Флуоресцентные методы исследования нуклеиновых кислот Флуоресценция нашла широкое применение в различных прикладных биологических и биомедицинских исследованиях. Это физическое явление, суть которого заключается в кратковременном поглощении кванта света флюорофором (веществом, способным флуоресцировать) с последующей быстрой эмиссией другого кванта, который имеет свойства, отличные от исходного. Много направлений в биофизике, молекулярной и клеточной биологии возникли и развиваются именно благодаря внедрению новых методов, базирующихся на флуоресценции. Секвенирование ДНК Секвенированием называют определение последовательности нуклеотидов в цепи нуклеиновой кислоты. Первые методы секвенирования были разработаны в 1970-х годах XX столетия. Ими были метод химической деградации Максама — Гилберта и метод, базирующийся на использовании дидезокситерминаторов по Сенгеру. Суть последнего состояла в энзиматическом удлинении праймера (короткого олигонуклеотида-затравки известной структуры) на молекуле ДНК неизвестной последовательности в присутствии специальных химически-модифицированных нуклеозидов — дидезокситерминаторов. Они похожи на обычные нуклеозид-трифосфаты, которые являются исходными соединениями для синтеза ДНК в организме, но отличаются от них отсутствием 3'-гидроксильной группы. Эти химические соединения могут инкорпорироваться в последовательность ДНК, которая синтезируется ДНК-полимеразой. Но после инкорпорации дидезокситерминатора синтез обрывается из-за отсутствия свободного 3'-гидроксила для образования нового фосфодиэстерной связи с последующим нуклеозидом. В оригинальном методе Сэнгера использовалось энзиматическое удлинение праймера, меченного радиоактивным изотопом (32Р на 5’гидроксильной группе) в четырёх разных пробирках. К каждой из них добавлялся небольшой процент одного определённого дидезокситерминатора. Из-за этого синтез в каждой пробирке обрывался в определённый момент, но всегда на позиции того нуклеотида, который был в форме дидезокситерминатора. По теории вероятности, в смеси, содержащей большое количество вновь образовавшихся молекул ДНК, накапливались все возможные последовательности, терминированные на всех возможных позициях, которые содержат нуклеотид, присутствующий в форме ddNTP. После завершения реакции все четыре реакционные смеси разделялись в полиакриламидном геле на четыре разные дорожки, распределение радиоактивных фрагментов считывалось радиоавтографией, после чего последовательность неизвестной ДНК можно было прочитать прямо на снимке. Кроме использования радиоактивных изотопов, другим недостатком этого метода было большое количество операций, необходимое для обнаружения и считывания радиоактивного сигнала, а также необходимость использования четырёх дорожек для каждого анализа, потому что невозможно было различить разные терминированные фрагменты только по их радиоактивности. Метод секвенирования с дидезокситерминаторами был существенно усовершенствован, когда радиоактивное мечение праймера было заменено на флуоресцентное мечение терминальных нуклеотидов. Было обнаружено, что такие модификации азотистых оснований минимально влияют на распознавание трифосфатов ДНК-полимеразами, поэтому они могут встраиваться в синтезированную ДНК наряду с обычными дНТФ. В случае с флуоресцентными дидезокситерминаторами при терминации синтеза ДНК происходит её флуоресцентное мечение. Использование флуоресцентных красителей четырёх цветов для кодирования каждого из природных нуклеозидов позволило проводить синтез в одной пробирке и разделение на одной дорожке геля. Более того, флуоресцентная детекция оказалась более чувствительной и быстрой по сравнению с радиоактивной, позволяя проводить определение нуклеотидов в реальном времени. В результате в конце 1980-х удалось разработать автоматические системы для секвенирования ДНК с разделением терминированных фрагментов в капиллярном варианте гель-электрофореза и с детекцией каждой «буквы» в последовательности по её специфическому цвету флуоресценции. Хотя именно благодаря этому методу была расшифрована значительная часть ДНК человека, секвенирование по Сангеру уже не актуально из-за существования более быстрых, дешёвых и эффективных методов новых поколений. Многие из них также базируются на флуоресцентной детекции. Например, секвенирование с помощью синтеза (англ. sequencing by synthesis) также использует кодировку четырьмя разными цветами флуоресценции для каждой из четырёх букв генетического кода Гибридизация ДНК Молекулы ДНК состоят из двух цепей полинуклеотидов, которые комплементарны друг другу. Азотистые основания двух цепей образуют пары, которые стабилизированы водородными связями. Характерной чертой нуклеиновых кислот является способность к молекулярному узнаванию, благодаря которой одноцепные фрагменты ДНК имеют сродство с комплементарными фрагментами. На основе явления гибридизации были созданы методы анализа последовательностей нуклеиновых кислот с использованием синтетических флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов. Одним из них является флюоресцентная гибридизация in situ (англ. fluorescent in-situ hybridization, FISH), которая используется для выявления точной локализации определённых последовательностей ДНК на метафазных хромосомах. Во флуоресцентной гибридизации in situ используют синтетические олигонуклеотиды-зонды. Каждая последовательность-зонд ковалентно соединена с флюорофором определённого цвета. Такие зонды вводятся в клетки, после чего остаются на определённое время, для того чтобы состоялась гибридизация между зондами и комплементарными регионами хромосомной ДНК. Зонды, которые не гибридизировались, удаляются промыванием, после чего характерная окраска хромосом изучается с помощью флуоресцентной микроскопии. Кроме локализации единичных генов на хромосомах, FISH позволяет исследовать колокализацию фрагментов ДНК. Благодаря этому метод полезен для цитологии и генетики. Так, если использовать для гибридизации с хромосомной ДНК два зонда, меченных красным и зелёным флюорофорами, места колокализации этих последовательностей на хромосомах будут выглядеть как жёлтые точки. Часто стоит задача определить, содержится ли последовательность ДНК нужной структуры в растворе, например в клеточном экстракте или в смеси продуктов полимеразной цепной реакции. Флюоресцентная гибридизация in situ для этого непригодна, потому что при связывании меченой ДНК с мишенью не произойдет изменения флуоресценции, а отделить связанный и несвязанный зонд, как в случае с хромосомами, невозможно из-за их одинаковой растворимости и других физико-химических свойств. Элегантный метод для решения этой задачи был найден в 1996-м году и получил название «молекулярные маяки» (англ. molecular beacons probes, MB-зонды, рус. ММ-зонды). ММ-зонд является одноцепочечным фрагментом ДНК, состоящим из двух участков: петли и основы. Последовательность нуклеотидов в петле выбирается таким образом, чтобы быть комплементарным той последовательности, которую надо обозначить (мишени). Две части основы комплементарны друг другу, и поэтому образуют стабильную структуру при отсутствии мишени. Конечные гидроксильные группы одноцепочечной ДНК ковалентно модифицируются флюорофором (F) с одной стороны и гасителем флуоресценции (Q) с другой. При отсутствии мишени зонд находится в закрытом состоянии: флюорофор и гасители находятся друг возле друга, из-за чего флуоресценция «выключена». В присутствии ДНК-мишени может образовываться гибридная структура, в которой центральная петля комплементарна мишени, поэтому ММ-зонд «раскрывается». В таком состоянии концы, которые изначально образовывали основу зонда, оказываются разнесены на значительное расстояние в пространстве. Соответственно в таком состоянии гасители не могут эффективно гасить флюорофор, что приводит к значительному росту интенсивности флуоресценции. Оригинальный метод обозначения ДНК с помощью ММ-зондов претерпел многочисленные усовершенствования. Например, существуют модификации, которые базируются на использовании резонансного переноса энергии. Вместо пары «флюорофор-гасители» концы одноцепочечного ДНК-зонда метят двумя флюорофорами, которые образуют ФРПЭ-пару; за счёт этого наличие ДНК-мишени можно определять по исчезновению флуоресценции акцептора и росту флуоресценции донора. Важной областью применения ММ-зондов стала количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР). ММ-зонд, комплементарный центральному региону последовательности, которая амплифицируется, добавляют в реакционную смесь до начала реакции. После старта реакции интенсивность флуоресценции измеряется на каждом цикле амплификации. Если в результате ПЦР амплифицируется фрагмент, комплементарный зонду, интенсивность флуоресценции растёт пропорционально концентрации продукта в смеси. Благодаря этому возможно оценить количество исходной ДНК, которое было в начале амплификации. Более того, возможно наблюдать за амплификацией нескольких вариантов последовательности ДНК в одной смеси, если использовать комбинацию ММ-зондов, закодированных разными цветами флуоресценции. Этот приём нашёл использование в генетическом анализе для идентификации различных аллелей одного гена. Во флуоресцентной микроскопии ММ-зонды используются для изучения уровня экспрессии генов путём визуализации мРНК в цитоплазме. Когда определённый ген начинает транскрибироваться, в цитоплазме растёт концентрация соответствующей мРНК. Если синтезировать ММ-зонд с петлей, которая комплементарна участку мРНК, такой зонд будет гибридизироваться с ней, увеличивая при этом интенсивность своей флуоресценции. За счёт этого можно узнать локализацию соответствующей мРНК в клетке и оценить уровень экспрессии по росту флуоресценции ПЦР в реальном времени (Real-time PCR) – метод позволяет регистрировать накопление ДНК ПЦР в реальном времени с использованием флуоресценции и количественно оценить ДНК в образце. Для этой цели применяют флуоресцентные метки (флуорофоры) двух видов: 1) Интеркалирующие флуорофоры – соединения, которые встраиваются в любые двуцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты и повышают интенсивность флуоресценции. Примерами таких красителей может служить SYBR Green или SYBR Gold. Интеркалирующие красители широко используются в научных исследованиях, однако обладают существенным ограничением, поскольку регистрируют все двуцепочечные ДНК, включая неспецифичные продукты реакции. 2) Флуорофоры для меченья олигонуклеотидов – это соединения, интенсивность флуоресценции которых не зависит от связывания с ДНК и регулируется так называемыми гасителями (темновыми или флуоресцирующими). Олигонуклеотиды меченные парой флуорофор–гаситель, используют в качестве праймеров или зондов (пробы) для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК. К настоящему времени разработано множество вариантов структуры меченных парой флуорофор – гаситель олигонуклеотидов. Линейные разрушаемые зонды (TaqMan) – представляют собой олигонуклеотид (25–30 н.о.), в котором 5’-концевой нуклеотид содержит флуорофор, а 3’-концевой нуклеотид – гаситель. В растворе и при отжиге на ДНК такой зонд не флуоресцирует, за сет гасителя. Во время элонгации ДНК полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью, гидролизует зонд на нуклеотиды. В результате этого флуорофор и гаситель попадают в раствор, где вероятность нахождения этих веществ рядом будет небольшой, и флуоресценция восстановится. Накопление флуоресценции детектируется прибором при каждом цикле ПЦР. В одной реакции можно использовать несколько зондов, у которых флуорофоры имеют разные спектры испускания. «Молекулярные маячки» (beacons) – зонд представляет собой небольшую одноцепочечную молекулу ДНК, которая в свободном состоянии способна образовывать пространственную структуру – шпильку. На одном конце олигонуклеотида располагают флуорофор, а на втором – гаситель. Последовательность зонда комплементарна ДНК-мишени, которую нужно детектировать. В такой структуре молекулы зонда, находясь в растворе, не флуоресцируют. При отжиге олигонуклеотида на молекуле ДНК мишени, происходит пространственное разнесение флуорофора от гасителя и восстановление флуоресценции. Примыкающие пробы (Light cyaler) – в этом варианте используют два зонда, которые связывают ДНК-мишень на небольшом расстоянии друг от друга. 5’-конец одного зонда и 3’конец второго содержат флуорофор-донор и флуорофор-акцептор, соответственно. При их близком расположении флуорофор-донор поглощает свет определенной длины волны и переносит энергию на флуорофор-акцептор, по флуоресценции которого детектируют продукты амплификации. Применение примыкающих проб также позволяет использовать несколько флуорофоров, с разными спектрами испускания и детектировать в одной пробирке сигнал от разных молекул ДНК. Анализ данных ПЦР в реальном времени позволяет судить как о присутствии или отсутствии искомой НК, так и оценить ее изначальное количество, за счет регистрации накопления продуктов амплификации в течение всей реакции. Количество исследуемой НК выражают в абсолютных или относительных значениях. Определение абсолютных значений применяют для расчета количества копий НК в пробирке. Для этого необходим внешний контроль с известной концентрацией НК-мишени. Относительные количества определяют для ответа на вопрос: во сколько раз концентрация НК в одном образце больше (или меньше) чем в другом? Для коррекции массы образца, числа клеток, сохранности и количества общей НК проводят нормировку (выравнивание) результатов. Нормировку проводят по числу клеток, по суммарной ДНК, РНК, рибосомальной РНК и др. Флуоресцентные красители Карбоксифлуоресцеин (FAM) Области применения: Производные флуоресцеина являются наиболее распространенными флуоресцентными метками, вводимыми в олигонуклеотиды. Карбоксифлуоресцеин имеет достаточно большой молярный коэффициент поглощения и высокий квантовый выход. Кроме того, максимум возбуждения для производных флуоресцеина находится в диапазоне спектральных линий аргонового (488 нм) и Nd:YAG (477 нм) лазеров, что делает этот краситель незаменимым в таких областях, как: • ДНК анализ с лазер-индуцируемой флуоресцентной детекцией; • микроскопия с конфокальным лазерным сканированием; • проточная цитофлуориметрия. Тем не менее, при работе с производными флуоресцеина и их конъюгатами следует учитывать их следующие особенности: относительно высокая скорость выцветания; рН-чувствительная флуоресценция (рКа ~ 6.4), которая существенно уменьшается при рН ниже 7.0; относительно широкий спектр флуоресценции, ограничивающий использование производных флуоресцеина в некоторых приложениях, предусматривающих использование нескольких флуоресцентных красителей одновременно; возможное уменьшение интенсивности флуоресценции в составе конъюгатов с биополимерами, особенно при множественном замещении. Родамины 6-Карбоксиродамин (R6G) Области применения: Красители родаминового ряда снискали широкое применение в качестве олигонуклеотидных меток. В отличие от производных флуоресцеинов, их спектральные характеристики не меняются в диапазоне рН от 4 до 10. Карбокисродамин R6G близок по спектральным характеристикам к 6-JOE. Карбоксиродамины используются в различных молекулярно-биологических приложениях, таких как: автоматическое секвенирование ДНК; количественная ПЦР в реальном времени; флуоресцентная in situ гибридизация; детекция на ДНК-чипах. Карбокси-Х-родамин (ROX) Тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA) Тетраметилкарбоксиродамин в настоящее время является наиболее используемым флуоресцентным красителем родаминового ряда. Прежде всего, необходимо отметить, что TAMRA используется в качестве акцептора флуоресценции в зондах, применяемых для проведения количественного ПЦР в реальном времени. 6-Карбокси-4',5'-дихлор-2',7'диметоксифлуоресцеин (6-JOE) 6-Карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (6-JOE) - один из флуорофоров (таких как 5-FAM, 6-TAMRA и 6-ROX), традиционно используемых при автоматическом секвенировании ДНК. Химическая модификация ксантенового кольца смещает максимумы поглощения и флуоресценции этого производного флуоресцеина в длинноволновую область. Промежуточный по сравнению с другими красителями спектр поглощения/флуоресценции 6-JOE, высокий квантовый выход и низкая чувствительность к изменению рН (рКа ~4.3) в диапазоне близком к физиологическому, позволяют использовать этот краситель для целого ряда молекулярно-биологических приложений. Карбоксиродамин (R110) Красители родаминового ряда снискали широкое применение в качестве олигонуклеотидных меток. В отличие от производных флуоресцеинов, их спектральные характеристики не меняются в диапазоне рН от 4 до 10. Карбоксиродамины используются в различных молекулярно-биологических приложениях, таких как: автоматическое секвенирование ДНК; количественная ПЦР в реальном времени. Прочие красители Dansyl Acridine Pyrene Будучи сближены в пространстве, производные пиренов формируют эксимер. При этом пик флуоресценции эксимера отличен от пика флуоресценции одиночного красителя (470нм - эксимер, 376нм - пирен). Это свойство пиренов активно используют для проведения структурных исследований нуклеиновых кислот. Спасибо за внимание
