Экспресс-тест для выявления туберкулеза

TB-Spot ver.2.0
(тест-гребенка)
Быстрый серодиагностический тест для выявления туберкулеза.
Код: № 25987
(24 теста)
№ 25987А (96 тестов)
(тест для выявления антимикобактериальных антител как
дополнительное средство при диагностике активного туберкулеза)
Туберкулез является широко распространенным заболеванием, которое может приводить
к смертельному исходу. Туберкулез продолжает оставаться одной из главных проблем
здоровья в развивающихся странах, и даже во многих развитых странах наблюдается
относительный рост числа случаев заболевания туберкулезом. На настоящий момент в
мире отмечено 20 миллионов случаев этой болезни. Частота заболевания туберкулезом в
мире увеличивается на 0,4 % в год, ежегодно регистрируется 8,4 миллиона новых случаев
заболевания и 2 миллиона смертей. По возрастающей распространенности туберкулез
сравним со СПИДом и был объявлен ВОЗ серьезной угрозой человечеству в глобальном
масштабе.
Туберкулез вызывается бактерией Mycobacterium tuberculosis, кислотоустойчивой
бациллой. Туберкулез является легочной инфекцией, но фактически он может поразить
любой орган тела. Быстрая и достоверная диагностика пациентов с подозрением на
туберкулез очень важна для раннего и успешного лечения с помощью имеющихся
химиотерапевтических средств. Недостаточная чувствительность анализа мазков,
неспецифичность радиологических результатов и туберкулиновых проб, длительность
культурального цикла и трудности диагностики детского туберкулеза и внелегочного
туберкулеза обусловили насущную необходимость применения иммунодиагностики
туберкулеза как удобного и относительно недорогого метода, результаты которого в
дополнение к клиническому обследованию будут полезны для постановки правильного
диагноза. Таким иммунодиагностическим методом и является тест TB-Spot ver.2.0.
ВВЕДЕНИЕ
Тест TB-Spot — это простой быстрый (20 минут) и надежный серодиагностический тест,
который может обнаруживать антимикобактериальные антитела в сыворотке, в плазме
или в цельной крови (с антикоагулянтом). Тест сочетает в себе конкурентноспособную
цену с хорошей чувствительностью и высокой специфичностью, что делает его полезным
при диагностике туберкулеза. Он является очень удобным для скрининга больных
активным туберкулезом. Тест TB-Spot использует два высокоочищенных антигена, что
обеспечивает максимальную чувствительность и одновременно хорошую специфичность.
Один из антигенов, используемых в этом тесте, — это липоарабиноманнан (ЛАМ). ЛАМ
является высокоиммуногенным липополисахаридом, присутствующим на клеточной
стенке всех представителей Mycobacteria и участвующим в иммунопатогенезе
туберкулеза.
Другой антиген, используемый в этом тесте, — это рекомбинантный антиген 38кДа
Mycobacterium tuberculosis. Известно, что этот антиген является самым важным антигеном
для серодиагностики туберкулеза. Он является уникальным белком, связанным с
заболеванием, который, как оказалось, полностью специфичен для представителей
совокупности Mycobacterium tuberculosis, которая включает в себя три родственных вида,
а именно M. tuberculosis, M. bovis и M. africanum.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Смесь из рекомбинантного белка молекулярной массы 38 кДА и высокоочищенного
ЛАМ, полученных из Mycobacterium tuberculosis, сорбирована в виде пятен на
пластиковые гребенки. Когда гребенка инкубируется в разбавленной сыворотке, плазме
или цельной крови (с антикоагулянтом), специфические антимикобактериальные
антитела, если таковые имеются, связываются с антигенами. Затем гребенка отмывается
от неспецифических антител и инкубируется в Коллоидном Золотом Сигнальном
Реагенте, частицы которого ассоциированы с Протеином А, который связывается
антимикобактериальными антителами, связавшимися в свою очередь с антигенами. В
итоге, если в образце присутствуют специфические антитела, то на том месте пластиковой
гребенки, где сорбирована смесь антигенов, появится окрашенное пятно. Тест так
откалиброван по чувствительности, что только в случае наличия активного туберкулеза
появится пятно, цвет которого будет таким же или более интенсивным, чем самое
слабоокрашенное положительное (+) пятно на гребенке-эталоне, которая прилагается к
набору в качестве ориентира при интерпретации результатов. О том, что результат
тестирования положителен, говорит появление фиолетово-красного пятна в «зоне
тестирования», а именно около кончика зубца гребенки, т.е. там, где была сорбирована
смесь антигенов. Встроенный контроль должен дать пятно в верхней части зубца в
«контрольной зоне», т.е. там, куда был нанесен Контрольный Реагент, выполняющий роль
производственного контроля. Фиолетово-красное пятно в «контрольной зоне» должно
появляться всегда независимо от того, имеются или нет противотуберкулезные антитела в
исследуемом образце. По появлению пятна в «контрольной зоне» можно также судить о
том, что образец был действительно добавлен в инкубационную смесь.
ОБРАЗЦЫ ДЛЯ АНАЛИЗА
В качестве образцов для анализа могут быть использованы цельная кровь (с
антикоагулянтом), плазма или сыворотка. При кратковременном хранении образцы могут
находиться при 2 – 8оС. Однако для длительного хранения их следует держать в
замороженном состоянии при температуре –20оС или ниже. Цельная кровь не подлежит
длительному хранению. При необходимости от нее должна быть отделена плазма путем
центрифугирования и заморожена для длительного хранения. Не используйте образцы с
признаками гемолиза или образцы, чем-либо загрязненные.
СОСТАВ НАБОРА
Реагенты
1. Washing buffer (5×) — буфер для отмывки
2. Colloidal Gold Signal Reagent — Коллоидный Золотой Сигнальный Раствор
3. Sample Diluent —раствор для разбавления образцов
4. Negative Control — Отрицательный Контроль
5. Positive Control — Положительный Контроль
6. Antigen&Control Reagent Coated Comb — гребенка с сорбированными
Контрольным Реагентом и антигенами
Вспомогательные принадлежности
1. Резервуар для отмывки
2. Планшеты для микротестов
3. Закрывающийся пакет
4. Зажим
5. Клейкие полоски для заклеивания использованных ячеек планшеты
6. Гребенка-эталон
НЕОБХОДИМЫЕ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ/МАТЕРИАЛЫ,
НЕ ВХОДЯЩИЕ В СОСТАВ НАБОРА
1. Микропипетки (50 – 100 мкл) и одноразовые насадки
2. Мерный градуированный цилиндр объемом 100 мл
3. Дистиллированная вода
4. Таймер
5. Бумажные полотенца или другой мягкий абсорбирующий материал
6. Емкость для отходов и дезинфицирующее средство (5%-ный гипохлоритом натрия)
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ
Наборы необходимо хранить при 2 – 8оС. Все компоненты набора стабильны до срока
годности, указанного на упаковке. Перед тем, как вскрывать пакет с гребенкой, дайте ему
достичь комнатной температуры, чтобы избежать конденсации влаги на гребенке.
Неиспользованную часть гребенки можно сохранить в пакете, не забыв положить в пакет
мешочек с силикагелем во избежание увлажнения гребенки и плотно закрыв пакет с
помощью зажима, прилагаемого к набору. Однако, однажды вынутую из пакета гребенку
не следует использовать позднее одного месяца после вскрытия пакета. Разбавленный до
нужной концентрации буфер для отмывки остается стабильным при 2 – 8оС в течение
одной недели.
Предостережение: Все образцы для анализа должны считаться потенциально
инфицированными, и обращаться с ними надо осторожно. Сыворотки, используемые в
качестве Положительного Контроля и Отрицательного Контроля, инактивированы путем
тепловой обработки и проверены на ВИЧ, на вирус гепатита С и на поверхностный
антиген гепатита В (австралийский антиген). Тем не менее, со всеми образцами следует
обращаться, соблюдая общепринятые меры предосторожности.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ/ИНФОРМАЦИЯ О БИОБЕЗОПАСНОСТИ
1. После завершения работы вылейте остатки образцов, Контролей и буфера и вытряхните
жидкость из планшет в контейнер для биологически опасных отходов, специально для
этого находящийся под рукой, и перед тем, как контейнер выбросить, автоклавируйте его
в течение 1 часа при 121оС или обработайте 5%-ным гипохлоритом натрия в течение 30
минут.
2. Перед началом работы наденьте одноразовые перчатки, а после окончания работы, сняв
перчатки, тщательно вымойте руки.
3. Не курите, не принимайте пищу или напитки в месте, где идет работа с биологическими
образцами.
4. Избегайте разбрызгивания или пролития образцов.
5. Особое забота должна быть о том, чтобы уберечь реагенты от загрязнения микробами.
6. Не совмещайте при выполнеии кокретного теста гребенку и Коллоидный Золотой
Сигнальный Раствор из наборов, относящихся к разным партиям.
7. Тестирование проводите только на новых планшетах, а не на использованных ранее.
Когда работа с планшетом завершена, выплесните содержимое его ячеек в контейнер для
биологически опасных отходов и залепите опустевшие ячейки клейкими полосками,
прилагаемыми к каждому набору.
8. Не используйте реагенты с просроченным сроком годности.
9. Дистиллированная вода используется для разбавления только концентрированного
буфера для отмывки гребешков.
10. Закрывайте флакон с реагентом только крышкой от этого флакона.
11. Не суспендируйте растворы в ячейках планшеты пипеткой с помощью рта, обходитесь
для этой цели только манипуляциями с пипеткой.
ПОДГОТОВКА К ПРОВЕДЕНИЮ ТЕСТА
а) Приготовление буфера для отмывки гребешков.
Разбавьте концентрированный буфер для отмывки дистиллированной водой в объемном
соотношении 1:5. Для этого добавьте 12 мл концентрированного буфера к 48 мл
дистиллированной воды и осторожно перемешайте, избегая образования пены. Перелейте
приготовленный раствор в резервуар для отмывки, избегая при этом вспенивания
раствора. В каждых 60 мл этого раствора отмывайте не более 2 гребешков.
б) Общая информация.
1. Размешайте осторожно все реагенты перед тем, как их использовать.
2. Все реагенты за исключением буфера для отмывки находятся в виде, готовом к
употреблению.
3. При проведении каждого теста положено проводить анализ Положительного Контроля
и Отрицательного Контроля, которые всегда прилагаются к набору.
ХОД ВЫПОЛНЕНИЯ ТЕСТА
К моменту начала работы все растворы, гребенки и другие принадлежности должны
нагреться до комнатной температуры, а по окончании использования тотчас поставлены
обратно в холодильник.
1. Пронумеруйте исследуемые образцы, а также образцы Положительного Контроля и
Отрицательного Контроля в соответствии с номерами ячеек планшета, в которые они
будут помещены. Ячейки для образцов удобно выбирать в рядах, идущих через один друг
от друга (1, 3 и т.д.). Поместите в эти ячейки по 3 капли (150 мкл) раствора для
разбавления образцов.
2. В ячейки рядов (2, 4 и т.д.), расположенных под каждым из рядов с образцами,
поместите по 4 капли (200 мкл) Коллоидного Золотого Сигнального Реагента.
3. В ячейки с раствором для разбавления образцов добавьте по 50 мкл сыворотки, плазмы
или растворов Положительного Контроля и Отрицательного Контроля. Если используется
цельная кровь (с антикоагулянтом), то ее следует добавлять в количестве 75 мкл. Смесь в
каждой ячейке осторожно перемешайте, например, путем суспедирования с помощью
пипетки, т.е. несколько раз забирая в насадку пипетки содержимое ячейки и выпуская
обратно.
4. Выньте гребенку из пакета и на ее матовой стороне в местах над зубчиками напишите
соответствующие номера образцов.
5. Установите таймер на 6 минут и, повернув гребенку стороной с написанными номерами
к лицу, опустите гребенку в вертикальном положении зубцами вниз в первый ряд
планшета, содержащий 6 ячеек с разбавленными исследуемыми образцами и 2 ячейки с
разбавленными контрольными образцами. Включите таймер. В течение 6 минут
инкубации время от времени (8 – 10 раз) осторожно подвигайте гребенку взад-вперед.
6. По прошествии 6 минут инкубации выньте гребенку из ячеек и, прикоснув кончики
зубцов к разложенному на столе бумажному полотенцу или другому абсорбирующему
материалу, удалите излишки влаги с зубцов гребенки. Касайтесь полотенца только
самыми кончиками зубцов. Промойте зубцы гребенки в разбавленном буфере для
отмывки, для чего опустите зубцы гребенки в резервуар с буфером и 10 раз подвигайте
гребенку взад-вперед. Снова удалите излишнюю влагу с зубцов гребенки, прикоснувшись
их кончиками к абсорбенту.
7. Установите таймер на 10 минут, поместите зубцы гребенки в ячейки с Коллоидным
Золотым Сигнальным Реагентом и включите таймер. В течение 10 минут инкубации время
от времени (8 – 10 раз) осторожно подвигайте гребенку взад-вперед.
8. По прошествии 10 минут инкубации выньте гребенку из ячеек и промокните и
промойте его, как это описано в пункте 6.
Внимание: Разбавленный буфер для отмывки в резевуаре должен заменяться на свежий
после отмывки в нем двух гребенок.
9. Удалив излишки влаги с гребенки путем касания кончиков зубцов к бумажному
полотенцу, дайте гребенке высохнуть на воздухе. Для прочтения результатов положите
гребенку на горизонтальную поверхность, хорошо и равномерно осветите ее и
рассматривайте, глядя на нее в направлении, перпендикулярном к ее поверхности.
Ослепительный свет может затруднить интерпретацию, особенно в случае не ярко
выраженной положительной реакции. Сравните интенсивности окраски пятен,
получившихся в результате реакций во время теста, с окраской пятен на гребенке-эталоне,
прилагаемой к каждому набору.
Внимание: Слишком яркий свет, падающий на гребенку, или наклонно направленный
взгляд на поверхность гребенки могут затруднить интерпретацию результата. Если
рассматривать гребенку на белом фоне под освещением люминесцентной лампы, то это
облегчит интерпретацию.
КРИТЕРИИ КОНТРОЛЯ ЗА КАЧЕСТВОМ РАБОТЫ
Положительный и Отрицательный Контроли созданы для того, чтобы проверять
эксплутационные качества реагентов, входящих в состав конкретного набора.
Положительный Контроль должен всегда вызывать появление двух фиолетово-красных
пятен: в верхней части зубца в «контрольной области» и в нижней части в «зоне
тестирования».
Отрицательный Контроль должен всегда вызывать появление только одного фиолетовокрасного пятна в верхней части зубца в «контрольной области».
Каждый исследуемый образец должен всегда вызывать появление фиолетово-красного
пятна в верхней части зубца в «контрольной области», независимо от того имеет он статус
положительного или отрицательного результата.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Интерпретацию результатов теста TB-Spot ver.2.0 надо осуществлять с использованием
гребенки-эталона, прилагаемой к каждому набору.
Положительной реакцией считается реакция, которая привела к появлению пятна в
«зоне тестирования», чья окраска по интенсивности такая же или ярче, чем самое слабое
положительное (+) пятно на гребенке-эталоне.
Отрицательной реакцией является результат, если пятно имеет окраску менее
интенсивную, чем самое слабое положительное (+) пятно на гребенке-эталоне.
В пограничном случае, когда трудно с уверенностью отнести окраску пятна к
положительной или отрицательной реакции, рекомендуется повторить тест со свежим
образцом через 2 — 4 недели. В течение этого времени врачам следует собрать как можно
больше клинических данных, которые помогут сделать окончательный вывод о диагнозе.
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И СПЕЦИФИЧНОСТЬ
Тест TB-Spot ver.2.0 обладает в общем специфичностью 96.6%. Его чувствительность
составила 80 – 85% , а специфичность — 95% по сравнению с такими
иммунодиагностическими системами, как ELISA/PCR. Анализ использования антигена
ЛАМ для диагностики туберкулеза в США показал, что его чувствительность составляет
от 85% до 95%, специфичность — 100%, а показатели положительного и отрицательного
прогноза равны соответственно 52% и 98%. У некоторых больных активным
туберкулезом антимикобактериальные антитела не выявляются, и результаты теста для
них будут носить ложный отрицательный характер. Есть некоторые основания полагать,
что присутствие циркулирующих комплексов антиген-антитело может снизить
выявляемый титр антитела.
Следует отметить, что результаты теста TB-Spot ver.2.0 должны оцениваться вкупе со всей
доступной клинической информацией, включающей результаты анализа мазков,
результаты культивирования клеток, рентгеноскопию грудной клетки и клинические
симптомы такие, как лихорадка, недомогание, потеря веса, кашель и т.д.
ОГРАНИЧЕНИЯ
1. Здоровые инфицированные лица
Так как тест выявляет антимикобактериальные антитела, относящиеся к IgG, пациенты,
которые перенесли активный туберкулез в предыдущие несколько лет, могут после
выздоровления продолжать иметь повышенный титр антител.
2. Иммунологически «скомпрометированные» лица
Иммунологически «скомпрометированные» лица с пониженным значением CD4 Тлимфоцитов (как это бывает в определенных случаях у больных СПИДом) могут не
показать положительный результат в тесте TB-Spot ver.2.0, так как у них уровень
антимикобактериальных антител может быть ниже уровня, считающегося показательным
для активного туберкулеза.
3. Небугорковый активный микобактериоз
Реакция, полученная при использовании теста TB-Spot ver.2.0, может оказаться
положительной в случае активных микобактериальных заболеваний других, нежели
туберкулез. В общем нетуберкулезный микобактериоз случается редко за исключением
тех случаев, когда иммуная система подавлена; при таких обстоятельствах ответ антител
будет сниженным, и реакция, наблюдаемая в тесте TB-Spot ver.2.0, вероятно, будет
отрицательной. Больные проказой без туберкулеза дадут положительный результат в тесте
TB-Spot ver.2.0; однако, клинические проявления проказы достаточно сильно отличаются
от таковых при туберкулезе, чтобы внести путаницу. Таким образом, на практике для
пациента с симптомами, предполагающими наличие туберкулеза, положительная реакция
в тесте TB-Spot ver.2.0 является показателем активного туберкулеза.
КОМПЛЕКТАЦИЯ
Реагенты
Реагент-1. Washing buffer (5×)
Концентрированный буфер для отмывки
Реагент-2. Colloidal Gold Signal Reagent
Коллоидный Золотой Сигнальный Раствор
Реагент-3. Sample Diluent
Раствор для разбавления образцов
Реагент-4. Negative Control
Отрицательный Контроль
Реагент-5. Positive Control
Положительный Контроль
Реагент-6. Antigen&Control Reagent Coated Comb
гребенка с нанесенными Контрольным Реагентом
и антигенами
Принадлежности
Код № 25987
(24 теста)
Резервуар для отмывки
1
Планшеты
1
Закрывающийся пакет
1
Зажим
1
Клейкие полоски для заклеивания 1
использованных планшетов
Гребенка-эталон
1
Код № 2598 Код № 25987А
(24 теста)
(96 тестов)
1×100 мл
2×100 мл
1×6 мл
1×22 мл
1×6 мл
1×22 мл
1×0,5 мл
1×0,5 мл
1×0,5 мл
1×0,5 мл
3 пакетика
12 пакетиков
Код № 25987А
(96 тестов)
1
2
1
1
4
1
ССЫЛКИ
WHO report-2003 Global Tuberculosis Control-Surveillance, Planning, Financing:
WHO/CDS/TB/2003, 316.
Sepkowitz K.A., Raffall J., Riley L., Kiehn T.E. and Armstrong D. (1985) Tuberculosis in AIDS
era., Clin. Microbiol. Rev., 8: 180-199.
Reichman L.B. and Hershfield E.S. (1993) Tuberculosis, Marcel Dakker Inc., New York, USA.
Bhatia A.S., Kumar S. And Harinath B.C. (2003) Immunodiagnosis of Tuberculosis: an update.,
Indian J. Clin. Biochem., 18(2):1-5.
Andersen P., Munk M.E., Pollock J.M. and Doherty T.M. (2000) Specific Immune Based
Diagnosis of Tuberculosis., Lancet, 356: 1099-1104.
Chan E.D., Reves R., Belisle J.T., Brennan P.J. and Hann W.E. (2000) Diagnosis of tuberculosis
by a visually detectable immunoassay for lipoarabinomannaan., Am. J. Respir. Crit. Care Med.,
161(5): 1715-1719.
Espitia C., Cerveral I., Gonzalez R. And Mancilla R.A. (1989) 38kD Mycobacterium
tuberculosis antigen associated with infection: its isolation and serological evaluation., J. Exp.
Immunol., 77: 373-377.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ ТЕСТА
Реагенты нагреваются до комн. to,
отрезается часть гребенки с необходимым количеством зубцов и
зубцы нумеруются в соответствии с номерами исследуемых
и контрольных образцов.
Концентрированный буфер для отмывки разбавляется в 5 раз
3 капли раствора для разбавления образцов и
4 капли Коллоидного Золотого Сигнального Реагента
добавляются в соответствующие ячейки
Исследуемые и контрольные образцы добавляются в
ячейки, содержащие раствор для разбавления образцов.
Зубцы гребенки погружаются в соответствующие ячейки
и инкубируются 6 минут.
Гребенка отмывается от несвязавшихся антител.
Гребенка инкубируется в
Коллоидном Золотом Сигнальном Реагенте 10 минут.
Гребенка опять отмывается в разбавленном буфере,
чтобы удалить несвязавшиеся частицы
Коллоидного Золотого Сигнального Реагента.
Результаты оцениваются визуально после высыхания гребенки.
Два фиолетово-красных пятна являются положительным
результатом, указывающим на наличие активного туберкулеза.