УДК 581.143:577.175.1 А.П. ВОЛЫНЕЦ Ауксино-фенольный комплекс растений – индуктор роста клеток растяжением Институт экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича НАН Беларуси Введение. Взаимодействие эндогенных регуляторов в процессах роста и органообразования важный и пока малопознанный акт эндогенной регуляции. То, что он носит системный характер не вызывает сомнений. Остается не ясным ход этого процесса и компоновка регуляторов роста в таких интегральных явлениях как рост, корне- и плодообразование, дифференцировка органов и защита растений. Наше внимание привлекло взаимодействие эндогенных регуляторов при осуществлении роста растяжением. С одной стороны, в реализации такого акта бесспорно участие ауксина. С другой стороны, представлялось, что к этому могут быть причастны фенольные соединения как эндогенные вещества, имеющие много общего с ауксинами. Прежде всего структура ИУК и фенолкарбоновых кислот близка. Она включает бензольное кольцо и карбоксильную группу [1]. Пути биосинтеза этих веществ однотипны. Они идут от аминокислот триптофана и фенилаланина [2]. Локализация их в органах растений и накопление в онтогенезе сходны [3-5]. Как ИУК, так и фенольные соединения наиболее характерны интенсивно растущим органам и максимальное содержание их приходится на фазы бутонизации, цветения и плодообразования. Фенольные соединения способны регулировать активность ферментных систем биосинтеза и распада ИУК, а также образовывать с ИУК ростовой комплекс ауксин-фенол [6]. Если точки соприкосновения фенольных соединений с ауксином определены в модельных системах при росте растяжением, то роль отдельных фенольных соединений в опытах in vitro и in vivo и масштабы взаимодействия этих регуляторов роста, ждут своего решения. Объекты и методы исследований. Объектами исследований служили листья и цветки желтого люпина сортов Боровлянский кормовой и Быстрорастущий кормовой, а также растения льна-долгунца сорта Л-1120. Растения люпина выращивали в лабораторных условиях до возраста 4-х листьев при освещенности 6000 лк. Использовали зеленые и этиолированные листья люпина. Последние применяли с целью снижения эндогенного состава и содержания фенольных соединений в опытных растениях при изучении активности ферментов в условиях in vivo. Растения льна-долгунца выращивали в вегетационных опытах до фазы желтой спелости, используя для анализов фенольных соединений надземную массу растений. Активность ферментной системы синтеза ИУК (СИУК) определяли по методу Вихнера и Либберта [7], активность оксидазы ИУК (ОИУК) – по методу Гамбурга [8], но без добавления в рабочую смесь 2,4-ДХФ во избежание возможного взаимодействия его с фенольными соединениями. Состав и содержание фенольных соединений в разных органах люпина определяли ранее описанным методом [9], рассчитывая эндогенное количество их по чистым образцам фенольных соединений. Выделение суммарных препаратов флавоноидных гликозидов и агликонов описано в работе [10]. Активность ферментных систем ОИУК и СИУК в опытах in vivo определяли после введения отдельных фенольных соединений или их смесей в листья люпина методами вакуум-инфильтрации, свободного поступления через нижний срез стебля и поступления через корни. Исходная концентрация фенольных соединений составляла 10-4 М. Анализ активности ферментных систем ауксинового обмена в опытах in vitro и in vivo осуществляли с использованием люпина сорта Боровлянский кормовой, а определение состава фенольных регуляторов ИУК в разных органах люпина проводили на растениях сорта Быстрорастущий кормовой. Состав фенольных соединений названных сортов люпина был одинаков. Результаты исследований и их обсуждение. Сначала изучали действие фенольных соединений на активность ОИУК, выделенной из листьев люпина сорта Боровлянский кормовой в возрасте 4-х листьев. Практически все испытанные фенольные соединения в опытах in vitro были активны. Они стимулировали или ингибировали ОИУК в широком диапазоне концентраций (табл. 1). В качестве активаторов фермента выступали Таблица 1. Влияние фенольных соединений на активность ОИУК листьев люпина в опытах in vitro (в % к контролю) Вещество -3 10 158 125 0 102 - Концентрация, M 10 10-5 10-6 109 85 112 102 28 82 90 80 27 34 7 10 0 0 84 9 107 -4 Апигенин Ройфолин Кверцетин Рутин Кофейная кислота Хлорогеновая кислота Эскулетин Эскулин Суммарный препарат 155 154 117 изофлавоновых гликозидов Кемпферол 3 76 Лютеолин 1 62 Коричная кислота 67 54 53 Салициловая кислота 109 100 103 П-кумаровая кислота 123 94 84 Феруловая кислота 67 85 Примечение: здесь и далее контроль - водный раствор ИУК 10-6 М. 10-7 77 95 107 93 93 96 п-оксифенолы и п-диоксифенолы, а в роли ингибиторов проявляли себя одиоксифенолы и о-диоксиполифенолы. Исключение составлял кемпферол, который ингибировал ОИУК, хотя относится к группе п-оксиполифенолов. Замещение оксигруппы на метогоксигруппу ослабляет действие фенолов на активность фермента (сравните активность кофейной и феруловой кислот). Особо следует отметить активность коричной кислоты, которая ингибировала ОИУК, хотя по своей структуре не является фенольным соединением. Можно полагать, что в процессе выделения фермента происходит о-дигидрооксилирование ее с образованием кофейной кислоты. В целом же следует отметить, что максимальную ингибирующую активность показала хлорогеновая кислота, а наиболее сильным активатором ОИУК выступал суммарный препарат изофлавоновых гликозидов, производных генистеина, т.е. п-оксиполифенола. Среди пары флавоноидов (агликонгликозид) активнее вели себя агликоны, а среди эфиров и свободных фенолкарбоновых кислот более активными были фенольные конъюгаты (сравните действие кофейной и хлорогеновой кислот). В аналогичных условиях опыта выясняли особенности действия фенольных соединений на активность ферментного препарата биосинтеза ИУК. Все фенольные соединения оказывали влияние на активность ферментной системы СИУК в опытах in vitro (табл. 2). Просматривается Таблица 2 Действие фенольных соединений на активность ферментной системы синтеза ИУК листьев люпина в опытах in vitro (в % к контролю) Вещество Кофейная кислота Хлорогеновая кислота Феруловая кислота П-кумаровая кислота П-оксибензойная кислота Эскулин Эскулетин Апигенин Ройфолин Кверцетин Рутин Кемпферол Лютеолин -4 10 160 207 71 87 179 91 - -5 10 104 132 83 103 155 140 118 71 50 151 74 204 54 Концентрация, M 10-6 10-7 88 98 111 115 75 92 86 82 170 97 162 158 120 73 97 80 44 80 118 130 94 94 130 124 67 74 10-8 130 120 85 74 83 183 79 53 58 180 76 определенная связь действия фенольных соединений на активность СИУК со структурой этих веществ. Фенольные соединения, ингибирующие ОИУК, проявляли себя как стимуляторы биосинтеза ИУК и, наоборот, стимуляторы ОИУК вели себя как ингибиторы СИУК. Исключений немного. Ингибиторы ОИУК (феруловая кислота и лютеолин) одновременно подавляли и образование ауксина. Самым сильным стимулятором образования ИУК оказался эскулин, а инигибитором – ройфолин. В зеленых органах люпина обнаружены только гликозиды апигенина (ройфолин) и гликозиды кверцетина (рутин и изокверцетин), изорамнетина (изорамнетин-3-О-рутенозид) и кемпферола (астрагалин и кемпферол-3-Орамноглюкозид), тогда как в цветках - в большом количестве гликозиды флавонов и флавонолов, а также флавоноидные агликоны [11]. Среди гликозидов люпина основными компонентами были ройфолин и рутин, а среди агликонов – кверцетин и лютеолин. Учитывая состав и содержание флавоноидных соединений в зеленых органах и цветках люпина и их совместную локализацию в этих органах, важным было изучить совместное действие гликозидов и агликонов на активность ОИУК. С этой целью составляли искусственные смеси гликозидов (рутин+ройфолин) и агликонов (кверцетин+апигенин) примерно в эндогенных концентрациях и действовали на активность ОИУК, выделенной из листьев люпина. Когда индивидуальные гликозиды оказывали слабое стимулирующее действие на фермент или были инертны, то смеси их сильно подавляли активность ОИУК (табл. 3). Таблица 3 Влияние флавоноидных гликозидов и их смесей на активность ОИУК листьев люпина в опытах in vitro Вещество или смесь Рутин Рутин Ройфолин Ройфолин Рутин+ Ройфолин Рутин+ Ройфолин Рутин+ Ройфолин Концентрация, М 10-3 10-4 10-3 10-4 10-3+10-4 10-3+10-3 10-4+10-3 Активность ОИУК в % к контролю 101 92 118 109 16 9 24 Оптимум действия гликозидов на активность ОИУК отмечается при соотношении компонентов 1:1 (концентрация 10-3 М). Индивидуальные флавоноидные агликоны ингибировали активность ОИУК (кверцетин) или оказывали разное влияние на активность фермента (апигенин), в то время как смеси их стимулировали ее по возрастающей (табл. 4). Максимальный эффект оказывала смесь агликонов при соотношении компонентов 1:1 (концентрация 10-5 и 10-4 М соответственно). Наконец, определяли характер действия суммарных препаратов флавоноидных гликозидов и агликонов, выделенных их листьев и цветков люпина соответственно, на активность ОИУК. Оба препарата в концентрации 10-3 М подавляли активность фермента примерно в одинаковой степени (Рис. 1). Таблица 4 Влияние флавоноидных агликонов и их смесей на активность ОИУК этиолированных листьев люпина в опытах in vitro Вещество или смесь Концентрация, М Кверцетин Кверцетин Апигенин Апигенин Кверцетин+Апигенин Кверцетин+Апигенин Кверцетин+Апигенин 10-4 10-5 10-4 10-5 10-4+10-5 10-4+10-4 10-5+10-4 Активность ОИУК в % к контролю 23 86 106 88 120 158 204 % 200 2 1 150 100 50 0 10 30 60 Время ингибирования, мин Рисунок 1. Действие суммарных препаратов флавоноидных гликозидов (1) и агликонов (2), выделенных из этиолированных листьев и цветков люпина, на активность ОИУК, выраженной в % окисленной ИУК в единицу времени (опыты in vitro) Таким образом, фенольные соединения выступают эффекторами ИУК, стимулируя или подавляя активность ОИУК. При этом влияние индивудуальных фенольных соединений на активность ОИУК отличается от действия смесей и суммарных препаратов. Если влияние индивидуальных фенольных соединений на активность фермента определяется в основном структурой веществ, то действие смесей и суммарных препаратов – преимущественно составом, соотношением компонентов и их концентраций. Одновременно с опытами in vitro определяли активность ферментов ОИУК и СИУК люпина в опытах in vivo. Фенольные соединения вводили в листья люпина тремя способами (вакуум-инфильтрацией, свободным поступлением через стебель и поступлением через корни). Во всех случаях влияние фенольных соединений на активность ферментов проявлялась в полной мере. Так, действие фенольных соединений на активность ОИУК в максимальной степени наблюдалось при поступлении их через корни и свободном поступлении через стебель (табл. 5). Характер действия фенольных соединений на активность ОИУК в опытах in vivo в основном сохраняется с аналогичным влиянием их в опытах in vitro. Преимущественное действие фенольных соединений на активность ОИУК в опытах in vivo ингибирующее, тогда как стимуляция фермента была редкая и небольшая. Нужно отметить, что способ действия фенольных соединений может иногда меняться в зависимости от характера поступления их в листья люпина, что отмечалось в частности у хлорогеновой и поксибензойной кислот. Таблица 5. Влияние фенольных соединений на активность ОИУК этиолированных листьев люпина в опытах in vivo (в % к контролю) Способ введения фенольных соединений Вакуум-инфильтрация в листья Поступление через корни Свободное поступление через стебель Вещество Стимуляция Ингибирование п-Оксибензойная кислота Хлорогеновая кислота Кофейная кислота п-Оксибензойная кислота Хлорогеновая кислота Эскулин Кверцетин Хлорогеновая кислота Эскулин 5 8 9 - 45 65 54 70 55 63 Вместе с ОИУК в опытах in vivo изучено действие фенольных соединений и на активность СИУК. У большинства фенольных соединений характер действия их на активность этого фермента был сходен в опытах in vitro и in vivo. Направленность изменения активности фермента была в основном однотипная, стимулирующая (табл. 6). Только апигенин Таблица 6 Влияние фенольных соединений на активность СИУК этиолированных листьев люпина в опытах in vivo (в % к контролю) Способ введения фенольных соединений Вакуум-инфильтрация в листья Поступление через корни Свободное поступление через стебель Вещество Стимуляция Ингибирование п-Оксибензойная кислота Хлорогеновая кислота Апигенин Кверцетин п-Оксибензойная кислота Хлорогеновая кислота Апигенин Хлорогеновая кислота Эскулин 61 135 98 52 45 30 29 28 22 - ингибировал активность СИУК. В тоже время хлорогеновая кислота оказывала стимулирующее действие на активность этого фермента при разных способах введения фенольных соединений в листья люпина. Если эндогенные фенольные соединения являются регуляторами ауксинового обмена в интактных растениях, то между соотношением фенольных ингибиторов и активаторов и активностью ОИУК должна проявляться определенная связь. Ее можно было обнаружить только при одновременном определении активности фермента и содержания фенольных эффекторов ИУК в условиях изменения роста растений под влиянием внешних факторов. В качестве последних использовали гербицид 2,4-Д в концентрациях стимулирующих и ингибирующих рост люпина сорта Боровлянский кормовой. Опыты показали, что при высокой интенсивности роста люпина соотношение ингибиторы: стимуляторы сохраняется на высоком уровне в течение всего опыта (табл. 7). Таблица 7 Изменение соотношения природных эффекторов ауксинового обмена и активности ОИУК в листьях люпина под влиянием 2,4-Д Вариант Контроль (вода) 2,4-Д, 2ּ10-5 М 2,4-Д, 2ּ10-7 М Контроль (вода) 2,4-Д, 2ּ10-5 М 2,4-Д, 2ּ10-7 М Контроль (вода) 2,4-Д, 2ּ10-5 М 2,4-Д, 2ּ10-7 М Экспозиция, сут 1 3 6 Ингибиторы Активаторы мкг/г сухой массы 176 246 238 184 228 228 198 199 198 645 775 596 651 526 557 709 593 567 Соотношение ингибиторы/ активаторы 1:3,3 1:3,2 1:2,5 1:3,5 1:2,3 1:2,5 1:3,6 1:3,0 1:2,9 Активность ОИУК, % 100 134 70 100 67 75 100 119 80 Более выраженная связь роста с накоплением фенольных эффекторов ауксина была свойственна растениям льна-долгунца (Рис. 2), в которой соотношение ингибиторы: активаторы оставалось более высоким в течение всего онтогенеза с максимумом в фазе интенсивного роста. Таким образом, все фенольные соединения ведут себя как активные регуляторы ауксинового обмена, оказывая стимулирующее или ингибирующее влияние на рост растяжением. При этом действие индивидуальных фенольных соединений отличается от влияния природных ли искусственных смесей. Если действие отдельных веществ может быть разным по направленности и силе, то влияние смесей на обмен ИУК в период роста обычно сильное и однонаправленное, способствующее повышению активности фитогормона. Длина стебля и содержание фенольных соединений в условных единицах 20 18 16 14 12 10 8 6 в б а 4 2 1 2 3 4 5 Рисунок 2. Содержание фенольных ингибиторов и активаторов ОИУК в онтогенезе льна-долгунца. 1-5 соответственно фазы всходов, «елочки», интенсивного роста, цветения и желтой спелости а - активаторы, б – рост стебля, в – ингибиторы Кроме определения активности ферментов ИУК, провели также анализ эффекторов фитогормона в онтогенезе люпина сорта Быстрорастущий кормовой (табл. 8). Оказалось, что фенольные регуляторы ауксинового обмена присутствуют во всех органах и на разных этапах развития люпина. Даже в покоящихся семенах обнаружены фенольные регуляторы, тогда как с набуханием их начинается рост растяжением осевых органов зародыша. На примере растений желтого люпина видно, насколько многообразна и динамична система фенольных эффекторов ауксина, хотя она еще далеко не полная. К указанным эффекторам следует добавить фенолкарбоновые кислоты, минорные флавоноидные гликозиды и агликоны, а также эфиры фенолкарбоновых кислот. Постоянное обновление состава и содержания фенольных соединений в растениях обеспечивает надежность, непрерывность и своеобразие ростового процесса. Таблица 8. Состав онтогенезе люпина Растения и орган Семена покоящиеся Проростки 5-дневные Растения в фазе цветения а) листья б) стебли в) цветки основных флавоноидных эффекторов в Ингибиторы ОИУК Активаторы ОИУК Лютеолин Лютеолин, кверцетин, кемпферол, лютеолин-3-О-глюкозид Рутин, астрагалин, изорамнетин-3О-рутинозид, кемпферол-3-Орамноглюкозид, изокверцитрин Рутин, изорамнетин-3-О-рутинозид, кемпферол-3-О-рамноглюкозид Лютеолин, кверцетин, рутин, изорамнетин-3-О-рутинозид, кемпферол, кемпферол-3-Орамноглюкозид Апигенин, виценины Апигенин, генистеин8-С-глюкозид Ройфолин, генистеин8-С-глюкозид Ройфолин, генистеин8-С-глюкозид Апигенин, генистеин, ройфолин, генистеин8-С-глюкозид Итак, установлена тесная функциональная связь ауксинового и фенольного обменов в растениях, что является новым достижением в области эндогенной регуляции физиологических процессов. Заключение. Проведен анализ влияния фенольных соединений на активность ферментных систем синтеза и распада ауксина (ИУК) в растениях желтого люпинав опытах in vitro и in vivo, а также эффекторов ОИУК в растениях льна-долгунца. Установлено, что все фенольные соединения выступают в качестве эффекторов ауксинового обмена, повышая или снижая содержание фитогормона. Стимуляторами ауксинового обмена являются в основном о-оксифенолы и о-диоксиполифенолы, а ингибиторами поксифенолы и п-диоксиполифенолы. Действие индивидуальных фенольных соединений на активность ферментных систем ауксинового обмена отличается от влияния природных и искусственных смесей этих веществ. Последние обычно способствуют биосинтезу и сохранению эндогенного ауксина, т.е. поддерживают рост растяжением. Эффекторы ауксинового обмена имеют всеобщее распространение в растениях, т.е. связь ауксинового и фенольного обменов постоянна. Литература 1. Кефели В. И. Природные ингибиторы роста и фитогормоны. М.: Наука, 1974. 253 с. 2. Муромцев Г.С., Чкаников Д.И., Кулаева О.Н., Гамбург К.З. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений. М.: Агропромиздат, 1987. 383с. 3. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. 248 с. 4. Физер Л., Физер М. Стероиды. М.: Мир, 1986.184с. 5. Минкина Ю.В. Фитогормоны и флавонолы в регуляции прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок петунии (Petunia hibrida L.). Автореф. дисс…. Канд. биол. наук. М. ИФР РАН, 2007. 27 с. 6. Леопольд А. Рост и развитие растений. М.: Мир, 1968. 494с. 7. Wichner S., Libbert E. Physiol. Plantarum, 1968, Vol. 21. № 1. Р. 227-232. 8. Гамбург К.З. //Методы определения регуляторов роста и гербицидов. М., Наука, 1966. С. 57-66. 9. Волынец А.П., Маштаков С.М. Определение фенольных соединений в растительном материале // Методы определения фитогормонов, ингибиторов роста, десикантов и гербицидов. М., Наука, 1973. С. 39-49. 10. Волынец А.П., Корнелюк В.Н. // Физиология растений, 1973. Т. 20. Вып. 4. С. 844-851. 11. Волынец А.П. Фенольные соединения в жизнедеятельности растений. Минск: Беларуская навука, 2013. 283 с. А.П. Волынец АУКСИНО-ФЕНОЛЬНЫЙ КОМПЛЕКС РАСТЕНИЙ – ИНДУКТОР РОСТА РАСТЯЖЕНИЕМ Резюме Доказано, что в растениях существует тесная функциональная связь между ауксиновым и фенольным обменами, осуществляемая через ферментные системы синтеза и распада ИУК, что является новым достижением в области эндогенной регуляции роста. A.P. Volynets THE AUXINE-PHENOLIC COMPLEX OF PLANTS IS AN INDUCER OF GROWTH STRETCHING Summary It is proved that in plants there is a close functional connection between auxin and phenol metabolism, which is realized through enzyme systems of synthesis and decomposition of IAA. This is a new development in the field of endogenous growth regulation.
