'конца каждого фрагмента Оказаки осуществляет ДНК- пол.I, используя свою 5'→3'кзонуклеазную активность. Заполнение брешей между фрагментами Оказаки катализируется той же ДНК-полимеразой I. Одноцепочечный разрыв зашивает ДНК-лигаза. Таким образом, из серии фрагментов Оказаки образуется новая цепь. 10. Характеристика ДНК-полимераз эукариот: размеры, субъединичный состав, ферментативные активности и участие в процессах репликации и репарации. В клетках эукариот имеются по меньшей мере шесть различных ДНК-зависимых ДНК-полимераз: α, β, δ,ε,γ,ζ. Четыре из них — α, β, δ,ε — непосредственно участвуют в репликации хромосомной ДНК . ДНК-полимераза α —первая ДНК-полимераза, обнаруженная в клетках эукариот. Она представлена в клетке в виде прочного комплекса с ДНК-праймазой — ферментом, осуществляющим синтез РНК-затравок. Комплекс ДНК-полимераза α-праймаза является единственным у эукариот ферментативным ансамблем, способным инициировать синтез ДНК de novo. В ходе репликации в клеточных ядрах ДНК полимераза α-праймаза синтезирует затравку лидирующей нити в участке ori и затравки фрагментов Оказаки запаздывающей нити. Как правило, ДНК-полимераза не обладает корректорской 3'→5'экзонуклеазной активностью. По-видимому, в ходе эволюции экзонуклеазный центр в данном ферменте редуцировался. ДНК-полимеразаβ является наименьшей по размеру и самой простой по строению ДНК-полимеразой в клетках эукариот. Основная функция ДНК-пол.β в клетке связана с эксцизионной репарацией ядерной ДНК (заполнение пробелов при репарации). ДНК-полимераза δ —гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы (125—130 кДа) и субъединицы 48 — 55 кДа, необходимой для преодоления ферментом структурных барьеров в природных однонитевых матрицах и для связи с фактором процессивности PCNA (от англ. Proliferating Cell Nuclear Antigen –ядерный антиген пролиферирующих клеток). Три молекулы PCNA образуют кольцевой тример с отверстием для двунитевой ДНК в центральной части, который представляет собой перемещающуюся по ДНК подвижную платформу или «скользящую скрепку» в форме тора (бублика), удерживающую ДНК-полимеразу δ в ходе полимеризации на матрице и обеспечивающую высокопроцессивный синтез ДНК. Хотя PCNA и прокариотический фактор процессивности субъединица β ДНК-полимеразы III Е. coli имеют низкую гомологию на уровне первичной структуры, оба белка формируют близкие по пространственной геометрии структуры «скользящей скрепки». ДНК-полимераза ε,выделена из клеток HeLa, содержит два полипептида — каталитический 261 кДа и полипептид 55 кДа. Каталитический полипептид обладает ДНКполимеразной и 3'→5‘-экзонуклеазной активностями. Особенностью холофермента ДНКполимеразы ε по сравнению с ДНК-полимеразой δ является его меньшая зависимость от вспомогательных факторов (PCNA, RFС - репликативный фактор С и RPA – репликативный ядерный белок А), а также низкая (почти на порядок) скорость синтеза ДНК. Это различие, возможно, связано с разной функцией ДНК-полимераз в репликативной вилке. Один холофермент, ДНК-полимераза δ осуществляет быстрый и процессивный синтез лидирующей нити, используя для элонгации единственную затравку, синтезируемую ДНКполимеразой α-праймазой в районе ori, и диссоциирует только по достижении конца репликона, тогда как несколько холоферментов ДНК-полимеразы ε могут одновременно синтезировать фрагмены Оказаки в «зоне Оказаки», удлиняя затравки, синтезируемые ДНК-полимеразой α-праймазой в начале каждого фрагмента. ДНК-полимераза γ локализована в митохондриях, ее функция связана с репликацией и репарацией митохондриальной ДНК, она кодируется ядерным геномом. ДНК-полимераза γ способна направлять высокопроцессивную полимеризацию на однонитевых ДНК-матрицах в отсутствие вспомогательных факторов. Таким образом, поскольку эукариотические ДНК-полимеразы α и β лишены 3′ → 5 ′ и 5 ′ → 3 ′ -экзонуклеазных активностей, становится понятным участие ДНК-полимераз δ и ε в процессе репликации ядерной ДНК в качестве корректирующих ферментов, а ДНКполимеразе ε приписывают также функцию удаления РНК-праймеров на концах фрагментов Оказаки. 11. Структура вилки репликации: события на ведущей и отстающей нитях. Полунепрерывный синтез и фрагменты Оказаки. Участие в репликации вспомогательных белков (SSB, хеликазы, праймазы, лигазы). Каждая репликативная вилка включает по крайней мере две молекулы ДНКполимеразы III, ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомеразы (гиразы), которые раскручивают плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликазы, которые расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи. Поскольку матричная цепь всегда читается в направлении 3'→5' , только одна из цепей может считываться непрерывно. Другая цепь считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. В результате на матрице вначале синтезируются короткие фрагменты новой цепи ДНК, так называемые фрагменты Оказаки (OF), названные так по имени их первооткрывателя. Каждый фрагмент начинается с короткой РНК-затравки (праймера), необходимой для функционирования ДНКполимеразы. Праймер синтезируется специальной РНК-полимеразой («праймаза»), ДНКполимераза III достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев. Синтез этого фрагмента далее прерывается, и новый синтез начинается со следующего РНК-праймера. Индивидуальные фрагменты Оказаки первоначально не связаны друг с другом и все еще имеют РНК на 5'-концах. На некотором расстоянии от репликативной вилки ДНК-полимераза I начинает замещать РНК-праймер последовательностью ДНК. В завершение остающиеся одноцепочечные разрывы репарируются ДНК-лигазой. В образованной таким образом двойной спирали ДНК только одна из цепей синтезирована заново. Поэтому говорят, что репликация ДНК происходит по полуконсервативному механизму. ДНК-праймаза. ДНК-полимеразы не способны инициировать синтез новых цепей ДНК, они могут лишь добавлять дезоксирибонуклеотидные звенья к З'-концу уже имеющейся полинуклеотидной цепи. Чтобы молекулы ДНК-полимераз могли начать синтез ДНК, им необходима затравка, или праймер (от англ. primer — затравка), короткий олигорибонук-леотид, комплементарный соответствующему участку ДНК-матрицы, у которого на конце имеется свободная З'-ОН-гр. Неспособность молекул ДНК-пол. самостоятельно, без затравки начинать синтез ДНК принципиально отличает эти ферменты от других ферментов матричного синтеза — РНК-полимераз. На стадии инициации репликации короткую РНК-затравку из рибонуклеозидтрифосфатов синтезирует фермент, называемый ДНК-праймазой. ДНКпраймаза может быть отдель-ным ферментом (как у бактерий) или входить в качестве субъединицы в ДНК-полимеразу (как у ДНК-полимеразы α эукариот). В любом случае праймаза — это фермент, отличный от РНК-полимераз, которые синтезируют разнообразные клеточные РНК. После того как будет синтезирован РНК-праймер, подключается ДНК-полимераза и продолжает наращивать цепь. Новосинтезированные цепи ДНК всегда содержат на 5'-конце несколько рибонуклеотидов: у прокариот — от двух до пяти нуклеотидов, у эукариот их в два раза больше. В дальнейшем короткие праймеры замещаются сегментами ДНК. ДНК-лигаза. ДНК-лигазы вирусов, бактерий, млекопитающих соединяют 5'фосфатную и З'-гидроксильную группы нуклеотидов, находящихся на противоположных концах одноцепочечного разрыва в дуплексе ДНК. В результате образуется фосфодиэфирная связь, ликвидирующая этот разрыв (рис.). ДНК-лигаза Е. coli — это одиночный полипептид (мол. масса 75000 Да). Для образования фосфодиэфирной связи между концами нуклеотидных цепей ДНК-лигазы используют энергию гидролиза АТР либо NAD. Реакция протекает в три стадии: Реакция аденилирования ДНКлигазы. Аденилильный остаток NAD или АТФ переносится на ε-аминогруппу лизиново-го остатка в активном центре лигазы с одновременным высвобождением пиро-фосфата (в случае АТФ) или никотин-амидмононуклеотида (в случае NAD). 1. Реакция трансаденилирования. Остаток адениловой кислоты с аденилатлигазы перебрасывается на свободную фосфатную группу 5’-углеродного атома рибозы концевого нуклеотида. 2. Реакция лигирования. Между сближенными активированной аденилатом 5’-фосфатной группой и 3’-ОН-группой фрагмента цепи ДНК происходит образование фосфодиэфирной связи с выделением АМР. Хеликаза Раскручивание, или расплетание, спирали происходит в локальном участке ДНК. Эту реакцию осуществляет хеликаза — ДНК-зависимая АТРаза, использующая энергию гидролиза АТР для расплетания двойной спирали ДНК. Хеликазы имеют кольцевую (тороидальную) структуру, образованную шестью субъединицами. Такие гексамерные хеликазы кольцеобразной формы обнаружены у фагов, вирусов, бактерий, архей, эукариот (рис.). Хеликаза, движимая гидролизом АТР, однонаправленно перемещается по одной из цепей ДНК (вероятно, за счет ее конформационных изменений), расплетая перед собой двойную спираль, в результате чего возникает вилка (Y) из двуцепочечного участка ДНК и двух одноцепочечных ветвей. ДСБ-белки (SSB-белки) Белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК. ДСБ-белки связываются с сахарофосфат-ным остовом одиночных цепей ДНК, не закрывая оснований, что не мешает комплемен-тарному присоединению нуклеотидов в ходе репликации. ДСБ-белок Е. coli наиболее изучен, он представляет собой тетрамер, характеризуется высокой степенью асимметрии молекулы.ДСБ-белки стабилизируют одноцепочечную ДНК, обеспечивая условия для комплементарного спаривания, удаляют Возможные элементы вторичной структуры ДНК(например, предотвращают образование шпилечных структур); связывание одноцепочечной ДНК с ДСБ-белками стимулирует ДНК-полимеразу и повышает точность ее работы. У эукариот таковым белком является ядерный репликативный белок A (RPA), представляющий гетеротример с субъединицами 70, 32 —34 и 11 — 14 кДа. 12. Регуляция инициации репликации у E.coli: структура участка старта репликации (OriC), участие белков DnaA, DnaB, DnaC и DnaG в процессе инициации. Геном Е. coli реплицируется двунаправленно от одной точки начала репликации, получившей название локус ori С. Инициация репликации начинается с узнавания инициаторными белками специфических последовательностей в точках начала репликации ДНК. Хромосома Е. coli содержит единственную область начала репликации (oriC), размер которой составляет 258 н.п. В oriC имеется пять консенсусных девятинуклеотидных сайтов связывания инициаторного белка Dna А, названных Dna А-боксами. В левой части oriC наряду с Dna А распознает область начала репликации и образует комплекс с други-ми белками.Сначала белок Dna А в комплексе с АТР взаимодействует с Dna А-боксами. С помощью электронной микроскопии исходный комплекс обнаруживается в виде компактной эллипсоидной структуры, содержащей -20 мономеров Dna А, которая закрывает oriC. В этом комплексе частично расплетаются АТ-богатые повторы и формируется открытый комплекс. В этом процессе участвуют некоторые вспомогательные белки, которые помогают инициатору Dna А раскручивать и изгибать ДНК (ранее они обозначались n, n', n", i, а. В последнее время их обозначают IME, FIS-факторы и т.д.). Белок Dna В (хеликаза) в виде гексамеров в комплексе с шестью мономерами белка Dna С, каждый из которых связывает одну молекулу АТР, а именно (Dna В —Dna С— АТР)6, взаимодействует с одноцепочечными участками частично расплетенной ДНК. В этом комплексе хеликазная активность Dna В блокирована. Транслокация Dna В (хеликазы) от места ее первоначального вхождения в комплекс к месту старта репликативной вилки и высвобождение из комплекса белка Dna С, вызывает активацию хеликазы. Далее хеликаза взаимодействует с белком Dna G (праймазой), и этот комплекс играет ключевую роль в инициации репликации на oriС. Оба фермента обеспечивают сопряженное функционирование двух репликативных вилок, движущихся в противоположные стороны; хеликаза начинает расплетать дуплекс ДНК, праймаза синтезирует первые затравки. В сформированном праймирующем комплексе присутствие белка Dna А не требуется, и он после освобождения из комплекса может быть повторно использован для репликации на другом оriС. Сложный комплекс белков, осуществляющий инициацию репликации, получил название праймосомы. Праймосома в свою очередь является компонентом еще более сложного комплекса — реплисомы, осуществляющей процесс полной репликации. Завершающим этапом сборки реплисомы является взаимодействие праймосомы с ДНКполимеразой III. Для продолжения синтеза ДНК необходимо участие еще двух белков, двигающихся впе-реди репликативной вилки и выполняющих функцию геликаз - геликазы II и белка rep.Этапы инициации репликации ДНК E. coli.1 – белок dna A формирует тетрамеры, связывающиеся со специфическими сайтами из 9 пар нуклеотидов в пределах локуса ori C; 2 – тетрамеры dna A образуют комплекс, индуцирующий плавление ДНК Терминация репликации происходит тогда, когда встречаются две репликативные вилки при удвоении кольцевых молекул ДНК. Непрерывный рост лидирующей и отстающей цепей приводит к совмещению 3′ и 5′-концов одной цепи, либо в точке начала репликации (однонаправленная репликация, либо – при двунапраленной репликации – в середине кольца). Кольца в местах встречи соединяются лигазой, при этом они оказываются попарно сцепленными, т.е. образуется катенан. 13. Механизм репликации концов линейных хромосом эукариот с помощью теломеразы. На концах хромосом эукариот находятся специализированные повторяющиеся последовательности ДНК, получившие название теломерной ДНК, а содержащие ее концы хромосом -- теломероми. В клетках животных количество хромосом, а следовательно, и теломерных участков невелико -- они составляют лишь небольшую часть от всех остальных последовательностей. Теломеры играют важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра. Они предотвращают деградацию и слияние хромосом, а также ответственны за их прикрепление к специальной внутриклеточной структуре (своеобразному скелету клеточного ядра). Механизмы репликации теломерных участков эукариотических хромосом и центральных областей ДНК принципиально различаются. Все известные ДНК-полимеразы, являющиеся ферментами сложного репликативного комплекса эукариот, неспособны полностью реплицировать концы линейных молекул ДНК. Известно, что ДНК-полимеразы, синтезируя дочернюю нить ДНК, прочитывают родительскую нить в направлении от ее З'конца к 5'-концу. Соответственно дочерняя цепь синтезируется в направлении 5'>3'. Кроме того, ДНК-полимераза начинает синтез только со специального РНК-праймера, комплементарного ДНК. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются, а пропуски в одной из дочерних цепей ДНК (отстающей) заполняются ДНК-полимеразой в. Однако на З'-концевых участках ДНК такой пропуск заполнен быть не может, и поэтому они остаются однотяжевыми, а их 5'-концевые участки -- недореплицированными. Следовательно, при каждом раунде репликации хромосомы будут укорачиваться на 10 -- 20 нуклеотидов (у разных видов размер РНК-затравок различен), и в первую очередь сокращать длину теломерной ДНК. Возникла проблема «концевой недорепликации ДНК». В случае репликации кольцевых бактериальных ДНК этой проблемы не существует, так как первые по времени образования РНК-праймеры удаляются ферментом, который одновременно заполняет образующуюся брешь путем наращивания З'-ОН-конца растущей цепи ДНК, направленной в «хвост» удаляемому праймеру. Проблема недорепликации З'концов линейных молекул решается эукариотическими клетками с помощью специального фермента -- теломеразы. Этот фермент был обнаружен впервые в 1985 г. у инфузории Tetrahymena thermophila, а впоследствии -- в дрожжах, растениях и у животных, в том числе в яичниках человека и бессмертных линиях раковых клеток НеLа. Теломераза является ДНК-полимеразой, достраивающей 3'-концы линейных молекул ДНК хромосом короткими (6 -- 8 нуклеотидов) повторяющимися последовательностями (у позвоночных ТТАGGG). Согласно номенклатуре, этот фермент называют ДНК-нуклеотидилэкзотрансферазой, или теломерной терминальной трансферазой (мол. масса 103--133 кДа). Помимо белковой части теломераза содержит РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК повторами. Длина теломерной РНК колеблется от 150 нуклеотидов -- у простейших до 1400 нуклеотидов -- у дрожжей, у человека -- 450 нуклеотидов. Наличие в молекуле теломеразы РНК-последовательности, по которой идет матричный синтез фрагмента ДНК, позволяет отнести теломеразу к своеобразной обратной транскриптазе, т.е. ферменту, способному вести синтез ДНК по матрице РНК. Основное назначение теломеразы -- синтезировать тандемно повторяющиеся блоки ДНК, из которых состоит G-цепь теломерной ДНК. Матричный участок представлен в теломеразной РНК только один раз. Его длина не превышает длину двух повторов в теломерной ДНК. Механизм синтеза теломерных повторов, катализируемый теломеразой: На первой стадии (связывание теломеры) происходит комплементарное взаимодействие части матричного участка теломеразной РНК с 3'-концевым выступающим одноцепочечным сегментом ДНК хромосом. При этом З'-концевой фрагмент ДНК служит затравкой для удлинения этой ДНК на РНК-матрице. На стадии элонгации выступающая цепь ДНК удлиняется до конца матрицы. Эта реакция осуществляется РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью теломеразы. После удлинения выступающей цепи ДНК до конца матрицы происходит транслокация, т.е. перемещение матрицы и белковых субъединиц фермента на заново синтезированный конец теломеразной ДНК, и весь цикл повторяется вновь. После завершения удлинения одноцепочечной З'-концевой теломерной последовательности вторая цепь ДНК (С-цепь) достраивается с помощью обычной ДНК-полимеразы. Таким образом происходит решение проблемы концевой репликации ДНК у эукариот. Репарация и рекомбинация ДНК 14. Прямая репарация тиминовых димеров, алкилированных оснований и одноцепочечных разрывов в молекуле ДНК. Прямая репарация включает несколько наиболее простых механизмов коррекции ДНК, которые осуществляются обычно с помощью одного репарирующего фермента. По такому механизму осуществляются прямая реактивация и прямая фотореактивация. Прямая реактивация важна для «исправления» алкилированных (в основном метилированных и этилированных) азотистых оснований. У бактерий специальный фермент метилтрансферазаотщепляет алкильную группу от «неправильного» нуклеотида и переносит ее на свой цистеиновый остаток. В результате сам фермент инактивируется, но может служить регулятором собственного гена и некоторых других генов. Фотореактивация. Неоспоримым фактом является то, что ультрафиолетовый свет (УФ) повреждает уникальную молекулу ДНК. Повреждения в основном касаются пиримидиновых оснований – тимина и цитозина. Под влиянием УФ света происходит перераспределение валентностей в пиримидиновых основаниях, т.е. между находящимися рядом на одной нити двумя тиминами, двумя цитозинами или тимином и цитозином. Следствием этого является появление необычной химической связи между основаниями и возникновение димера (два нуклеотида) – тиминового (тимин-тимин), цитозинового (цитозин-цитозин) или тиминцитозинового. Водородная связь между оппозитными нуклеотидами при этом разрушается . Есть данные о том , что пиримидиновые димеры способны активировать процессы приводящие к развитию опухолевых заболеваний. Возникшая мутация репарируется несколькими системами репарации. Одна из них фотореактивация. Основной фермент этой реакции – белок фотолиаза имеет сложную белковую структуру. На одном участке молекулы находится светочувствительный центр воспринимающий фотоны синего света и активирующий фермент. Фермент в таком состоянии находит димеры в молекуле ДНК, разрывает образованные УФ связи между тиминами и восстанавливает межнитевые водородные связи пиримидин – пурин. По завершению цикла фермент отходит от ДНК. Следует отметить, что при этом типе репарации фермент непосредственно действует на повреждение, восстанавливая его. Это классический тип прямой репарация. 15. Репарация неправильно спаренных оснований с помощью комплекса белков MutLSH. Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов — система обнаружения и репарации вставок, пропусков и ошибочных спариваний нуклеотидов, возникающих в процессе репликации и рекомбинации ДНК, а также в результате некоторых типов повреждений ДНК. Сам факт ошибочного спаривания не позволяет исправить ошибку, поскольку она может находиться на любой из двух составляющих ДНК ниток. Однако ошибки спаривания, как правило, локализуются только на одной (дочерней) нити ДНК, что позволяет избежать неоднозначности в интерпретации ошибки. В грам-положительных бактериях исходная нитка ДНК метилирована, а дочерняя нитка некоторое время остаётся неметилированной. Механизм распознавания исходной и дочерней ниток у других прокариот и эукариот в настоящее время неясен. Предполагается, что у них дочерняя нить ДНК содержит разрезы, которые затем удаляются ДНК-лигазой. Вероятность ошибки при репликации ДНК составляет 10–7—10–8. Система репарации ошибочно спаренных нуклеотидов снижает эту вероятность до 10–9. Процесс репарации заключается в распознавании дефекта, определении исходной и дочерней нити ДНК, удалении ошибочно включённого нуклеотида и его замена правильным нуклеотидом. Удаляется обычно не только неправильный нуклеотид, но и часть нити ДНК вокруг него, после чего дочерняя нить восстанавливается, используя основную нить как матрицу. Белки-репараторы Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов — чрезвычайно консервативный процесс, практически без изменений унаследованный эукариотами от прокариот. Впервые этот тип репарации был обнаружен у S. pneumoniae (гены HexA и HexB). В дальнейшем исследования E. coli позволили обнаружить ряд генов, блокировка которых вызывает резкое повышение уровня мутаций. Белки, кодируемые этими генами, являются главными активными составляющими системы репарации и обозначаются префиксом «Mut»: MutS, MutH и MutL (MutS и MutL являются гомологами HexA и HexB соответственно). MutS формирует димер (MutS2), который распознаёт неправильный нуклеотид на дочерней нити ДНК и связывается с дефектным участком ДНК. MutH связывается с полуметилированным участком ДНК, однако не совершает никаких действий, пока не будет активирован димером MutL (MutL2), который служит медиатором между MutS2 и MutH, активируя последний. Спираль ДНК расплетается в поисках ближайшей к дефекту метилированной группы GATC, которая может находиться на расстоянии 1000 нуклеотидов и более. MutH разрезает дочернюю нитку ДНК вблизи метилированной группы и активирует одну из хеликаз UvrABC, которая отделяет дочернюю нить от основной и отрезает её в районе дефекта, включая сам дефект и ближайшие к нему нуклеотиды. Используемая эндонуклеаза зависит от того, по какую сторону (3' или 5') от дефекта MutH разрезает нитку ДНК. Если разрез сделан на стороне 5', используется RecJ или ExoVII, если на стороне 3', то ExoI. Образовавшийся однониточный участок заполняется ДНК-полимеразой III, которая использует основную нитку в качестве образца, а затем разорванная нитка ДНК сшивается ДНК-лигазой и метилируется метилазой. Гомологи MutS Связываясь с ДНК, MutS2 деформирует спираль и покрывает около 20 нуклеотидных пар. Он обладает слабыми аденозинтрифосфатазными свойствами и связывая АТФ формирует третичную структуру молекулы. Рентгеноструктурный анализ показывает, что структура молекулы MutS исключительно асимметричная, и хотя активной конфигурацией является димер, только один из мономеров взаимодействует с дефектным участком ДНК. У эукариот в качестве гомологов MutS обнаружены два гетеродимера: Msh2/Msh6 (MutSα) и Msh2/Msh3 (MutSβ). MutSα используется для репарации нуклеотидных замен и небольших петель, возникших в результате вставки или делеции нуклеотидных цепочек. MutSβ удаляет только длинные петли (10 и более нуклеотидов). Гомологи MutL MutL также обладает слабыми аденозинтрифосфатазными свойствами (использует АТФ для движения вдоль нитки ДНК). Он образует с MutS и MutH комплекс, расширяя участок взаимодействия MutS с ДНК. 16. Эксцизионная репарация оснований. Тминовые димеры, могут быть в силу ряда причин не восстановлены системой фотореактивации. В этом случае активируются ферменты системы эксцизионной репарации. Этот тип репарации позволяет исправить до 95% спонтанных мутаций. Существует несколько типов реакций эксцизионной репарации. Их объединяет то, что повреждённое основание, нуклеотид или неправильно спаренное основание (мисмэтч) вначале полностью вырезается из цепи, а затем вставляется новый нуклеотид (или нуклеотиды) комплементарный нуклеотиду противоположной цепочки. Приведём в качестве примераэксцизионную репарацию нуклеотидов (тиминовых димеров). Реакция состоит из нескольких этапов. На первом этапе ферментэндонуклеаза находит повреждённую нить ДНК и делает надрез в месте повреждения. Другой ферментэкзонуклеазарасширяет надрез, «откусывая» с обоих концов надреза нуклеотиды вместе с тиминовым димером. Образовавшаяся брешь застраивается с одного конца нити ДНК специальным ферментом ДНК-полимеразой. При этом вставляемые нуклеотиды комплементарны нуклеотидами не повреждённой нити ДНК. Не застроенной остаётся небольшой разрыв, который сшивается ДНК-лигазой. Дефекты в различных путях репарации ДНК способствуют развитию рака, и BER не является исключением. В самых разных организмов нарушения в генах, белковые продукты которых задействованы в BER, приводят к резкому повышению частоты мутаций, что является предпосылкой для раковых заболеваний. Действительно, соматические мутации, затрагивающие ДНК-полимеразу β, наблюдаются в 30 % случаев рака, и некоторые из них вызывают злокачественную трансформацию у мышей. Мутации ДНК-гликозилазы MUTYH повышают риск развития рака толстой кишки. 17. Эксцизионная репарация нуклеотидов с помощью белков uvrABC. NER-система у человека достаточно эффективно исправляет последствия действия на организм канцерогенов, солнечных лучей и табачного дыма. Эксцизионная репарация нуклеотидов у кишечной палочки E. coli —АТФзависимыйпроцесс, в котором участвуют ферментыUvrA,UvrB,UvrC. Эту систему ещё часто называют UvrABC-эндонуклеазой Стадии репарации: 1.Ферментный комплекс UvrABC разрезает цепь ДНК у7-гои3-го/4-гонуклеотида с 5’- и 3’- стороны от повреждения, соответственно. 2.Вырезанный 11-12нуклеотидный фрагмент затем вытесняется фер-ментом UvrD(хеликазаII). 3.ДНК-полимеразаIсинтезует комплементарную цепочку, а ДНК-ли-газа сшивает цепи. У эукариот NER-системасостоит из 16 белков и вырезает отрезок длиной примерно 30 нуклеотидов. 18. SOS-репарация. Агенты, повреждающие ДНК, индуцируют комплексную систему защиты в клетках кишечной палочки E. coli —SOS-ответ.Эта система регулируется белкамиLexA (репрессор) иRecA (ДНК-связывающийбелок). В норме LexA подавляет экспрессию гена SOS. Однако при повреждении цепи ДНК связываются с RecA и формируют комплекс, который выключает LexA.SOS-системаконтролируется 43 генами, среди которых — гены, кодирующиеДНК-полимеразы IV иV. Эти полимеразы способны синтезировать цепь, не имея матрицы в виде комплементарного участка ДНК. ПоэтомуSOS-репарациясовершает ошибки и является мутагенной, однако позволяет продлить срок жизни клетки. По мнению некоторых учёных, эта система позволяет клеткам приобрести новые признаки, утратив при этомкакие-либодругие. 19. Рекомбинационная репарация. Рекомбинационная репарация у кишечной палочки осуществляется следующим образом: 1.Репликативная вилка встречает одноцепочечный разрыв и останавливается. 2.Процесс восстановления начинается с переноса белками RecBCD +RecA участка новосинтезированной и неповрежденной ДНК на двуцепочечную ДНК в место повреждения (с3’-конца). 3.Образуется структура Холлидея. Происходит обмен 3’-концамимежду репликативными вилками с помощью белковRuvAB. 4.Белок RuvC разрывает структуру Холлидея и восстанавливает репликативные вилки. 5.Процесс репликации продолжается при участии особой праймосомы. 20. Механизм общей гомологичной рекомбинации: образование гетеродуплексов, миграция ветви, разрешение структур Холлидея. Роль белков RecA, RecBCD и RuvABC в рекомбинации у E.coli. Известно два основных механизма гомологичной рекомбинации: путь репарации двуцепочечных разрывов (DSBR-путь), также известный как модель двойной структуры Холлидея, и путь синтезозависимого отжига цепи (SDSA-путь). Оба начинаются одинаковым образом. Когда двуцепочечный разрыв в цепи обнаружен, белковый комплекс MRX (у человека MRN) встает по обе стороны от разрыва, после чего следует отрезание 5'концов, проходящее в два отдельных этапа. Первый этап заключается в том, что MRX в паре с белком Sae2 вырезают 5'-концы цепи около разрыва, тем самым оставляя выступающие 3'-концы. Второй этап 5' → 3'-отрезания продолжает геликаза Sgs1[en] и нуклеазы Exo1 и Dna2. Sgs1 «расстёгивает» двойную спираль, а Exo1 и Dna2 создают разрывы в одноцепочечной ДНК, высвобожденной Sgs1. Репликативный белок А (RPA), имеющий высокое сродство к одноцепочечной ДНК, связывает выступающие 3'-концы и с помощью ряда других белков, которые опосредуют процесс, например Rad51, формирует комплекс с одноцепочечной ДНК, покрывая её. Затем нуклеопротеидная нить ищет похожую или идентичную цепь ДНК и внедряется в неё, когда находит. В клетках, делящихся путем митоза, «жертвой» внедрения обычно является сестринская хроматида, идентичная поврежденной ДНК, которая чаще всего используется в качестве матрицы для репарации. В мейозе, однако, реципиентным ДНК-дуплексом служит гомологичная хромосома, которая очень похожа на повреждённую хромосому, но не обязательно идентична ей[29]. В ходе вторжения цепи между торчащим 3'-концом внедряющейся цепи и гомологичной хромосомой образуется D-петля. После этого ДНК-полимераза продлевает 3'-концы. Получившаяся перекрёстная структура называется структурой Холлидея. Вслед за этим на внедрённой цепи (то есть на одном из выступающих 3'-концов) происходит синтез ДНК, эффективно восстанавливая её комплементарно гомологичной хромосоме в том месте, откуда была вытеснена D-петля У прокариот известны ферменты, вовлеченные в каждый этап рекомбинации, и кодирующие их гены, имеющие название rec (recombination). Мутации этих генов фенотипически проявляются в неспособности к рекомбинации. Идентифицировано около 20 таких генов. У Е. coli описаны два механизма гомологичной рекомбинации. Один - RecAзависимый, то есть основанный на уникальных свойствах АТР-зависимой синаптазы - белка RecA, другой - recA-независимый, ключевым ферментом которого является АТРнезависимая аннилаза - белок RecT. Белок RecT отжигает комплементарные участки ДНК взаимодействующих молекул так, что становится возможной репарация двунитевых разрывов ДНК. Но мы остановимся подробно на RecA-зависимой рекомбинации, так как именно этот тип рекомбинации оказался тем механизмом, эволюция которого привела к появлению особой системы репарации двунитевых разрывов у эукариот. У Е. coli в рекомбинацию, проводимую белком RecA, вовлечено более 20 белков. Рекомбинация инициируется переходом белка RecA в активную форму RecA*, представляющую собой тройной комплекс RecA::ATP::oнДHK, образующийся при полимеризации отдельных молекул RecA на онДНК в присутствии АТР. То есть онДНК выступает в качестве "затравки" процесса. Гомологическая рекомбинация может быть инициирована как двунитевыми разрывами ДНК так и однонитевыми брешами. Существует много доказательств того, что даже единственной бреши только в одной цепи молекулы ДНК достаточно для инициации общей рекомбинации. Химические препараты или облучение, приводящие к образованию однонитевых разрывов, будут стимулировать рекомбинацию. В принципе, инициировать рекомбинацию в клетке может любая онДНК. Однако в нормальной клетке баланс ферментов таков, что образующиеся в ходе репликации однонитевые пробелы (между фрагментами Оказаки) не являются рекомбиногенными. 21. Сайт-специфическая бактериальную хромосому). рекомбинация (механизм интеграция фага λ в Сайт-специфическая рекомбинация — тип генетической рекомбинации в которой при обмене цепей ДНК происходит реакция между специфическими cайтами. Перестановка сегментов ДНК происходит путем распознавания и связывания коротких последовательностей ДНК (сайтов), в которых специальные ферменты расщепляют, переставляют и снова соединяют цепи ДНК. Для одних систем рекомбинации достаточно только фермента рекомбиназы, другие же требуют наличия дополнительных факторов. В природе сайт-специфическая рекомбинация случается при интеграции вируса в геном (образование провируса). Системы сайтспецифической рекомбинации высокоспецифичны, быстры и эффективны даже при работе со сложными эукариотическими геномами[4] и по этой причине широко используются в генетической инженерии[5] Они участвуют во множестве клеточных процессов, включая репликацию бактериального генома, патогенез, передвижение мобильных генетических элементов и образовании антител в лимфоидных клетках млекопитающих. Сайты рекомбинации обычно имеют длину от 30 до 200 нуклеотидов и состоят из двух инвертированных повторов, с которыми связывается рекомбиназа, между которыми располагается последовательность по которой и происходит рекомбинация. Оба сайта по которым происходит рекомбинация как правило идентичны, но бывают и исключения. Фаг λ, фаг лямбда — умеренный бактериофаг, который заражает кишечную палочку (Escherichia coli). Как только фаг попадает внутрь клетки хозяина, он может интегрировать себя в его ДНК. В этом состоянии λ называют профагом, он остается в геноме хозяина, внешне не проявляя своё присутствие. Профаг размножается с каждым делением клетки хозяина. ДНК профага может экспрессироваться в тех случаях, когда наблюдаются признаки стресса в клетке-хозяине. Стресс может быть вызван голоданием, ядами (например антибиотиком), или другим факторами, которые могут повредить или уничтожить хозяина. В этом случае профаг активируется, выделяет себя из ДНК клетки-хозяина и вводит её в литический цикл. Активированный фаг уничтожает ДНК хозяина и производит большое количество собственной мРНК, чтобы произвести множество единиц фага. Когда все ресурсы хозяина исчерпаны от построения новых фагов, клетка-хозяин разрушается, клеточная мембрана разрывается, и новые фаги выходят во внешнюю среду[3]. Интеграция фага λ происходит на специальном сайте в бактериальном геноме, названном attλ. Последовательность att сайта называют attB (состоит из компонентов B-OB'), тогда как комплементарную последовательность в кольцевом геноме фага называют attP (состоит из компонентов P-O-P'). Сама интеграция — последовательный обмен (см. генетическая рекомбинация) происходит через образование структуры Холлидея и требует фагового белка Int и бактериального белка IHF (англ. integration host factor). И Int и IHF связываются с attP и формируют интрасому: ДНК-белковый комплекс, предназначенный для сайт-специфической рекомбинации ДНК фага и хозяина. Оригинальная BOB' последовательность заменяется интеграцией на B-O-P'-фаг ДНК-P-O-B'. ДНК фага теперь — часть генома хозяина. Мобильные генетические элементы 22. Характеристика IS-элементов и транспозонов бактерий: структура и механизм перемещения. У микробных клеток есть еще 2 вида структурных компонентов ДНК: Isпоследовательности и транспозоны. Они относятся к мигрирующим генетическим элементам и могут кодировать свой собственный перенос (транспозицию) от одного нуклеоида к другому или между нуклеоидом и плазмидами. Это обусловлено их способностью определять синтез ферментов транспозиции и рекомбинации – транспозаз. Более просто устроены инсерционные последовательности (Is-элементы). Is-элементы (от англ. insertion – вставка, sequence – последовательность) обладают своеобразными генетическими свойствами. Во-первых, они способны перемещаться по геному. При этом происходит репликация Is-элемента. Первичный экземпляр остается на прежнем месте, а копия встраивается в мишень. Места, куда встраиваются инсерционные последовательности, почти не обладают специфичностью. Функции, обеспечивающие способность к перемещению (транспозиции), закодированы в самом Is-элементе. Во-вторых, транспозиция представляег собой редкое событие, которое происходит на порядок реже, чем спонтанные мутации. В-третьих, в местах, смежных по отношению к инсерции, возникают делеции и инверсии бактериальных генов. Кроме этого, встроенная инсерция может либо активировать транскрипцию соседних генов, выступая в роли промотора, либо наоборот, ингибировать их. Наконец, именно Is-элементы обеспечивают взаимодействие между нуклеоидом, плазмидами и эписомами (например – F-фактором). В свободном состоянии Is-последовательности не обнаружены. Транспозоны – это более сложно устроенные генетические элементы. Они состоят из 2500-20000 и более пар нуклеотидов. В отличие от инсерций, они могут быть в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы. Кроме того, транспозоны могут перемещаться из хромосомы в плазмиды и наоборот, мигрируя с репликона на репликон. ДНК транспозонов окружена с обоих концов (фланкирована) последовательностями ДНК, напоминающими Isэлементы. Некоторые умеренные фаги (например, Mu-бактериофаг E.coli) устроены аналогично и по существу представляют собой гигантские транспозоны. Транспозоны могут нести информацию о синтезе бактериальных токсинов и ферментов, модифицирующих антибиотики. Также они могут проникать в хромосому клеток животных или человека сходно с провирусами. Так как для интеграции в геном транспозоны не нуждаются в классической рекомбинации, а обладают собственной системой встраивания, то они могут широко горизонтально распространяться между различными видами бактерий. 23. Характеристика ДНК-транспозонов эукариот: структура, механизм перемещения, представители. ДНК-транспозоны передвигаются по геному способом «вырезать и вставить» благодаря комплексу ферментов под названием транспозаза. Информация об аминокислотной последовательности белка транспозазы закодирована в последовательности транспозона. Кроме того, этот участок ДНК может содержать другие, связанные с транспозоном последовательности, например гены или их части. Большинство ДНК-транспозонов имеют неполную последовательность. Такие транспозоны не являются автономными и передвигаются по геному благодаря транспозазе, которая закодирована другим, полным, ДНК-транспозоном. На концах участков ДНК-транспозона расположены инвертированные повторы, которые являются особыми участками узнавания транспозазы, таким образом отличая эту часть генома от остальных. Транспозаза способна делать двухцепочные разрезы ДНК, вырезать и вставлять в ДНК-мишень транспозон. К ДНК-транспозонам принадлежат Ac/Ds-элементы растений, которые были впервые открыты Барбарой Макклинток в кукурузе. Ac-элемент (англ. Activator) является автономным и кодирует транспозазу. Есть несколько типов Ds-элементов, которые способны к формированию разрывов хромосом и которые перемещаются по геному благодаря Ac-элементам. Гелитроны (англ. Helitron) — тип транспозонов, который есть у растений, животных и грибов, но который широко представлен в геноме кукурузы, где он, в отличие от других организмов, находится в частях ДНК, богатых генами. Гелитроны транспозируются по механизму «катящегося кольца». Процесс начинается с разрыва одной цепи ДНКтранспозоны. Высвобожденный участок ДНК вторгается в последовательность-мишень, где формируется гетеродуплекс. С помощью ДНК-репликации завершается внедрение транспозона в новый участок. Гелитроны могут захватывать соседние последовательности при транспозиции. 24. Ретротранспозоны с длинными перемещения, представители. концевыми повторами: структура, механизм Ретротранспозоны — это мобильные генетические элементы, которые применяют метод «копировать и вставить» для распространения в геноме животных. По крайней мере 45 % генома человека составляют ретротранспозоны и их производные. Процесс передвижения включает промежуточную стадию молекулы РНК, которая считывается с участка ретротранспозона и которая затем, в свою очередь, используется как матрица для обратной транскрипции в последовательность ДНК. Новосинтезированный ретротранспозон встраивается в другой участок генома. Активные ретротранспозоны млекопитающих делятся на три основные семьи: Aluповторы, ДДП-1, SVA. Структура ДДП-1-ретротранспозона. ДДП-1-ретротранспозоны — длинные диспергированные повторы — тип ретротранспозонов, который широко распространён у млекопитающих и составляет до 20 % генома. ДДП-1 -элементы имеют длину около 6 тысяч пар оснований. Большинство этих ретротранспозонов в геноме представлено неполно, хотя существует примерно 150 полных и потенциально мобильных ДДП-1-элементов в последовательности ДНК человека и примерно 3000 — у мыши. Процесс передвижения начинается со считывания молекулы РНК с элемента ДДП1. РНК транспортируется к цитоплазме, где от неё транслируются белки БОРС1 (который является РНК-связывающим белком) и БОРС2 (который является белком с эндонуклеазной и возвратно-транскриптазной активностями). БОРС1, БОРС2 и РНК транспозона формируют рибонуклеопротеин и импортируются в ядро, где происходит обратная транскрипция ретротранспозона. Большинство случаев вставки ДДП-1-элементов происходит не до конца, и такие копии больше не способны к самостоятельной мобилизации. Существуют сведения о неканонических функциях ДДП-1-элементов во время инактивации X-хромосомы. ДКП — длинные концевые повторы — ретротранспозоны, имеющие конечные повторяющиеся последовательности, которые играют важную роль в транскрипции и обратной транскрипции РНК транспозона. ДКП-элементы кодируют белки pol и gag, которые близки к белкам ретровирусов, но, в отличие от последних, ДКП не хватает белков, которые смогли бы сформировать внешнюю оболочку (суперкапсид) и выйти из клетки. 25. Ретротранспозоны без перемещения, представители. длинных концевых повторов: структура, механизм Ретротранспозоны — это мобильные генетические элементы, которые применяют метод «копировать и вставить» для распространения в геноме животных. По крайней мере 45 % генома человека составляют ретротранспозоны и их производные. Процесс передвижения включает промежуточную стадию молекулы РНК, которая считывается с участка ретротранспозона и которая затем, в свою очередь, используется как матрица для обратной транскрипции в последовательность ДНК. Новосинтезированный ретротранспозон встраивается в другой участок генома. Активные ретротранспозоны млекопитающих делятся на три основные семьи: Aluповторы, ДДП-1, SVA. КДП — короткие диспергированные повторы являются неавтономными ретротранспозонами: они требуют активности ДДП-1-элементов для передвижения, в ДНКпоследовательности КДП содержат только участок связывания РНК-полимеразы. В число КДП входят Alu-ретротранспозоны. Структура Alu-ретротранспозона. Alu-повтор (Alu от Arthrobacter luteus) — широко распространённые мобильные элементы в геноме человека. Alu-элементы имеют длину около 300 пар оснований и часто расположены в интронах, участках генома, которые не транслируются, и межгенных участках. Приставку Alu- ретротранспозоны получили за то, что они содержат последовательность распознавания рестрикционного энзима AluI. Анализ последовательностей показал, что Alu-элементы возникли у приматов примерно 65 миллионов лет назад от гена 7SL РНК, который входит в рибосомный комплекс. Aluретротранспозоны не имеют собственной обратной транскриптазы, поэтому для передвижения им необходимые ферменты ДДП-1-элементов. Alu-элементы являются участками, где происходит до 90 % всех случаев A-I редактирования РНК. SVA — мобильные элементы длиной в 2-3 тысячи пар оснований ДНК, состоящие из нескольких частей: коротких разбросанных элементов (КДП), вариабельного числа тандемных повторов (ВЧТП), Alu-последовательностиі и CT-повтора, с последовательностью CCCTCT, которая встречается чаще всего и имеет название гексамер (Hex). SVA элементы значительно варьируют в длину из-за разного количества составляющих повторов. Они не являются автономными и нуждаются в белках, закодированных в ДДП1 ретротранспозонах для передвижения, но они активны в геноме человека. SVA-элементы претерпевают высокий уровень метилирования ДНК в большинстве тканей человека. Интересным фактом является заниженное метилирование ДНК SVA-ретротранспозонов в мужских половых клетках человека, тогда как у шимпанзе SVA-последовательности сперматозоидов высоко метилированы. Транскрипция ДНК 26. Понятие о кодирующей и некодирующей (матричной) цепях ДНК. Единица транскрипции у про- и эукариот и ее структурные элементы. Процесс переноса информации с ДНК на РНК называется транскрипцией. Давайте посмотрим на схему транскрипции внимательно, благо всеми понятиями, которые нужны, чтобы в ней разобраться, мы теперь уже владеем. Итак, двойная спираль ДНК частично раскручивается, и фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза ползет по одной из ее цепей от 3’-конца к 5’-концу, синтезируя комплементарную этой цепи РНК. Отметим, что синтезируемая РНК, точно так же как и вторая цепочка ДНК, антипараллельна той цепи, которой она комплементарна. Это означает, что 5’-конец и 3’-конец у нее направлены в другую сторону. Цепь ДНК, с которой идет транскрипция, называется кодирующей, противоположная - некодирующей. Тут возникает вопрос: откуда РНК-полимераза "знает", какая из цепей - кодирующая? Ответ: РНК-полимераза распознает кодирующую цепь по наличию в ней особой нуклеотидной последовательности - промотора. В некодирующей цепи промотора нет, а есть комплементарная ему последовательность, которая распознана РНК-полимеразой не будет. Получающаяся в итоге иРНК будет повторять нуклеотидную последовательность именно некодирующей цепи, только, конечно, с повсеместной заменой тимина на урацил. Мономерами, из которых строится новая молекула нуклеиновой кислоты, в клетке всегда служат нуклеозидтрифосфаты - в данном случае АТФ, ГТФ, ЦТФ и УТФ. Синтез РНК молекулами РНК-полимераз in vivo начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами, и завершается на особых регуляторных последовательностях – терминаторах. Последовательности нуклеотидов ДНК, заключенные между промоторами и терминаторами, называют транскрипционными единицами, или транскриптонами. В пределах каждого транскриптона транскрибируется только одна цепь ДНК, которая получила название значащей или матричной. Термины "транскрипционная единица" или "транскриптон" по смыслу близки термину "ген", но они не всегда совпадают. Так, транскрипционные единицы прокариот, как правило, заключают в себе генетическую информацию нескольких генов и называются оперонами. Продуктами транскрипции оперонов являются полицистронные мРНК, в результате трансляции которых рибосомами образуется несколько белков. Белки, кодируемые полицистронными мРНК, обычно функционально связаны друг с другом и обеспечивают протекание какоголибо метаболического процесса, например биосинтеза определенной аминокислоты или утилизацию углеводов в качестве источника углерода. Организация генов в виде оперонов облегчает координированную регуляцию их экспрессии на уровне транскрипции. Согласованная регуляция транскрипции (и других этапов экспрессии) многих генов, не образующих одного оперона, чаще всего осуществляется специфическими белкамирегуляторами, которые взаимодействуют с гомологичными регуляторными нуклеотидными последовательностями, маркирующими гены данной группы. Промоторы эукариот. Промоторы эубактерий были определены выше как минимальный набор последовательностей нуклеотидов, необходимых для их специфического распознавания холоферментом РНК-полимеразы и начала (инициации) синтеза РНК. Распространение этого определения на промоторы эукариот встречает трудности из-за невозможности в настоящее время исчерпывающе описать эукариотический функциональный аналог бактериального холофермента Es. 27. Особенности структуры РНК-полимеразы E.coli: кофермент и холофермент, роль отдельных субъединиц. У бактерий один и тот же фермент катализирует синтез трёх типов РНК: мРНК, рРНК и тРНК. РНК-полимераза — достаточно большая молекула. Основной фермент содержит 5 субъединиц (~400 кДа): α2: две α-субъединицы связывают остальные элементы фермента и распознают регулирующие факторы. Каждая субъединица состоит из двух доменов: αСКД (С-концевой домен) связывает первый элемент промотора, и αNКД (N-концевой домен) связывается с остальными компонентами полимеразы. β: эта субъединица обладает собственно полимеразным действием, катализируя синтез РНК. Она осуществляет инициацию процесса и управляет элонгацией. β': неспецифически связывается с ДНК. ω: восстанавливает денатурированную РНК-полимеразу обратно в дееспособную форму in vitro. Также обнаружено её защитное/шаперонное действие на β'-субъединицу у Mycobacterium smegmatis. Для связывания с промоторными областями ДНК, основной фермент нуждается в еще одной субъединице — сигма (σ). Сигма-фактор значительно снижает сродство РНКполимеразы к неспецифичным областям ДНК, и в то же время повышает её чувствительность к определенным промоторам, в зависимости от своей структуры. С его помощью транскрипция начинается с нужного участка ДНК. Для инициации транскрипции требуется присутствие определенной регуляторной сигмасубъединицы, необходимой для распознавания РНК-полимеразой промоторов бактериальных генов, определяющей специфичность взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами и, возможно, последующую изомеризацию комплекса РНК-полимеразапромотор, необходимую для начала синтеза РНК. Полный фермент, включающий сигма70субъединицу, часто называют холоферментом и обозначают Есигма70. РНК-полимераза Есигма70 способна транскрибировать большинство (но не все) генов E.coli. В частности, для транскрипции генов теплового шока , оперонов gln или nif требуется включение в состав полного фермента другой регуляторной субъединицы - сигма54 (молекулярная масса 54 кДа) вместо сигма70 с образованием фермента Eсигма54. Полный голоэнзим таким образом состоит из 6 субъединиц: α2ββ'σω (~480 кДа). В структуре РНК-полимеразы присутствует канавка длиной 55 Å (5,5 нм) и шириной 25 Å (2,5 нм). Именно в эту канавку помещается двойная спираль ДНК, имеющая ширину 20 Å (2 нм). На длине канавки укладывается 16 нуклеотидов. Молекулы РНК-полимеразы не растворены в цитоплазме. Когда РНК-полимераза не используется, она связывается с неспецифичными областями ДНК в ожидании открытия активного промотора. 28. Альтернативные σ-факторы и их роль в инициации транскрипции. Для инициации транскрипции требуется присутствие определенной регуляторной сигма-субъединицы, необходимой для распознавания РНК-полимеразой промоторов бактериальных генов, определяющей специфичность взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами и, возможно, последующую изомеризацию комплекса РНК-полимеразапромотор, необходимую для начала синтеза РНК. Полный фермент, включающий сигма70субъединицу, часто называют холоферментом и обозначают Есигма70. РНК-полимераза Есигма70 способна транскрибировать большинство (но не все) генов E.coli. В частности, для транскрипции генов теплового шока , оперонов gln или nif требуется включение в состав полного фермента другой регуляторной субъединицы - сигма54 (молекулярная масса 54 кДа) вместо сигма70 с образованием фермента Eсигма54 . Описано до десяти различных сигма-факторов, объединение которых с минимальным ферментом дает возможность образующимся холоферментам узнавать разные промоторы. Все четыре субъединицы кор-фермента обеспечивают контакт РНКполимеразы с промоторами. При этом бета'-субъединица участвует в связывании фермента с ДНК, бета-субъединица образует каталитический активный центр, а альфа- субъединицы обеспечивают правильное взаимодействие фермента с промоторами. Данные такого рода получают с использованием ферментов, у которых под действием мутаций изменены конкретные субъединицы, и если, например, мутация в гене альфа-субъединицы нарушает связывание РНК-полимеразы с ДНК, делаются соответствующие выводы. Однако любая мутантная субъединица в составе олигомерного фермента может изменять его конформацию и придавать ферменту самые неожиданные свойства. Более прямым методом определения мест контакта макромолекул при белокбелковых и белково-нуклеиновых взаимодействиях является метод поперечных сшивок с использованием бифункциональных химических агентов. Такие химические соединения образуют ковалентные связи (поперечные сшивки) между близкорасположенными реакционноспособными группами. 29. Характеристика РНК-полимераз I, II и III эукариот: структура и синтезируемые ими молекулы. Эукариоты обладают различными типами РНК-полимераз, классифицируемыми по типам РНК, которые они производят: РНК-полимераза I, синтезирующая 45S-предшественника рРНК, превращающуюся затем в рРНК 28S, 18S и 5,8S, которые уже образуют главные РНК-секции рибосомы. РНК-полимераза II, производящая предшественников для мРНК, а также для большинства мяРНК и миРНК. Это наиболее хорошо изученный тип РНК-полимеразы. Ввиду того, что транскрипция должна происходить под строгим контролем, РНКполимеразе II для связывания с промоторами требуется целый набор факторов транскрипции. РНК-полимераза III, синтезирующая тРНК, 5S рРНК и другие малые РНК, присутствующее в ядре и цитозоле. Существуют также и другие типы РНК-полимеразы, используемые в митохондриях и хлоропластах. Молекулярная масса этих ферментов составляет величину порядка 500 000. Они различаются по чувствительности к альфа-аманитину. РНК-полимераза I нечувствительна к нему, РНК-полимераза III умеренно чувствительна, а РНК-полимераза II сильно ингибируется им. 30. Структура бактериального промотора и механизм его распознавания РНКполимеразой. Инициация транскрипции у прокариот. Стадии транскрипционного цикла. Транскрипция — это синтез РНК на матрице ДНК. У прокариот синтез всех трех видов РНК катализируется одним сложным белковым комплексом — РНК-полимеразой. Транскрипция включает три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Инициация транскрипции На этом этапе транскрипции необходимы холофермент, специальная последовательность нуклеотидов в ДНК (промотор) и набор нуклеозидтрифосфатов. Транскрипция инициируется при образовании стабильного комплекса между холоферментом и промотором, расположенным в начале всех транскрипционных единиц. Промотор ‒ это участок молекулы ДНК, состоящий примерно из 40 пар нуклеотидов и расположенный непосредственно перед участком инициации транскрипции. В нем различают две важные и достаточно консервативные по составу последовательности. Одна из них состоит из шести или семи нуклеотидов (чаще ТАТААТ) и расположена на расстоянии примерно 10 нуклеотидов от первого транскрибируемого нуклеотида (+1); эту последовательность обычно обозначают как ‒10-последовательность, или Прибнов-бокс, (в честь ее первооткрывателя Прибнова). В данном сайте РНК-полимераза связывается с ДНК. Вторая последовательность расположена на расстоянии примерно 35 нуклеотидов до сайта инициации (-35) и служит участком распознавания промотора РНК-полимеразой . Когда РНК-полимераза связывается с промотором, происходит локальное расплетение двойной спирали ДНК и образование открытого промоторного комплекса, так называемого транскрипционного «глазок». Благодаря этому нуклеотиды матричной цепи ДНК в области «глазка» становятся доступными для спаривания с рибонуклеозидтрифосфатами. Происходит копирование последовательности смысловой, или (+)-цепи ДНК, имеющей направление 5ʹ→ 3ʹ. При этом первым в строящуюся цепь РНК всегда включается пуриновый нуклеотид ‒ АТР или GTP, сохраняющий все три его фосфатных остатка. Затем образуется первая 5ʹ,3ʹ-фосфодиэфирная связь. Далее σ-субъединица теряет связь с ферментом, а кор-фермент начинает перемещаться по ДНК. Элонгация транскрипции Растущая цепь РНК остается связанной с ферментом и спаренной своим растущим концом с участком матричной цепи. Остальная часть образовавшейся цепи не связана ни с ферментом, ни с ДНК. По мере продолжения транскрипции кор-фермент, движущийся вдоль цепи ДНК, действует подобно застежке «молния», расплетая двойную спираль, которая замыкается позади фермента, и восстанавливается ее исходная дуплексная структура. «Раскрытая» ферментом область ДНК простирается всего на несколько нуклеотидов. Наращивание РНК идет в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу вдоль матричной (‒)-цепи, ориентированной в направлении 3ʹ→5ʹ, т.е. антипараллельно. РНК наращивается на 3ʹконце. В ходе присоединением каждого нуклеотида кор-фермент делает шаг по ДНК и сдвигается на один нуклеотид. Размер белкового комплекса, составляющего кор-фермент, 150 Ǻ. Размеры РНК-полимеразы − 150×115×110Ǻ. Скорость работы РНК-полимеразы – до 50 нуклеотидов в секунду. Комплекс корфермента с ДНК и РНК называется элонгационным комплексом. В нем находится ДНКРНК гибрид. Это участок, на котором ДНК спарена с РНК и 3′-конец РНК открыт для дальнейшего роста. Размер этого гибрида – 9 пар оснований. «Расплетенный» участок ДНК занимает примерно 12 пар оснований. Перед «расплетенным» участком РНК-полимераза связана с ДНК. Этот участок называется передним дуплексом ДНК, его размер – 10 пар оснований. Полимераза связана также с более длинной частью ДНК, называемой задним дуплексом ДНК. Размер матричных РНК, которые синтезируют РНК-полимеразы у бактерий, может достигать 1000 нуклеотидов и больше. В эукариотических клетках размер синтезируемых ДНК может достигать 100000 и даже нескольких миллионов нуклеотидов. Правда, неизвестно, существуют ли они в таких размерах в клетках, или в процессе синтеза могут успеть процессировать. Элонгационный комплекс довольно стабилен, т.к. должен выполнить большую работу. Он способен перемещаться по ДНК со скоростью до 50 нуклеотидов в секунду. Этот процесс называется перемещением (или транслокацией). Взаимодействие ДНК с РНКполимеразой (кор-ферментом) не зависит от последовательности этой ДНК, в отличие от σсубъединицы. При прохождении определенных сигналов терминации кор-фермент завершает синтез ДНК. 31. Завершение транскрипции у прокариот: Rho-зависимые и независимые терминаторы. Последовательности ДНК, являющиеся сигналами остановки транскрипции, называются транскрипционными терминаторами. Обнаружено два типа сигналов терминации – ρ-зависимый и ρ-независимый терминаторы. Оба они имеют некоторые общие признаки (прозрачка 11). И тот и другой содержат инвертированные повторы, благодаря чему 3`-концы РНК-транскриптов складываются с образованием шпилек разной длины. Стебли шпилек ρ-независимых терминаторов обычно содержат ГЦ-богатые участки; один из них находится вблизи основания стебля, и к нему примыкает участок, состоящий из 4-6- У и 1-2- А-остатков. В стебле ρ-зависимых терминаторов, напротив, содержится лишь несколько ГЦ-пар (а иногда и не содержится вообще), а У-3`-концы могут отсутствовать. Точный механизм ρ-независимой и ρ-зависимой терминации транскрипции является пока предметом дискуссий. Наиболее вероятно следующее объяснение ρнезависимой терминации: РНк-полимераза останавливается после транскрипции инвертированного повтора потому, что шпилечная структура оказывается помехой. В результате сразу после остановки процесса РНК отделяется от матричной цепи вблизи Убогатого участка, который относительно слабо связан с А-богатым участком матрицы. Этим, по-видимому, объясняется то обстоятельство, что наиболее часто на конце цепи РНК находятся У-или А-остатки. ρ – это олигомерный белок, прочно связывающийся с РНК и в этом состоянии гидголизующий АТФ до АДФ и неорганического фосфата. В одной их моделей действие ρбелка объясняется тем, что он связывается с синтезируемой цепью РНК и перемещается вдоль нее в направлении 5΄→3΄ к месту синтеза РНК; необходимая для его перемещения энергия выделяется при гидролизе АТФ. Если ρ-белок наталкивается на образующуюся в РНК шпильку, он останавливает полимеразу, которая могла бы продолжать транскрипцию. Возможно, для отсоединения РНК от матрицы достаточно этой ρ-индуцированной остановки, но не исключено, что диссоциации и отделению способствует сам ρ-белок. Терминация транскрипции редко является абсолютно зависимой или абсолютно независимой от ρ-белка. Некоторые ρ-независимые терминаторы работают в присутствии ρ более эффективно. А в некоторых условиях так называемые ρ-зависимые терминаторы вызывают терминацию и в отсутствии ρ, хотя и не столь успешно. Терминация, как и инициация синтеза РНК является регулируемым процессом. Существуют белки, функционирующие как антитерминаторы и предотвращающие терминацию в ρ-независимых терминаторах; известны также другие белки, ингибирующие ρ и тем самым обеспечивающие удлинение цепи после сигналов терминации. При определенных обстоятельствах молекулы РНК могут образовывать альтернативные шпилечные структуры на особых последовательностях определенных участков ДНК. Одни их таких структур могут приводить к абортивной терминации, а другие, к продолжению транскрипции. 32. Структура лактозного оперона и репрессоров и активаторов. механизм его регуляции с помощью белков В состав бактериальных геномов входят независимые гены и опероны. Работа независимых генов не регулируется другими генами, а их экспрессия носит конститутивный (непрерывный) характер. От соседних генов независимые гены отделены некодирующими участками (спейсерами), которые обычно не транскрибируются. В отличие от независимых генов оперон — это группа рядом расположенных структурных генов, имеющих общую систему регуляции. Обычно эти гены участвуют в осуществлении последовательных этапов какого-либо биохимического процесса. Впервые модель оперона была разработана в 1960 г. французскими биохимиками Ф. Жакобом и Ж. Моно на примере процесса сбраживания лактозы. В систему лактозного оперона входят три структурных гена (Z, Y, A), кодирующие три фермента, участвующие в процессе сбраживания молочного сахара (см. схему). Основным ферментом является β-галактозидаза. К системе регуляции оперона относятся промотор, оператор и ген-регулятор. Промотор расположен перед оператором и является участком, который узнается ферментом РНК-полимеразой, осуществляющим транскрипцию структурных генов. Одна из субъединиц фермента (δ-частица) узнает промотор по специфической последовательности нуклеотидов (блок Прибнова), благодаря чему РНК-полимераза связывается с матрицей. Фермент начинает транскрипцию, если расположенный рядом с промотором оператор не связан с белком-репрессором, вырабатываемым под контролем генарегулятора. Отсутствие этой связи обусловлено наличием в клетке субстрата — лактозы, с которой соединяется репрессор. Как только уровень лактозы в клетке падает, регуляторный белок освобождается и садится на оператор, препятствуя тем самым транскрипции структурных генов. Такой тип регуляции носит название негативной индукции, т.к. отсутствие репрессора запускает работу оперона. У прокариот установлены и другие механизмы оперонной регуляции. Например, при синтезе триптофана она может осуществляться по типу репрессии, при котором сам конечный продукт (триптофан) является корепрессором и в комплексе с белком-регулятором, связываясь с оператором, препятствует транскрипции. Объем генома прокариот может увеличиваться, с одной стороны, за счет копирования имеющихся генов, а с другой — за счет включения в геном чужеродной генетической информации. Путями переноса информации у прокариот являются процессы трансформации, конъюгации, трансдукции и транспозиции. 33. Транскрипция генов эукариот с помощью РНК-полимеразы I: расположение и структура промотора, механизм его распознавания, транскрипционные факторы, последовательность сборки инициаторных комплексов на промоторе, терминация транскриптов. Промоторы генов класса I включают левый регуляторный элемент, расположенный на расстоянии 100 п.н. от стартовой точки генов пре-рРНК. Два фактора транскрипции – UBF (Upstream Binding Factor) и SL1 (Selectively factor 1) связываются с регуляторным элементом промотора и стабилизируют инициирующий комплекс. У дрожжей белковый фактор Reb-1 связывается с природными терминаторами транскрипции на ДНК, обеспечивая как остановку элонгирующей РНК-полимеразы I на этих терминаторах, так и последующее освобождение РНК из транскрипционных комплексов. Удаление в результате делеции из рибосомной транскрипционной единицы Reb-1-связывающего сайта нарушает правильное образование 3'-концов рРНК in vivo. Мышиный фактор TTF-1 , который также является ДНК- связывающим белком, необходим для правильной терминации транскрипции РНК-полимеразой I в клетках этих животных. 34. Транскрипция генов эукариот с помощью РНК-полимеразы II: расположение и структура промотора, механизм его распознавания, транскрипционные факторы, последовательность сборки инициаторных комплексов на промоторе, терминация транскриптов. Гены класса II транскрибируются с помощью РНК-полимеразы II. Регуляторные последовательности промоторов генов этого класса включают: • ТАТА-бокс (блок Хогнесса) • СААТ-бокс • ГЦ-бокс • цис-элементы • Энхансеры • Сайленсеры Почти для всех промоторов генов эукариот класса II характерно наличие консервативной последовательности слева от точки начала транскрипции. Это ТАТА-бокс (ТАТААТАА) или блок Хогнесса. На расстоянии 70-80 п.н. в направлении 5’-конца от точки старта расположена другая последовательность – ЦААТ–бокс, также необходимая для связывания РНК-полимеразы. ГЦ-повторы расположены слева от точки старта на расстоянии 300 п.н. Образование минимального инициирующего транскрипционного комплекса связано с последовательным присоединением белков (базовых факторов транскрипции) с промотором: 1. Первым с ТАТА-боксом связывается белок TBP, входящий в состав фактора TFIID 2. Затем присоединяется белок TFIIВ 3. После этого с промотором связываются TFIIF и РНК-полимераза II 4. Затем TFIIE и TFIIH (геликаза) завершают сборку инициирующего комплекса Транскрипция с участием минимального инициирующего комплекса происходит с недостаточной скоростью. Для эффективной транскрипции необходимы другие цисэлементы и транс-факторы, а также энхансеры, усиливающие транскрипцию в сотни раз. 35. Транскрипция генов эукариот с помощью РНК-полимеразы III: расположение и структура промотора, механизм его распознавания, транскрипционные факторы, последовательность транскриптов. сборки инициаторных комплексов на промоторе, терминация Внутренние промоторы (А-бокс и В-бокс) находятся во всех генах тРНК. Для инициации транскрипции генов тРНК необходимы два транскрипционных фактора: TFIIIC и TFIIIB. Дополнительный фактор TFIIIA необходим для инициации транскрипции генов 5S-рРНК. В клетках животных обнаружен LА-белок , специфически взаимодействующий с РНК, функционирование которого требуется для образования транскриптов полной длины под действием РНК-полимеразы III , что происходит в результате освобождения РНК из транскрипционных комплексов и реинициации транскрипции. 36. Энхансеры, сайленсеры и изоляторы транскрипции. Энхансеры – регуляторные последовательности ДНК, расположенные на расстоянии тысяч пар нуклеотидов справа или слева от точки старта и усиливающие транскрипцию регулируемого гена. Сайленсеры - регуляторные последовательности ДНК, расположенные на расстоянии тысяч пар нуклеотидов справа или слева от точки старта и ослабляющие транскрипцию регулирумого гена. Инсулятор (insulator, от англ. insulate - изолировать, в переводе - изолятор): последовательность ДНК , предотвращающая некорректные взаимодействия между соседними доменами хроматина . Один тип инсуляторов определяет домены, блокируя взаимодействия промоторов из одного домена с энхэнсером из другого. Другой тип инсуляторов предотвращает распространение гетерохроматина. Внедряясь между энхансером и промотором и блокируя способность энхансера активировать транскрипцию с данного промотора, инсулятор действует, как нейтральный, т.е. не участвующий в активации или репрессии транскрипции, элемент, предотвращающий распространение как позитивной, так и негативной информации от энхансера. 37. Характеристика ДНК-связывающих доменов факторов транскрипции эукариот (спираль-поворот-спираль, гомеодомен, спираль-петля-спираль, «лейциновая застежка», «цинковые пальцы»). Анализ структуры ДНК показал существование локальных ее особенностей, специфически узнаваемых молекулами белков. В случае взаимодействия между поверхностью белка и структурой ДНК образуется множество специфических контактов при участии водородных связей, ионного и гидрофобного взаимодействий. Исследование белков, участвующих в регуляции экспрессии генов, позволило выделить несколько групп, объединенных общими признаками в структурной организации. Спираль-поворот-спираль. Первая изученная группа таких белков, связывающихся с ДНК, получила название спираль-поворот- спираль. Два спиральных участка молекулы белка, согнутые под углом в области короткого линейного отрезка, располагаются таким образом, что С-концевой отрезок специфически узнает определенную последовательность нуклеотидов в ДНК. Как правило, все белки с такой структурой выполняют свою функцию в виде димеров. К этой группе белков относится и гомеодомен. Гомеодомен - высоко консервативный домен из 60 аминокислот, обнаруженный среди большого семейства факторов транскрипции. Семейство было сначала идентифицировано у Drosophila (до 60 белков), а в последующем обнаружено у всех живых организмов от дрожжей до человека. Эти белки кодируются группой генов, изменение которых, может вызвать нарушение номального формирования организма (преобразования одной части тела в другую, так называемые гомеотические преобразования). Этот класс генов был идентифицирован как у беспозвоночных так и позвоночных. Сам гомеодомен формирует структуру, высоко подобную бактериальным белкам типа спираль-поворотспираль. Цинковые пальцы: второй тип наиболее часто встречающихся белковых структур, узнающих ДНК содержит в качестве стабилизирующего элемента ион цинка. Существует целое семейство таких белков, наиболее простой из которых составлен из a- спирального отрезка цепи и отрезка с b - структурой, связанных между собой ионами цинка. Этот тип белков участвует в регуляции транскрипции рибосомных РНК (фактор транскрипции РНК pol III, TFIIIA). Второй вариант такой структуры составлен из 2-х a-спиральных участков, также связанных ионами цинка. К ним относятся внутриклеточные рецепторы стероидных гормонов и гормонов щитовидной железы. Атомы цинка связываются с остатками цистеина и гистидина, способствуя формированию пальцевидных структур. И тот и другой варианты используют a -спиральные структуры для узнавания участков. Области пальца могут "вставляться " в главное углубление спирали ДНК. Интервал цинковой области пальца в этом классе факторов транскрипции совпадает с полуповоротом двойной спирали. Спираль-петля-спираль (HLH): HLH домен формирует димеры. HLH домен составлен из двух a- спиральных областей, разделенных областью переменной длины, которая формирует петлю между 2 a – спиралями. HLH область функционирует в форме гомо- и гетеродимеров. Среди белков, имеющих HLH домен можно назвать MyoD (фактор транскрипции, идуцирующий миогенез) и c-Myc (первоначально идентифицированный как ретровирусный онкоген). Некоторые HLH белки не содержат основной области и, образуя гетеродимеры с белками bHLH, действуют как репрессоры, подавляя активность bHLH белков. Лейциновая застежка - молния: как указывалось выше, большинство белков взаимодействуют с ДНК в форме димеров, причем в образовании димера участвуют последовательности аминокислот, которые не задействованы в самом механизме взаимодействия с ДНК. Белки с лейциновым доменом застежки - молнии сочетают при этом обе функции: и образование димера и связывание с ДНК. В белке имеются участки, богатые гидрофобными аминокислотами (часто лейцином) радикалы которого выступают из a-спиральной структуры белка. Два белка с такими участками могут формировать суперспираль в которой выступающие группы радикалов лейцина взаимодействуют с лейциновыми радикалами другого мономера подобно застежке - молнии. Димер при этом приобретает Y- форму. Ножки этой структуры содержат участки узнавания последовательности ДНК. Область лейциновой застежки - молнии присутствует в многих связывающих ДНК белках, типа cMyc, C/EBP и т.д. Процессинг РНК 38. Модификация 5' и 3'-концов молекул мРНК эукариот. Ферменты и катализируемые ими реакции. Значение модификации концов транскриптов. Эукариотические гены имеют большую протяженность и сложное строение. Они включают в себя кроме кодирующих последовательностей -экзонов, многочисленные вставочные участки- интроны. Поэтому продукты транскрипции -предшественники мРНК имеют высокую молекулярную массу и подвергаются процессингу (ковалентной модификации), прежде чем из них образуются зрелые мРНК. Процессинг включает в себя модификацию 5'- и 3'-концов и сплайсинг. Кэпирование 5'-конца происходит, когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 н. К 5'-концу присоединяется ГДФ через свою фосфатную группу, а затем гуанин метилируется с образованием 7-метилгуанозина и образуется кэп. Кэп обеспечивает: 1) инициацию трансляции, так как только в его присутствии рибосома распознает инициирующие кодоны мРНК ,АУГ, ГУГ; 2) защиту мРНК от нуклеаз клетки, удлиняя тем самым время ее жизни; 3) работу ферментативной системы, проводящей сплайсинг. У большинства транскриптов 3'-конец тоже подвергается модификации, при которой специальным ферментом наращивается поли-(А)-«хвост», состоящий из 100 - 200 остатков адениловой кислоты. Поли-(А)- последовательность облегчает выход мРНК из ядра и замедляет ее гидролиз в цитоплазме. 39. Процессинг пре-тРНК: формирование 5'- и 3'-концов тРНК, сплайсинг пре-тРНК эукариот, модификация оснований. Реакции и ферменты, катализирующие эти процессы. Предшественники транспортных РНК (пре-тРНК) включаются в реакции процессинга, часто значительно изменяющие структуру предшественников до того, как они приобретут зрелую форму: эти реакции включают расщепление по 5/- и 3/-концам, добавление нуклеотидов к 3/-концам молекул, многочисленные специфические модификации внутренних нуклеотидов и, во многих случаях, удаление внутренних интронов. 5/-концы транспортных РНК у организмов охватывающих все три царства живого образуются за счет эндонуклеолитического расщепления, катализируемого рибонуклеопротеидным комплексом – РНКазой Р. Эукариотическая РНКаза Р состоит из высококонсервативной РНК и девяти белков, которые узнают соответствующую шпилечную структуру в составе пре-тРНК. РНК-компонент РНКазы Р некоторых видов микроорганизмов может катализировать реакцию расщепления in vitro в отсутствие белковых кофакторов, но эта активность не была доказана для эукариотических ферментов (дополнительная информация по РНК-энзимам приведена в разделе, описывающем свойства интронов I и II групп). Интересно, что, как оказалось, процессинг большинства тРНК протекает в ядрышках, а не в нуклеоплазме, как думали в течение нескольких десятилетий. Что касается 3/-концов транспортных РНК все тРНК приобретают терминальную тринуклеотидную последовательность ССА, необходимую для реакции аминоацилирования, которая ответственна за присоединение аминокислоты к тРНК. У эукариот РНК-полимераза III терминирует транскрипцию за 3/-концом зрелой тРНК. Затем избыточная 3/-концевая последовательность удаляется под действием экзонуклеазы и терминальная ССА-последовательность добавляется с помощью РНК-нуклеотидил трансферазы (известной также как ССА-добавляющий фермент). Белок La, который связывается с участком поли-U на 3/-концах молекул пре-тРНК и других транскриптов синтезируемых РНК-полимеразой III, необходим для правильного процессинга 3/-концов. В общем и целом, молекулы транспортных РНК составляют бóльшую часть класса высоко модифицированных РНК, каждая из которых включает около 100 различных видов модификаций нуклеозидов, расположенных в разных положениях внутренней нуклеотидной последовательности. Эти модификации – начиная с простого добавления метильных групп (как, например, в 1-метилгуанине) и заканчивая крупномасштабными перестройками структуры нуклеозидов (например, 2-метилтио-N6треонилкарбамоиладенозин) – осуществляются посредством химического изменения структуры первоначально транскрибированных нуклеотидов без расщепления сахарофосфатного остова транспортных РНК. Энзимология этих модификаций часто чрезвычайно сложна, так что различные белки могут вносить одну и ту же модификацию нуклеозида, но по двум разным позициям в структуре тРНК. Полагают, что модифицированные нуклеозиды придают действию транспортных РНК неповторимость и специфичность. 40. Механизм сплайсинга пре-мРНК в ядре: определение границ интронов, роль аденилового (А) нуклеотида, находящегося в районе точки ветвления, реакции трансэтерификации. Пре-мРНК, транскрибируемая с ДНК, содержит как экзоны, так и интроны, причём число и длина интронов, создающих необходимый фон для альтернативного сплайсинга, у различных эукариот существенно варьирует. Так, среднее число интронов, приходящееся на один интрон-содержащий ген, у модельных организмов составляет: у дрозофилы Drosophila melanogaster — 2,5, у нематоды Caenorhabditis elegans — 4,2, у резуховидки Таля Arabidopsis thaliana — 4,8; у млекопитающих оно изменяется от 5,7 до 7,8. В ходе сплайсинга экзоны должны быть оставлены в транскрипте, а интроны удалены. Регуляцию и выбор сайтов сплайсинга обеспечивают транс-действующие белки-активаторы и репрессоры сплайсинга, а также присутствующие в самой пре-мРНК цис-действующие элементы — энхансеры и сайленсеры сплайсинга. Типичные эукариотические интроны содержат консенсусные последовательности; так, на 5'-конце каждого интрона присутствует динуклеотид GU, рядом с 3'-концом находится «точка ветвления», в которой всегда присутствует нуклеотид А, а расположенные вокруг него последовательности варьируются. У человека консенсусная последовательность вокруг точки ветвления yUnAy. После точки ветвления расположен ряд пиримидинов, а 3'-конец интрона выглядит как AG. Сплайсинг пре-мРНК осуществляет РНК-белковый комплекс, известный как сплайсосома. В состав сплайсосомы входят малые ядерные рибонуклеопротеиды[en] (snRNP), обозначаемые U1[en], U2[en], U4[en], U5[en] и U6[en] (рибонуклеотид U3 в сплайсинге мРНК не участвует). Рибонуклеотид U1 связывается с 5'-концевым динуклеотидом GU, а U2, при участии белковых факторов U2AF, связывается с точкой ветвления (на этой стадии комплекс называется сплайсосомный А-комплекс). Во время формирования А-комплекса определяются 5'- и 3'-границы удаляемого интрона, а также концы экзонов, которые должны быть оставлены. Далее с А-комплексом связывается комплекс U4, U5, U6. После этого U6 замещает U1, а U1 и U4 покидают комплекс. Оставшийся комплекс подвергается двум реакциям переэтерификации. В ходе первой реакции происходит отрезание 5'-конца интрона от вышележащего экзона и его присоединение в точке ветвления к нуклеотиду А с помощью 2',5'-фосфодиэфирной связи, в результате чего интрон принимает форму лассо. Вторая реакция обеспечивает отрезание 3'-конца интрона и соединение двух экзонов фосфодиэфирной связью; при этом интрон высвобождается и разрушается. 41. Характеристика сплайсосомы: ее структурные компоненты, механизм функционирования. мяРНК и мяРНП-частицы. Роль комплементарных взаимодействий в протекании процесса сплайсинга. Сплайсосо́ма — структура, состоящая из молекул РНК и белков и осуществляющая удаление некодирующих последовательностей (интронов) из предшественников мРНК. Этот процесс называется сплайсингом. Сплайсосому составляют пять малых ядерных РНК (мяРНК), и каждая из них связана по меньшей мере с семью белковыми факторами, образуя малые ядерные рибонуклеопротеины[en] (мяРНП). Содержащиеся в сплайсосоме мяРНП называются U1, U2, U4, U5 и U6. Цикл работы сплайсосомы Сплайсосома функционирует как сложная динамичная машина: в системах in vitro несколько компонентов сплайсосомы собираются на предшественнике мРНК (пре-мРНК) и выполняют свои задачи, после чего уходят, уступая место следующим компонентам. В ходе сплайсинга распознавание 5'-границы сплайсинга, участка точки ветвления и 3'-границы в значительной мере обусловлено спариванием оснований в молекулах мяРНК и консенсусными последовательностями в пре-мРНК. В самом начале сплайсинга U1 комплементарно связывается с 5'-границей связывания, а белок BBP[en] (англ. branchpoint binding protein) и U2AF (вспомогательный фактор U2) узнают будущую точку ветвления. Далее мяРНП U2 вытесняет BBP и U2AF, комплементарно связываясь с консенсусной последовательностью участка точки ветвления. Связывание U2 с точкой ветвления вызывает выход соответствующего неспаренного аденина из спаренной области, благодаря чему он активируется для реакции с 5'-границей сплайсинга. Именно этот аденин станет точкой ветвления. Присутствие же в U2 псевдоуридиновых остатков практически напротив области ветвления приводит к изменению конфигурации связей РНК-РНК во время связывания с U2. Эти изменения структуры, вызванные псевдоуридином, помещает 2'-OHгруппу вытянутого аденозина в положение, позволяющее совершить первый шаг сплайсинга. После этого в реакцию вступает тройной мяРНП U4/U6•U5, в котором U4 и U6 удерживаются вместе за счёт комплементарного связывания. Комплекс U1, U2, U4, U5 и U6 получил название B-комплекса. U5 взаимодействует с последовательностями на 5'- и 3'концах сплайсингового участка за счет инвариантной петли мяРНК, входящей в его состав. Белковые компоненты U5 взаимодействуют с 3'-регионом сплайсингового участка. Сплайсосома претерпевает ряд перестроек, благодаря которым создаётся активный участок сплайсосомы и происходит размещение пре-мРНК для первой фосфорилтрансферазной реакции. Интрон приобретает характерную форму лассо. Происходит ещё несколько перестроек, в результате которых разрываются связи между U4 и U6, и U4 уходит. Освободившаяся U6 заменяет U1 на 5'-границе сплайсинга и образует активный участок для второй фосфорилтрансферазной реакции, в ходе которой соединяются концы экзонов, а интрон вырезается. Комплекс U2, U5 и U6 называется В*-комплексом, а комплекс, существующий в промежутке между существованием В*-комплекса и вырезанием интрона называется С-комплексом. Для соединения экзонов необходима U5. Хотя сами реакции сплайсинга не требуют затрат АТФ, он требуется для сборки и перестроек сплайсосомы. Например, АТФ используется некоторыми белками сплайсосомы для разрыва связей РНК—РНК. По сути все этапы, кроме посадки BBP на точку ветвления и U1 на 5'-сайт сплайсинга, требуют гидролиза АТФ и участия дополнительных белков (для одного события сплайсинга необходимо не менее 200 белков с учётом белков мяРНП). По завершении сплайсинга сплайсосома направляет набор белков, которые связываются с мРНК вблизи позиции, которую раньше занимал интрон. Эти белки носят название комплекса соединения экзонов[en]* (англ. exon junction complex, EJC). Малая сплайсосома Сравнение работы большой (U2-зависимой) и малой (U12-зависимой) сплайсосом Помимо U2-зависимой большой сплайсосомой существует U12-зависимая малая сплайсосома[en] (англ. minor spliceosome). Малая сплайсосома имеется у большинства эукариот, но сплайсирует только около 0,5 % интронов. Такие интроны сплайсируются несколько менее эффективно, чем интроны большой сплайсосомы, и, как предполагается, ограничивают экспрессию соответствующих генов. По сравнению с обычными интронами, которые имеют концы GT—AG и низкоконсервативный 5'-сайт сплайсинга, интроны малой сплайсосомы имеют консервативные 5'-сайты сплайсинга и концы АТ—АС. мяРНП малой сплайсосомы включают четыре специфичные мяРНК U11[en], U12[en], U4atac[en] и U6atac[en], а также мяРНК U5, общую для обеих типов сплайсосом[9]. На рисунке слева представлены основные различия в работе большой и малой сплайсосом. Клиническое значение Мутации различных компонентов сплайсосомы и соответствующие им нарушения зачастую приводят к развитию миелодиспластических синдромов, а также различных видов рака и нейропатологий. В связи с этим кандидатами в противораковые препараты являются малые молекулы, способные модулировать работу сплайсосомы. Синдром Тейби — Линдера связан с мутациями в мяРНК, входящей в состав малой сплайсосомы 42. Аутосплайсинг на примере рРНК тетрахимены: последовательные стадии процесса, рибозим L-19РНК. инициация процесса, Аутосплайсинг индуцируется гуанозином, гидроксильная группа которого атакует фосфатную группу на 5'-конце интрона, в результате чего разрывается межнуклеотидная (фосфодиэфирная) связь и высвобождается З'-конец экзона 1. Затем гидроксильная группа, содержащаяся на З'-конце экзона 1, атакует фосфатную группу на З'-конце интрона, что ведет к вычленению интрона и замыканию фосфодиэфирной связи между ОН-группой З'конца экзона 1 и 5'-фосфатной группой экзона 2. Таким образом в результате реакции трансэтерификации без дополнительных затрат энергии осуществляется лигирование двух экзонов с образованием зрелой 26S рРНК. Вырезанный интрон затем циклизуется. Из его состава путем двухэтапного ауторасщепления освобождается фрагмент, содержащий 19 нуклеотидов, в результате чего образуется РНК длиной 376 нуклеотидов (L-19 IVS), которая и представляет собой истинный РНК-фермент (рибозим), обладающий каталитическими свойствами. Этот рибозим обладает устойчивой структурой, имеет эндонуклеазную активность, расщепляя длинные одноцепочечные РНК. Оказалось также, что рибозим L-19 IVS помимо нуклеазной обладает in vitro нуклеотидилтрансферазной (полимеразной) активностью и способен катализировать синтез олигонуклеотидов (олиго-С). Это указывает на возможность аутокаталитической репликации РНК и является одним из важных свидетельств в пользу существования «мира РНК». В структуре интронов типа I выявлены характерные внутренние олигопуриновые последовательности (у тетрахимены это последовательность GGАGGG), называемые адапторными последовательностями, которые участвуют в образовании активного центра РНК-ферментов и выполняют важнейшую роль в каталитическом расщеплении РНК. 43. Примеры рибозимов и катализируемых ими реакций (L-19 РНК, РНКаза P, "головка молотка"). Эндорибонуклеазная активность РНК была обнаружена Т. Чехом в 1980 г. у интрона группы I предшественника рибосомной РНК Tetrahymena, осуществляющего аутокаталитическую реакцию сплайсинга (аутосплайсинга), в результате которой происходит вырезание из молекулы предшественника рРНК последовательности этого интрона и образование зрелой молекулы рРНК (L-19 РНК). С тех пор аутокаталитические реакции расщепления были выявлены у многих молекул РНК. Наиболее перспективными для использования в составе антисмысловых РНК оказались рибозимы, образующие пространственную структуру типа "головки молотка" (hammerhead - HH).. Такие РНК были найдены у сателлитных РНК вирусов растений, вироидов, а также среди транскриптов сателлитных ДНК тритонов. У РНК подобного типа была определена минимальная каноническая последовательность, необходимая для появления ферментативной активности, длиной в 27 нуклеотидов, из которых высококонсервативны 13 нуклеотидов, а также последовательность из трех нуклеотидов, в пределах которой происходит расщепление фосфодиэфирной связи. Другими примерами рибозимов являются РНК, образующие структуры типа шпилек, а также РНК вируса гепатита дельта (ВГД) и сателлитная РНК Варкуда (Varcud satellite - VS) нейроспоры. Рибозимы со структурами типа шпилек были обнаружены у вироидов и вирусоидов растений , рибозимы ВГД были идентифицированы среди сателлитных РНК вируса гепатита В человека , а рибозимы VS - среди сателлитных РНК природных изолятов Neurospora. В связи с рибозимами следует вспомнить и о РНКазе Р E. coli , состоящей из небольшого полипептида и РНК длиной в 375 нуклеотидов. Именно РНК обеспечивает этому ферменту эндонуклеазную активность, необходимую для процессинга предшественников тРНК. Хотя у природных РНК сайт расщепления и последовательность нуклеотидов рибозима расположены на одной молекуле (in cis по отношению друг к другу), HHрибозимы могут действовать и на сайты расщепления, расположенные in trans, т.е. на других молекулах РНК. Именно это свойство рибозимов данного класса позволило использовать их для создания высокоспецифичных эндорибонуклеаз на основе антисмысловых РНК, которые обладают способностью расщеплять in trans молекулы РНК, содержащие тринуклеотидные сайты расщепления. Для создания высокоспецифического рибозима, функционирующего по этому принципу, последовательность рибозима заключают в последовательность антисмысловой РНК таким образом, чтобы при образовании гибрида с РНК-мишенью в контакте с активным центром рибозима оказывалась тринуклеотидная последовательность сайта расщепления. 44. Процессинг рРНК у прокариот и эукариот (участвующие в процессе ферменты). Метилирование и другие модификации рРНК в ядрышке; роль малых РНК в этих процессах. Процессинг РНК — стадия отвечающая за реализацию генетической информации у про- и эукариот. ПРОКАРИОТЫ. У прокариот синтез белка рибосомой (трансляция) пространственно не отделён от транскрипции и может происходить ещё до завершения синтеза мРНК РНК-полимеразой. Прокариотические мРНК часто полицистронные, то есть содержат несколько независимых генов. ЭУКАРИОТЫ. мРНК эукариот синтезируется в виде предшественника, пре-мРНК, претерпевающего затем сложное стадийное созревание — процессинг, включающий присоединение кэп-структуры к 5'-концу молекулы, присоединение нескольких десятков остатков аденина к её 3'-концу (полиаденилирование), выщепление незначащих участков — интронов и соединение друг с другом значащих участков — экзонов (сплайсинг). При этом соединение экзонов одной и той же пре-мРНК может проходить разными способами, приводя к образованию разных зрелых мРНК, и в конечном итоге разных вариантов белка (альтернативный сплайсинг). Только мРНК, успешно прошедшая процессинг, экспортируется из ядра в цитоплазму и вовлекается в трансляцию. Процессинг РНК (посттранскрипционные модификации РНК) — совокупность процессов в клетках эукариот, которые приводят к превращению первичного транскрипта в зрелую РНК. В зависимости от типа РНК (матричные, рибосомные, транспортные, малые ядерные) их предшественники подвергаются разным последовательным модификациям. Например, предшественники матричных РНК подвергаются кэпированию, сплайсингу, полиаденилированию, метилированию и иногда редактированию. Кэпирование представляет собой присоединение к 5'-концу транскрипта 7метилгуанозина через необычный для РНК 5',5'-трифосфатный мостик, а также метилирование остатков рибозы двух первых нуклеотидов. Процесс кэпирования происходит во время синтеза молекулы пре-мРНК. Кэпирование защищает 5'-конец первичного транскрипта от действия рибонуклеаз, специфически разрезающих фосфодиэфирные связи в направлении 5’→3'. Функции кэпа и связанных с ним белков: участие в сплайсинге; участие в процессинге 3'-конца мРНК; экспорт мРНК из ядра; защита 5'-конца транскрипта от экзонуклеаз; участие в инициации трансляции. Полиаденилирование Фермент поли(А)-полимераза присоединяет 3'-концу транскрипта от 100 до 200 остатков адениловой кислоты. Полиаденилирование осуществляется при наличии сигнальной последовательности 5'- AAUAAA-3' на 3'-конце транскрипта, за которой следует 5'-CA-3'. Вторая последовательность является сайтом разрезания. Сплайсинг После полиаденилирования мРНК подвергается сплайсингу, в ходе которого удаляются интроны (участки, которые не кодируют белки), а экзоны (участки, кодирующие белки) сшиваются и образуют единую молекулу. Сплайсинг катализируется крупным нуклеопротеидным комплексом — сплайсосомой, состоящей из белков и малых ядерных РНК. Многие пре-мРНК могут быть подвергнуты сплайсингу разными путями, при этом образуются разные зрелые мРНК, кодирующие разные последовательности аминокислот (альтернативный сплайсинг). Редактирование Редактирование РНК — процесс, в ходе которого информация, содержащаяся в молекуле РНК, изменяется путём химической модификации оснований. Метилирование мРНК эукариот подвергаются посттранскрипционному метилированию. То есть сметению (метилированию) наружу ингибиторного гена. Наиболее распространённой модификацией является метилирование остатков аденина по положению N6 с образованием N6-метиладенозина (m6A). Этот процесс метилируют ферменты N6аденозинметилтрансферазы, которые распознают остатки аденина в консенсусных последовательностях GAC (70 % случаев) и AAC (30 % случаев). Соответствующие деметилазы ингибируют обратный процесс деметилирования. Учитывая обратимость и динамичность процесса метилирования мРНК, а также повышенную концентрацию m6A в длинных экзонах и вокруг стоп-кодонов, предполагают, что метилирование мРНК выполняет регуляторную функцию. Трансляция; преобразование белковых молекул 45. Матричная (информационная) РНК, ее структура и функциональные участки у прокариот и эукариот. Последовательность кодонов в части молекулы мРНК. Каждый кодон состоит из трех нуклеотидов, обычно соответствующих единственной аминокислоте. Эта молекула мРНК указывает рибосоме синтезировать белок согласно данному генетическому коду. Ма́тричная рибонуклеи́новая кислота́ (мРНК, синоним — информацио́нная РНК, иРНК) — РНК, содержащая информацию о первичной структуре (аминокислотной последовательности) белков. мРНК синтезируется на основе ДНК в ходе транскрипции, после чего, в свою очередь, используется в ходе трансляции как матрица для синтеза белков. Тем самым мРНК играет важную роль в «проявлении» (экспрессии) генов. Длина типичной зрелой мРНК составляет от нескольких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов. Самые длинные мРНК отмечены у (+)оц РНК-содержащих вирусов, например пикорнавирусов, однако следует помнить, что у этих вирусов мРНК образует весь их геном. ДНК нередко сравнивают с чертежами для изготовления белков. Развивая эту инженерно-производственную аналогию, можно сказать, что, если ДНК — это полный набор чертежей для изготовления белков, находящийся на хранении в сейфе директора завода, то мРНК — временная рабочая копия чертежа отдельной детали, выдаваемая в сборочный цех. Следует отметить, что ДНК не содержит чертежи взрослого организма, а больше похожа на «рецепт» по его изготовлению. Строение зрелой мРНК Зрелая мРНК состоит из нескольких участков, различающихся по функциям: «5'кэп», 5'-нетранслируемая область, кодирующая (транслируемая) область, 3'нетранслируемая область и 3'-полиадениновый «хвост». 5'-кэп (от англ. cap — шапочка) — это модифицированный гуанозиновый нуклеотид, который добавляется на 5'- (передний) конец незрелой мРНК. Эта модификация очень важна для узнавания мРНК при инициации трансляции, а также для защиты от 5'-нуклеаз — ферментов, разрушающих цепи нуклеиновых кислот с незащищённым 5'-концом. Кодирующие области состоят из кодонов — следующих непосредственно друг за другом последовательностей из трёх нуклеотидов, каждая из которых соответствует в генетическом коде определённой аминокислоте или началу и концу синтеза белка. Кодирующие области начинаются со старт-кодона и заканчиваются одним из трёх стопкодонов. Считывание последовательности кодонов и сборка на её основе последовательности аминокислот синтезируемой молекулы белка осуществляется рибосомами при участии транспортных РНК в процессе трансляции. В дополнение к кодированию белков, части кодирующих областей могут служить управляющими последовательностями. Например, вторичная структура РНК в некоторых случаях определяет результат трансляции. Моноцистронная и полицистронная мРНК мРНК называют моноцистронной, если она содержит информацию, необходимую для трансляции только одного белка (один цистрон). Полицистронная мРНК кодирует несколько белков. Гены (цистроны) в такой мРНК разделены интергенными, некодирующими последовательностями. Полицистронные мРНК характерны для прокариот и вирусов, у эукариот большая часть мРНК является моноцистронной. Полицистронные мРНК встречаются у эукариот и в митохондриях. Нетранслируемые области — участки РНК, расположенные до старт-кодона и после стоп-кодона, которые не кодируют белок. Они называются 5'-нетранслируемая область и 3'-нетранслируемая область, соответственно. Эти области транскрибируются в составе того же самого транскрипта, что и кодирующий участок. Нетранслируемые области имеют несколько функций в жизненном цикле мРНК, включая регуляцию стабильности мРНК, локализации мРНК и эффективности трансляции. Стабильность мРНК может контролироваться 5'- и/или 3'-областью из-за различной чувствительности к ферментам, которые отвечают за деградацию РНК — РНКазам и регуляторным белкам, которые убыстряют или замедляют деградацию. 3'-полиадениновый хвост Длинная (часто несколько сотен нуклеотидов) последовательность адениновых оснований, которая присутствует на 3'-«хвосте» мРНК эукариот, синтезируется ферментом полиаденилатполимеразой. У высших эукариот поли(А)-хвост добавляется к транскрибированной РНК, которая содержит специфическую последовательность, AAUAAA. Важность этой последовательности можно увидеть на примере мутации в гене человеческого 2-глобина, которая изменяет AAUAAA на AAUAAG, что приводит к недостаточному количеству глобина в организме. 46. Основные свойства генетического кода. Особенности кодового словаря. Генетический код — это способ кодирования последовательности аминокислот в молекуле белка с помощью последовательности нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты. Свойства генетического кода вытекают из особенностей этого кодирования. Триплетность. Каждая аминокислота кодируется триплетом (кодоном) – сочетанием из трех последовательно расположенных нуклеотидов. Неперекрываемость. Один и тот же нуклеотид не может входить одновременно в состав двух соседних триплетов. Однозначность. Каждый триплет кодирует только одну аминокислоту. Избыточность (вырожденность). Одна и та же аминокислота может кодироваться несколькими разными триплетами (от 2 до 6). Исключение составляют метионин и триптофан – каждая из этих аминокислот кодируется лишь одним триплетом. Непрерывность. Между триплетами нет знаков препинания, то есть информация в пределах одного гена считывается непрерывно. Универсальность. У всех живых организмов одним и тем же триплетам соответствуют одни и те же аминокислоты, что свидетельствует о единстве происхождения живых организмов. Генетический код обладает следующими особенностями: 1. Код содержит много синонимов, т.е. почти каждая аминокислота представлена более чем одним кодоном. 2. Код имеет определенную структуру. Так, кодоны - синонимы почти всегда находятся в одном и том же квадрате, т.е. отличаются друг от друга по последнему из трех нуклеотидов. (Исключения из этого правила составляют кодоны аргинина, серина и лейцина, имеющие по шесть кодонов, которые не могут уместиться в одном квадрате, соответствующем всем четырем кодонам). Как видно из таблицы генетического кода, более частое использование пролина, аргинина, аланина и глицина для построения белков соответствует более высокому содержанию [Г] + [Ц], тогда как в белках бактерий с более низким содержанием [Г] + [Ц] следует ожидать более высокой частоты встречаемости фенилаланина, метионина, аспарагина, тирозина, изолейцина и лизина. Исседование суммарного аминокислотного состава белков у разных видов бактерий подтвердило, что различное содержание [Г] + [Ц] в их ДНК может быть частично объяснено подобными различиями в первичной структуре белков. 3. Код содержит три пошеше-кодона («бессмысленных» кодона): УАГ, УАА, и УГА, обозначенных «Стоп»; ни один из них не соответствует ка-кой либо аминокислоте. Они служат сигналами терминации полипептидных цепей. 47. Кодон и антикодон, принципы их взаимодействия. Принцип нестрогого соответствия (wobble-гипотеза). Кодо́н (кодирующий тринуклеотид) — единица генетического кода, тройка нуклеотидных остатков (триплет) в ДНК или РНК, обычно кодирующих включение одной аминокислоты. Антикодо́н — триплет, участок в транспортной рибонуклеиновой кислоте (тРНК) , состоящий из трёх неспаренных (имеющих свободные связи) нуклеотидов. Спариваясь с кодоном матричной РНК (мРНК) , обеспечивает правильную расстановку каждой аминокислоты при биосинтезе белка. Правила, согласно которым происходит взаимодействие кодон-антикодон, суммированы в гипотезе неоднозначного соответствия (гипотеза качаний, Wobbleгипотеза). Эта гипотеза постулирует, что образование пары кодон-антикодон в двух первых положениях кодона происходит всегда по каноническим правилам, но в третьем положении возможно "качание" (неоднозначное соответствие). Объясняется это тем, что конформация антикодоновой петли тРНК допускает значительную подвижность первого основания антикодона. Уридин может образовывать пару не только с аденином, но и с гуанином. Эта пара часто участвует в образовании не только кодон-антикодоновой пары, но и в образовании вторичной структуры тРНК. Инозин может образовывать три различные пары (уридин, цитозин, аденин). 48. Аминоацилирование тРНК как необходимый этап трансляции: механизм действия аминоацил-тРНК-синтетаз. Аминоацилирование— реакция активации аминокислот, в результате которой происходит замещение аденозинмонофосфата (АМФ) в аминоациладенилате (образуется при присоединении карбоксильной группы аминокислоты к остатку АМФ) молекулой тРНК и образование аминоацил-тРНК — конечного продукта реакции активации аминокислот. Нагруженные таким образом молекулы тРНК далее используются рибосомами в качестве субстратов при образовании пептидных связей. Процесс А. осуществляется ферментом аминоацил-тРНК-синтетазой. Аминоацил-тРНК-синтетаза (АРСаза) — фермент-синтетаза, катализирующий образование аминоацил-тРНК в реакции этерификации определённой аминокислоты с соответствующей ей молекулой тРНК. Для каждой протеиногенной аминокислоты существует своя аминоацил-тРНК-синтетаза. АРСазы обеспечивают соответствие нуклеотидным триплетам генетического кода (антикодону тРНК) встраиваемых в белок аминокислот, и, таким образом, обеспечивают правильность происходящего в дальнейшем считывания генетической информации с мРНК при синтезе белков на рибосомах. Аминоацилирование аминокислота + АТФ → аминоацил-АМФ + PPi — АТФ активирует аминокислоту аминоацил-AМФ + тРНК → аминоацил-тРНК + АМФ — активированная аминокислота соединяется с соответствующей тРНК Суммарное уравнение двух реакций: аминокислота + тРНК + АТФ → аминоацил-тРНК + АМФ + PPi Механизм аминоацилирования Сначала в активном центре синтетазы связываются соответствующая аминокислота и АТФ. Из трёх фосфатных групп АТФ две отщепляются, образуя молекулу пирофосфата (PPi), а на их место становится аминокислота. Образованное соединение (аминоациладенилат) состоит из ковалентно связанных высокоэнергетической связью аминокислотного остатка и АМФ. Энергии, содержащейся в этой связи, хватает на все дальнейшие этапы, необходимые для того, чтобы аминокислотный остаток занял своё место в полипептидной цепи (то есть в белке). Аминоацил-аденилаты нестабильны и легко гидролизуются, если диссоциируют из активного центра синтетазы. Когда аминоациладенилат сформирован, с активным центром синтетазы связывается 3'-конец тРНК, антикодон которой соответствует активируемой этой синтетазой аминокислоте. Происходит перенос аминокислотного остатка с аминоацил-аденилата на 2'- либо 3'-ОН группу рибозы, входящей в состав последнего на 3'-конце аденина тРНК. Таким образом синтезируется аминоацил-тРНК, то есть тРНК, несущая ковалентно присоединённый аминокислотный остаток. От аминоацил-аденилата при этом остаётся только АМФ. И аминоацил-тРНК, и АМФ освобождаются активным центром. 49. тРНК: первичная, вторичная и третичная структура, роль модифицированных нуклеотидов. Транспортная РНК, тРНК— рибонуклеиновая кислота, функцией которой является транспортировка аминокислот к месту синтеза белка. Имеет типичную длину от 73 до 93 нуклеотидов и размеры около 5 нм. тРНК также принимают непосредственное участие в наращивании полипептидной цепи, присоединяясь — будучи в комплексе с аминокислотой — к кодону мРНК и обеспечивая необходимую для образования новой пептидной связи конформацию комплекса.Для каждой аминокислоты существует своя тРНК. Первичная структура тРНК тРНК - относительно небольшие молекулы, длина их цепей варьирует от 74 до 95 нуклеотидных остатков. Все тРНК имеют одинаковый 3'-конец, построенный из двух остатков цитозина и одного - аденозина (CCA-конец). Именно 3'-концевой аденозин связывается с аминокислотным остатком при образовании аминоацил-тРНК. CCA-конец присоединяется ко многим тРНК с помощью специального фермента. В других случаях он считывается с кодирующего данную тРНК гена. Нуклеотидный триплет, комплементарный кодону для аминокислоты (антикодон), находится приблизительно в середине цепи тРНК. В отдельных положениях последовательности практически у всех видов тРНК встречаются одни и те же (консервативные) нуклеотидные остатки. В некоторых положениях могут находиться или только пуриновые, или только пиримидиновые основания (их называют полуконсервативными остатками). Для всех молекул тРНК характерно присутствие большого числа (до 25% всех остатков) разнообразных модифицированных нуклеозидов, часто называемых минорными. Они образуются в различных местах молекул, во многих случаях четко определенных, в результате модификации обычных нуклеозидных остатков с помощью специальных ферментов. Общий список выявленных в тРНК модифицированных нуклеозидов превышает 60 названий. Среди них много метилированных производных, часто встречаются псевдоуридин (5-рибофуранозилурацил, Y), 5,6-дигидроуридин, D, 4тиоуридин, инозин и многие другие. Вторичная структура тРНК Анализ нуклеотидной последовательности уже первой расшифрованной дрожжевой аланиновой тРНК выявил возможность складывания цепи во вторичную структуру за счет взаимокомплементарности участков цепи. Три фрагмента цепи оказываются комплементарными при складывании их на себя, образуя шпилькообразные структуры. Кроме того, 5'-конец комплементарен участку, близкому к 3'-концу цепи, при их антипараллельном расположении; они формируют так называемый акцепторный стебель. В результате образуется структура, характеризующаяся наличием четырех стеблей и трех петель, которая получила название "клеверного листа". Стебель с петлей формируют ветвь. В дополнение к трем петлям клеверного листа в структуре тРНК выделяют также дополнительную, или вариабельную, петлю (V-петлю). Ее размеры резко различаются у разных тРНК, варьируя, как это обозначено на рис. 1, от 4 до 21 нуклеотида, а по последним данным, и до 24 нуклеотидов. Двутяжевые стебли, имеющие постоянное число спаренных нуклеотидов, представляют собой двойную спираль. На виток этой спирали приходится 11 пар нуклеотидных остатков, она близка по параметрам к A-форме ДНК. Неспаренные участки молекулы тРНК (петли и CCA-конец) также имеют вторичную структуру: несколько расположенных друг за другом нуклеотидных остатков образуют однотяжевую спираль за счет межплоскостных взаимодействий их оснований (так называемый стэкинг оснований). Пространственная (третичная) структура тРНК Третичная структура тРНК соответстует реальной пространственной структуре. Она получила название L-формы, из-за сходства третичной структуры с формой латинской заглавной буквы «L». Третичная структура образуется благодаря взаимодействию элементов вторичной структуры. Веё формировании принимают участие стэкингвзаимодействия оснований. За счёт стэкинга оснований акцепторный и Т-стебель клеверного листа образуют одну непрерывную двойную спираль, формирующую одну из «палочек» L-формы. Антикодоновый и D-стебли образуют другую «палочку» этой буквы, D- и T-петли оказываются в такой структуре сближенными и скрепляются между собой путём образования дополнительных, часто необычных пар оснований, которые, как правило, образованы консервативными или полуконсервативными остатками. В свете такого участия консервативных и полуконсервативных оснований в образовании L-формы становится ясным их присутствие в T- и D-петлях. Основания антикодона обращены внутрь L-образной молекулы. 50. Структура рибосом про- и эукариот, входящие в их состав рибосомные РНК и белки. Функциональные участки рибосом: мРНК-связывающий участок, тРНК-связывающие А, Р и Е участки, факторсвязывающий участок. Рибосо́ма — важнейший немембранный органоид живой клетки, служащий для биосинтеза белка из аминокислот по заданной матрице на основе генетической информации, предоставляемой матричной РНК (мРНК). Этот процесс называется трансляцией. Рибосомы имеют сферическую или слегка эллипсоидную форму, диаметром от 15—20 нанометров (прокариоты) до 25—30 нанометров (эукариоты), состоят из большой и малой субъединиц. В эукариотических клетках рибосомы располагаются на мембранах эндоплазматической сети, хотя могут быть локализованы и в неприкреплённой форме в цитоплазме. Нередко с одной молекулой мРНК ассоциировано несколько рибосом, такая структура называется полирибосомой (полисомой). Синтез рибосом у эукариот происходит в специальной внутриядерной структуре — ядрышке. Рибосомы представляют собой нуклеопротеид, в составе которого соотношение РНК/белок составляет 1:1 у высших животных и 60-65:35-40 у бактерий. Рибосомная РНК составляет около 70 % всей РНК клетки. Рибосомы эукариот включают четыре молекулы рРНК, из них 16S, 5,8S и 28S рРНК синтезируются в ядрышке РНК-полимеразой I в виде единого предшественника (45S), который затем подвергается модификациям и нарезанию. 5S рРНК синтезируются РНК-полимеразой III в другой части генома и не нуждаются в дополнительных модификациях. Почти вся рРНК находится в виде магниевой соли, что необходимо для поддержания структуры; при удалении ионов магния рибосома подвергается диссоциации на субъединицы. Константа седиментации (скорость оседания в ультрацентрифуге) у цитоплазматических рибосом эукариотических клеток равняется 80S (большая и малая субъединицы 60S и 40S, соответственно), у рибосом бактериальных клеток (а также у рибосом митохондрий и пластид) — 70S (большая и малая субъединицы 50S и 30S, соответственно). Состав рибосомы Рибосома состоит из специфических (рибосомных) РНК, специфических (рибосомных) белков и небольшого количества низкомолекулярных компонентов. Рибосомные РНК Структурно и функционально рибосома — это, прежде всего, её РНК. Рибосомная РНК (рРНК) в составе рибосомы очень компактна, имеет сложную третичную структуру и плотно инкрустирована молекулами различных рибосомных белков. Очищенные от белков высокомолекулярные рибосомные РНК в специально подобранных условиях (20 мМ Mg2+, ионная сила 0,3—0,5, иногда условия включают также присутствие ди- и полиаминов, этанола) самопроизвольно сворачиваются в компактные частицы, морфологически (формой, внутренней структурой и размерами) очень схожие с рибосомными субчастицами, основу которых они составляют. Таким образом, общий план структурной организации рибосомы задаётся свойствами рРНК. Третичная структура рРНК выступает каркасом для размещения рибосомных белков, белки же в определённом смысле играют лишь второстепенную роль в формировании и поддержании структуры рибосомы и её функционировании. Рибосома: участки связывания с тРНК В рибосоме имеется два разных участка, связывающих молекулы тРНК . Один из них удерживает молекулу тРНК, присоединенную у растущему концу полипептидной цепи; поэтому его называют пептидил-тРНК-связывающим участком или P-участком ( донорным участком ). Второй служит для удержания только что прибывшей молекулы тРНК, нагруженной аминокислотой; его называют аминоацил-тРНК-связывающим участком или A-участком ( акцепторным участком ). К обоим участкам молекула тРНК прочно прикрепляется только в том случае, если ее антикодон спаривается с комплементарным ему кодоном мРНК . A- и P-участки располагаются очень близко друг к другу, так что две связанные с ними молекулы тРНК спариваются с двумя соседними кодонами в молекуле мРНК. Когда оба участка заняты, происходит образование пептидной связи в результате следующей реакции: полипептидный компонент комплекса пептидил-тРНК переносится на аминокислоту, связанную в аминоацил-тРНК ( реакция транспептидации ). Эта реакция происходит на большой субчастице рибосомы . Тот конец тРНК, который несет аминокислоту, расположен на большой субчастице, тогда как другой ее конец, т.е. антикодон, взаимодействует с мРНК, связанной малой субчастицей . Следовательно, расположение участков P и A таково, что в их образовании принимают участие обе рибосомные частицы. 51. Механизм инициации трансляции у прокариот. Инициирующие кодоны и сайт связывания рибосом на мРНК. Инициаторная тРНК и белковые факторы инициации. Инициация трансляции внутренних рамок считывания у полицистронных мРНК. Рибосомы прокариот инициируют трансляцию на мРНК уже во время транскрипции. Время необходимое для посадки рибосом порядка секунд, хотя это зависит от каждой мРНК. Рибосомы транслируют мРНК со скоростью приблизительно 12 аминокислот в секунду. В инициации трансляции участвуют: рибосома, аминоацилированная и формилированная тРНК (fMet-tRNAfMet), мРНК и три белковых инициирующих фактора IF1, IF2 и IF3. Бактериальная 70S рибосома состоит из большой 50S и малой 30S субъединицы. Имеется три tRNA связывающих сайта аминоацил - aminoacyl (A), пептидил - peptidyl (P), и сайт выхода - exit (E). Присоединение фактора IF3 к 30S рибосомной субъединице обеспечивает распад рибосомы на субъединицы. Фактор инициации IF1 связывается с Aсайтом 30S рибосомной субъединицы и служит инициатором присоединения tRNA к рибосомному P-сайту блокируя A-сайт. IF1 стимулирует активность IF3 и также распад рибосомных субъединиц. После распада субъединиц, IF2, mRNA и fMet-tRNAfMet соединяются с 30S рибосомной субъединицей. Последовательность Шайно-Дальгарно (Shine-Dalgamo -SD) mRNA взаимодействует с anti-SD последовательностью 16S rRNA и инициирующий кодон присоединяется в Р-сайте рибосомы. Инициирующие факторы, особенно IF3, способствуют этому присоединению. Инициаторная tRNA устанавливается в P-сайте 30S рибосомной субъединицы в три шага не зависимо от кодона, зависимо от кодона и fMet-tRNAfMet присоединение. Все три шага обеспечиваются фактором IF2, который взаимодействует с fMettRNAfMet на рибосоме. IF3 стабилизирует присоединение fMet-tRNAfMet к рибосомному P-сайту и стабилизирует кодон-антикодон взаимодействие. 30S преинициаторный комплекс состояций из 30S рибосомной субъединицы, трех инициаторных факторов, mRNA в стартовой позиции, где fMet-tRNAfMet связана кодон независимо. Такой относительно нестабильный комплекс подвергается конформационному изменению, что обеспечивает кодон-антикодон взаимодействие и формирует более стабильный 30S инициаторный комплекс. Инициаторные факторы IF1 и IF3 отсоединяются, тогда как IF2 фактор стимулирует взаимодействие с 50S рибосомной субъединицей. После сборки рибосомы IF2 покидает комплекс. Во время этого процесса GTP связанный с IF2 гидролизуется до GDP и Pi. Вновь образованный 70S инициаторный комплекс, содержащий fMet-tRNAfMet как субстрат для пептидилтрансферазного центра 50S рибосомной субъединицы готов к вступлению в фазу элонгации трансляции. Факторы инициации: IF-1, IF-2, IF-3 - белки временно связывающиеся с рибосомой, необходимые для инициации. Этапы инициации трансляции: 1. Факторы инициации IF-1 и IF-3 связываются с 30S-субчастицей, что обеспечивает ее взаимодействие с IF-2, инициаторной формилметиониновой-тРНК (Fmet-тРНКFMet) и GTP. 2. При связывании инициаторных белков IF-1 и IF-2 с 30S-субчастицей происходит диссоциация 70S-рибосомы на две субъединицы. 3. Комплекс 30S-субъединицы со всеми факторами инициации и Fmet-тРНКFMet связывается с 5'-концом мРНК вблизи кодона AUG и узнает. AUG-кодон мРНК. Связывание 30S-субчастицы с мРНК находится под строгим контролем нуклеотидной последовательности, расположенной примерноза 10 нуклеотидов до 5'-конца инициаторного кодона. Взаимодействию способствует комплементарное спаривание этой богатой пуринами по следовательности из 5-8н, называемой последовательностью ШайнаДальгарно, с полипиримидиновым участком, находящимся вблизи 3'-конца 16S-pPHK. 4. Формирование полноценного функционального комплекса инициации завершается ассоциацией 50S-субчастицы с преинициаторным комплексом. При ассоциации 70S-рибосомы образуются два активных центра: Р- и А-участки. FmetTPHKFMet занимает Р-участок. 5. С образованием функциональной 70S-субчастицы отделяются все три белка инициации. Рамка считывания Поскольку каждый кодон содержит три нуклеотида, один и тот же генетический текст можно прочитать тремя разными способами (начиная с первого, второго и третьего нуклеотидов), то есть в трех разных рамках считывания. За некоторыми интересными исключениями, значимой является информация, закодированная только в одной рамке считывания. По этой причине крайне важным для синтеза белка рибосомой является её правильное позиционирование на стартовом АУГ-кодоне — инициация трансляции. 52. Механизм инициации трансляции у эукариот. Белковые факторы, взаимодействующие с рибосомой и с мРНК. Роль кэп-структуры в инициации процесса. Влияние на инициацию трансляции структур на 3'-конце мРНК. Механизм распознавания инициирующего кодона. У эукариот существуют два основных механизма нахождения рибосомой стартового AUG: кэпзависимый (сканирующий) и кэпнезависимый (внутренняя инициация). При сканирующем механизме рибосома (точнее, её малая субъединица) садится на 5'-конец мРНК в области кэпа и двигается вдоль молекулы мРНК, «сканируя» один кодон за другим, пока не наткнётся на инициаторный AUG. Для привлечения рибосомы к 5'-концу мРНК требуется специальная структура, кэп — 7-метилгуанин, прикреплённый к 5'концевому нуклеотиду мРНК. При механизме внутренней инициации, называемом у эукариот также IRESзависимым механизмом, рибосома садится на внутренний участок мРНК, называемый IRES (англ. Internal Ribosomal Entry Site, участок внутренней посадки рибосомы) — участок мРНК, обладающий выраженной вторичной структурой, позволяющей ему направлять рибосомы на стартовый AUG. По IRES-зависимому механизму инициируется синтез лишь на небольшой части клеточных мРНК, а также на РНК некоторых вирусов. В дополнение к основным механизмам инициации, при наличии перед стартовым кодоном поли(А)-лидера (например, в мРНК вирусов семейства оспы) реализуется нестандартный механизм инициации. В этом случае инициаторный комплекс не содержит факторов IF3 и eIF4F, и после сборки на 5'-нетранслируемой области осуществляет не последовательное сканирование мРНК, а т.н. АТФ-независимое "бесфазное блуждание". При этом инициация протекает значительно быстрее, чем в случае работы по классическому сканирующему механизму. Также у эукариот возможна реинициация трансляции, когда после окончания трансляции рибосома с белковыми факторами не диссоциирует от мРНК, а перескакивает с 3' на 5'-конец мРНК и начинает инициацию ещё раз. Это возможно благодаря т.н. циклизации мРНК в цитоплазме, то есть физическому сближению старт- и стоп-кодонов с помощью специальных белков. Кэпзависимый механизм В отличие от прокариот, инициация трансляции у которых обеспечивается лишь тремя белковыми факторами, трансляция подавляющего большинства мРНК эукариот, содержащих 5'-кэп [m7G(5')ppp(5')N] и 3'-поли(А)-хвост, требует участия, по крайней мере, 13 общих эукариотических факторов инициации (eIF), представленных 31 полипептидом. Инициация трансляции включает события между диссоциацией рибосомы во время терминации в предыдущем цикле трансляции и сборкой рибосомы, готовой к элонгации, на старт-кодоне мРНК. Во время инициации аппарат трансляции решает следующие задачи: 1 диссоциация и антиассоциация рибосомных субъединиц; 2 выбор инициаторной метионил-тРНК (Met-tRNAiMet); 3 связывание 5'-кэпа, связывание поли(А), сканирование; 4 выбор правильного старт-кодона; 5 объединение рибосомных субъединиц на старт-кодоне. 53. Механизм элонгации трансляции. Фактор элонгации 1 (ЕF-Тu или ЕF-1 у про- и эукариот соответственно) и поступление аминоацил-тРНК в рибосому. Реакция транспептидации: механизм и катализ. Фактор элонгации 2 (ЕF-G или ЕF-2) и транслокация рибосомы. Во время элонгации происходит последовательное присоединение аминокислотных остатков к C-концевым частям строящихся полипептидных цепей, направляемое кодонами транслируемых матричных РНК. Этап элонгации начинается со взаимодействия фактора элонгации трансляции EFTu , молекулы GTP и очередной аминоацилированной тРНК с A-участком рибосомы ( рис. I.20 ). Вхождение аминоацилированной тРНК в A-участок происходит в соответствии с установленным в нем кодоном транслируемой мРНК. При этом лишь та аминоацилированная тРНК прочно связывается с рибосомой, у которой антикодон комплементарен кодону, установленному в A-участке. После гидролиза GTP и освобождения EF-TuGDP из комплекса (стадия Е2) происходит образование новой пептидной связи между карбоксильной группой формилметионина инициаторной тРНК и NH2- группой аминокислотного остатка, находящегося в A-участке рибосомы в составе аминоацил-тРНК (стадия Е3). Эта стадия получила название транспептидации . Обмен GDP на GTP в освободившемся комплексе EF-TuGDP происходит с участием фактора EF-Ts . Образовавшийся пептид удерживается рибосомой через остаток тРНК, находящийся в A-участке, а освободившаяся тРНК временно сохраняется в так называемом E-участке рибосомы (от англ. exit - выход). Такая соединенная с пептидом тРНК получила название пептидил-тРНК. Образовавшаяся пептидил-тРНК далее переносится из A- в P-участок рибосомы . Эта стадия элонгации (Е4) известна под названием транслокации . Транслокация индуцируется фактором элонгации EF-G , который освобождается из элонгирующего комплекса после расщепления молекулы GTP. Таким образом, энергия еще одной молекулы GTP используется в акте транслокации. После завершения транслокации происходит освобождение фактора EF-G из элонгирующего комплекса. При этом A-участок рибосомы остается свободным. Следующий цикл элонгации начинается с вхождения в A-участок рибосомы в составе тройного комплекса очередной молекулы тРНК (стадия Е1), что сопровождается освобождением формилметионил-тРНКfMet из E-участка, после чего повторяются стадии элонгации. В физиологических условиях рибосома совершает около 20 циклов элонгации в секунду. В соответствии с этим для синтеза белка длиной в 200 аминокислотных остатков требуется около 10 секунд. В рассмотренной классической модели биосинтеза белка с тремя участками связывания тРНК на любой стадии элонгации с рибосомой взаимодействуют две молекулы тРНК. Иными словами, до стадии транслокации тРНК занимают A- и P-участки рибосомы, тогда как после транслокации молекулы ассоциированы с P- и E-участками. Между участками A и E существует аллостерическое взаимодействие, что проявляется в отрицательном кооперативном эффекте связывания молекул тРНК этими участками и означает, что только A- или E- участки рибосомы могут быть заняты молекулой тРНК, и рибосома не содержит одновременно занятыми оба участка. 54. Механизм терминации трансляции у про- и эукриот. Терминирующие кодоны, белковые факторы терминации (RF1, RF2, RF3), гидролиз пептидил-тРНК. Фактор RRF и диссоциация трансляционного комплекса. Терминация — окончание синтеза белка, осуществляется, когда в А-сайте рибосомы оказывается один из стоп- кодонов — UAG, UAA, UGA. Из-за отсутствия тРНК , соответствующих этим кодонам, пептидил-тРНК остаётся связанной с Р-сайтом рибосомы. Здесь в действие вступают специфические белки RF1 или RF2, которые катализируют отсоединение полипептидной цепи от мРНК, а также RF3, который вызывает диссоциацию мРНК из рибосомы. RF1 узнаёт в А-участке UAA или UAG; RF-2 — UAA или UGA. С UAA терминация эффективнее, чем с другими стоп-кодонами. Факторы терминации: RF-1 вызывает отделение полипептидной цепи при считывании кодонов UAA и UAG; RF-2 действует аналогичным образом при считывании UAA и UGA, EF-3 может облегчить работу двух других факторов. Этапы терминации трансляции: 1. В А-участке оказывается один из трех терминирующих кодонов – UAG, UAA или UGA. Из-за отсутствия тРНК, отвечающих этим кодонам,полипептидил-тРНК остается связанной с Р-участком. 2. RF-1 и RF-2 катализируют отсоединение полипептидной цепи от тРНК, отделение их обоих от рибосомы, а 70S-рибосомы – от мРНК. RF-1 узнает в А-участке кодон UAA или UAG; RF-2 включается в том случае, когда в А-участке оказы-вается UAA или UGA; RF-3 облегчает работу двух других факторов. Если терминирующим кодономявляется UAA, то эффективность процесса терминации оказывается наибольшей, поскольку этот кодон узнают оба фактора – RF-1 и RF-2. Однако, каким бы из стоп-кодонов ни обеспечивалась терминация,ее эффективность зависит от фланкирующих эти кодоны последовательностей в мРНК. 55. Энергетика синтеза белка: количество макроэргических связей, необходимых на присоединение к растущему полипептиду одной аминокислоты; энергетические затраты на сборку рибосомы (при инициации трансляции) и на отсоединение готового полипептида от рибосомы. Биосинтез белков – очень энергоемкий процесс. Любой синтетический процесс представляет собой эндотермическую реакцию и, следовательно, нуждается в затрате энергии. Биосинтез белка представляет цепь синтетических реакций: 1) синтез и-РНК; 2) соединение аминокислот с т-РНК; 3) "сборку белка". Все эти реакции требуют энергетических затрат. Энергия для синтеза белка доставляется реакцией расщепления АТФ. Каждое звено биосинтеза всегда сопряжено с распадом АТФ. При аминоацилировании тРНК затрачивается энергия одной связи молекулы АТФ, при кодонзависимом связывании аминоацил-тРНК – энергия одной связи молекулы ГТФ, при перемещении рибосомы на один триплет – энергия одной связи еще одной молекулы ГТФ. В итоге на присоединение аминокислоты к полипептидной цепи затрачивается около 100 кДж/моль. При гидролизе же пептидной связи высвобождается лишь 2 кДж/моль. Таким образом, при биосинтезе большая часть энергии безвозвратно теряется (рассеивается в виде тепла). На стадии инициации трансляции затрачивается 1 ГТФ. 56. Особенности синтеза белка, имеющего N-сигнальную последовательность: котрансляционная транслокация белка в полость эндоплазматического ретикулума, SRPчастица и ее рецептор. Биосинтез белка [трансляция мРНК (mRNA)] всегда начинается в цитоплазме. Определенная последовательность из 15-60 аминокислот в начале цепи, обозначаемая как сигнальный пептид, указывает место синтеза. Если образующийся на рибосоме белок начинается с сигнального пептида, ориентирующего белок на шероховатый эндоплазматический ретикулум (ШЭР), с ним связывается РНК-содержащая сигналузнающая частица SRP (англ signal-recognition particle) и трансляция временно прерывается. SRP связывает рибосому посредством SRP-рецептора с мембраной ШЭР. Как только рибосома закрепится на мембране, SRP-частица диссоциирует От сигнального пептида и от SRP-рецептора [при этом гидролизуется ГТФ (GTP)], и на рибосоме вновь начинается процесс трансляции. Белковая цепь на рибосоме растет и, еще не свернувшись, проходит через мембрану по каналу, называемому транслоконом, в просвет ШЭР. Прохождение растущего пептида через мембрану может быть прервано соответствующим стоп-сигналом. В этом случае пептид остается погруженным в мембрану и дает начало интегральному мембранному белку. В ходе белкового синтеза возможно многократное прохождение растущей цепи через мембрану и возобновление синтеза вновь при посредстве сигнального пептида Образующийся по такому механизму мембранный белок будет иметь множество трансмембранных участков. Модификации в ШЭР. Превращение линейной немодифицированной пептидной цепи в полноценный функциональный белок (созревание) осуществляется в результате многостадийного процесса, который начинается сразу же после начала трансляции и протекает в просвете ЭР. Прежде всего соответствующая пептидаза отщепляет сигнальный пептид. Фермент узнает точку расщепления в составе< специфической N-концевой последовательности белка. Путем окисления боковых цепей цистеина образуются дисульфидные мостики, правильность положения которых контролируется протеиндисульфид-изомеразой. Пептидилпролил-изомераза контролирует цис-транс-изомеризацию Х-Рго-связей в синтезируемом пептиде. Трансгликозидазы переносят олигосахариды в блоке с долихолом (длинноцепочечным изопреноидом) на определенные остатки аспарагиновой кислоты в белке, тем самым осуществляя N-гликозилирование белка. Гликозидазы «подстригают» олигосахариды, отщепляя избыточные остатки глюкозы и маннозы . Для того чтобы растущая полипептидная цепь могла свернуться необходимым образом, с еще линейным участком цепи временно связываются шапероны. Эти белки направляют процесс свертывания цепи путем подавления нежелательных побочных взаимодействий. Наиболее важным шапероном, присутствующим в просвете ШЭР. является белок связывания (BiP, от англ. binding protein). Когда вновь образованный белок приобретает правильную вторичную и третичную структуру и остатки глюкозы удалены полностью, он с помощью транспортных везикул перемещается в аппарат Гольджи. Модификации в аппарате Гольджи. В аппарате Гольджи осуществляются следующие ферментативные стадии модификации белка: фосфорилирование и отщепление с последующим переносом (перегруппировка) остатков сахаров с помощью гликозидаз и гликозилтрансфераз. Эта модификация имеет целью образование специфической олигосахаридной структуры в гликопротеинах. Наконец, в секреторных пузырьках (везикулах) отщепляется еще один пептид, прежде чем содержимое секретируется посредством экзоцитоза. Это отщепление, катализируемое специфичными пептидазами, выполняет функцию активации секретируемого белка. Например, отщепление С-пептида от неактивного проинсулина приводит к образованию активного гормона инсулина. 57. Фолдинг белков: молекулярные шапероны семейств Hsp60 и Hsp70 у про- и эукариот. Фолдинг белков – процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру. При этом происходит сближение удаленных аминокислотных остатков полипептидной цепи, приводящее к формированию нативной структуры. Эта структура обладает уникальной биологической активностью. Поэтому фолдинг является важной стадией преобразования генетической информации в механизмы функционирования клетки. Структура и функциональная роль шаперонов в фолдинге белков В процессе синтеза полипептидных цепей, транспорта их через мембраны, при сборке олигомерных белков возникают промежуточные нестабильные конформации, склонные к агрегации. На вновь синтезированном полипептиде имеется множество гидрофобных радикалов, которые в трёхмерной структуре спрятаны внутри молекулы. Поэтому на время формирования нативной конформации реакционноспособные аминокислотные остатки одних белков должны быть отделены от таких же групп других белков. Во всех известных организмах от прокариотов до высших эукариотов обнаружены белки, способные связываться с белками, находящимися в неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны стабилизировать их конформацию, обеспечивая фолдинг белков. Эти белки получили название шаперонов. Классификация шаперонов (Ш) В соответствии с молекулярной массой все шапероны можно разделить на 6 основных групп: высокомолекулярные, с молекулярной массой от 100 до 110 кДа; Ш-90 – с молекулярной массой от 83 до 90 кДа; Ш-70 – с молекулярной массой от 66 до 78 кДа; Ш60; Ш-40; Низкомолекулярные шапероны с молекулярной массой от 15 до 30 кДа. Среди шаперонов различают: конститутивные белки (высокий базальный синтез которых не зависит от стрессовых воздействий на клетки организма), и индуцибельные, синтез которых в нормальных условиях идёт слабо, но при стрессовых воздействиях на клетку резко увеличивается. Индуцибельные шапероны относятся к «белкам теплового шока», быстрый синтез которых отмечают практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрессовым воздействиям. Название «белки теплового шока» возникло в результате того, что впервые эти белки были обнаружены в клетках, которые подвергались воздействию высокой температуры. Роль шаперонов в фолдинге белков При синтезе белков N-концевая область полипептида синтезируется раньше, чем Сконцевая область. Для формирования конформации белка нужна его полная аминокислотная последовательность. Поэтому в период синтеза белка на рибосоме защиту реакционно-способных радикалов (особенно гидрофобных) осуществляют Ш-70. Ш-70 – высококонсервативный класс белков, который присутствует во всех отделах клетки: цитоплазме, ядре, митохондриях. Фолдинг многих высокомолекулярных белков, имеющих сложную конформацию (например, доменное строение), осуществляется в специальном пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомерного комплекса, состоящего из 14 субъединиц. Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к белкам, на поверхности которых есть элементы, характерные для несвёрнутых молекул (прежде всего участки, обогащённые гидрофобными радикалами). Попадая в полость шаперонового комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участков Ш-60. В специфической среде этой полости, в изоляции от других молекул клетки происходит выбор возможных конформаций белка, пока не будет найдена единственная, энергетически наиболее выгодная конформация. Высвобождение белка со сформированной нативной конформацией сопровождается гидролизом АТФ в экваториальном домене. Если белок не приобрёл нативной конформации, то он вступает в повторную связь с шапероновым комплексом. Такой шаперонзависимый фолдинг белков требует затрат большего количества энергии. Таким образом, синтез и фолдинг белков протекает при участии разных групп шаперонов, препятствующих нежелательным взаимодействиям белков с другими молекулами клетки и сопровождающих их до окончательного формирования нативной структуры. 58. Рабочий цикл шаперонных комплексов GroELS и DnaKJ-GrpE. Молекулярные шапероны – группа вспомогательных специализированных белков, предохраняющих растущую цепь от ошибочных внутренних и внешних контактов. Биологические функции молекулярных шаперонов - коррекция структуры и конформации других белков клетке, предотвращение агрегации неправильно свернутых или частично развернутых белков, разрушение и солюбилизация стабильных белковых агрегатов, разворачивание нативных белковых субстратов для транслокации их через мембраны, разборке активных олигомерных структур и поддерживании их в состоянии неактивных мономеров, разворачивании активных мономеров для их последующей деградации. Шапероны контролируют процессы ремоделирования нативного состояния регуляторных и сигнальных белков в клетке. Молекулярные шапероны являются основными компонентами системы контроля качества клеточного протеома. Hsp70-система Escherichia coli, состоит из шаперона DnaK, кошаперона DnaJ и NEFбелка GrpE, причем, белки DnaJ и GrpE функционируют в системе в форме димеров. Гомологом Hsp60 у E. coli является GroEL, формирующий гигантский комплекс с GroES. Комплекс GroEL- GroES имеет сходство с эукариотической протеосомой 26S, ответственной за деградацию меченных убихитином белков. При фолдинге белки проходят через ряд промежуточных конформаций, имеющих более высокую энергию, чем конечная конформация. Поэтому для многих белков существуют локальные энергетические минимумы, в которых частично свернутый белок может задержаться надолго. Белки, требующие помощи в фолдинге, опознаются аппаратом DnaK-DnaJ-GrpE, через гидрофобные участки. Молекулярный шаперон, гидролизуя АТФ, "перетасовывает" конформацию многих оснований, разворачивая белок и позволяя ему свернуться заново. Если нативная конформация не достигается таким путем, белок переходит в ведение шаперонина GroES-GroEL. Полость шаперонина защищает белок от контакта с раствором и другими субъединицами, предотвращая агрегацию и позволяя белку спокойно свернуться. 59. Деградация белков: 26S-протеасома эукариот. Протеасомы— полиферментные каталитические белковые структуры, обладающие протеолитической и АТФазной активностями. Протеасомы построены из центрального кора, состоящего из 14 белковых димеров в кольцевой структуре. Всего содержат 4 кольца, расположенных друг над другом; две регуляторные части с двух сторон от кора, 14 белков в каждой, 6 из которых АТФазы. Протеасомы вовлечены в деградацию всех убиквитинированных белков, а также в презентирование антигенов на поверхности клеток. Белки, меченые убиквитином (см. Убиквитин), в основном деградируют в клетках в 26S протеасом, которые состоят из протеолитического кора и одного или двух регуляторных комплексов. У эукариот протеасомы присутствуют в цитозоле и ядрах, но не в других клеточных органеллах. Протеасомы выделяют в виде индивидуальных частиц с коэффициентами седиментации 20S и 26S. 20S частица является коровой частью 26S частицы , которая обладает протеолитической активностью. Коровая частица представляет собой белковый комплекс в виде цилиндра, через центральный канал которого "протягивается" молекула гидролизуемого белка. В качестве модельного объекта используют протеасомы архебактерии Thermoplasma, которые были закристаллизованы и исследованы с помощью рентгеноструктурного анализа. Субъединицы протеасом синтезируются в виде неактивных предшественников, что предотвращает их преждевременное протеолитическое действие. Подобно тому как ферменты лизосом активируются только после их перемещения в соответствующий компартмент клетки, процессинг бета-предшественников сопряжен с их включением в состав протеасом. Сборка протеасом начинается с образования гептамерных альфа- субчастиц (альфа7), которые стимулируют аутокаталитическое удаление пропоследовательности предшественника бета-субъединиц, что приводит к их упорядоченной самосборке с образованием гептамерных бета-субчастиц (бета7), состыкованных с альфа- субчастицами. Две предварительно собранные половины протеасомы (альфа7бета7) далее ассоциируют друг с другом с образованием активных 20S протеасом. Очищенные 20S протеасомы эффективно расщепляют небольшие пептиды, но не способны гидролизовать интактные белки. Распознавание конъюгатов убиквитина и разворачивание белковой глобулы происходят с участием около 16 белков, ассоциированных с 20S протеасомой и образующих 26S комплекс. Эти белки способны объединяться в отдельные комплексы, получившие название 19S-кэп-структур . 19S-комплексы ассоциируют друг с другом в присутствии ATP и с 20S протеасомами in vitro, присоединяясь к концам цилиндра. Протеасомы участвуют в процессинге предшественников с образованием зрелых, активных белков. В частности, процессинг субъединицы p50 транскрипционного фактора NF-kB животных , сопровождающийся отщеплением и деградацией С-концевой части полипептида, происходит с помощью 26S протеасом. 60. Система убиквитинилирования белков эукариот. Убиквитинлигаза (англ. E3 ubiquitin ligase) — фермент-лигаза, ковалентно присоединяющий убиквитин к белку-мишени изопептидной связью. Убиквитинлигазы являются частью системы убиквитинопосредованного распада белка в протеасомах. Известно, что протеасома расщепляет не любые белки, а только те, которые были «помечены» убиквитином. Убиквитинлигазы специфично узнают белки-субстраты и участвуют в их полиубиквитинировании (присоединении цепочек из молекул убиквитина), которое, в конечном счёте, приводит к деградации последних в протеасомах. Кроме этого, убиквитинлигазы осуществляют и другие модификации белков убиквитином, такие как моноубиквитинирование и мультиубиквитинирование, которые имеют регуляторное значение. Механизм убиквитинирования белков. Процесс убиквитинирования белков происходит в несколько стадий, ферменты, катализирующие отдельные его этапы, получили условные названия Е1 (убиквитинактивирующий фермент), Е2 (убиквитинконъюгирующий фермент) и Е3 (убиквитинлигаза). Фермент Е1 АТФ-зависимо активирует убиквитин с формированием высокоэнергетической тиоэфирной связи между карбоксильной группой С-концевого остатка глицина убиквитина и остатком цистеина в молекуле Е1. Затем активированный убиквитин переносится на молекулу Е2 с формированием сходной тиоэфирной связи. Убиквитинлигазы взаимодействуют одновременно с Е2 благодаря Е2-связывающему домену и с белком-субстратом благодаря субстратсвязывающему домену. Они осуществляют перенос активированного убиквитина с Е2 на субстрат либо напрямую, либо через образование промежуточного тиоэфирного соединения.Чаще всего убиквитин-лигазы катализируют образование изопептидной связи между карбоксильной группой С-концевого остатка глицина убиквитина и ε-аминогруппой одного из остатков лизина в белке-мишени, реже связь образуется между убиквитином и Nконцевой аминогруппой или боковой цепью цистеина белка. После присоединения первой молекулы убиквитина к субстрату Е3-ферменты последовательно добавляют ещё несколько молекул, так же соединяя их изопептидной связью. Эта модификация называется полиубиквитинированием. В молекуле убиквитина присутствуют 7 остатков лизина, каждый из которых, как считают, может участвовать в образовании изопептидной связи. Последствия полиубиквитинирования зависят от того, какой из этих остатков был задействован в формировании цепочки. Так, полиубиквитиновые цепи, соединённые при участии Lys-48, чаще всего являются сигналом к протеасомальной деградации (минимальная длина цепочки — 4 молекулы убиквитина), а образованные через Lys-63 играют регуляторную роль в эндоцитозе белков(процесс транспорта макромолекул внутрь клетки ( белков , полисахаридов , полинуклеотидов и т. д. ) и репарации ДНК. Также выделяют и другие типы модификаций, катализируемых Е3-ферментами: моноубиквитинирование (присоединение единственного остатка убиквитина) и мультиубиквитинирование, или множественное моноубиквитинирование. Моноубиквитинирование — довольно распространённая регуляторная посттрансляционная модификация, которая может влиять на способность белка взаимодействовать с другими молекулами, на его внутриклеточную локализацию, а также может служить сигналом к его деградации в лизосомах. Мультиубиквитинирование мембранных белков приводит к их эндоцитозу и расщеплению в лизосомах. Убиквитинлигазы разделяют на три семейства в зависимости от структуры домена, связывающего убиквитинконъюгирующий фермент (E2): убиквитинлигазы, содержащие HECT-домен(homologous to E6-AP carboxyl terminus), RING-домен (англ. really interesting new gene) или U-бокс. Сенсорные процессы 61. Сенсорные механизмы эукариот с помощью рецепторов, сопряженных с G-белками: компоненты сигнальных путей (рецепторы, G-белки, эффекторы, вторичные мессенджеры). Структура и принцип действия G-белков. РЕЦЕПЦИЯ СИГНАЛА. Каскадный механизм начинается с активации рецептора, воспринимающего сигнал. Сигналом могут быть разные стимулы˸ химические вещества,свет,температура. Специализированный рецептор должен обладать способностью изменять свои свойства под влиянием воспринимаемого стимула и передавать сигнал на следующий компонент цепи. Любая клетка, исходя из её специализации, содержит граниченный набор рецепторов. Не каждая клетка способна отвечать на специфические сигналы. Компоненты сигнальных путей˸ Рецептор воспринимает экстраклеточный сигнал и запускает каскадный сигнальный механизм внутри клетки. Клетки обладают разными типами специализированных рецепторов, распознающих определенный вид сигнала. G-белки — особые сигнальные молекулы, обладающие GTPазной активностью,были обнаружены и исследованы А.Гилманом и М. Родбеллом, которые получили за это открытие Нобелевскую премию по физиологии и медицине1994 года[1].G-белки делятся на две основных группы — гетеротримерные (ʼʼбольшиеʼʼ) и ʼʼмалыеʼʼ. Гетеротримерные Gбелки — это белки с четвертичной структурой, состоящие из трёх субъединиц˸ альфа(α), бета (β) и гамма (γ). Малые G-белки — это белки из одной полипептидной цепи, они имеют молекулярную массу 20—25 кДа и относятся к суперсемейству Ras малых ГТФаз. Обе группы G-белков участвуют во внутриклеточной сигнализации. Гетеротримерные G-белки.У всех гетеротримерных G-белков сходный механизм активации˸ они активируются при взаимодействии со специфическими рецепторами, сопряженными с G-белками, при этом обменивая ГДФ на ГТФ и распадаясь на α- и βγсубъединицы. Вторичные мессенджеры — это низкомолекулярные органические соединения или ионы, способные обеспечивать дальнейшую передачу сигнала путем аллостерической регуляции. Активация последующих компонентов сигнальной цепи вторичными мессенджерами осуществляется при достижении ими определенной концентрации. На уровне эффекторов обеспечивается усиление сигнала, так как они синтезируют большое количество вторичных посредников, которые могут активировать множество последующих сигнальных посредников или конечных мишеней. В клетках животных и грибов выявлены и охарактеризованы киназы, формирующие каскадные регуляторные системы (или модули). Киназные каскады включают три (реже четыре) киназы, которые последовательно фосфорилируют друг друга. Модули работают в направлении MAPKKK → MAPKK → MAPK.Посредством киназных каскадов регулируется активность множества функциональных белков, в т.ч. транскрипционных факторов. В растениях киназные каскады изучены меньше и механизм активации не ясен. Структура и принцип действия G-белков G-белки переносят сигнал с рецептора третьего типа на белки-эффекторы. Они построены из трех субъединиц: α, β и γ. α-cубъединица обладает свойством связывать гуаниновые нуклеотиды [ГТФ (GTP) или ГДФ (GDP)]. Белок проявляет слабую ГТФ-азную активность и похож на другие ГТФ-связывающие белки, такие, как ras и фактор элонгации Tu (EF-Tu). В неактивном состоянии G-белок связан с ГДФ. При связывании сигнального вещества с рецептором третьего типа конформация последнего изменяется таким образом, что комплекс приобретает способность связывать G-белок. Ассоциация G-белка с рецептором приводит к обмену ГДФ на ГТФ. При этом происходит активация G-белка, он отделяется от рецептора и диссоциирует на αсубъединицу и β,γ-комплекс. ΓΤΦ-α субъединица связывается с белками-эффекторами и изменяет их активность, в результате чего происходит открывание или закрывание ионных каналов, активация или ингибирование ферментов. Медленный гидролиз связанного ГТФ до ГДФ переводит α-субъединицу в неактивное состояние и она вновь ассоциирует с β,γкомплексом, т.е. G-белок возвращается в исходное состояние. Некоторые G-белки воздействуют на белки каналов и способствуют открытию каналов. Таким образом активируются К+-каналы. 62. Способы передачи сигнала в ядро в сигнальных путях TGFβ-Smad, JAK-STAT и Ras/MAPK. TGF-beta инициирует апоптоз в большинстве типов клеток. TGF-beta может вызывать апоптоз, активируя какой-либо их двух сигнальных путей: SMAD или DAXX. Сигнальный путь SMAD является каноническим. Димеры TGF-beta связываются с рецептором второго типа, который присоединяет и фосфорилирует рецептор первого типа. Рецептор первого типа впоследствии присоединяет и фосфорилирует рецептор R-SMAD. Один из R-SMAD, SMAD3, вовлекается в индуцирование апоптоза. R-SMAD далее связывается с обычным SMAD (SMAD4) и формирует гетеродимерный комплекс. Этот комплекс входит в клеточные ядра, где действует как транскрипционный фактор для разных генов, включая те гены, которые активируют митоген-активируемый протеинкиназный путь, который является пусковым механизмом апоптоза. Принципиально отличным классом рецепторных молекул являются рецепторы, сопряженные с тирозинкиназами класса Janus (Jak-киназами). В отличие от описанных ранее молекул, для эффективной передачи сигнала с таких рецепторов необходима их димеризация вокруг молекулы- агониста. При малой концентрации гормона он связывается с двумя молекулами рецептора, позволяя их внутриклеточным доменам сблизить Jakкиназы, которые начинают фосфорилировать друг друга, активируя передачу сигнала. Однако при равной концентрации агониста и рецептора передача сигнала по такому механизму невозможна, так как каждый рецептор связан с лигандом, что препятствует их димеризации. К рецепторам, сопряжённым с JAK-киназами относятся три семейства: Семейство рецепторов группы СТГ, лептина, эритропоэтина и интерлейкинов (кроме IL-10); Семейство рецепторов интерферонов и IL-10; Семейство рецепторов Т- и Влимфоцитарных антигенов. Рецепторы, ассоциированные с тирозинкиназами класса Janus, передают сигнал по нескольким сигнальным каскадам: STAT, МАР-киназному и фосфатидилинозитольному путям. Активированные Jak-киназы передают сигнал по STAT-пути. После связывания гормона, димеризации рецепторов и фосфорилирования их внутриклеточных доменов JAKкиназами на них садятся STAT-белки. Под действием Jak-киназ они претерпевают активирующее фосфорилирование, после чего направляются в ядро, где активируют транскрипцию генов-мишеней (гены дифференцировки, роста и др.) и генов, кодирующих ингибиторы STAT-пути (белки SOCS, CIS и PIAS). Важно отметить, что пути передачи сигнала зависят от изоформ рецептора, образовавших гомодимер. Так короткие изоформы рецептора пролактина активируют только МАР-киназный путь, в то время как длинные – и МАР-киназный и STAT-пути. Однако обе изоформы задействуют фосфоинозитидный путь через PI3K (фосфатидилинозитид-3-киназу) и активацию эффекторных протеинкиназ (Akt и др.). Сигнальный путь ERK (Ras-ERK, MAPK/ERK) относится к ключевым сигнальным кассетам в системе MAPK-сигнальных путей. Своё название путь получил по центральной MAP-киназе ERK, которая представлена двумя близкими по структуре белками, ERK1 и ERK2. Сигнальный путь ERK может быть активирован в ответ на сигналы, полученные клеткой через рецепторные тирозинкиназы или рецепторы, сопряжённые с G-белками. Около цитоплазматической части таких рецепторов собирается сигнальный комплекс из множества белков, который в конце концов активирует ГТФазу Ras. Ras связывает и активирует киназу киназы MAPK/ERK (MAPK/ERK kinase kinase или MEKK), главными компонентами которой являются белки семейства Raf (Raf-1, A-Raf и B-Raf). MEKK фосфорилирует и активирует киназу MAPK/ERK (MAPK/ERK kinase или MEK), представленную двумя компонентами MEK1 и MEK2. MEK1/2 активирует ERK1/2. Фосфорилирование ERK1/2 происходит вблизи клеточной мембраны. После этого фермент диффундирует в цитоплазму, где фосфорилирует сигнальные белки, в том числе p90 киназу рибосомального белка S6 (p90 ribosomal S6 kinase или RSK), а затем в ядро, где он регулирует транскрипцию. ERK1/2 индуцирует транскрипцию ранних генов c-Fos и cMyc, продукты которых являются факторами транскрипции и обеспечивают транскрипцию поздних генов, ответственных за пролиферацию, выживание и подвижность клеток. Сигнальный путь ERK принимает участие в активации T-клеток, пролиферации эндотелиальных клеток при ангиогенезе, в регуляции синаптической пластичности и фосфорилировании транскрипционного фактора p53. Молекулярная биология онтогенеза 63. Эмбриональное развитие D. melanogaster: асимметрия и градиенты морфогенов в ооците и раннем эмбрионе. Механизмы транспорта материнской мРНК и белков в ооцит; формирования градиентов в ооците и тканях эмбриона. Плодовая мушка Drosophila melanogaster была введена в качестве модельного организма в генетические эксперименты Томасом Морганом в 1909 году и до настоящего времени является одним из самых любимых модельных организмов среди исследователей, изучающих эмбриональное развитие животных. Малый размер, быстрая смена поколений, высокая плодовитость, прозрачность эмбрионов — делают дрозофилу идеальным объектом для генетических исследований. Жизненный цикл Дрозофила имеет голометаболический жизненный цикл — три отдельных стадии постэмбрионального развития, отличающиеся строением тела: личинка, куколка и имаго. В ходе эмбриогенеза образуются структуры, необходимые для функционирования организма в течение этих фаз и перехода между ними. В результате эмбриогенеза формируется личинка мухи. Личинка содержит имагинальные диски — группы клеток, из которых затем образуются структуры имаго. На стадии куколки ткани личинки разрушаются, и из имагинальных дисков образуются ткани взрослого организма. Такое развитие называется развитием с полным метаморфозом. Эмбриогенез дрозофилы уникален среди других модельных организмов тем, что дробление у неё неполное. В результате дробления образуется синцитий. Около 5000 ядер накапливаются в неразделенной цитоплазме и далее мигрируют к поверхности ооцита. Происходит целлюляризация — образование индивидуальных плазматических мембран, при этом обособляются клетки, окружающие желточный мешок. Первыми на заднем конце эмбриона отделяются полярные клетки (первичные половые клетки). Как и у других трехслойных многоклеточных, гаструляция приводит к образованию трех зародышевых листков — энтодермы, мезодермы и эктодермы. Мезодерма инвагинирует по вентральной бороздке. Средняя кишка образована эктодермой. Полярные клетки интернализуются другим образом. Зародышевая полоска удлиняется, задняя часть, включая заднюю кишку, растягивается и расширяется к переднему концу по спинной стороне зародыша. На ранних этапах сегментации образуются межсегментные бороздки. В момент формирования трахей появляются первые признаки дыхательной активности. Втягивание зародышевой полоски возвращает заднюю кишку к спинной стороне заднего конца зародыша. Оставшиеся стадии включают в себя интернализацию нервной системы (эктодермального происхождения) и образование внутренних органов. Гены материнского эффекта Основа для формирования передне-задней оси закладывается во время формирования яйца (оогенеза), задолго до момента оплодотворения и откладки яиц. Во время созревания ооцита питающие клетки(nursing cells) синтезируют большое количество РНК и белков, которые переносятся в созревающий ооцит по цитоплазматическим мостикам. Большинство этих молекул бывают необходимы в первые два часа эмбрионального развития дрозофилы, до начала транскрипции в зиготе. Развивающийся ооцит имеет градиенты концентраций мРНК. Гены, которые кодируют такие мРНК, называют генами материнского эффекта. Bicoid и hunchback — это гены материнского эффекта, которые имеют особое значение в формировании передних частей зародыша дрозофилы (головы и груди). Nanos и Caudal — это гены материнского эффекта, которые определяют формирование задних брюшных сегментов зародыша дрозофилы. В яйце микротрубочки реорганизуются в ходе оогенеза. Сначала центр организации микротрубочек находится у заднего полюса ооцита, и микротрубочки направлены своими ±концами к переднему полюсу ооцита. Однако перед формированием градиентов мРНК генов bicoid и nanos локализация центра организации и положение микротрубочек меняется на противоположное: в этот период они направлены своими ±концами к заднему полюсу яйца. мРНК гена bicoid связывается с микротрубочками и накапливается на переднем конце формирующихся яиц дрозофилы. В неоплодотворенных яйцах транскрипты находятся на самом кончике передней части яйца. Последние данные указывают на то, что сразу после оплодотворения образуется градиент мРНК в результате направленной диффузии мРНК в яйце, видимо, по периферической сети микротрубочек при участии белкового продукта гена Staufen. мРНК Nanos связана с цитоскелетом яйца, но располагается на заднем конце яйца. мРНК генов Hunchback и caudal теряют системы контроля положения и распределяются практически равномерно в объеме яйца. 64. Роль морфогенов в формировании переднего и заднего концов эмбриона D. melanogaster. Одним из наиболее изученных примеров формирования паттернов развития вдоль передне-задней оси является формирование передне-задней оси тела, зависящее от градиентов морфогенов, у плодовой мушки Drosophila melanogaster. Некоторые другие многоклеточные организмы используют сходные механизмы формирования осей тела, хотя относительное значение передачи сигнала между первичными клетками многих развивающихся организмов выше, чем в описанном случае. Гены материнского эффекта Основа для формирования передне-задней оси закладывается во время формирования яйца (оогенеза), задолго до момента оплодотворения и откладки яиц. Во время созревания ооцита питающие клетки(nursing cells) синтезируют большое количество РНК и белков, которые переносятся в созревающий ооцит по цитоплазматическим мостикам. Большинство этих молекул бывают необходимы в первые два часа эмбрионального развития дрозофилы, до начала транскрипции в зиготе. Развивающийся ооцит имеет градиенты концентраций мРНК. Гены, которые кодируют такие мРНК, называют генами материнского эффекта. Bicoid и hunchback — это гены материнского эффекта, которые имеют особое значение в формировании передних частей зародыша дрозофилы (головы и груди). Nanos и Caudal — это гены материнского эффекта, которые определяют формирование задних брюшных сегментов зародыша дрозофилы. В яйце микротрубочки реорганизуются в ходе оогенеза. Сначала центр организации микротрубочек находится у заднего полюса ооцита, и микротрубочки направлены своими ±концами к переднему полюсу ооцита. Однако перед формированием градиентов мРНК генов bicoid и nanos локализация центра организации и положение микротрубочек меняется на противоположное: в этот период они направлены своими ±концами к заднему полюсу яйца. мРНК гена bicoid связывается с микротрубочками и накапливается на переднем конце формирующихся яиц дрозофилы. В неоплодотворенных яйцах транскрипты находятся на самом кончике передней части яйца. Последние данные указывают на то, что сразу после оплодотворения образуется градиент мРНК в результате направленной диффузии мРНК в яйце, видимо, по периферической сети микротрубочек при участии белкового продукта гена Staufen. мРНК Nanos связана с цитоскелетом яйца, но располагается на заднем конце яйца. мРНК генов Hunchback и caudal теряют системы контроля положения и распределяются практически равномерно в объеме яйца. Когда мРНК генов материнского эффекта транслируется в белки, образуются градиенты белка Bicoid на переднем полюсе яйца и белка Nanos—на заднем полюсе. Белок Bicoid блокирует трансляцию мРНК белка caudal, и поэтому белковый продукт этого гена образуется только на заднем конце яйца. Белок Nanos связывает мРНК hunchback и блокирует её трансляцию на заднем конце эмбриона дрозофилы. Белки Bicoid, Hunchback, и Caudal являются факторами транскрипции. Bicoid имеет ДНК-связывающий гомеодомен, который связывает ДНК и мРНК nanos. Bicoid связывается со специфической последовательностью на 3' нетранслируемом участке мРНК caudal и блокирует трансляцию. Уровень белка Hunchback в раннем эмбрионе значительно увеличивается за счет трансляции мРНК, которая образована уже зиготой. В течение раннего эмбриогенеза дрозофилы происходит деление ядра без деления цитоплазмы. Множество образующихся ядер расходятся к периферии цитоплазмы. Экспрессия генов в этих ядрах регулируется белками Bicoid, Hunchback, и Caudal. Например, Bicoid является транскрипционным активатором гена hunchback. 65. Принципы контроля сегментации и дифференциации сегментов у эмбриона D. melanogaster. Процесс сегментации организма, включающий в себя разделение на головной, грудной, брюшной, а также производные от них отделы, является универсальным в животном мире. Избрав в качестве модельного объекта развития D. melanogaster, рассмотрим сначала присущие именно ей детали, представленные на рисунке. Первый этап становления пространственной организации регулируется генами с материнским эффектом, продукты активности которых в ходе оогенеза образуют фадиенты с морфогенетически активными белками. Вслед за этим происходит оплодотворение и дробление зародыша. После образования бластодермы и включения зиготических генов начинается последовательное формирование сегментарного плана строения тела дрозофилы, личинки и взрослые особи (имаго) которой состоят из передних головных, трех фудных и восьми брюшных сегментов. В результате взаимодействия перекрывающихся фадиентов морфогенетически активных белков, являющихся продуктами генов bicoid и nanos, активируются гены фуппы gap (от англ. gap — брешь, дыра), разделяющие зародыш на широкие домены. К настоящему времени описано 6 генов из группы gap, к числу главных следует отнести гены hunchback, Kruppel и knirps. Каждый из них экс премируется в определенных сегментах эмбриона. Экспрессия гена hunchback происходит в двух областях: в задней четверти яйца, а также в пространстве от переднего полюса почти до середины яйца. Ген Kruppel экспрессируется в широкой зоне, составляющей середину эмбриона, Продукт гена knirps выявляется как спереди, так и сзади от этой зоны. Тот факт, что экспрессия названных трех генов регулируется продуктами генов bicoid и nanos, был установлен в результате изучения мутантов, не способных к их синтезу. Показано, что белок гена bicoid, действуя как позитивный регулятор экспрессии гена hunchback, способствует накоплению продукта последнего у головного конца эмбриона, а белок гена nanos, вероятно, ингибирует активность продукта гена hunchback. Кроме того, блокируя экспрессию гена Kruppel в передней и задней областях эмбриона, белковые продукты генов bicoid и nanos способствуют накоплению мРНК гена Kruppel в центральной части эмбриона. Поначалу размытые границы транскрипционных областей генов группы gap с течением времени сужаются, так как белок гена Kruppel ингибирует транскрипцию гена hunchback, а продукты генов hunchback и knirps — транскрипцию гена Kruppel. Таким образом, области стабильной экспрессии gap-генов сначала дифференциально регулируются материнскими детерминантами, а затем взаимной репрессией последних и собственно генов группы gap. Продукты активации генов gap запускают функционирование группы pair-rule, состоящей из восьми генов и обусловливающей подразделение зародыша на более мелкие домены, состоящие из двух так называемых парасегментов. Причем, в одном из парасегментов гены из группы pair-rule активны, а вдругом — нет. Из группы pair-rule у дрозофилы в первую очередь экспрессируются гены rиnt и hairy, во вторую -fushi tarazu (редуктор числа сегментов) и even-skipped (редуктор четных сегментов). Периодическая смена уровней экспрессии генов группы pair-rule приводит к локальной экспрессии генов самой многочисленной группы - сегментарной полярности. Под действием их продуктов зародыш становится разделенным по всей продольной оси на окончательные сегменты. Для нас наибольший интерес из этой группы представляет ген hedgehog, для которого у позвоночных, в частности, у человека есть четко установленный гомолог. Такова иерархическая последовательность функционирования трех основных групп сегрегационных (т.е. ответственных за количество сформированных сегментов) генов. Как уже указывалось, мутации генов с материнским эффектом фенотипически проявляются у дрозофилы в виде нехватки или удвоения головных, хвостовых, дорсальных или вентральных структур. Следствием мутаций других трех групп генов будут соответственно: 1) нарушение числа и полярности сегментов; 2) нарушение формирования половины сегментов: либо четных, либо нечетных; 3) утрата части каждого сегмента с одновременным удвоением такой же части с противоположной стороны. 66. Характеристика гомеозисных генов комплексов Antennapedia и Bithorax дрозофилы и их продуктов; принципы их действия; фенотипическое проявление мутаций данных генов. Гомеобокс и гомеодомен. Гомеозисные гены — гены, определяющие процессы роста и дифференцировки в организме. Гомеозисные гены кодируют транскрипционные факторы, контролирующие программы формирования органов и тканей. Мутации в гомеозисных генах могут вызвать превращение одной части тела в другую. Гомеозисными мутантами называются такие организмы, у которых на месте органа развивается орган другого типа. Например, у дрозофилы при мутации antennapedia формируется конечность на месте антенны. Гомеозисные гены контролируют работу других генов и определяют превращение внешне неразличимых участков зародыша или определённого органа (ткани, участка тела). В частности, гомеозисные гены контролируют появление различий сегментов многоклеточных животных в раннем эмбриональном развитии. У насекомых гомеозисные гены играют ключевую роль в определении особенностей строения эмбриональных сегментов и структур на них (ноги, антенны, крылья, глаза). Antennapedia — это гомеозисный ген, впервые обнаруженный у дрозофилы, контролирующий расположение ног. Мутация в регуляторном районе этого гена, которая приводит к потере функции, может вызывать превращение второй пары ног в эктопические антенны на груди мухи. Мутантный аллель, который приводит к приобретению функции, превращает антенны в эктопические ноги. Antennapedia относится к комплексу генов дрозофилы, которые отвечают за образование и дифференцировку торакальных и головных сегментов. Bithorax комплекс (BX-C) представляет собой группу гомеозисных гены дрозофилы, контролирующие дифференциацию сегментов брюшка и задних груди. BX-C гены расположенны в III хромосоме. При мутации этих генов происходит повторение второго грудного сегмента, по сути появляется добавочная вторая грудь. Это может привести к появлению второй пары крыльев и в целом к дублированию груди в разной степени. Комплекс включает в себя следующие гены: Ultrabithorax (Ubx), Abdominal A (abdA) и Abdominal B (Abd-B). Гомеозисные гены содержат гомеобокс — последовательность из 180 пар нуклеотидов ДНК, образующую в кодируемом белке гомеодомен. Гомеодомен впервые был обнаружен в составе генов, контролирующих развитие, и, в частности, в составе гомеозисных генов, у дрозофилы. Однако многие гены, содержащие гомеобокс, не являются гомеозисными. Таким образом, гомеобокс — это особая последовательность нуклеотидов, в то время как гомеозисность — это потенциальная возможность образования гомеозисной мутации. Последовательность нуклеотидов в гомеодомене высоко консервативна. Функциональная равнозначность гомеозисных белков может быть доказана тем фактом, что развитие мухи с соответствующими гомеозисными генами курицы протекает нормально. Несмотря на то, что общий предок курицы и мухи существовал около 670 миллионов лет назад,гомеозисные гены куриц сходны с аналогичными генами мух до такой степени, что могут заменить друг друга. Последовательность гомеобокса состоит из 60 остатков аминокислот и образует структуру спираль-поворот-спираль, известную как гомеодомен. У дрозофилы белковый продукт гомеозисного гена Antennapedia активирует гены, которые определяют структуру второго грудного сегмента, содержащего ноги и крылья, и репрессирует гены, вовлеченные в формирование глаз и антенн. Гены, которые регулируются белками, содержащими гомеобокс, называют реализаторными генами, и они являются белковыми продуктами генов полярности сегментов, которые кодируют ткане- и органо-специфичные белки. Регуляция Гомеозисные гены регулируют работу реализаторных генов, и, в свою очередь, регулируются генами gap и pair-rule, которые находятся под контролем белков-морфогенов ряда генов с материнским эффектом. В результате этого образуется каскад транскрипционных факторов: гены материнского эффекта включают гены gap и pair-rule; гены gap и pair-rule включают гомеозисные гены; наконец, гомеозисные гены включают реализаторные гены, которые приводят к сегментации и дифференцировке зародыша. Такая регуляция осуществляется градиентами концентрации белков-морфогенов. Высокая концентрация одного из материнских белков и низкая — других включает определенный набор генов gap и pair-rule. У мух вторая полоска экспрессии гена Evenskipped эмбриона активируется материнскими белками Bicoid и Hunchback и репрессируется белками gap Giant и Kruppel. Гомеозисные мутации В конце 1940-х годов на модельном объекте Drosophila melanogaster Эдвард Льюис изучал гомеозисные мутации, которые приводили к формированию причудливых органов. Мутации в генах, участвующих в развитии конечности, могут приводить к уродствам или даже к смерти. Например, мутации в гене Antennapedia приводят к образованию конечностей на голове мухи на месте антенн. Другим известным примером у дрозофилы является мутация в гомеозисном гене Ultrabithorax, который определяет развитие третьего грудного сегмента. Обычно на данном сегменте представлена пара ног и пара жужжалец (редуцированных крыльев). У мутантных особей, которые не имеют функционального белка Ultrabithorax, на третьем сегменте образуются такие же структуры, как на втором грудном сегменте, который несёт пару конечностей и пару полностью развитых крыльев. Такие мутанты иногда встречаются в диких популяциях дрозофил, и изучение таких мутантов привело к открытию гомеозисных генов животных. 67. Hox-кластеры гомеозисных генов у различных организмов, принципы их действия. Hox-гены располагаются на одной или нескольких (до четырёх) хромосомах, обычно тесными группами (кластерами), внутри которых сохраняется более или менее строгий порядок: «головные» гены впереди, «хвостовые» — сзади. У более примитивных представителей многоклеточных, таких как гребневики (Ctenophora) и кишечнополостные (Cnidaria), этих эмбриональных регуляторных генов только четыре, у млекопитающих их уже 48. Семейство Hox-генов подразделяется на 14 классов. Считается, что эти 14 классов возникали путём дупликации одного или немногих исходных генов, реплики затем мутировали и обретали новые функции. У примитивных кишечнополостных и гребневиков имеется всего 4 класса Hox-генов, у предполагаемого общего предка двустороннесимметричных животных их должно было быть по крайней мере 8, у млекопитающих присутствуют все 14 классов. Принцип работы этих генов одинаков. Их продукты являются транскрипционными факторами, функция которых состоит во «включении» или «выключении» других генов. В результате работы Hox-факторов запускается каскад реакций, приводящий к появлению в клетке нужных белков. За последнее десятилетие расшифрованы ДНК-последовательности Hox-генов у многих групп животных: аннелид, плоских червей, иглокожих, нематод, членистоногих, оболочников, ланцетников, не говоря уже о млекопитающих. Регуляция Гомеозисные гены регулируют работу реализаторных генов, и, в свою очередь, регулируются генами gap и pair-rule, которые находятся под контролем белков-морфогенов ряда генов с материнским эффектом. В результате этого образуется каскад транскрипционных факторов: гены материнского эффекта включают гены gap и pair-rule; гены gap и pair-rule включают гомеозисные гены; наконец, гомеозисные гены включают реализаторные гены, которые приводят к сегментации и дифференцировке зародыша. Такая регуляция осуществляется градиентами концентрации белков-морфогенов. Высокая концентрация одного из материнских белков и низкая — других включает определенный набор генов gap и pair-rule. У мух вторая полоска экспрессии гена Evenskipped эмбриона активируется материнскими белками Bicoid и Hunchback и репрессируется белками gap Giant и Kruppel. Молекулы микроРНК в hox-кластерах сильнее ингибируют передние гомеозисные гены, вероятно, для более точной регуляции их экспрессии. В кластерах гомеозисных генов широко распространены некодирующие РНК (ncRNA). Один из генов некодирующих РНК у человека, HOTAIR, снижает уровень транскрипции гомеозисных генов (транскрибируется с кластера HOXC и ингибирует поздние HOXD гены), связываясь с белками группы Polycomb (PRC2). Структура хроматина необходима для транскрипции, но также требуется выпетливание хромосомных территорий, на которых располагается кластер.Количественная ПЦР показала некоторые закономерности коллинеарности: система находится в равновесии и общее количество транскриптов зависит от количества генов, представленных в линейной последовательности. Организация геномов 68. Семейства гомологичных генов. Ортологи и паралоги. Мультигенные семейства. Семейства генов обычно кодируют белки, богато представленные в клетке. В своем большинстве гены активны. По критерию соответствия последовательностей специфичному зонду обнаруживаются много генов кодирующих синтез интерферона, актина, тубулина... Внутри семейства генов некоторые его члены могут повторяться чаще, чем другие. Например: существует 8 генов для а-типа интерферона человека, и только один β-типа. Актиновые гены: мулътигенное консервативное семейство. Актин участвует в самых разных типах клеточного движения, в частности он обеспечивает клеточную подвижность и мышечные сокращения. Соответственно эукариоты имеют несколько разных типов актина и кодирующих их генов. Одни из этих генов организованы в кластеры, другие диспергированы. В ходе эволюции актиновых генов в них встраивались новые интроны. Каждое такое событие приводило бы к смещению соседних последовательностей и к сдвигу рамки считывания. Можно предположить обратное: большинство актиновых генов содержали интроны во всех тех положениях, где они находятся и в современных генах, но при эволюции разных таксонов утрачивались различные интроны. Актиновые гены в основном рассеяны по хромосомам. У мыши, например, гены аактина скелетных мышц и сердечной мышцы локализованы в хромосомах 3 и 17 соответственно, а гены цитоплазматического β-актина ~ в хромосоме 5. Тубулиновые гены: мультигенное семейство, которое включает гены двух разных субъединиц гетеродимерного белка. Микротрубочки участвуют во многих процессах, протекающих во всех эукариотических клетках: мейозе, митозе, клеточном движении и секреции. Поэтому не удивительно, что структура тубулина-белка, из которого состоят микротрубочки, равно как и нуклеотидная последовательность гена, кодирующего тубулин, одинаковы у всех эукариот. кДНК, синтезированные на тубулиновой мРНК курицы, гибридизуются с тубулиновыми генами таких отдаленных организмов, как дрожжи и млекопитающие. Тубулин - это гетеродимер, состоящий из двух полипептидов: а и β. а- и βсубъединицы содержат 450-451 и 445 аминокислотных остатка соответственно и гомологичны примерно на 40%. Гены обеих субъединиц относятся к одному мультигенному суперсемейству, хотя довольно сильно различаются и не гибридизуются. Как правило, семейства тубулиновых генов у каждого вида эукариот кодируют разные изотипы а- и β-субъединиц. Аминокислотные последовательности различных а- или βсубъединиц, кодируемых этими генами, обычно различаются лишь незначительно (менее чем на 10%), и раз­личия касаются в основном карбоксильных концов молекул. Повидимому, вариации в структуре тубулинов связаны с тем, что немного различаются те микротрубочки, которые они образуют. Последние в свою очередь специфичны в отношении клеточных процессов, типов клеток и стадий развития. Таким образом, разные а- и β-изотипы могут соответствовать разным типам микротрубочек, выполняющих определенные функции, хотя такая специализация и не абсолютна. Дальнейшие изменения в структуре тубулина происходят уже после транскрипции и тоже способствуют функциональной специализации микротрубочек. О такой специализации свидетельствует высокая консервативность специфических изотипов у позвоночных. Например, у различных позвоночных преобладающий в нервной ткани β-тубулин имеет на карбоксильном конце совершенно одинаковые последовательности. Интерфероновые гены. В ответ на разнообразные внешние воздействия клетки многих позвоночных секретируют полипептиды, называемые интерферонами. Например, в результате вирусной инфекции и попадания в клетку двухцепочечной РНК в лейкоцитах индуцируется синтез интерферонов группы ặ, а в фибробластах-интерферонов группы β (IFN-а, I IFN-β, 1 IFN-γ). Каждая группа содержит различные структурные родственные белки. Совершенно другой белок, уникальный lFM-y, синтезируется в лимфоцитах при репликации ДНК, индуцированной митогенами. Все эти интерфероны в свою очередь вызывают различные клеточные ответыподавление вирусной инфекции, иммунные реакции, противоопухолевую активность. Ортологичные гены (orthologous genes) - гомологичные гены филогенетически родственных организмов, разошедшихся в процессе видообразования; гены, которые у различных видов произошли от общего предшественника и передавались вертикально в эволюции . Два гена ортологичны у двух видов, если они появились и далее дивергировали вместе с видами в результате видообразования. Часто (но необязательно) ортологи сохраняют свои функции в процессе эволюции. Ортологи близких видов имеют одну и ту же функцию. Паралогичные гены (paralogous genes): паралогичными называют гены , которые произошли в результате внутригеномных дупликаций в геноме данного вида . В процессе эволюции их функции дивергировали. Идентификация ортологов и паралогов очень важна для функциональных выводов на базе сравнений геномов. Методы такого отнесения совершенствуются, и, по мере совершенствования, список известных ортологичных и паралогичных генов расширяется. 69. Псевдогены. Их называют так потому, что они содержат нуклеотидные последовательности, сходные с последовательностями функционально- активных генов, но не могут экспрессировать с образованием фунционально - активного белка. Некоторые псевдогены имеют в целом такую же структуру, как и функционально-активные гены, с обычным расположением последовательностей соответствующих экзонам и интронам. Они становяться не активными в результате мутации, нарушающих одну или все стадии экспрессии гена. Эти изменения могут проявляться в виде инициирования транскрипции, препятствовать осуществлению сплайсинга на границах экзон-интрон или приводить к преждевременному терминированию трансляции. Обычно псевдоген несет несколько временных мутаций, потому что ген однажды перестав быть активным стал объектом для дальнейшего накопления мутаций. Такие псевдогены обнаружены во многих системах генов, включая гены глобинов, иммуноглобинов, антигенов гистосовместимости и т.д. Например: псевдоген кролика с обычной организацией экзонов и интронов по строению близкий к функционально- активному гену, но в кодоне 20 псевдогена имеется делеция одной пары нуклеотидных оснований, вызывающая сдвиг рамки считывания, из-за которого трансляция терминируется вскоре после ее начала. В результате точковых мутаций оказались измененными несколько расположенных правее кодонов, кодирующих аминокислоты, имеющиеся во всех глобинах, но один из 2-х интронов псевдогена не сохранил пограничные последовательности, удовлетворяющих правилу. Поэтому интроны не могут быть удалены при сплайсинге даже если бы ген и транскибировался. Общий вывод, исходя из структуры таких псевдогенов - это независимый характер эволюционирования каждого из них в процессе эволюции кластера глобина генов каждого вида организмов. Таким образом, возникновение новых генов, за которыми следует их закрепление в геноме в качестве функциональных копий, их изменение приводящее к образованию новых функционально-активных генов, или инактивация с образованием псевдогенов - процессы происходящие в кластере постоянно. Псевдогены, которые имеют сходство с РНК-транскриптом, называются процессироваными псевдогенами. Псевдогены являються членами большей части семейства генов. Обычно псевдогены составляют очень небольшую часть от общего числа генов. Но есть исключения: рибосомный белок мыши кодируется одним активным геном, имеющим около 15 сходных с ним процессированных псевдогенов. Псевдогены- это тупик эволюции, просто нежелательный побочный эффект перестроек функционально- активных генов. Механизмы, ответственные за дупликации, делеции и перестройки генов, воздействуют на все последовательности, относящиеся к членам кластера, независимо от того, являются они функционально - активными или нет. Область, включающая псевдогены - это повтор последовательностей, окружающей начало активного гена (от -73 до +101 п.н.). Удивительная особенность кластера в целом заключается в том, что он, таким образом, должен содержать одинаковое число генов и псевдогенов. 70. Типы повторяющихся последовательностей и их встречаемость в геномах различных организмов. Геном эукариот характеризуется двумя основными особенностями: 1) Повторенность последовательностей; 2) Разделением по составу на различные фрагменты, характеризуемые специфическим содержанием нуклеотидов; Повторенная ДНК состоит из нуклеотидных последовательностей различной длины и состава, которые встречаются в геноме несколько раз либо в тандемно-повторенном, либо в диспергированном виде. Последовательности ДНК, которые не повторяются, называются уникальной ДНК (single-copy DNA). Размер части генома, занятой повторяющимися последовательностями, широко варьирует между таксонами. У дрожжей он достигает 20%, у млекопитающих до 60% всей ДНК повторяется. У растений процент повторенных последовательностей может превышать 80%. По взаимной ориентации в структуре ДНК различаются прямые, инвертированные, симметричные повторы, палиндромы, комплементарные палиндромы и т.п. В очень широком диапазоне варьирует и длина (в числе оснований) элементарной повторяющейся единицы, и степень их повторяемости, и характер распределения в геноме (наиболее грубая классификация: тандемно и дисперсно распределенные повторы); наконец, периодичность повторений ДНК может иметь очень сложную структуру, когда короткие повторы включены в более протяженные или окаймляют их и т.д. Геномы высших эукариот можно грубо разделить на четыре фракции: самокомплементарная ДНК, высоко повторенная ДНК, умеренно повторенная ДНК и уникальные последовательности. Самокомплементарная ДНК состоит из палиндромных последовательностей, способных образовывать двуцепочечные шпильки, "замыкаясь" сами на себя. Фракция высоких повторов состоит из коротких последовательностей длиной от нескольких нуклеотидов до нескольких сотен н.п., которые имеют около 500,000 копий. В умеренные повторы входят более длинные последовательности от сотен до тысяч н.п., имеющие до 100 копий на геном. Повторы могут быть точными и неточными. Кроме того, для последовательностей ДНК можно рассматривать зеркальные и инвертированные повторы. С биологической точки зрения интересны также неточные повторы. Такие повторы иногда называются вырожденными. Дупликации. Повторы в геномных последовательностях были обнаружены довольно давно. Повторы в геномах можно классифицировать по-разному: (1) Некоторые геномы сами являются дупликациями. (2) Сегментарные дупликации, особенно выраженные в геноме человека. Такие дупликации включают перенос 1-200 т.п.о. блоков геномных последовательностей в основном в прицентромерные и в меньшей степени в субтеломерные районы хромосом. Степень гомологии таких дупликаций выше 90%. Некоторые из этих дупликаций связаны с геномными болезнями. Сегментарные дупликации занимают 3.3% генома человека (3) Дупликации генов и генные семейства. (4) Множественные копии мобильных элементов. (5) Простые повторы (короткие, от 1 до нескольких десятков нуклеотидов, в том числе микросателлиты и минисателлиты , которые по-видимому, не кодируют никаких продуктов. (6) Палидромы. (7) Блоки тандемно повторенных последовательностей, такие как последовательности в центромерах, теломерах, коротких плечах акроцентрических хромосом, кластеры рибосомальных генов. (8) Инактивированные ретротранспозированные копии генов. (9) Внутрибелковые повторы. По частоте встречаемости различают низкокопийные (примерно до 10 копий), умеренно повторяющиеся последовательности (от 10 до 104), часто повторяющиеся последовательности (более 105). По типу следования различают диспергированные и тандемные повторы. Геном человека известен на 94%. На основании этого материала можно сделать следующие выводы. Повторы занимают по крайней мере 50% генома.
