Клиническая характеристика больных БАС

ФГБУ «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР НЕВРОЛОГИИ»
РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ БОКОВОГО
АМИОТРОФИЧЕСКОГО СКЛЕРОЗА:
З. А. Суслина, Б. С. Народицкий, В. З. Тарантул, С. Н. Иллариошкин,
М. Н. Захарова, И. А. Завалишин, М. М. Шмаров, А. Л. Гинцбург,
Н. П. Бочков
ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН,
Институт молекулярной генетики РАН,
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ
Москва, 2013
БАС – прогрессирующее
нейродегенеративное заболевание,
обусловленное избирательным
поражением периферических
мотонейронов передних рогов
спинного мозга и двигательных ядер
мозгового ствола, а также
центральных мотонейронов.
Заболевание проявляется
неуклонно нарастающими
парезами, мышечными атрофиями,
фасцикулляциями и пирамидным
синдромом
Стивен Хокинг
астрофизик
Спорадическая форма – 90-95% больных
Частота - 3-5 на 100000 населения
Возраст 55-60 лет
Соотношение мужчин и женщин 1,6:1
Семейная форма – 5-10% больных
Ювенильная форма – 10%
Западно-Тихоокеанская форма
(БАС + паркинсонизм + деменция)
Частота - в 100 раз чаще, чем спорадическая
Индукторы запрограммированной
клеточной гибели при БАС
Экзогенные
 Вирусы
 Токсины
Эндогенные
Мутации (Cu/Zn-СОД1, алсин)
Экзайтотоксичность
Окислительный стресс
Нарушение Са 2+ гомеостаза
Митохондриальная дисфункция
Конформационные изменения
белков и нарушения их
деградации
 Дефицит нейротрофических
факторов
 Нарушение структуры и функции
цитоскелетных белков и
аксонального транспорта






Описанные генетические локусы при БАС
Локус
Ген
ALS1
SOD1
Медь-цинксодержащая супероксиддисмутаза
ALS2
ALS2
Алсин
ALS3
Название гена
Не идентифицирован Не идентифицирован
ALS4
SETX
Сенатаксин
ALS5
SPAST
Спастин
ALS6
FUS
ALS7
Связанный со злокачественной липосаркомой
Не идентифицирован Не идентифицирован
Положение
21q22.11
2q33.2
18q21
9q34.13
2p24
16p11.2
20p13
ALS8
VAPB
Везикуло-ассоциированный мембранный белок
20q13.33
ALS9
ANG
Ангиогенин
14q11.1
ALS10
TARDBP
TAR-ДНК-связывающий белок
1p36.22
ALS11
FIG4
SAC-домен-содержащий белок
6q21
ALS12
OPTN
Оптиневрин
10p13
ALS13
ATXN2
Атаксин-2
ALS14
VCP
ALS15
UBQLN2
Убиквилин-2
ALS16
SIGMAR1
Неопиоидный внутриклеточный рецептор сигма-1
ALS17
CHMP2B
Хроматин модифицирующий белок 2В
3p11.2
ALS18
PFN1
Профилин-1
17p13.3
Валозин-содержащий белок
12q23-q24.1
9p13
Xp11.21
9p13
Подходы к разработке новых
методов терапии БАС
•
•
•
основываются на современных представлениях о
механизмах гибели мотонейрона
используются препараты, доказавшие свою
эффективность на различных природных и
трансгенных моделях болезни двигательного нейрона
у животных
при БАС могут быть эффективны и препараты,
которые с успехом уже применяются при других
нейродегенеративных заболеваниях (болезнь
Паркинсона, болезнь Альцгеймера, хорея Гентингтона,
прионные болезни)
Нейротрофические факторы,
регулирующие выживание
мотонейронов
•Нейротрофины (BDNF, NT-3, NT 4/5)
•Цитокины (CNTF, LIF, CT-1 (кардиотрофин-1))
•Трансформирующие ростковые факторы (GDNF,
neuroturin, persephin)
•Инсулиноподобные ростковые факторы (IGF-1, IGF-2)
•Гипоксия индуцибельные факторы (VEGF,
эритропоэтин, ангиогенин)
Особенности регуляции
выживания мотонейронов
1.
Синергизм действия НТФ (CNTF и IGF-1; CNTF
и BDNF; CNTF и LIF; GDNF и NT3, 4/5)
2.
Способность замещать друг друга
3.
Гетерогенность действия на различные
субпопуляции мотонейронов спинного мозга,
ядер черепно-мозговых нервов, двигательной
коры
VEGF (vascular endothelial growth factor) - фактор роста
эндотелия кровеносных сосудов, относящийся к новому
классу соединений - гипоксия индуцибельных
нейротрофических факторов.
•
•
•
•
В экспериментах на животных показано, что уменьшение
уровня VEGF приводит не только к снижению нейрональной
перфузии, но и к недостаточности VEGF опосредованной
нейропротекции
Делеция промоторного элемента, в гене VEGF,
определяющего реакцию на гипоксию (HRE) вызывает БДН у
мышей
Данная мутация приводит к избирательному снижению
VEGF в МН на 40%, при гипоксии - на 75%
Полиморфизмы в гене VEGF, приводящие к снижению его
экспрессии, повышают риск заболевания БАС в 1,8 раза
Снижение уровня VEGF в биологических жидкостях больных
БАС и корреляция с тяжестью заболевания
Ангиогенин (ANG)
• является ключевым фактором
•
•
регулирования ростковых факторов
ангиогенеза
функции ANG разнообразны и включают
стимуляцию процессов транскрипции и
трансляции белков, регуляцию биогенеза
рибосом, пролиферацию и рост
эндотелиальных клеток
частота встречаемости мутаций в гене
ANG у больных БАС 1,5%
Клинические испытания НТФ при БАС
(подкожное, внутримышечное,
интратекальное введение)
Положительные эффекты
• Замедление прогрессирования при в/м введении IGF-1
• Улучшение ЖЕЛ после в/м введения BDNF
Отрицательные эффекты
• Быстрая деградация пептидных молекул и,
соответственно, кратковременный эффект
• Низкая проницаемость через ГЭБ
• Выраженность периферических побочных эффектов
• Токсичность при введении больших доз
• Образование аутоантител к нейротрофическим
факторам
Свойства рекомбинантных
аденовирусов
Безопасность
• не вызывают вирусной инфекции;
• не встраиваются в геном клеток-мишеней;
• выводятся из организма в течение 4- 5
недель
Эффективность
• способны проникать в широкий спектр как
делящихся, так и неделящихся клеток;
• осуществляют высокоэффективную экспрессию
генов терапевтического вмешательства
Схема получения рекомбинантных аденовирусов
ДНК
аденовируса
Область А
Этап 1
Удаление
области А
(Область, ответственная
за размножение аденовируса)
Этап 2
VEGF
Вставка
целевого гена
Введение полученной
конструкции в клетки
Этап 3
клетки линии 293,
содержащие E1
область генома
аденовируса
сборка
рекомбинантных
вирусных
частиц
рекомбинантная
вирусная
частица
Ретроградная доставка генов в мотонейроны
спинного мозга рекомбинантными аденовирусными
векторами
Спинной мозг
Характеристика препарата АдеВаск™
Торговое название препарата:
АдеВаск™
Международное непатентованное название:
нет
Лекарственная форма:
раствор для внутримышечного введения, доза/3 мл.
Состав:
смесь (1:1) рекомбинантных псевдоаденовирусных
частиц, экспрессирующих гены фактора роста эндотелия
сосудов человека и ангиогенина человека, в суммарной
концентрации (7,0±1,4)х1011 частиц в 3 мл буферного
раствора.
Экспериментальная модель БАС
трансгенные мыши линии B6SJL-Tg(SOD1*G93A)dl1Gur/J (мыши
линии SOD1*G93A).
• экспрессируют мутантный ген Cu/Zn-супероксиддисмутазы
SOD1
• характеризуются прогрессирующей дегенерацией
мотонейронов,
• в возрасте 6–7 месяцев появляются первые клинические
признаки заболевания: парез и последующий паралич одной
или двух конечностей, с последующей генерализацией
• умирают через 4–6 недель после клинической манифестации
заболевания в возрасте около 8 месяцев
Дизайн исследования на
трансгенных животных
• Начало инъекций с 5-месячного возраста до конца
жизни
• Курс инъекций через каждые 2 недели
• Раствор вводился билатерально в разные группы
мышц передних, задних конечностей и спины (всего 6
групп); в каждой из указанных мышечных зон было по
5 точек введения, каждое введение – по 30 мкл
препарата или сравниваемого контрольного раствора
(в каждую группу мышц по 150 мкл, соответственно)
• общее количество вводимого препарата 0,9 мл
Экспрессия введенной генноинженерной
конструкции в спинальных мотонейронах
Экспрессия маркерного
белка GFP:
A – флюоресцентная
микроскопиия;
Б – иммуногистохимия.
Экспрессия гена VEGF (RT-PCR):
1 – поясничный отдел, 4-й день;
2 – поясничный отдел, 8-й день;
3 – грудной отдел, 8-й день.
1
2
3
Безопасность
• повторные инъекции не приводили к летальным
исходам и выбраковке экспериментальных
животных
• после введения препарата (сравниваемого
раствора) у животных не наблюдалось явных
признаков воспалительных, аллергических
реакций или проявлений системной интоксикации
• в экспериментальных группах не зафиксировано
каких-либо ассоциированных патологических
состояний, которые могли бы быть прямо или
косвенно связаны с введением рекомбинантного
препарата
Продолжительность жизни
экспериментальных животных
(дни)
Группа I Группа II Группа III Контроль
Самцы 260±18 276±25
258±17
252±10
Самки 271±15 269±19
272±14
256±18
Продолжительность жизни (самки)
Группы мышей (самки)
Контроль
Д1
Д2
Д3
120%
110%
Выживаемость мышей, в (%)
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
-10%
230
240
250
260
270
280
290
Продолжительность жизни (дни)
300
310
Продолжительность жизни (самцы)
Группы мышей (самцы)
Контроль
Д1
Д2
Д3
120%
110%
100%
Выживаемость, в (%)
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
-10%
220
240
260
280
300
Продолжительность жизни (дни)
320
340
Продолжительность жизни
270
Кумулятив ная доля в ыжив ших (Каплан-Мейер)
Зав ерш.
p < 0,05
Цензурир.
1,0
260
0,9
0,8
Кумулятивная доля выживших
250
240
230
220
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
p = 0,043
0,1
0,0
210
-0,1
100
200
200
300
400
500
Время
VEGF+ANG
Плацебо
600
700
800
VA
Плацебо
Оценка показателей двигательной
активности и неврологического статуса
Установка Opto-Varimex-3
("Columbus instruments", США)
Оценка неврологического
статуса: паралич задних
конечностей
Двигательная активность
*
*
* - статистически значимые различия между группами, p < 0,05
контроль
препарат
Цель исследования
Оценить безопасность и
переносимость AdV терапии с
введением генов VEGF 121 и
ANG у больных со
спорадической формой БАС
Критерии включения больных
в исследование:
•
•
•
•
•
•
•
Письменное информированное согласие
Мужчины и женщины в возрасте от 18 до 69 лет
Достоверный диагноз БАС, согласно международным
критериям El Escorial (1998)
Длительность заболевания не более 3-х лет
Значение по шкале ALSFRS не менее 30 баллов
ЖЕЛ не менее 70%
Женщины могут включаться в исследование при
следующих условиях:
- не обладающие репродуктивным потенциалом
- обладающие репродуктивным потенциалом с
отрицательным результатом теста мочи на беременность
во время скрининга при условии согласия постоянно
использовать один из указанных методов контрацепции
(ВМС, барьерные методы контрацепции)
Критерии исключения
• Пациенты, получавшие или получающие рилузол
• Пациенты с клинически значимыми изменениями лабораторных
показателей функции почек и печени
• Наличие онкологических заболеваний у пациентов
• Любое клинически значимое отклонение от нормы на ЭКГ,
зарегистрированное в любом из 12 отведениях
• Кормление грудью, беременные женщины или пациентки,
планирующие беременность
• Наличие сахарного диабета I-II типов
• Наркотическая и лекарственная зависимость, алкогольная
зависимость в течение последних 6 месяцев
• Пациенты, позитивные по гепатитам В, С или ВИЧ
• Участие в других клинических испытаниях
• Наличие у больных трахеостомы или гастростомы
• Высокий исходный уровень вируснейтрализующих антител
(>1:80)
Дизайн исследования
• Рандомизированное плацебо-контролируемое
исследование
• 50 больных спорадическим БАС (25 пациентов
получающих AdV VEGF+ANG, 25 получающих
плацебо)
• Введение препарата (или плацебо) внутримышечное в
3 мышцы (m.trapezius, m.deltoideus, m.quadriceps) с
каждой стороны каждые 3 недели
• Общая однократно вводимая доза препарата 1,2 мл,
содержащие 3х109БОЕ (бляшкообразующих единиц) (в
каждую мышцу по 0,2 мл)
• Количество визитов – 26 (в течение 18 месяцев)
Безопасность и переносимость
• Контроль за физиологическими
показателями (АД, ЧСС, t тела, масса
тела, ЭКГ)
• Контроль лабораторных данных
(клинический и биохимический анализы
крови, мочи, исследование
онкомаркёров)
• Оценка нежелательных явлений
(местных, системных, лабораторных
отклонений)
Оценка прогрессирования
заболевания
• Исследование жизненной ёмкости лёгких
(ЖЕЛ/ДЖЕЛ)
• Оценка по функциональной шкале
ALSFRSR
• Исследование мышечной силы с оценкой
по шкале ММТ (manual muscle test)
• Выживаемость больных БАС
Клиническая характеристика
больных БАС (n=50)
AdV
Плацебо
Пол, м:ж
1,5:1
1,3:1
Возраст, лет
41,8±4,1
52,0±10,8
Длительность
заболевания до
лечения, месяц
17,6 ±8,9
15,0 ±11,7
Клиническая характеристика
больных БАС (n=50)
Показатель
Медиана
Нижний
Верхний
квартиль
квартиль
ЖЕЛ (% от ДЖЕЛ)
86,0
79,8
99,9
Тяжесть заболевания
(ALSFRS)
39,0
34,0
42,0
Срок до
генерализации (мес)
7,5
4,0
14,0
Динамика нарастания неврологического
дефицита больных БАС (по шкале ALSFRSR)
*
Динамика изменений
ЖЕЛ у больных БАС
*
Динамика побочных эффектов у
пациентов групп AdvVEGF-ANG
*
*
* - статистически значимое отличие от визита 1 (p<0,05)
Заключение
• Лечение препаратом AdvVEGF+ANG
замедляет нарастание
неврологического дефицита у больных
БАС
• Лечение препаратом AdvVEGF+ANG
замедляет снижение жизненной
емкости легких у больных БАС.
• Во время исследования серьезных
нежелательных явлений не было