Зарегистрировано «______»__________201__ г. ________ _______________ подпись (расшифровка подписи) ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» ( Н И У « Б е л Г У » ) ИНСТИТУТ ФАРМАЦИИ, ХИМИИ И БИОЛОГИИ Кафедра биологии ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЧИПОВ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ Курсовая работа по дисциплине «Практикум по методам молекулярной биологии» студентки очной формы обучения направления подготовки 06.04.01 «Биология» 1 курса группы 11001843 Мовчан Евгении Александровны Научный руководитель: к.б.н., доц. Зубарева Е.В. Допущена к защите «___»_________________201__ г. ________ ____________________ Подпись (расшифровка подписи) Оценка______________________ «______»______________201__ г. ________ ____________________ Подпись (расшифровка подписи) БЕЛГОРОД 2019 Оглавление Введение ………………………………………………………………………...3 Глава 1. Теоретическая основа изучения использования биочипов в лабораторной диагностике………………………………………………………….……5 1.1. Понятие и сущность биочипов…………….................................................5 1.2. Виды и функции биочипов ………………………………………...............8 Глава 2. Анализ использования биочипов в лабораторной диагностике…….14 2.1. Биочипы – настоящее и будущее в лабораторной диагностике…………14 2.2. Применение биочипов в лабораторной диагностике……………………..16 Выводы…..………………………………………..………………………...........23 Список использованных источников…………………..……………………….26 3 Введение Актуальность исследования. Около двадцати лет назад была разработана технология биологических чипов. Данная разработка принадлежит Институту молекулярной биологии им. Энгельгардта, Москва, Россия. Можно сказать, что в течение двадцати лет эта разработка не использовалась, и никто ей не занимался. Но сейчас ученые решили вновь возобновить работу над чипами, и в ближайшем будущем собираются изготовить целую серию чипов. Главное преимущество технологии в сравнении с привычными для нас процедурами сдачи анализов – это оперативность. Биологические микрочипы – это совокупность ячеек, расположенных на поверхности стекла или пластика, своего рода, миниатюрный аналог сразу нескольких сотен, а то и тысяч реакционных пробирок [10]. Биочип – это матрица, на которую наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, в том числе и ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе. Матрица биочипа представляет собой, совокупность микроячеек на плоскости, каждая из которых содержит молекулярные зонды, специфичные к одной из множества биологических молекул или их фрагментов. В качестве молекулярных зондов могут служить олигонуклеотиды, фрагменты геномной ДНК, РНК, белки, полипептиды, рецепторы антител, лиганды, олигосахариды и т.д. Таким образом, это многопараметровый (в некоторых случаях до 16 искомых показателей) анализ одного биообъекта [29]. Что такое матрицы для биочипа? Это может быть стеклянный или гелевый слайд стандартного размера 25х75х1 мм. Так как большинство сканеров биочипов работают именно в таком формате, для пользователя важно, что, покупая готовый биочип, он может анализировать его на сканере любого производителя. Целью данного исследования является изучение использования биочипов в лабораторных исследованиях. 4 Задачи исследования: 1. Рассмотреть понятие и сущность биочипов, а также виды, и функции биочипов. 2. Описать перспективы применения биочипов в современной клинической лабораторной диагностике. 3. Проанализировать применение биочипов в лабораторной диагностике. Объект исследования: биочипы в лабораторных исследованиях. Предмет исследования: применение биочипов. Теоретической основной курсовой работы послужили исследования отечественных и зарубежных ученных в области изучения генетики человека. Курсовая работа изложена на 28страницах, она состоит из оглавления, введения, двух глав, выводов и списка использованных источников, который насчитывает 29 наименований. 5 Глава 1. Теоретическая основа изучения использования биочипов в лабораторной диагностике 1.1. Понятие и сущность биочипов Биочип (биологический микрочип, биологический чип) (от английского слова – Biochip) – данное понятие включает в себя несколько моментов: – матрица с нанесенными молекулами белков или нуклеиновых кислот для одновременного проведения большого количества анализов в одном образце; – электронное устройство, содержащее биологические молекулы; – миниатюрный датчик, способный выявить исчезающие малые концентрации белков, гормонов, ДНК или РНК [28]. Изобретены биочипы были в конце 90-х годов в России и в США. Особенно удивительна история происхождения сугубо отечественного биочипа, который, не случайно за рубежом до сих пор называют «русский биочип». В конце 80-х годов прошлого века, когда команда ученых из Института молекулярной биологии РАН (ИМБ) под руководством академика Андрея Мирзабекова, взялась за изготовление универсального миниатюрного анализатора. В то время весь мир был увлечен процессом расшифровки генома человека, и было предложено использовать для этих целей биочипы. Но вскоре стало ясно поняли, что такие новые устройства могут пригодиться для решения различных практических задач, поэтому поспешили разработать технологию. И успешно. В середине 90-х, когда финансирование российской науки почти полностью прекратилось, Мирзабекова пригласили для работы в США. Вместе с ним работали другие русские ученые и команда из США. Именно так, российским биологам удалось пережить, тяжелые годы для отечественной науки. Также за это время они получили более 10 патентов и закупили оборудование для комплексной лабораторию в ИМБ. 6 Право на использование технологии отечественного биочипа купили компании Motorola и НР, а затем зарегистрировали свой патент на модифицированную технологию [4]. Технология микрочипов – это принципиально новый уровень лабораторных исследований, так как она позволяет проводить одновременное тестирование тысяч образцов. Тысячи молекул ДНК или белков помещаются на стеклянные пластинки для создания ДНК- и белковых чипов соответственно. Биочип составляет крошечную пластинку – платформу, на которую можно нанести до нескольких тысяч микротестов. Чаще используют стеклянные или пластиковые платформы, на которые наносят биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе. Биочип – матрица с нанесёнными молекулами для одновременного проведения большого числа анализов в одном образце; или электронное устройство, содержащее биологические молекулы. Биологические микрочипы широко используются в in vitro диагностике. В основе механизма действия биочипов лежит молекулярное распознавание анализируемых молекул молекулами биополимерами, нанесёнными на чип. Это распознавание построено либо на взаимодействии рецепторов с лигандами (например, антител с антигенами), либо на гибридизации комплементарных цепей ДНК. В частности, разработаны биочипы, распознающие короткие олигонуклеотидные последовательности и позволяющие детектировать единичные мутации в генах. Наноразмерная длина олигонуклеотидов, нанесённых на микрочип, является одним из ключевых факторов, определяющих их высокую эффективность и специфичность [11]. Что же такое биочип? Технологически биочип представляет собой специальный носитель (небольшую пластинку) – матрицу, как упоминалось ранее. Чаще всего она сделана из стекла или пластика (иногда используют и другие материалы) на которой в строго определенном порядке размещены 7 ячейки, на каждой из которых закреплены (иммобилизованы) олигонуклеотиды (последовательности нуклеотидов ограниченной длины). Длина самих олигонуклеотидов (олигозондов) во всех ячейках одинаковая, отличаются они лишь разным сочетанием последовательностей нуклеотидов. На пластине размером в 1 кв. см может быть размещено до миллиона таких ячеек. Принцип работы ДНК биочипа сравнительно прост и основан на принципе комплементарности оснований (нуклеотид аденин образует пару только с нуклеотидом тимин, а гуанин с цитозином в двухцепочечной ДНК) образовывать химические связи. Выделенная ДНК (РНК) исследуемого материала амплифицируется в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и по ходу реакции ПЦР фрагменты метятся флуоресцентным красителем. Получается огромный набор маркированных фрагментов, являющихся составными частями исходной ДНК (РНК). Эта смесь наносится на все ячейки чипа и идет процесс гибридизации (связывания комплементарных оснований) фрагмента ДНК с олигозондом. Если в наборе имеются фрагменты ДНК (РНК), комплементарные закрепленным на ячейке олигозондам, то между ними образуется связь и при отмывании эти фрагменты не смоются, а не связавшиеся – смываются. Затем такой чип помещается под флуоресцентный микроскоп, где по флуоресцентному сигналу связавшихся фрагментов ДНК определяется генетический состав проб. Носителем этой информации являются интенсивность и цвет меченой пробы. Следовательно, зная структуру олигонуклеотидов, закрепленных на ячейке и однозначность образования комплементарных пар, можно сделать вывод о составе фрагмента исследуемой ДНК (РНК). Это общая универсальная схема механизма действия биочипов, но уже сегодня существует и работает огромное количество технологических модификаций микрочипов – ДНК, белковые, клеточные, экспрессионные, в которых используются разные типы носителей чипов – стеклянные, гелевые, кремниевые, пластиковые, пористые мембраны. Есть уже множество областей биологии и медицины, где применяются биочипы: в молекулярной биологии – для быстрого секвениро- 8 вания геномов и генов, выявления точечных мутации, экспрессии генов; в медицине – для выявления онкогенов, мутации наследственных болезней, генов предрасположенности к соматическим болезням; в молекулярной диагностике – для идентификации и типирования патогенных микроорганизмов в клинических образцах и окружающей среде, подбора подходящего донора при пересадке органов; в фармакогенетике – для выявления генетических и белковых маркеров, контролирующих метаболизм лекарств, генов, ответственных за устойчивость к лекарствам и ксенобиотикам [29]. Спектр областей использования биочипов с каждым годом расширяется, и круг проблемных направлений в ближайшие годы будет фокусироваться в основном, как видим, на здоровье человека. История развития биочиповых технологий охватывает небольшой период времени. В конце 1980 х гг., когда началось обсуждение глобального проекта «Геном человека», в нескольких лабораториях практически одновременно возникла идея секвенирования (расшифровки последовательного расположения нуклеотидных оснований в геномах живых систем) с помощью гибридизации. Технологических вариантов реализации этой идеи было несколько, и первыми здесь были югославские исследователи Дрманач и Чрквеняков, которые в 1987 г. запатентовали свой подход по этой проблеме. Они предложили иммобилизовать на твердую поверхность анализируемую ДНК и проводить ряд последовательных гибридизаций с комплементарными олигонуклеотидными зондами. Каждый раунд гибридизации должен был выявлять фрагменты, где содержалась соответствующая последовательность [1]. 1.2. Виды и функции биочипов В зависимости от природы молекул выделяют виды биологических микрочипов, ориентированные на различные цели. Основная доля современных биочипов приходится на ДНК-чипы (94%) и белковые чипы (6%). Устройство позволяет за короткое время определить несколько тысяч аллер- 9 генов, онкогенов, различных биологически активных веществ и даже генетические дефекты. Биологические микрочипы, технологии производства и внедрения которых активно развиваются в России и за рубежом, являются сильнейшими из существующих инструментов для выявления и идентификации биологических материалов. В основе применения таких микрочипов лежит принцип быстрого определения взаимодействий тех или иных лигандов со множеством различных зондов одновременно. Собственно, биологические микрочипы представляют собой ту или иную твердую подложку, на которую нанесены или определенные фрагменты нуклеиновых кислот, или белки, или углеводы, или какие-либо иные молекулы-зонды, способные быть узнанными или проявлять биологическую активность. Количество различных зондов на подложке может достигать сотен тысяч, причем чипы каждого типа, строго идентичны и при существующих технологиях могут быть реплицированы в сотнях тысяч и миллионах копий, нанесенных на подложку. К главным причинам широкого распространения биочиповых исследований относят высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простоту процедуры выполнения, возможность одновременного анализа множества параметров и относительно невысокую стоимость работ. Эти же причины заставляют рассматривать биочипы как перспективный инструмент в различных областях народного хозяйства. Биочипы применяются для обнаружения бактериальных и вирусных контаминаций в продуктах питания, косметике и окружающей среде, выявления генно-модифицированных организмов в пищевых продуктах, диагностики и прогнозирования различных заболеваний, детекции особо опасных инфекционных агентов в антибиотеррористических целях и др. [25]. 10 ДНК-микрочипы. ДНК–чипы представляют собой уникальный аналитический инструмент, позволяющий определять наличие в анализируемом образце (как правило, биологического происхождения) заданных последовательностей ДНК (т.н. гибридизационный анализ). Проведение анализа с помощью ДНК- чипов обходится в несколько раз дешевле, чем при использовании альтернативных технологий (электрофорез, ПЦР в реальном времени) и допускает, при наличии детектора несложной конструкции, работу вне лаборатории. Впервые ДНК-чипы были использованы в исследованиях в конце 80-х годов прошлого века. В основе этого теперь уже широко распространенного метода, позволяющего одновременно анализировать экспрессию множества генов, лежит принцип узнавания мРНК-овых или кДНК-овых мишеней посредством их гибридизации с иммобилизованными на микрочипе одноцепочечными фрагментами ДНК. ДНК - чип представляет собой твердую подложку, на которой иммобилизованы (как правило, ковалентно) однонитевые фрагменты ДНК разной длины: короткие – 15-25 нуклеотидов, длинные – 25-60 нуклеотидов и кДНК фрагменты – от 100 до 3000 нуклеотидов. В качестве материала подложки используют стекло, кремний, различные полимеры, гидрогели (например, на основе полиакриламида) и даже золото. Наиболее распространенные подложки – из стекла [28]. Белковые и пептидные чипы. Для анализа продуктов трансляции генов используют чипы, построенных на основе полипептидов. Большинство лекарственных мишеней являются белками, следовательно, белковые и пептидные чипы могут быть полезны для поиска новых лекарств. Белковые микрочипы могут оказаться чрезвычайно полезными в медицине в качестве миниатюрных аналитических систем для определения иммунного статуса организма, выявления аллергической сенсибилизации и идентификации специфических аллергенов. 11 Микрочипы, представляющие собрание основных антигенов главных патогенных организмов (бактерии, грибы и вирусы), позволяют анализировать образцы крови на присутствие одновременно сотен, тысяч антител и быстро идентифицировать инфекции. Большое значение в развитии белковых микрочипов имеют способы регистрации сигналов. К ним относятся: самый первый из известных методов – РИА (радиоиммунологический анализ), применяющий радиоактивную метку, иммуноанализ с использованием флуоресцентных меток – ФИА и иммуноферментный анализ (ИФА), в котором меткой является молекула фермента, ковалентно связанная с молекулой антитела. В качестве меток в ИФА выбираются высокоактивные стабильные ферменты (щелочная фосфатаза, пероксидаза и др.) [27]. Преимуществом ИФА является возможность многократного усиления сигнала. В последние годы разработаны чувствительные системы субстратов, дающих нерастворимые флуоресцирующие продукты, например, ELF-97. Очевидно, что процесс изготовления белкового микрочипа должен включать процедуру закрепления, иммобилизации на микрочипе. Выбор метода определяется многими параметрами – природой исходного субстрата, последующей областью применения микрочипа и т.д. Белковые микрочипы активно применяются, прежде всего, для анализа всех известных (и доступных) биологических жидкостей, включая сыворотку/плазму крови, мочу, цереброспинальную жидкость, слюну, слезную жидкость, амниотическую жидкость, и др. Углеводные микрочипы. Многие природные биомолекулы (белки, липиды) модифицированы сахарными остатками. Часто биологические процессы включают связывание сахаров с рецепторами, и микрочипы могут стать важным инструментом в исследовании таких взаимодействий. Гликолипиды, нанесенные на нитроцеллюлозу или поливинилиденфторид, представляют пример углеводных микрочипов. Эти гликолипиды взаимодействуют с белками с известной углевод-связывающей специфичностью для подтверждения предсказанных оли- 12 госахарид-белковых взаимодействий. Связывание углеводов с мембранами регистрируют с помощью флуоресцентно меченых гликолипидов. Углеводный состав связавшегося компонента определяют in situ масс- спектрометрически. Важно отметить, что олигосахариды, связанные с липидом, могут иметь различное происхождение, например, гликопротеины, протеогликаны, гликолипиды, целые клетки и синтетические олигосахариды. Таким образом, по взаимодействию олигосахаридов, последовательность которых известна, с мембраной могут быть идентифицированы конкретные связанные с сахарами белковые мотивы. И, наоборот, путем связывания неизвестных олигосахаридов с мембраной можно отобрать белки с известной структурой, чтобы определить, с какими олигосахаридами они связаны. Тканевые микрочипы. Данные по анализу экспрессии генов только начинают давать нам важную информацию о биологической функции генов, их потенциальном клиническом влиянии или их пригодности в качестве мишени для лекарства. В то же время традиционный гистологический анализ образцов ткани требует больших затрат времени: ткани выдерживают в формалине, помещают в парафин, делают срезы и только затем красят и проводят микроскопический анализ на индивидуальных стеклах. В 1998 году для такого анализа впервые были изготовлены тканевые микрочипы посредством нанесения на одну подложку многих образцов ткани. Изготовление микрочипа включает объединение до тысячи иголочных биопсий, взятых из помещенных в парафин образцов ткани, в парафиновом блоке с определенными координатами. Из этого блока делается до 300 срезов, которые переносятся на стекло для прокрашивания и анализа. Таким образом, из одного блока может быть произведено до 300 тысяч анализов. При этом такой способ вызывает минимальное повреждение ткани. Приготовленные один раз, микрочипы могут быть испытаны на взаимодействие с различными молекулярными мишенями – ДНК, РНК или бел- 13 ками – в сотнях или даже тысячах образцов ткани. Принципиальное отличие тканевых чипов от, например, ДНК- чипов заключается в том, что в последнем случае определяется экспрессия тысяч генов в одной ткани/образце, тогда как в первом – один ген в тысяче различных тканей/образцов. Преимущество анализа с использованием тканевых микрочипов состоит в том, что все образцы ткани обрабатываются одинаковым способом, т.е. концентрации реагентов, время инкубации, температура и состав растворов неизменны. При этом для анализа требуется всего десятые или сотые доли миллилитра реагентов. Тканевые микрочипы довольно активно используются для поиска маркеров, ассоциированных с теми или иными заболеваниями, в первую очередь, с онкологическими. Показаны примеры успешного применения тканевых чипов для анализа аутоиммунных заболеваний, сердечной недостаточности, диабета и нейродегенеративных патологий [2]. 14 Глава 2. Анализ использования биочипов в лабораторной диагностике 2.1. Биочипы – настоящее и будущее клинической лабораторной диагностики Открытие функционального значения тысяч генов и молекулярных механизмов действия множества ферментов стало революционным событием в биологии, оказавшим и продолжающим оказывать огромное влияние на развитие медицины XXI в.в. Перед учеными и медиками открылись уникальные возможности для выяснения причин многих инфекционных и наследственных заболеваний, а также разработки эффективных методов их лечения. В свою очередь, развитие новых диагностических методов потребовало и создания новых технологий многопараметрического анализа биологических образцов, с помощью которых можно одновременно исследовать множество белковых и ДНК-маркеров различных заболеваний, функциональнозначимых биологических макромолекул и их комплексов. Так появилась технология биологических микрочипов, способных, подобно микрочипам электронным, извлекать и обрабатывать огромные массивы информации из одного небольшого образца биологического материала, полученного от конкретного пациента [18]. За последние десятилетия был накоплен огромный объем знаний о молекулярных основах биохимических процессов в живых организмах. Это дало возможность не только точно диагностировать то или иное заболевание, но и оценить вероятность его возникновения еще до проявления у пациента клинических симптомов, а также подобрать эффективную терапию. Подавляющую часть такой информации получают с помощью лабораторной диагностики, на которую в мире ежегодно расходуется свыше 100 млрд долларов. В России в 1970 г. она насчитывала 81 биохимический / молекулярный тест, в 2000 г. – 170, а сегодня число тестов измеряется тысячами. Большинство важнейших современных методов молекулярной диагностики основано на анализе данных, полученных при исследовании структуры 15 геномов человека и микроорганизмов. В первую очередь речь идет о полимеразной цепной реакции (ПЦР). Обычно ДНК содержится в образцах в минимальных количествах, однако с помощью ПЦР можно в миллионы раз «размножить» в исследуемой пробе биоматериала определенные фрагменты этих макромолекул. «Мишенями» могут служить бактериальные или вирусные гены, генетические маркеры раковых опухолей и т. п. С помощью этого метода можно определить наличие, к примеру, возбудителя болезни, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул его ДНК. Однако возможности методов, базирующихся на ПЦР, ограничены в случае, когда речь идет об одновременном анализе десятков и сотен различных биомаркеров. И здесь на первый план выходит уже успешно зарекомендовавшая себя технология биологических микрочипов (биочипов). Достоинство этой технологии в том, что тест проводится в формате «один образец – один реакционный объем биочипа», т. е. образец не нужно разделять на несколько частей и их отдельно анализировать. Такой формат намного повышает чувствительность анализа и снижает его трудоемкость и стоимость, что дает возможность клинико-диагностическим лабораториям тестировать десятки и сотни образцов за одну рабочую смену [26]. Сегодня ведущие научные журналы регулярно публикуют обзоры, посвященные биологическим микрочипам, которые производят многие десятки компаний, а объем продаж составляет сотни миллионов долларов в год. Вместе с тем сама идея создания биочипов родилась лишь четверть века назад, и одним из мест рождения этой технологии стал Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, Россия. С самого начала подход российских исследователей отличался удачным выбором ключевых технологических решений, благодаря которым технологии биочипов ИМБ РАН продолжают оставаться конкурентоспособными в мировой науке. Многие из этих подходов (например, замена радиоактивных меток на флуоресцентные, применение гидрогеля и элементов сферической формы) стали использовать в своей работе другие исследователи, 16 занимающиеся разработкой биочипов. А с 2000 г. в ИМБ РАН при поддержке Международного научно-технического центра начались работы по созданию биочипов для медицинской диагностики возбудителей социально значимых заболеваний. Главным элементом любого биочипа служит матрица из сотен и тысяч микроячеек, каждая из которых содержит так называемые молекулярные зонды – молекулы, способные специфично связываться только со строго определенными биологическими молекулами или их фрагментами. Зондами могут служить олигонуклеотиды, участки геномной ДНК, РНК, антитела, олигосахариды, различные низкомолекулярные соединения и др. Каждая ячейка биочипа служит своего рода отдельной «нанопробиркой», где иммобилизованный зонд распознает в анализируемом образце только свою мишень. Таким образом удается проводить параллельное распознавание сразу множества мишеней, например, генов, ответственных за лекарственную устойчивость возбудителя болезни. 2.2. Применение биочипов в лабораторной диагностике Биочипы в лабораторной диагностике применяются в онкологии, вирусной неонатологии, акушерстве и гинекологии, онкогематологии и др. Биочипы могут служить удобным инструментом при анализе различных генетических изменений, включая генетический полиморфизм, точечные мутации и некоторые хромосомные перестройки [3]. Так, продемонстрирована эффективность практического применения биочипов тест-системы ПФ-биочип для анализа полиморфизма в генах системы биотрансформации, участвующих в метаболизме ксенобиотиков (лекарственные препараты, канцерогены, продукты питания и т.д.), в гене NAT2 и генах ренин-ангиотензиновой системы, участвующих в регуляции кровяного давления. 17 Эта диагностическая тест-система зарегистрирована в Росздравнадзоре (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/5317-06 от 28 декабря 2006 г.) и разрешена к применению в клинической диагностике. ПФ-биочип используется в ФГБНУ «НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта» (СанктПетербург, Росиия) и ФГАУ «Научный центр здоровья детей» (Москва, Россия) для определения индивидуальной чувствительности к некоторым лекарственным препаратам, в том числе, тиопуринам, а также риска развития некоторых многофакторных заболеваний и составления генетического паспорта [5]. Использование технологии ДНК-микрочипов позволило идентифицировать ключевые гены, связанные с предрасположенностью к возникновению рака желудка. Были проведены масштабные исследования по изучению геномов пациентов с различными заболеваниями: атеросклероз, ожирение, диабет, рак легких и простаты, сердечно-сосудистые заболевания, астма, хронические заболевания легких, болезнь Альцгеймера и многие другие [23]. Разработана микрочиповая нанотехнология ClearRead (Nanosphere) с применением наночастиц золота для исследования однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), которая может использоваться для анализа ДНК человека, полученной из образцов размером с каплю крови. Технология от Nanosphere позволяет быстро, просто и точно генотипировать любые последовательности ДНК на наличие ОНП для выявления генетических заболеваний, предрасположенности к мультифакторным болезням, а также для прогнозирования метаболического ответа на фармакологические препараты [11]. Благодаря появлению ДНК- чипов появилась возможность проводить анализ мутаций во всех генах генома одновременно. Для анализа всех возможных мутаций во всех генах человека достаточно ДНК-чипа с количеством ячеек 100–200 млн, что технически достижимо. Современные ДНКмикрочипы могут выявить около миллиона мутаций. К настоящему моменту создан метод диагностики 13-ти транслокаций при острых и хронических лейкозах с использованием олигонуклеотидных 18 биочипов. Впервые в России определены частоты этих транслокаций у детей, больных лейкозом [10]. Диагностическая тест-система ЛК-биочип для анализа хромосомных транслокаций при лейкозах зарегистрирована в Росздравнадзоре (регистрационное удостоверение № ФС 01262006/4756-06 от 28 декабря 2006 г.) и разрешена к применению в клинической диагностике. В работе Т.В. Павловой впервые была представлена модифицированная технология сравнительной геномной гибридизации на Notl-микрочипах. Данная технология перспективна для масштабного скринирования структурных (деление и амплификация) и эпигеномных (метилирование) изменений в геномах опухолевых клеток. Информация об этих изменениях может служить предварительной базой для выявления потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста и наиболее перспективных опухолевых маркеров [6]. Наибольшие успехи в применении биочипов для классификации и прогноза течения заболеваний достигнуты в области онкологии, а именно, идентификации мутаций, вызывающих онкологические заболевания [14]. Национальным Институтом рака США проведено типирование 60-ти видов различных раковых клеток с использованием чипа, содержащего 9703 кДНК, и показано, что характер генетической экспрессии меняется в соответствии с происхождением ткани. Выявлено, что общий подход позволяет идентифицировать профиль транскрипции и классифицировать тип опухоли, а затем найти корреляции между этим типом и прогнозом течения заболевания [16]. Клиническое применение профилей транскрипции, получаемых с помощью биочипов, детально отработано для рака молочной железы [21]. Технология биочипов может помочь осуществить переход от массового лечения к персонализованной медицине (ПМ), главной задачей которой является поиск конкретного лекарства для конкретного пациента в соответствии с его генотипом [24]. Использование биочипов в ПМ можно проиллюстрировать на примере поиска вариаций числа генетических копий (CNV) у больных аутизмом и психозами с ранним началом в рамках проекта PsychCNVs [18]. 19 Возможность эффективного поиска редких вариабельных последовательностей появилась после разработки микрочипа HumanCNV370 (deCODE genetics), позволяющего выявлять десятки тысяч последовательностей ДНК, связанных с этими заболеваниями. Эта разработка, включающая в себя высокотехнологичное программное обеспечение, является одной из наиболее эффективных в мире для анализа вариабельных последовательностей ДНК. Описано применение биочипов для определения чувствительности раковых клеток к применяемым противораковым препаратам, что служит еще одним шагом к применению препаратов, эффективных именно для данного больного. ДНК-микрочипы позволяют диагностировать широкий спектр заболеваний, таких как шизофрения, склероз, ишемическая и неишемическая кардиомиопатии, болезнь Крона, ревматоидный артрит. Биочипы применяются в иммунодиагностике для обнаружения антигенов и антител к ним при инфекционных и аутоиммунных заболеваниях, а также для обнаружения биомаркеров, то есть веществ, наличие которых указывает на развитие какого-либо заболевания раньше, чем проявятся клинические признаки. Показана возможность одновременного количественного определения девяти онкомаркеров: альфа-фетопротеина, раково- эмбрионального антигена, хорионического гонадотропина человека, раковых антигенов СА125, СА15-3, СА19-9, двух форм простат-специфического антигена (ПСАобщ и ПСАсвоб). В работе А.В. Шишкина описано применение исследовательскодиагностического комплекса для изучения нормальных и опухолевых клеток крови на основе иммунобиочипов с возможностью одновременного проведения иммуноморфологических и иммуноцитохимических исследований клеток [9]. Этот комплекс пригоден для решения задач различного уровня сложности в лабораториях с разным уровнем оснащенности. 20 Была показана возможность использования биочипов в диагностике аутоимунных заболеваний, например, буллезного эпидермолиза, вульгарной пузырчатки (Pemphigus vulgaris) [17],[19]. Биочипы активно разрабатываются и применяются в вирусологии и микробиологии [13]. Показана эффективность применения биологических ДНК-микрочипов для этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы. Авторам удалось одновременно выявить и идентифицировать ДНК патогенных и условно-патогенных возбудителей острых кишечных инфекций: Shigella spp., Salmonella spp., Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis [1]. Ю.-Ч. Чанг (Yu-Ch. Chiang) и соавторами разработан биочип для определения пяти главных сероваров Salmonella (Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Hadar, Virchow) и показали возможность его использования для быстрого и надежного выявления клеток сальмонелл. Разработан биочип, позволяющий идентифицировать 15 вариантов гемагглютинина (Н1-Н15) и два варианта нейраминидазы (N1, N2) вируса гриппа А [8]. Процедура определения вирусного подтипа не требует выполнения предварительных стадий культивирования вируса, а результаты анализа могут быть получены в течение 10 ч. На выборке из 41-го образца были определены специфичность и чувствительность предложенного метода идентификации вирусного подтипа (100% и 76%, соответственно). Аналитическая чувствительность метода составила 10 ЭИДзо/мл. В этой работе было показано, что предложенный подход обладает высокой специфичностью и может использоваться для разработки ДНК микрочипов, нацеленных на генотипирование вирусов, характеризующихся высокой изменчивостью Необходимое оборудование установлено в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского в г. Москве и используется для определения этиологического агента эпизоотий и эпидемиологического мониторинга вирусов гриппа. Оценена возможность использования ДНК-микрочипов для быстрого определения наиболее распространенных β-лактамаз, плазмид-опосредованных 21 цефалоспориназ и карбапенемаз у Enterobacteriaceae, Pseudomonas и Acinetobacter [12]. Показана эффективность использования нового ДНК- чипа низкой плотности Check-MDR CT103 XL (Нидерланды) в определении наиболее значимых генов β-лактамаз – ESBLs (blaTEM, blaSHV, blaVEB и др.), pAmpCs (blaCMY-2-like, blaDHA, blaFOX и др.) и карбапенемаз (blaKPC, blaOXA-48, blaVIM и др.) в культуре бактерий. В 2011 году М.М. Уляшова продемонстрировала эффективность использования колориметрических ДНКмикрочипов для генотипирования β-лактамаз молекулярного класса А на основе определения ОНП кодирующих их генов [7]. Оптимизированы условия проведения гибридизационного анализа биотинилированной ДНК на микрочипах с колориметрической детекцией. Предел обнаружения биотинилированных олигонуклеотидов составил 0,025±0,005 нМ на микрочипах из стекла и 0,04±0,01 нМ на мембранных микрочипах. Апробация экспериментальной серии ДНК-микрочипов на 97ми клинических штаммах семейства Enterobacteriaceae показала 96%-ное совпадение с результатами ДНК-секвенирования. В.М. Михайловичем были разработаны тест-системы на основе олигонуклеотидных микрочипов. Эти тест-системы могут применяться для выявления штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к рифампицину и изониазиду, идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации его от близких видов рода Bacillus, идентификации ортопоксвирусов и возбудителей, вызывающих схожую с натуральной оспой клиническую картину, идентификации и количественного определения вирусов ВИЧ инфекции, гепатитов В и С в образцах донорской крови, обнаружения штаммов ВИЧ-1, устойчивых к ингибиторам вирусных протеаз, а также для определения субтипов вируса гриппа А. Представленные в работе подходы позволили рационально объединить преимущества чувствительных и эффективных ферментативных реакций и гибридизационного анализа с удобной и экономичной платформой биологи- 22 ческого микрочипа. В настоящее время четыре такие тест-системы прошли государственную сертификацию и применяются более чем в 20-ти научных и медицинских учреждениях. М.Дж. Хан (M.J. Khan) и его коллеги показали эффективность использования платформы ДНК-микрочипов (SMAvirusChip) для обнаружения смеси вирусов путем анализа четырех пулов: 1) вирусы из разных семейств, в том числе BSQV (Flaviviridae), MAYV (Togaviridae), PIRYV (Rhabdoviridae); 2) вирусы семейства Flavivirus (DENV-2, ROCV, SLEV); 3) четыре серотипа вируса денге (DENV-1(2,3,4); 4) вирусы, вызывавшие эпидемии в Бразилии (CHIKV, DENV-1, ZIKV). Проводятся исследования, направленные на разработку молекулярногенетических диагностических технологий в микологии на основе биочипов [15]. Биочипы позволяют определять грибковые патогены с высокой специфичностью и чувствительностью (15 пг/мл). Так, микрочип, основанный на технологии Arrayed-primer extension (APEX), может использоваться для анализа 24-х штаммов 10-ти видов патогенных грибов (в том числе кандиды, трихофитон и др.), включая дифференцированную диагностику близкородственных штаммов кандиды – C. Parapsilosis и C. orthopsilosis. Б.Спиесс (B.Spiess) с соавт. разработали метод, основанный на комбинации мультипраймерной ПЦР и гибридизации на биочипах, для анализа 14-ти грибковых патогенов в крови, бронхоальвиальном лаваже и образцах ткани пациентов с высоким риском иммунодефицитных состояний [22]. Исследования в ИМБ РАН показали, что биочип позволяет проводить эффективный количественный анализ пятнадцати белковых биотоксинов, бактериального и растительного происхождения одновременно: летального фактора и протективного антигена сибиреязвенного токсина, холерного и дифтерийного токсинов, термолабильного токсина из Е. coli, семи типов стафилококковых энтеротоксинов и двух типов ботулинических нейротоксинов (BNTA, BNTE). 23 Выводы Биологические чипы – это возможность проведения анализа здоровья больного не более чем за 24 часа. Они станут не только прекрасной экономией времени и денег для пациента, но и помогут даже всей медицине в стране сэкономить значительную часть бюджета. Внедрение данной технологии – это огромное вложение в медицинскую сферу и в экономию денежных средств страны. Есть даже официальные цифры, говорящие о том, что всего за год государство может разумно сэкономить 5 миллиардов рублей благодаря биочипам. Точнее всего сущность биочипов определяет их английское название – microarrays, – что означает «организованное размещение молекул на специальном носителе-платформе». В качестве платформы чаще всего используют пластинку из стекла или пластика (а иногда и из других материалов, например из кремния). В этом смысле чипы биологические близки к чипам электронным, которые изготовляются на кремниевых пластинах. Поскольку величина микрочипа, как правило, мала, – в его английском названии присутствует элемент micro. Тем не менее, несмотря на размер биочипа, на его площади можно разместить огромное количество различных молекул-зондов. После взаимодействия чипа с тестируемыми молекулами, информация, содержащаяся на этой площади, считывается с помощью специального устройства. Микрочиповая диагностика основана на установлении факта так называемого лиганд-рецепторного взаимодействия. Один из них – лиганд, или рецептор, – иммобилизуется на небольшой, но строго определенной, поверхности микрочипа, которую называют спот. Поверхность микрочипа в ряде случаев может быть структурирована, например, микроячейками (нанопланшеты) или микроэлектродами. На современном уровне диагностики основная доля производимых биочипов – ДНК-чипы. Они способны анализировать так называемые линей- 24 ные молекулы: ДНК и РНК, к примеру, находить мутации в генах, сравнивая «больные» и «здоровые» ДНК, или отлавливать вирусные и бактериальные ДНК. Белковые чипы появились сравнительно недавно, с их помощью анализируют более сложные по форме, чем ДНК, различные белковые молекулы – антитела, антигены, гормоны, аллергены и т.п Технология микрочипов открывает возможности и для точной идентификации пищевых патогенных микроорганизмов, что находит применение при оценке безопасности и качества пищевых продуктов [20]. Также это позволяет определять остаточные количества ветеринарных препаратов в животноводческой продукции, наличие остаточных количеств пестицидов и других вредных веществ в растительной продукции. Технология ДНК-микрочипов может применяться и в селекции растений, позволяя ускорять процессы создания новых сортов сельскохозяйственных культур, отличающихся высокой продуктивностью и устойчивостью к болезням, вредителям и абиотическим стрессовым факторам среды. Генномодифицированные сорта сои и кукурузы также могут быть выявлены с помощью олигонуклеотидных микрочипов с высокой плотностью. Уже созданы биочипы для выявления генов, ассоциированных с качественными характеристиками мяса крупного рогатого скота (КРС), а также биочипы для контроля происхождения животных. Эти биочипы позволяют выявлять однонуклеотидный полиморфизм по 20 тыс. сайтов в различных участках геномов КРС молочных и мясных пород и идентифицировать те мононуклеотидные замены, которые связаны с желательным проявлением характеристик продуктивности. Разработанные методы с использованием микрочипов могут успешно применяться и для идентификации вирусов, вызывающих эпизоотию среди животных. Многие биологические микрочипы используют также в криминалистике для экспресс-ДНК-дактилоскопии за пределами лаборатории, определения цвета глаз с точностью 94%, а также для идентификации личности. К примеру, создан биологический микрочип (ИЛ-биочип), который помогает сузить 25 круг подозреваемых или опознать тела погибших. При этом ИЛ-биочип позволяет определять группу крови АВО (заменяет серологический анализ крови) и пол индивида [4]. Таким образом, в настоящее время технология биологических микрочипов может быть использована и используется для решения широкого круга задач в разных областях исследований и диагностики. Все также продолжаются исследования, нацеленные на совершенствование биочипов и расширение областей их применения. В ближайшем будущем использование новейших технологий биочипов способно заменить многие диагностические лаборатории с многочисленным штатом и дорогим оборудованием, при этом повышая в десятки раз, производительность и значительно снижая себестоимость всех проведенных анализов. 26 Список использованных источников 1. Айвазян С. Р. Применение биологических ДНКмикрочипов в этиологической верификации острых кишечных инфекций бактериальной природы: Автореф. дис… канд. мед. наук. Москва, 2009. 25 c. 2. Голимбет В. Е., Корень Е. В. Вариации числа копий в геноме – новая страница в генетических исследованиях в области психиатрии: международный проект PsychCNVs. Москва: Клиническая психиатрия, 2010. Т. 110. № 1. С. 107–109. 3. Зубцова Ж. И. Анализ девяти серологических онкомаркеров на гидрогелевом биочипе: Автореф. дис. канд. физ.-мат. наук. Москва, 2010. 25 c. 4. Мирзабеков А. Д. Биочипы в биологии и медицине XXI века // Вестник Российской академии наук. 2003. Т. 73. № 5 С. 412. 5. Наседкина Т. В. Анализ генетических изменений у человека в норме и при различных заболеваниях с использованием биочипов: Автореф. дис. докт. биол. наук. Москва, 2009. 50 c. 6. Павлова Т. В. Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах: Автореф. дис. канд. биол. наук. Москва, 2009. 25 c. 7. Уляшова М. М. ДНК-микрочипы для генотипирования беталактамаз молекулярного класса А: Автореф. дис. канд. хим. наук. Москва, 2011. 25 c. 8. Фесенко Е. Е. Изучение вариабельности генов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа A на специализированном биологическом микрочипе: Автореф. дис. канд. биол. наук. Пущино, 2009. 26 c. 9. Шишкин А. В. Разработка и применение исследовательско- диагностического комплекса для изучения клеток крови на основе иммунологических биочипов: Автореф. дис. докт. мед. наук. СПб, 2012. 50 c. 27 10. Шляпников Ю. М. Разработка методов иммобилизации и детекции фрагментов ДНК на микрочипах: Автореф. дис. канд хим. наук. Москва, 2010. 24 c. 11. Щербо С. Н., Щербо Д. С. Лабораторная медицина как основа персонализированной медицины. Применение биочипов в медицине // Клинич. лабор. диагн. 2014. № 5. С. 4–11. 12. Bogaerts P. et al. Evaluation of a DNA Microarray for Rapid Detection of the Most Prevalent Extended-Spectrum β-Lactamases, Plasmid-Mediated Cephalosporinases and Carbapenemases in Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter // Int J Antimicrob Agents. 2016. Vol. 48(2). Pp. 189–193. 13. Chiang Y-Ch., Wang H-H., Ramireddy L., Chen H-Y., Shin C-M., Lin C-K., Tsen H-Y. Designing a biochip following multiplex polymerase chain reaction for the detection of Salmonella serovars Typhimurium, Enteritidis, Infantis, Hadar, and Virchow in poultry products // Journal of food and drug analysis. 2017. V.26. Pp. 58–66. 14. Gonzalez-Angulo A. M., Hennessy B. T., Mills G. B. Future of personalized medicine in oncology: a systems biology approach // J. Clin. Oncol. 2010. № 28. Pp. 2777–2783. 15. Khan M. J., Trabuco A. C., Alfonso H. L., Figueiredo M. L., Batista W. C., Badra S. J., Figueiredo L. T., Lavrador M. A., Aquino V. H. DNA Microarray Platform for Detection and Surveillance of Viruses Transmitted by Small Mammals and Arthropods // J. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2016. Vol. 10. Pp. 5017. 16. Lu J., Getz G., Miska E. A. MicroRNA expression profiles classify human cancers // Nature. 2005. Vol. 435, № 7. Pp. 834–838. 17. Marzano A. V., Cozzani E. The use of Biochip immunofluorescence microscopy for the serological diagnosis of epidermolysis bullosa acquisita //Arch Dermatol Res. 2016. Vol. 308, № 4. Pp. 273–276. 18. Quackenbush J. Microarray analysis and tumor classification // N.Engl. J. Med. 2006. Vol. 354, № 23. Pp. 2463–2472. 28 19. Russo I., Saponeri A., Michelotto A. Salivary Samples for the Diagnosis of Pemphigus vulgaris Using the BIOCHIP Approach: a Pilot Study // In vivo. 2017. № 31. Pp. 97–100. 20. Shin H. H., Hwang B. H., Cha H. J. Multiplex 16S rRNA-derived genobiochip for detection of 16 bacterial pathogens from contaminated foods // Biotechnol. J. 2016. № 11. Pp. 1–10. 21. Sotiriou C., Piccart M. Taking gene-expression profiing to the clinic:when will molecular signatures become relevant to patient care? // J. Nat. Rev. Cancer. 2007. № 7. Pp. 545–553. 22. Spiess B., Seifarth W., Hummel M. et al. DNA microarray based detection and identification of fungal pathogens in clinical samples from neutropenic patients // J. Clin. Microbiol. 2007. Vol. 45, № 11. Pp. 3743–3753. 23. Sun H. Identification of key genes associated with gastric cancer based on DNA microarray data // Oncology Letters. 2016. № 11. Pp. 525–530. 24. Yu X., Schneiderhan-Marra N., Joos T.O. Protein Microarrays for Personalized Medicine // Clinical Chemistry. 2010. Vol. 56, № 3. Pp. 376–387. 25. Биологические микрочипы (биочипы). Виды. URL: http://biofile.ru/bio/5209.html (дата обращения 20.01.2019). 26. Биочипы — высокие технологии в медицинской диагностике. URL: https://elementy.ru/nauchnopopulyarnaya_biblioteka/433812/Biochipy_vysokie_te khnologii_v_meditsinskoy_diagnostike (дата обращения 10.02.2019). 27. Биочипы: общие сведения. URL: http://humbio.ru/humbio/vir3pdd/00 002f7e.htm (дата обращения10.02.2019). 28. Биочип (биологический микрочип).Словарь. URL: http://vetconsultpl us.ru/%D0%91/Biochip Biologicheskij-mikrochip-Biologicheskij-chip.html (дата обращения 19.02.2019). 29. Внедрение биологических чипов. URL: https://elementy.ru/nauchnopopu- lyarnaya_biblioteka/433812/ Biochipy_vysokie _tekhnologii_v_meditsinskoy_diagnostike (дата обращения 03.04.2019).
