Разработка и применение новых методов пробоподготовки в

Разработка и применение
новых методов
пробоподготовки в ХТИ при
тестировании подростков в
Псковской области
Никитина Наталья Михайловна
врач-лаборант ГБУЗ «Наркологический
диспансер Псковской области»
Цель работы.
Разработка новых методических подходов в
химико-токсикологическом анализе
различных биологических объектов, в том
числе волос и срезов ногтевых пластин, и
оценка возможности их использования в
тестировании подростков на содержание
наркотических и психотропных веществ.
Разработка и применение новых методов пробоподготовки в ХТИ
при тестировании подростков в Псковской области
Научная новизна:
1. Предложен новый подход в методике пробоподготовки мочи и крови для
скринингового ГХ-МС анализа, обеспечивающий достоверность идентификации
наркотических и психоактивных веществ, а также охват максимально бòльшего
спектра анализируемых соединений, и особенно летучих компонентов пробы, за счет
совмещения технологических операций при пробоподготовке, а также сокращении
времени проведения анализа и уменьшении расхода реагентов необходимых для
проведения анализа.
2. Предложено и обосновано использование двойной экстракции кератиновых
структур.
3. Предложен новый алгоритм аналитических процедур для обнаружения в
сложных матрицах веществ кислотного, нейтрального, слабоосновного и основного
характера, используя минимальное количество биоматериала. Следуя данному
алгоритму, весь анализ заключается в проведении всего двух процедур: хромато-массспектрометрический анализ в режиме сканирования по характеристическим ионам
для обнаружения каннабиноидов и ГХ-МС скрининг на основные наркотические и
психотропные вещества в режиме сканирования по полному ионному току.
4. Исследованы методы изолирования аналитов из кератиновых структур и
предложены к использованию новые варианты, в частности использование ферментов
трипсин, пепсин, папаин и кератиназа.
5. Изучены способы проведения тестирования подростков. Разработан алгоритм
процедуры тестирования, наиболее комфортный для всех участников.
6. Предложено использование скринингового ГХ-МС анализа при организации
массовых и оперативных обследований, например при контроле подростков на
употребление наркотиков
Химико-токсикологическая
лаборатория Псковской области
• Тестирование проводилось в
2011-2013гг.
• общеобразовательные школы
г. Пскова и области
• вечерние школы
• профтехучилища
• высшие учебные заведения
По результатам первого года
тестирования наиболее
удобным был выбран вариант
проведения процедуры
тестирования с выездом
бригады в учебные заведения.
•
Разработка и применение новых методов пробоподготовки в
ХТИ при тестировании подростков в Псковской области
Вся процедура непосредственно
тестирования организована в
соответствии с Приказом МЗиСР
РФ №40 от 2006г. и включает в себя
следующие операции:
1) пробоотбор,
2) исследования мочи на предмет фальсификации,
3) предварительные исследования с
использованием групповых методов анализа на
наркотические и лекарственные вещества (ИХА),
4) подтверждающие исследования методом
газовой хроматографии с масс-селективным
детектированием – при получении
положительных результатов.
•
Разработка и применение новых методов пробоподготовки в
ХТИ при тестировании подростков в Псковской области
В процессе работы были выявлены
следующие варианты фальсификаций:
1) Подмена мочи.
2) Разбавление образца мочи.
3) Концентрирование мочи
4) Употребление продуктов, содержащих
аскорбиновую кислоту
5) Добавление инородных веществ в образец мочи.
При проведении тестов на фальсификацию мочи
необходимо учитывать возрастные физиологические
особенности молодого организма. Так, при не полностью
сформировавшейся функции клеточных мембран у
подростков возможно обнаружение белка в моче после
физических нагрузок.
•
Разработка и применение новых методов пробоподготовки в
ХТИ при тестировании подростков в Псковской области
Сравнительный анализ результатов
тестирования подростков Псковской области
2013 год
2012 год
0
10
20
30
40
50
60
70
80
2012 год
2013 год
Количество учащихся, давших
согласие на тестирование
89.2
87
«+» рез-т
0.1
0.3
Не протестировано из числа давших
согласие на момент проведения
тестирования
9.7
14.7
Количество учащихся, прошедших
тестирование, из числа давших
согласия
90.3
85.3
Количество учащихся, отказавшихся
от тестирования
10.8
13
% от количества человек целевой группы
90
100
Проведение скрининговых исследований методом
иммунохроматографии (ИХА)
Преимущества:
Недостатки:
• Простота метода (нет необходимости в
дополнительных реагентах и приборах,
все необходимые иммунореагенты для
анализа нанесены заранее на мембрану).
• Определение может быть проведено
неподготовленным персоналом в
нелабораторных условиях.
• Быстрота метода.
• Визуальная детекция результатов для
качественного или полуколичественного
анализа
• неселективность метода (групповые
реакции)
• чувствительность к изменениям
биохимических показателей мочи
(несрабатывание тест-полосок,
получение ложноотрицательных
результатов)
• кросс-реактивность (получение
ложноположительных результатов)
• ограниченное количество аналитов, на
которые разработаны наборы
Необходимость разработки скрининговых
методов анализа на основе экспертных
подтверждающих физико-химических
методов вызвана многообразием
химических соединений, которые при
определенных обстоятельствах могут
стать источником одурманивания и
отравлений. Круг этих веществ постоянно
расширяется по мере синтеза новых
соединений.
Комбинированный метод – хромато-масс-спектрометрия –
рассматривается как два раздельных метода, дающего возможность
использовать его не только в качестве скринингового, но и экспертного
подтверждающего .
С помощью хроматографии происходит разделение смеси на
отдельные компоненты. С помощью масс-спектрометрии проводят
обнаружение и количественное определение разделенных веществ
смеси.
•
Разработка и применение новых методов пробоподготовки в
ХТИ при тестировании подростков в Псковской области
Случай 1. Синтетические каннабимиметики
Cилильное производное метаболита синтетического каннабимиметика
РВ22F на хроматограмме, снятой в режиме полного сканирования,
идентифицированное по характеристическим ионам. Время удерживания
метаболита – 14.26 мин и его масс-спектр
Случаи, подтверждающие необходимость пересмотра
существующего алгоритма проведения тестирования
Случай 2. Баклофен
Хроматограмма, снятая в режиме полного сканирования, и производное
баклофена на ней, идентифицированное по характеристическим ионам.
Время удерживания баклофена – 10.4 мин и его масс-спектр
Случаи, подтверждающие необходимость пересмотра
существующего алгоритма проведения тестирования
Случай 3. Дицикломин (триган-Д)
Хроматограмма мочи, снятая в режиме полного сканирования, после
употребления таблеток «Триган Д». Время удерживания парацетамола –
10.2, дицикломина – 12.16. Масс-спектр дицикломина
Случаи, подтверждающие необходимость пересмотра
существующего алгоритма проведения тестирования
Оптимизация пробоподготовки мочи и
крови для скринингового ГХ-МС анализа
Карбонатный
буфер
Хлорид
натрия
бутилацетат
виала 2 мл
Исследуемый
образец
(моча, кровь)
Внутренний
стандарт
экстракция
центрифугирование
Закол в ГХ-МС
Аппаратура ГХ-МС. Agilent 7820/5975 с колонкой НР-5MS.
Условия анализа: газ-носитель гелий, скорость потока через колонку 2 мл/мин.
Программа: 500С(0.5мин) 990С /мин 1000С (1мин) 150С/мин 280 0С Объем
вводимой пробы - 1,0 мкл
Двойная экстракция волос и срезов
ногтевых пластин для скринингового ГХ-МС
анализа
II
I
биообъект
биообъект
метанол
NaOH 5н
Гидролиз (400С ночь)
экстракция
центрифугирование
Твердофазная экстракция
Закол в ГХ-МС
а) Abundanc e
б)
Abundance
S c a n 1 6 9 0 (1 4 . 7 2 2 m in ): c a n n a b _ 1 _ 1 0 _ d o a s s l. D \ d a t a . m s
2 3 1 .2
170000
T IC: c annab_1_10_doas sl.D \ data.ms
160000
1200000
150000
1100000
140000
1000000
130000
120000
900000
110000
800000
100000
700000
II
90000
I
80000
600000
70000
500000
60000
400000
50000
300000
40000
30000
200000
20000
100000
7 3 .1
10000
1 7 4 .1
1 2 1 .1
3 1 4 .3
2 7 1 .1
0
14.60
14.80
15.00
15.20
15.40
15.60
15.80
16.00
50
150
200
250
300
3 5 5 .1 3 9 2 .2 4 2 9 .1 4 6 6 .2 5 0 3 .2
5 5 5 .4
350
550
400
450
500
m / z -->
T ime-->
в)
100
г)
Abundance
Abundance
S c a n 1 8 6 2 (1 5 .9 0 6 m in ): c a n n a b _ 1 _ 1 0 _ d o a s s l. D \ d a ta .m s
2 9 5 .1
80000
Scan 1786 (15.383 min): cannab_1_10_doas sl.D\ data.ms
299.3
75000
70000
100000
65000
90000
60000
231.2
80000
55000
50000
70000
45000
60000
40000
50000
35000
30000
40000
25000
30000
20000
20000
41.1
147.1
10000
193.1
341.1
50
100
150
200
7 3 .1
10000
0
m/ z-->
2 0 7 .0
15000
91.1
250
300
350
388.9 429.1
400
450
503.1
500
2 5 3 .1
1 3 5 .1
5000
553.3
3 4 1 .1
4 0 5 .2
0
550
50
100
150
200
250
300
350
400
4 5 1 .1
450
5 0 3 .1
5 5 3 .1
500
550
m / z -->
Рис. а) Хроматограмма метанольного экстракта пробы волос (SCAN). Пик с временем удерживания 14.72 мин соответствует
каннабидиолу, 15.38 - Δ9-тетрагидроканнабинолу (ТНС), 15.9 – каннабинолу. Вещества идентифицированы по времени
удерживания и по масс-спектрам; б) Масс-спектр каннабидиола; в) Масс-спектр ТНС; г) Масс-спектр каннабинола.
Abundanc e
Io
Io
Io
Io
Io
Io
36000
34000
32000
n
n
n
n
n
n
2
2
2
3
2
3
9
3
9
1
4
1
5
1
9
0
6
4
.0
.0
.0
.0
.0
.0
0
0
0
0
0
0
(2
(2
(2
(3
(2
(3
9
3
9
0
4
1
4
0
8
9
5
3
.7
.7
.7
.7
.7
.7
0
0
0
0
0
0
to
to
to
to
to
to
2
2
2
3
2
3
9
3
9
1
4
1
5
1
9
0
6
4
.7
.7
.7
.7
.7
.7
0
0
0
0
0
0
):
):
):
):
):
):
h
h
h
h
h
h
a
a
a
a
a
a
ir _
ir _
ir _
ir _
ir _
ir _
2
2
2
2
2
2
0
0
0
0
0
0
_
_
_
_
_
_
sc
sc
sc
sc
sc
sc
r_
r_
r_
r_
r_
r_
th
th
th
th
th
th
c
c
c
c
c
c
_
_
_
_
_
_
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
_
_
_
_
_
_
s im
s im
s im
s im
s im
s im
.D
.D
.D
.D
.D
.D
\
\
\
\
\
\
d
d
d
d
d
d
a
a
a
a
a
a
ta
ta
ta
ta
ta
ta
.m
.m
.m
.m
.m
.m
s
s
s
s
s
s
30000
II
28000
I
26000
24000
22000
20000
18000
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
7 .8 0
8 .0 0
8 .2 0
8 .4 0
8 .6 0
8 .8 0
9 .0 0
9 .2 0
9 .4 0
9 .6 0
T im e - - >
Рис. Хроматограмма щелочного экстракта волос, снятая в режиме сканирования по характеристическим ионам (SIM) по
короткой программе. Пик с временем удерживания 8.19 мин соответствует каннабидиолу, 8.58 - Δ9-тетрагидроканнабинолу
(ТНС), 9.63 – каннабинолу.
Выводы
1. На основании проведенных исследований разработан новый подход в методике
пробоподготовки мочи и крови для скринингового ГХ-МС анализа,
обеспечивающий высокую точность и достоверность распознавания и
определения наркотических и психоактивных веществ, а также охват максимально
бòльшего спектра анализируемых соединений, и особенно летучих компонентов
пробы, за счет совмещения технологических операций при пробоподготовке, а
также сокращении времени проведения анализа и уменьшении расхода реагентов
необходимых
для
проведения
анализа.
2. На основании экспериментальных данных была разработана методика
пробоподготовки
кератиновых
структур
двойная
экстракция.
3. Разработан новый алгоритм аналитических процедур для обнаружения в
сложных матрицах веществ кислотного, нейтрального, слабоосновного и
основного характера, используя минимальное количество биоматериала. Следуя
данному алгоритму, весь анализ заключается в проведении всего двух процедур:
хроматомасс-спектрометрический
анализ
в
режиме
сканирования
по
характеристическим ионам для обнаружения каннабиноидов и хроматомассспектрометрическиц скрининг на основные наркотические и психотропные
вещества
в
режиме
сканирования
по
полному
ионному
току.
4. Предложены к использованию новые варианты оптимизации процесса
пробоподготовки волос и ногтей, в частности использование ферментов для
гидролиза
трипсина,
пепсина
и
кератиназы.
5. Разработан алгоритм процедуры тестирования подростков при использовании
скринингового ГХ-МС, который может быть введен в рутинную практику химикотоксикологических лабораторий.
Публикации.
По материалам дипломной работы опубликовано 7 статей, из них 6 в
журнале «Наркология» разных годов издания, рецензируемом ВАК, и
13 тезисов докладов.
СПАСИБО ЗА
ВНИМАНИЕ !