Лабораторна робота №8 Методи культивування аеробних і анаеробних мікроорганізмів в лабораторних умовах. Стерильний посів грунтової суспензії методом Дригальского https://www.youtube.com/watch?v=BspPQ-Vtq6Y&t=534s https://www.youtube.com/watch?v=jGOphnjTmoA https://www.youtube.com/watch?v=eAFW7_3vM64 (посів і кількісний облік на чашці) https://www.youtube.com/watch?v=DC_SYon54zE (теорія) https://www.youtube.com/watch?v=jqMQtxY66Q8&ab_channel=LifeBiology Теоретичний матеріал Мікроорганізми бувають аеробні, факультативно-анаеробні та облігатно анаеробні. Факультативно анаеробні мікроорганізми здатні розвиватися як у присутності кисню, так і в безкисневих умовах. Основною умовою для їх виділення є відсутність кисню. Факультативні анаероби культивують у рідких та на твердих поживних середовищах за відсутності кисню в атмосфері аргону. Для їх виділення використовують методи Хангейт та Штурм. Первинні облігатно анаеробні мікроорганізми на першому етапі здійснюють анаеробну деструкцію високомолекулярних полімерів до низькомолекулярних сполук (С 2С8) – органічних кислот, спиртів, Н2 та СО2. На другому етапі низькомолекулярні сполуки руйнуються до одновуглецевих попередників метаногенезу (форміат, метанол, метиламін та ін.). Потім метаногенні мікроорганізми (вторинні анаероби) синтезують метан з водню та вуглекислого газу або розкладають одномолекулярні сполуки до СН4 та СО2 [20]. Облігатних анаеробів культивують за допомогою методів Хангейта або Штурм в атмосфері аргону за відсутності кисню та за низьких значень редокс-потенціалу (-200...-350 мВ). Для створення низькопотенціальних умов використовують такі редокс-буфери, як цитрат заліза(II) з Eh = -200 мВ і цитрат титану(III) з Eh = -480 мВ. Для контролю редокс-потенціалу використовують індикатори анаеробіозу (резазуринат натрію і бромтимолблау), які за певних значень Eh знебарвлюються. Резазуринат натрію знебарвлюється при Eh ≤ -100 мВ, бромтимолблау (БТБ) – при Eh ≤ -200 мВ. Культивування (від лат. cultus – вирощування) – це вирощування мікроорганізмів на поживних середовищах. Мікроорганізми, що розвинулись на поживному середовищі називають культурами. Для успішного вирощування мікроорганізмів необхідно забезпечити оптимальні умови культивування, які залежать від їх фізіологічних особливостей. До таких умов відносять: склад поживного середовища, аерацію, температуру та інші специфічні фактори. Інтервали температур, за яких можуть рости мікроорганізми суттєво відрізняються. За відношенням до температури мікроорганізми поділяють на: • мезофіли – ростуть в діапазоні температур 20...40°С. Для водних та ґрунтових мікроорганізмів температурний оптимум 20...30°С. Для бактерій шкіри та слизових оболонок кишечника – 35...38°С; • термофіли – ростуть за температур вище 45°С; • психрофіли – ростуть за температури нижче 20°С. Оптимум 5...10°С. У лабораторних умовах температурний оптимум для мікроорганізмів забезпечується їх культивуванням у термостатах. Сучасні лабораторні термостати Температура у термостаті автоматично регулюється за допомогою спеціального обладнання – терморегулятора, який підтримує її на постійному рівні. Термостат – це металевий ящик із подвійними стінками, між якими знаходиться повітря або вода. В отворі верхньої стінки знаходиться термометр, який показує температуру в середині термостата, і терморегулятор. Роль терморегулятора полягає в тому, що при перевищенні встановленого рівеня температури, обігрів автоматично виключається або зменшується. Обігрів термостата забезпечується електричними тенами. За відношенням мікроорганізмів до кисню їх розподіляють на: • аероби – життєдіяльність яких відбувається за рахунок окислення речовин киснем повітря; • анаероби – отримують кисень при анаеробному розщепленні складних органічних сполук. Атмосферний кисень при цьому смертельний; • мікроаерофіли (факультативні аероби та анаероби) – потребують умов із зниженим рівнем кисню. 8.1 Способи культивування аеробних мікроорганізмів в лабораторних умовах. Культивування на поверхні рідкого та щільного поживного середовища. В цьому випадку мікроорганізми отримують кисень безпосередньо з повітря. При поверхневому культивуванні важливо збільшити площу контакту середовища з повітрям. Для цього середовище наливають тонким шаром у посуд із широким дном – чашки Петрі, матраци, скошені поверхні у пробірках, колби (рис. 12.1). Рисунок. 8.1 – Посуд для культивування мікроорганізмів: 1 – качалочна колба; 2 – качалочна колба з відбійниками; 3 – конічна колба; 4 – чашка Петрі; 5 – пробірка; 6 – матрац https://www.youtube.com/watch?v=naz_hq-xWcc https://www.youtube.com/watch?v=0X39eeZbS98 12.1.1. Глибинне культивування у рідкому середовищі Під час глибинного культивування мікроорганізми використовують кисень, розчинений у воді. Розчинність кисню у воді є невеликою, тому, щоб забезпечити ріст аеробів у товщі рідкого середовища, його необхідно штучно аерувати. Найпростіший спосіб аерації це струшування колб або пробірок на спеціальних качалках (шуттель-апаратах) (рис. 12.2). Рисунок 8.2 – Качалки (шуттель-апарати) для культивування мікроорганізмів При цьому відбувається збільшення поверхні контакту поживного середовища з киснем повітря. У промисловості для вирощування мікроорганізмів у ферментерах, досить часто разом із механічним перемішуванням використовують ще й продування через середовище стерильного повітря. 8.2 Способи культивування анаеробних мікроорганізмів в лабораторних умовах Вирощування у високому шарі середовища. Рідке середовище наливають до країв пробірок чи колб. Перед використанням середовище прогрівають на водяній бані 30...40 хвилин, і швидко охолоджують, щоб не встиг розчинитись кисень. Посівний матеріал вносять на дно пробірки. Пробірки закривають гумовими або скляними пробками. Якщо ріст мікроорганізмів не супроводжується виділенням газів, поверхню середовища заливають стерильним вазеліном або парафіном. Культивування у в’язкому середовищі. Дифузія кисню у рідину зменшується зі збільшенням її в’язкості. Готують середовище з додаванням 0,5% агар-агару (ущільнювача). Вирощування у шарі щільного середовища. Посівний матеріал вносять у розплавлене та охолоджене до 45...50°С агаризоване середовище. У пробірках поверхню заливають стерильною вазеліновою олією. Вирощування в анаеростатах. З анаеростатів (рис. 12.3) відкачують повітря, а потім заповнюють сумішшю азоту (80...90%) та вуглекислого газу (10...20%), за рахунок якої створюється надлишковий тиск, який перешкоджає проникненню кисню з повітря. Рисунок 12.3 – Анаеростати Щодо відношення мікроорганізмів до світла, то більшості мікроорганізмів воно не потрібно, за винятком фототрофних бактерій. Також культивування анаеробних мікроорганізмів може відбуватися у пластикових герметичних анаеробних боксах за використання (https://www.youtube.com/watch?v=OwnGnLMNn2U). https://www.youtube.com/watch?v=aFDYx-7ceS8 хімічних відновників https://www.youtube.com/watch?v=9ghSOnjD3Ls https://www.youtube.com/watch?v=OwnGnLMNn2U https://www.youtube.com/watch?v=YnlDbeNRk9g https://www.youtube.com/watch?v=RWDu6KjXxGI https://www.youtube.com/watch?v=sAEIHdUnuGI 8.3 Методи посіву мікроорганізмів на щільні та рідкі поживні середовища В лабораторних умовах мікроорганізми вирощують у рідких або на щільних поживних середовищах. Посіви проводять так, щоб у середовище не потрапили з повітря сторонні мікроорганізми. З цією метою посіви проводять поблизу газового пальника або спиртівки, в полум’ї яких стерилізують петлю, кінці піпеток, обпалюють краї короків та пробірок при їх відкриванні та закриванні. Пробірки з посівами тримають у лівій руці між великим і вказівним пальцями. Ватні короки із пробірок виймають затискуючи їх між безіменним пальцем і мізинцем правої руки. Краї відкритих пробірок і короки тримають поблизу полум’я пальника (рис. 12.4). Русинок 12.4 – Посів мікроорганізмів в рідке (а) і на скошене агаризоване (б) середовище Посів у рідке середовище проводять петлею, пастерівською або градуйованою піпеткою. Суспензію закапують безпосередньо у середовище, матеріал розтирають петлею на стінці пробірки біля поверхні середовища, а потім пробірку струшують, змиваючи посівний матеріал у середовище. Після посіву петлю обов’язково фламбують у полум’ї пальника, а піпетки занурюють у дезінфікуючий розчин. Перед посівом на щільне поживне середовище його необхідно розплавити на водяній бані, охолодити до 50...60°С і розлити у стерильні пробірки (стовпчиком або у вигляді скошеної поверхні) та чашки Петрі. Потім середовище охолоджують (ущільнюють) і підсушують. Посіви роблять бактеріальною петлею, голкою або шпателем. Рис. 12.5 – Посів мікроорганізмів на чашку Петрі петлею (метод поверхневих штрихів). У першому випадку матеріал набирають стерильною петлею і зигзагоподібно наносять на поверхню скошеного агаризованого середовища (рис. 12.5). В середовище, яке розлите стовпчиком, досліджуваний матеріал засівають уколом бактеріальної голки. При посіві шпателем на поверхню середовища в чашку Петрі наносять краплю мікробної суспензії, а потім рівномірно розтирають її по всій поверхні. https://www.youtube.com/watch?v=_1KP9zOtjXk https://www.youtube.com/watch?v=u84bTjqrt7k https://www.youtube.com/watch?v=uPveNOnmQxI Завдання на виконання 1. Ознайомитися з роботою автоклаву, термостату, анаеростату користуючись їх описом у лабораторному практикумі та поясненнями викладача. 2. Загорнути чашки Петрі, піпетки й пробірки з колбами в папір для проведення їх стерилізації в автоклаві. Виготовити ватні короки для пробірок. 3. Провести стерильний посів дріжджів на рідке та щільне середовище. 4. Почати виділення чистої культури дріжджів із суміші дріжджів за методом Коха. https://www.youtube.com/watch?v=2zmXCkgNBjQ https://www.youtube.com/watch?v=8LEWbZ-7Qzc http://www.biologicageo.com/separrus.html https://www.youtube.com/watch?v=AgQMbnb4hV0 5. Почати виділення чистої культури мікроорганізмів за методом Дригальского із виробничих субстратів. 8.4 Методи кількісного обліку мікроорганізмів Кількість аеробних, факультативно та облігатно анаеробних мікроорганізмів визначають на селективних середовищах прямим підрахунком колоній на твердих (метод Дригальського, Хангейта та Штурм) та ростом у рідких поживних середовищах (метод МакКреді). 8.4.1 Метод Мак-Креді На першому етапі проводять кількісний облік усіх фізіологічних груп мікроорганізмів у рідкому поживному середовищі методом граничних розведень за МакКреді. Метод включає в себе приготування десятикратних розведень суспензії мікроорганізмів та подальший їх посів із розведень у рідке поживне середовище. Кількість мікроорганізмів визначається за наявності або відсутності росту. Далі розраховувалось найбільш імовірне число клітин в одиниці об’єму досліджуваного субстрату по таблиці Мак-Креді. Суспензію мікроорганізмів готували методом десятикратних розведень (рис. 12.6). Рисунок 12.6. – Схема приготування розведень і посіву мікроорганізмів. Для приготування розведень фізіологічний розчин (0,85% NaCl) розливають по 9 мл у стерильні пробірки. Потім 1 мл вихідної суспензії – досліджуваного субстрату (грунт, вода, донний осад та ін.) стерильною піпеткою переносять у пробірку з 9 мл стерильного фізіологічного розчину. У такий спосіб готують перше розведення 10-1, тобто у 10 разів. Отримане розведення ретельно перемішуюь стерильною піпеткою, набираючи в піпетку й випускаючи з неї отриману суспензію. Цю процедуру виконують 5 разів, потім тією же піпеткою відбирають 1 мл суспензії й переносять в наступну пробірку з 9 мл фізіологічного розчину. Таким чином одержують друге розведення (10-2). У такий же спосіб готують і наступні розведення (рис. 12.6). У пробірки об’ємом 20 мл вносили по 9 мл стерильного поживного середовища і по 1 мл мікробної суспензії із відповідного розведення субстрату. Пробірки герметично закривають гумовими пробками для обмеження доступу О2. Мікроорганізми культивують 10 діб за 30ºС. Середовище без інокуляту використовують як контроль стерильності. Культивування мікроорганізмів в умовах обмеженої аерації створювало селективні умови, сприятливі для розвитку одночасно кількох фізіологічних груп мікроорганізмів (рис. 12.7.). По-перше, в поверхневому шарі середовища, який контактує з повітрям, розвиваються аеробні мікроорганізми. По-друге, в товщі середовища, де концентрація кисню різко знижувалась, і кисень не міг інгібувати ріст анаеробів, створювались умови для розвитку факультативно-анаеробних, а на дні – для облігатно-анаеробних мікроорганізмів. Таким чином, були створені умови для кількісного обліку всіх фізіологічних груп мікроорганізмів - деструкторів. Розвиток мікроорганізмів визначали за наявністю клітин мікроорганізмів при мікроскопії культуральної рідини, за помутнінням поживного середовища (приріст біомаси) та утворенням плівок і пухирців газу на поверхні. Гумова пробка Повітря Аеробні мікроорганізми Поживне середовище Факультативно-анаеробні мікроорганізми Облігатно-анаеробні мікроорганізми Рисунок 12.7. – Селективні умови для розвитку фізіологічних груп мікроорганізмівдеструкторів органічних сполук за відношенням до кисню Якщо потрібно розрахувати кількість та виділити лише облігатно анаеробних метаногенні мікроорганізми у складі субстрату за Мак-Креді, пробірки з фізіологічним розчином та поживним середовищем попередньо продувають аргоном та вносять відновник - цитрат титану(III), а також відновлене джерело сірки – H2S. Це забезпечує повну відсутність кисню та низький редокс-потенціал у середовищі культивування (-250…-300 мВ), що є необхідною умовою для росту метаногенів. 8.4.2 Чашковий метод Дригальського В основі методу лежить принцип Коха, згідно якого кожна колонія є потомством однієї клітини мікроорганізмів. Визначення кількості мікроорганізмів цим методом складається з трьох етапів: приготування десятикратних розведень мікроорганізмів (див. вище), посів на агаризоване поживне середовище в чашки Петрі і підрахунок колоній, що виросли. Чашковий метод Дригальського використовують для виділення аеробних мікроорганізмів. Для цього відбирають 1 мл суміші субстрату (грунт, водопровідна вода, донні осади річок, та ін.) та проводять серію розведень у пробірках (див. вище). Попередньо готують та підсушують чашки зі стерильним агаризованим (2%) середовищем HiMedia або МПА. На поверхню підсушеного поживного середовища стерильною піпеткою наносять 0,2 мл (можна 0,1 мл) відповідного розведення мікроорганізмів і розподіляли його стерильним скляним шпателем Дригальського. Мікроорганізми культивують за температури 30 ºС. Кількість аеробних мікроорганізмів визначають через 2-7 діб шляхом підрахунку колоній у чашках. Кількість клітин в 1 мл суспензії досліджуваних мікроорганізмів обчислювали за формулою: а 10 п М V (2.1), де М – кількість клітин в 1 мл (КУО/мл); а – середня кількість колоній, що виросли на чашці (від 30 до 300); 10n – фактор розведення; V – об’єм інокуляту, мл. 8.4.3 Метод Хангейта Метод Хангейта використовується для виділення, зберігання та кількісного обліку факультативно та облігатно анаеробних мікроорганізмів (див. вище) як у рідких, так і агаризованих поживних середовищах. Визначення кількості мікроорганізмів цим методом складався з трьох етапів. Спочатку готують десятикратні розведення субстрату (див. вище). При цьому, підготовка інокуляту здійснюється, враховуючи ростові потреби кожної фізіологічної групи мікроорганізмів. Наприклад, для культивування облігатно анаеробних мікроорганізмів необхідно підготувати герметично-закриті, продуті аргоном пробірки з відновленим за допомогою редокс-буфера фізіологічним розчином (див. вище). Навпаки ж, факультативно анаеробні мікроорганізми не потребують наявності відновника у середовищі, однак необхідною умовою для їх селекції є відсутність кисню у газовій фазі пробірки чи флакону (див. вище). Другий етап полягає у посіві мікроорганізмів у агаризоване поживне середовище у флакони в атмосфері аргону. Завершальний етап полягає у підрахунку колоній, що виросли на середовищі у флаконі. Для кількісного обліку факультативно анаеробних мікроорганізмів методом Хангейта на агаризованому середовищі, флакони об’ємом 120 мл продувають аргоном зі швидкістю протоку 0,5 л/хв. протягом 10 хв. для видалення повітря. Після цього в потоці аргону в них вносять по 0,5 мл кожного десятикратного розведення субстрату (див. вище) та 10 мл розплавленого та охолодженого до 45 ºС агаризованого поживного середовища. Флакони герметично закривають гумовими пробками та обертають у горизонтальному положенні під струменем холодної води так, щоб агаризоване середовище застигло на стінках рівномірним шаром у вигляді циліндру. Мікроорганізми культивують за 30 ºС. Кількість аеробних мікроорганізмів визначають через 5-7 діб шляхом підрахунку колоній у флаконах за формулою 1 (див. вище). Кількісний облік факультативно та облігатно анаеробних мікроорганізмів у рідкому поживному середовищі є поєднанням методів Мак-Креді та Хангейт (див. вище). Десятикратні розведення зразків, пробірки з середовищем, аргоном у газовій фазі, індикатором та відновником готують з урахуванням особливостей культивування кожної досліджуваної фізіологічної групи мікроорганізмів (див. вище) безпосередньо перед експериментом та закривають гумовими пробками та металічними затворами. Посів проводять в анаеробних умовах. Для цього стерильним шприцом пробивають гумові пробки пробірок з десятикратними розведеннями субстрату, відбирають 1 мл досліджуваного розчину та переносять у підготовлені пробірки з 9 мл рідкого стандартного (для факультативних анаеробів) або відновленого (для облігатних анаеробів) поживного середовища (див. вище). 8.4.4 Метод Штурм Метод Штурм є надійним методом визначення чисельності факультативно та облігатно анаеробних мікроорганізмів. До його переваг відносяться простота виконання та ефективність для виділення облігатних анаеробів. За методом Штурм 40 мл розплавленого та охолодженого до 45 ºС агаризованого поживного середовища з 0,5 мл відповідного розведення субстрату вносили у кришку чашки та накривали дном чашки. Щоб обмежити доступ кисню, простір між стінками кришки і дна чашки заливали сумішшю парафіну та вазелінового масла у співвідношенні 1:1. Варто зазначити, що десятикратні розведення субстрату та особливості приготування агаризованого поживного середовища проводять з урахуванням принципів культивування досліджуваних фізіологічних груп мікроорганізмів (див. вище). Визначення кількості мікроорганізмів у 1 мл досліджуваного субстрату проводили за формулою 1 (див. вище). 8.4.5 Анаеростатна техніка для культивування факультативно та облігатно анаеробних мікроорганізмів Культивування мікроорганізмів в анаеростатах є одним з найбільш точних та зручних методів виділення та кількісного обліку анаеробів. Анаеростат – це герметично закрита циліндрична ємність, в якій відсутній кисень (цього досягають відкачуванням повітря або хімічними методами). В кришку вмонтований штуцер для під’єднання вакуумного і зовнішнього джерела інертного газу. Процес посіву облігатних анаеробів зображений на рис. 12.8. Рисунок 12.8. – Анаеростатна техніка посіву облігатно анаеробних мікроорганізмів Для культивування облігатно анаеробних мікроорганізмів, крім видалення O2 із середовища, також необхідне створення негативних значень редокс-потенціалу (Eh ≤ -100 мВ). Відомо, що для росту облігатно анаеробних мікроорганізмів Eh має бути не вище, ніж -150 мВ. Такі умови досягаються внесенням газоподібного відновника H2S в анаеростат з чашками, що заповнений аргоном. Анаеростатний метод посіву мікроорганізмів складався з декількох етапів. Посів мікроорганізмів проводили чашковим методом Дригальського на поверхню агаризованого серодовища Nutrient Agar (HiMedia) з індикатором – резазуринатом натрію (див. вище). Анаеростат заповнювали чашками Петрі з мікроорганізмами та герметично закривали. Повітря видаляли трьохкратним вакуумуванням з наступним заповненням газової фази анаеростату аргоном. Видалення залишків кисню та зниження Eh у середовищі культивування досягалося за допомогою внесення газоподібного відновника – H2S одразу після відкачування повітря та перед внесенням аргону. Анаеростати поміщали в термостат та культивували 10 діб за температури 30 ºС. Для виділення та кількісного обліку факультативно-анаеробних мікроорганізмів у газову фазу анаеростата не потрібно вносити відновник, оскільки низькі значення редокспотенціалу середовища культивування не інгібують їх ріст. Необхідною умовою для їх росту є відсутність кисню в газовій фазі (див. вище). 8.4.6. Середовище для виділення і культивування облігатно-анаеробних метаногенних мікроорганізмів Приготування поживного середовища для культивування метаногенів – це складний і багатоетапний процес. До основних етапів належать: підготовка відновника – цитрату титану(ІІІ), приготування поживного середовища в анаеробних умовах та забезпечення анаеробних умов його зберігання. Відновник - цитрат трьохвалентного титану готували по Зендеру. Для цього 5 мл TiCl3 (15% розчин) вносили у 50 мл 0,2М розчину трьохзаміщеного цитрату натрію та нейтралізували насиченим розчином карбонату натрію. Утворювався блакитно-фіолетовий комплекс, що знебарвлюється при окисленні. При рН = 7,0 Eh становив -480 мВ. Для виділення метаногенних мікроорганізмів готували селективне середовище для метаногенів наступного складу: KH2PO4, NH4Cl, MgCl4×2H2O, KCl, CaCl2– 330 мг/л, вітаміни групи В по Волину (суміш біфотину, піридоксину, тіаміну, пантотенової кислоти, п-амінобензоату, вітаміну B12 та ін..) – 10 мг/л, мікроелементи , метанол – 10 мг/л, NaHCO3–1500 мг/л, резазурин – 2 мг/л та відновник – цитрат трьохвалентного титану – 500 мг/л (можна використовувати Na2S×9H2O у концентрації 500 мг/л). У середовище з метаногенними мікроорганізмами рекомендується вносити цитрат титану(III) у якості більш оптимального відновника до кінцевої концентрації 500 мг/л. Він інгібує розвиток факультативних, але сприяє росту облігатно-анаеробних мікроорганізмів. Середовища для метаногенів можуть бути як рідкими, так і агаризованими. Після приготування середовища, виділення та кількісний облік метаногенів проводять методами, що описані вище (чашковий метод Дригальського з наступним поміщенням чашок в анаеростат, метод Мак-Креді, метод Штурм). Особливості виділення мікроорганізмів та культивування облігатно анаеробних метаногенних Середовища для метаногенних мікроорганізмів повинні містити всі необхідні мінеральні елементи. До них відносять фосфати, солі амонію, калію, магнію, мікроелементи (особливо необхідний кобальт). Селективне мінеральне середовище для метаногенів повинне обмежувати можливість конкурентних мікробних процесів, тому з нього виключають сульфати та нітрати. Сірка входить до складу середовища у вигляді сульфіду. Необхідною умовою приготування середовища для метаногенів є наявність відновника – цитрат титану (III). Окисники в залишкових концентраціях (кисень та ін.) швидко відновлюються низькопотенціальним Ті(ІІІ). Відсутність кисню та низький редокспотенціал визначаються за допомогою індикаторів – резазуринату натрію та БТБ. В середовище необхідно включити речовини, що необхідні для конструктивного метаболізму метаногенів - дріжджовий екстракт, суміш вітамінів В та ін. Вирішальним фактором, що визначає можливість росту метаногенних мікроорганізмів є склад газової фази середовища культивування. Для їх культивування зазвичай застосовують водень-вуглекислотну суміш, що містить 80% водню і 20% вуглекислого газу. Така газова суміш є енергетичним субстратом для метаногенів. Для заміщення газової фази під час культивування метаногенів використовують інертні гази, наприклад аргон. Однак, вуглекислий газ необхідний не тільки як акцептор, а також для підтримання рН середовища. к-Креді. Опрацювання результатів За результатами роботи необхідно скласти протокол лабораторної роботи 12, у якому повинно бути відображено: 1. Назва лабораторної роботи. Дата виконання. Мета роботи. 2. Теоретичні відомості: Принципи складання поживних середовищ для культивування мікроорганізмів, вимоги до лабораторних поживних середовищ. Методи стерилізації поживних середовищ: фізичні, хімічні. Методи культивування аеробних і анаеробних мікроорганізмів в лабораторних умовах. 3. Практична частина – записати у лабораторному зошиті послідовність операцій, необхідних для здійснення посівів, назви посіяних культур мікроорганізмів та номер суміші для виділення чистої культури. У висновку до роботи відзначити застосовані способи посівів та методи культивування. Індивідуальне завдання. На вибір охарактеризуйте по одному виду мікроорганізмів (аеробний та анаеробний (факультативно-анаеробний)). Опишіть форму колоній, методи та джерела виділення, фізіолого-біохімічні властивості, можливі екзометаболіти (цільові продукти), що здатні синтезувати обрані мікроорганізми, а також різницю у метаболізмі між мікроорганізмами. Наприклад Pseudomonas aeruginosa та Clostridium butyricum. Обов’язково опишіть детальні методи культивування обох видів. Використовуйте таблицю 12.1 як приклад. Таблиця 12.1 Порівняльна характеристика аеробних та анаеробних видів мікроорганізмів Назва Відношення до кисню Синтез пігментів Оптимальна температура культивування Основний субстрат Методи культивування Оптимальні значення редокс-потенціалу Оптимальні поживні середовища Екзометаболіти Форма колоній Консистенція колоній Поверхня колоній Колір Край Ферменти Azotobacter vinelandii Облігатний аероб + Від 20 °C до 30 °C Peptostreptococcus anaerobius Облігатні анаероби 37°C Вуглеводи, спирти і солі органічних кислот, зокрема і бензоати Чашковий метод Дригальського, скошений агар, у пробірках у рідкому середовищі Етанол, ацетат і 4метилвалерат ≤ -50...-90 мВ Середовище Ешбі, середовище Федорова, середовище Бейєрінка Білки, амінокислоти Кругла Слизиста Гладка Кремовий Рівний Каталаза, оксидаза В анаеробних умовах за наявності відновника у агаризованому або рідкому середовищі (цитрату заліза(ІІ) або цитрату титану (ІІІ), в чашках, в анаеростатах, метод Хангейт і Штурм -400 ...-420 мВ. Кров’яний агар бруцел H2, CO2, Ізокапронова кислота Кругла Слизиста Гладка Білий Рівний Пролін-аріламідаза Фотографія мікроорганізмів на чашці Мікроскопічне колоній фото Окремо детально і послідовно опишіть методи виділення і культивування кожного з обраних видів мікроорганізмів. Azotobacter vinelandii Представники роду поширені повсюдно в нейтральних і слаболужних ґрунтах. Також вони були знайдені і в екстремальних умовах ґрунтів північного і південного полярних регіонів, незважаючи на короткі місцеві вегетаційні сезони і відносно низькі значення pH. Також бактерії Azotobacter були виділені з водних середовищ, зокрема з прісноводних водойм, солоневатих боліт. Для отримання біомаси цих бактерій використовують безазотні синтетичні середовища Ешбі і Федорова. Середовище стерилізують при 1 атм протягом 20хв. Бактерії вирощують в культиваторах (флаконах) загальним об'ємом 500мл. Для отримання необхідного значення масопереносу (0,4-0,6гО2/л·год.) в культиватор вноситься 50мл середовища. В якості посівного матеріалу використовується культура азотобактера яку вирощували протягом 24год. в середовищі подібного складу (можливе вирощування на синтетичному поживному середовищі), яку вносили в кількості 1% від об'єму середовища. Культивування проводять протягом 48 годин при температурі - 28-30С°. Бактерії культивують на качалці з кількістю обертів, n=240об/хв. Після 48 годин культивування чисельність життєздатних бактерій в культуральній рідині складає не менш ніж 1·1010кл/мл. Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus anaerobius відносяться до нормальної мікрофлори людини, мешкаючи в ротовій порожнині, в кишечнику (в основному, в товстій кишці) і піхву здорових людей, складаючи основну масу всіх пептострептококів, що зустрічаються в людини, які, у свою чергу, складають від 13 до 18 % всіх що виявляються у людини грампозитивних анаеробних коків. Проте P. anaerobius також виділено з фекалій щурів, мишей, кішок, собак, мавп та кроликів. Пептококи облігатнi анаероби, капнофіли, при рості утворюють велику кількість молочноï кислоти. Іноді ростуть у мікроаерофільних умовах (5-10 % со,), утворюючи велику кількість молочноï кислоти. Хемоорганотрофи; для росту потребують збагачених поживних середовищ. На кров'яному агарi колонії пептококів дрібні, опуклі, блискучі, прозорі або мутні, утворюються через 48 годин анаеробного культивування. Деякі штами пептококів на агарі формують чорні колонії. Температурний оптимум росту - 37 °С. Колонії Peptostreptococcus aerobius дещо крупніші, мутні, мають характерний солодкуватий запах; чутливі до анетолсульфонату натрію, що використовується для їх диференціації за допомогою дискiв.
