Маркеры активации гемостаза, БХМ, Москва, 06.10.2011г.
advertisement
Центр изучения тромбозов и аутоиммунных заболеваний ЯГМА Ярославская государственная медицинская академия Научное общество «Клиническая гемостазиология» Клинические проявления патологии гемостаза ТРОМБОЗЫ КРОВОТЕЧЕНИЯ ДВС Компоненты системы гемостаза Сосудистая стенка Тромбоциты Генез многих геморрагических и тромботических заболеваний может носить смешанный характер, то есть вовлекать несколько звеньев системы гемостаза Плазменные факторы коагуляции Естественные антикоагулянты Система фибринолиза Другие протеины (ф-р Виллебранда, белки острой фазы и др.) Низкомолекулярные субстанции (фосфолипиды и др.) Тромбозы… Ежегодно 1 из 250 человек на Земле погибает от тромбозов… Атеротромбоз: 3 из 1000 живущих погибает от острой ишемии жизненно важных органов Причина более 50% смертей в индустриально развитых странах Тромбоз глубоких вен ног: • 1-2 случая на 1000 человек в год • Смертность 6%, через 1 год – 20% • В России ежегодно венозный тромбоз развивается у 240 тыс. чел., у 100 тыс. из них - ТЭЛА • У 300 человек из 100 тыс. популяции перенесенный венозный тромбоз является причиной трофических язв ног • J Thromb Haemost 2007. Бокарев и соавт. «Тромбозы и противотромботическая терапия в клинической практике», 2009г. ТЭЛА • более, чем в 50% случаев ТЭЛА остается «незамеченной» • только тщательное исследование легочных артерий при аутопсии позволяет диагностировать ТЭЛА и • «маскировка» симптомов под другие заболевания (легкие, сердце) • сложность инструментальной диагностики Причины венозного тромбоза? Факторы риска? ПРОФИЛАКТИКА ! ТРИАДА ВИРХОВА • Стаз крови - ХСН - иммобилизация, гиподинамия - венозная недостаточность и др. • Повреждение сосуда - атеросклероз - тромбоз в анамнезе -травма, операция, инфекция и сепсис - варикозная болезнь и др. • Повышенная склонность самой крови к тромбообразованию (врожденная и/или приобретенная тромбофилия) Факторы риска и состояния, «приводящие» к гематогенной тромбофилии или усугубляющие врожденные дефекты гемостаза Возраст старше 40 лет (>40,>60,>75) Общая анестезия Беременность, послеродовый период Полицитемия, тромбоцитозы Послеродовый период Тромбофилии Хирургические вмешательства (особенно - ортопедические) Сахарный диабет Гипотиреоз Оральные контрацептивы, ГЗТ Патология печени ХСН Воспалит. процессы, инфекции Травмы, ожоги Курение Эмоциональные стрессы Ожирение (ИМТ>25кг/м2, Длительная иммобилизация, ОТ>80см жен., >94см муж.) гиподинамия, постельн. режим >3дн. Злокачественные опухоли Катетеризация сосудов Химиотерапия СКВ, другие сист. заболевания Нефротический синдром Заболевания легких Проблема тромбофилий Тромбофилия – врожденная или приобретенная повышенная склонность самой крови пациента к тромбообразованию Некоторые виды тромбофилий или их сочетание обусловливают более длительное (даже пожизненное) и интенсивное использование антикоагулянтов Генетические тромбофилии • Фактор VLeiden (+/-, +/+) (резистентность фактора V к активированному протеину С) Мутация протромбина 20210 (+/-, +/+) Мутация в гене метилентетрагидрофолатредуктазы (+/+) (предрасположенность к гипергомоцистеинемии) • Мутация в гене ингибитора активатора плазминогена PAI-1 (+/+) • Мутация в гене фибриногена С10034Т (+/+) - Дефект естественных антикоагулянтов • Антитромбин III, протеин C, протеин S - Резистентность фактора V к активированному протеину С - Повышение активности фактора VIII - Волчаночный антикоагулянт, антифосфолипидные антитела - АФС - Гипергомоцистеинемия - Lp(a) Диагностика тромбофилий не является затратной, технически быстро выполнима «Пронто Тромбориск» Чем «слабее» стимул, вызвавший тромбоз, тем больше вероятность врожденной патологии гемостаза, что крайне важно учитывать при назначении терапии и/или профилактики (характер, интенсивность, продолжительность) Во многих случаях тромбозы являются идиопатическими (возникают на фоне полного физического «благополучия», без очевидных воздействующих факторов) Проблемы… 1) Несмотря на то, что в первичной тромбопрофилактике нуждается очень большое число пациентов, во многих случаях она не назначается… • недооценка риска тромбоза • боязнь кровотечения 2) Вторичная профилактика назначается на непродолжительное, то есть неадекватное риску рецидива время Ключевые вопросы гемостазиологии • факторы риска тромбоза ? • когда они «проявятся» тромбозом? Одним из вариантов контроля за пациентами с высоким риском развития и рецидива тромбоза является исследование в крови уровня маркеров активации гемостаза, маркеров тромбообразования, а также глобальных тестов оценки активности коагуляции Приказ МЗ РФ №233 от 9.06.2003. “Утвердить отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Профилактика ТЭЛА при хирургических и иных инвазивных вмешательствах” Ю.Л.Шевченко «Критерий удлинения профилактики – действие факторов риска, динамика тромбинемии» «Существует подход ориентированный на прекращение профилактики только после нормализации уровня продуктов паракоагуляции в крови» Внутренний путь Общая схема свертывания Прекалликреин крови HMWHMW-кининоген фосфолипид XII XIIa HMWHMW-K Фосфолипид Ca++/Zn++ XI XIa Фосфолипид Ca++ Внешний путь IX IXa VIII VIIIa Фосфолипид Ca++ Общий путь X VIIVII-VIIa Ткан н Тка евый фактор Фосфолипид Ca++ Xa V Va Фосфолипид Ca++ Протромбин (II) Тромбин (IIa) IIa) Фибриноген Фибрин А В А е D Активация свертывания В D Фибриноген Отщепление фибринопептидов А,В Тромбин D е D D е D Фибрин-мономер (растворимый) Спонтанно, при достаточной концентрации Фибрин-полимер (нерастворимый) Фибрин-полимер Тромбин XIII е D е D XIIIa D D е D е D D D е D е D D е D D е D D D Поперечно-сшитый фибрин Плазмин D D + е Активация фибринолиза «+» D-димера • Высокая чувствительность при развитии тромбоза • Доступность методов быстрого и точного выполнения количественного анализа (иммунотурбидиметрия, иммунохемилюминесценция, ИФА и др.) и экспресссистемы • Может быть использован как маркер активации гемостаза, предиктор рецидива ВТЭ • Диагностическая и прогностическая ценность показаны во многих исследованиях, определены допустимые уровни (нормы) • Большая специфичность, чем у РФМК, ПДФибриногена Клиническое применение D-димера • Диагностика ВТЭ • Исследование степени активации гемостаза в оценке риска развития ВТЭ, патологии беременности • ДВС-синдром • Важный критерий дифф. диагностики ДВС и патологии печени (при удлинении скрининговых тестов, тромбоцитопении) • Мониторинг антикоагулянтной терапии (?: порог отсечки. 250нг/мл) NycoCard Reader II (Axis-Shield, Норвегия) Тест основан на методе иммунометрического анализа сэндвичевого типа Продолжительность исследования 3 минуты Границы измерения 100 - 2000 нг/мл Уровень Cut-off 0.3 mg/L Позитивный контроль ~2 mg/L Тест сертифтирован Европейской референс-лабораторией Большой срок хранения реактивов Использование человеческих моноклональных антител к нео-антигену D-димера не дает перекрестных реакций к мономерам фибрина и к фибриногену ® Triage ™ MeterPro • Иммунофлуоресцентный метод детекции • Прибор считывает тест-панель и выдает количественный результат в течение 15 минут • Отсутствие пробоподготовки (цельная кровь, плазма) • D-димер:100 - 5000 нг/мл; • Cut-Off 400 нг/мл • Доступные тесты: Myoglobin; CK-MB; Troponin-I; BNP; D-Dimer • • • • Высокая точность получаемых результатов Питание: кабельное или от батареи Наличие встроенного принтера Возможность подключения к ЛИС DXpress ридер • Тестируемый материал: цельная кровь плазма • Определяемые параметры: Тропонин I Nt-proBNP D-димер Рабочий диапазон «D-димер»: 60-5000 нг/мл «-» D-димера • Зависимость не только от активации коагуляции, но и от интенсивности фибринолиза (при гипофибринолизе уровень D-димера не будет отражать реальной активности гемостаза) • Связь с активностью воспалительного процесса • Снижение специфичности у пожилых пациентов • Может повышаться при кровотечениях • Уровень D-димера свидетельствует об уже протекающем процессе фибринообразования (источник – только фибрин) и фибринолиза, но не говорит о тромбогенном потенциале • Palaretti et al. NEJM 2006; 355: 1780 Глобальный тест оценки активности системы свертывания, ее тромбогенного потенциала • Тест генерации тромбина (TGA) Тромбин – ключевая молекула гемостаза • активация процесса перехода фибриногена в фибрин • активация ф.V, VIII, XI, XIII • активация PAR-рецепторов тромбоцитов • активация тромбомодулина (система прот.С, S) • активация TAFI (участие в фибринолизе) • участие в процессе воспаления и др. Тест генерации тромбина (TGA) – результат комплекса взаимодействий различных систем гемостаза Тест генерации тромбина Тромбоз Тромбин норма кровотечение Время Hemker et al. Принцип теста: каскад коагуляции активируется добавлением к плазме различных концентраций тканевого фактора и фосфолипидов. Реагент Состав RA Мало ФЛ и нет ТФ RB Мало ФЛ и мало ТФ (в буфере) RC Low Мало ФЛ и много ТФ RC High Много ФЛ и много ТФ RD Спец. «композиция» ФЛ Генерируемый в процессе активации коагуляции тромбин расщепляет флюорогенный субстрат и производится детекция изменений его флюоресценции Реагент TGA RA TGA RВ и TGA RC Low Цель исследования Активность микрочастиц - Контроль степени «манифестации» тромбофилии - Контроль геморрагических нарушений - Тромбогенность микрочастиц - Ф.VII, Xa, XIa TGA RC High Мониторинг антикоагулянтной терапии TGA RD - Мониторинг гепаринов, новых антикоагулянтов (ингибиторов Ха и IIa) - Активность ф.XII, калликреина Реагент Состав RA Мало ФЛ и нет ТФ RB Мало ФЛ и мало ТФ (в буфере) RC Low Мало ФЛ и много ТФ RC High Много ФЛ и много ТФ RD Спец. «композиция» ФЛ Какие функции осуществляет активный тромбин Однако, по выходу фибрина нельзя судить о повышенном тромбогенном потенциале системы свертывания, т.к лишь часть активности тромбина идет на образование сгустка. Диагностическую значимость имеет не только величина пика активности тромбина, но и фаза ожидания, угол наклона образования тромбина – в целом профиль кинетической кривой, как уникальная характеристика исследуемой плазмы Ход определения: 60минут с измерением каждую минуту (60 точек) Определяемые параметры: - пиковый (максимальный) уровень тромбина (nM) - время достижения пика - динамика образования (Slope) в минуту - Lag-фаза (от момента добавления реагента до начала образования тромбина) - площадь под кривой - Скорость образования (velocity index) = = Пиковый уровень / (Пиковое время – Lag-фаза) Пик и Скорость зависят от концентрации фосфолипидов в образце. Так как в реагентах количество их лимитировано, то указанные показатели будут зависеть от количества микрочастиц в образце. Оба параметра отражают также амплификацию «предсуществующего» тромбина (т.е. при значимой тромбофилии) и снижены при антикоагулянтной терапии и геморрагических заболеваниях. Тест генерации тромбина ОСНОВНОЕ ПРЕИМУЩЕСТВО перед тестом ЕТР (эндогенный потенциал тромбина) повышен при любой гиперкоагуляции понижен при любой гипокоагуляции ГДЕ БУДЕТ ПОЛЕЗЕН: - контроль за всеми группами антикоагулянтов, в т.ч. новыми - контроль «реализации» тромбофилий (врожденных и приобретенных), в т.ч. в педиатрии - ДВС - контроль активности гемостаза при беременности, у пациентов с ИБС, перенесенным ОНМК и др. - гемофилия и др. гипокоагуляционные состояния (врожденные и приобретенные), контроль заместительной терапии - научные цели (активность микрочастиц (отдельный реагент) и др.) (D-димер) Влияние различных факторов: Воспаление (травма, хирургия, инфекция и др.), кровотечение, гематома, инфаркт, опухоль, беременность, эстрогены (TGA) CEVERON-ALPHA – универсальный автоматический анализатор ОТКРЫТОГО типа • Автомат CEVERON-ALPHA TGA позволяет проводить уникальный флуориметрический TGA- • CEVERON-ALPHA для 4 методов анализа: • - коагулометрия АЧТВ, ПВ, ТВ, Фибриноген, Протеин С, ВА, дефицит факторов свертывания, мутация Лейдена и другие. • - фотометрия С1-ингибитор, FVIII, Протеин С, АТ-III и другие. • - турбидиметрия D-димер, ВА, С-реактивный белок и другие. • - флуориметрия кинетика образования эндогенного тромбина (для модификации Ceveron TGA) • 405, 570, 630 и 740 нм анализ • 360/430 нм Длины волн фотометрического блока: • Скорость проведения анализов на CEVERON-ALPHA до 70 образцов/час (ПВ) (Стационар на 300-400 больных) Маркеры активации системы тромбообразования (постоянного внутрисосудистого микросвертывания крови) Маркеры тромбинемии: • Комплекс Тромбин-Антитромбин III (TAT) • Фрагмент протромбина (F1+2) Маркеры фибринообразования: • Фибринопептид А • D-димер Поздние маркеры активации (маркеры реактивного фибринолиза) • D-димер • Комплекс плазмин-антиплазмин (PAP) (0-514нг/мл) Комплекс Тромбин-Антитромбин (ИФА) • Клиренс тромбин-антитромбинового комплекса из системы циркуляции достаточно быстрый, он удаляется в течение нескольких минут. • Присутствие ТАТ в плазме свидетельствует об образовании тромбина in vivo непосредственно в момент взятия крови на исследование и о возможности истощения антикоагулянтов. • Определение ТАТ очень информативно в острой ситуации, непосредственно при тромбообразовании с целью диагностики состояния гиперкоагуляции, которое может быть значимым при тромботических состояниях и последующей тромболитической терапии. • Определение ТАТ характеризуется высокой аналитической чувствительностью, поэтому его увеличение можно зарегистрировать до появления клинических признаков ДВСсиндрома. • Норма ТАТ – 2,1+1,3 нг/мл Фибринопептид А (ИФА) • Образуется при ферментативном действии тромбина в результате отщепления от N-конца Aα-цепи фибриногена. • Повышенный уровень фибринопептида А в крови говорит о гиперактивности тромбина и наряду с D-димером является маркером ДВС-синдрома и риска развития тромбозов. • Однако полная корреляция с уровнем Д-димера не обязательна, поскольку фибринопептид А образуется на стадии формирования фибринового сгустка, а Д-димер генерируется при его лизисе. • Норма – менее 3 нг/мл Маркеры активации системы тромбообразования (постоянного внутрисосудистого микросвертывания крови) Активация каскада коагуляции: • тканевый фактор и его активность (ДВС, онкология, кардиология, неврология и др. области) • TFPI / Xa – комплекс • активность отдельных факторов свертывания Фибринолиз: • t-PA (антиген и активность) • PAI-1, PAI-1/Upa, t-PA/PAI • u-PA (антиген и активность) • TAFI Важнейшая проблема гемостазиологии – оценка реальной активности фибринолиза, а не только реактивных изменений на фоне активации гемостаза и тромбоза. Гипофибринолиз может служить важнейшей причиной локальных нарушений микроциркуляции (акушерская патология и др.) Normal Норма Тромбоэластометрия «видит» фибринолиз как есть? Мнения противоречивы Hyperfibrinolysis Гиперфибринолиз Thrombocytopenia Тромбоцитопения Hypercoagulation Гиперкоагуляция Важнейшая проблема гемостазиологии – оценка реальной активности фибринолиза, а не только реактивных изменений на фоне активации гемостаза и тромбоза. Только комплексный анализ активности плазминогена, его активаторов (t-PA) и ингибиторов (PAI-1 и др.) может дать реальное представление об активности системы фибринолиза Фибринолиз: • t-PA (антиген и активность) • PAI-1, PAI-1/Upa, t-PA/PAI • u-PA (антиген и активность) • TAFI Маркеры активации системы тромбообразования (постоянного внутрисосудистого микросвертывания крови) Для более дифференцированной трактовки результатов рекомендуется одновременное определение показателей активности воспаления (С-реактивный белок, фибриноген, ИЛ6, sCD40 и др.) Маркеры активации тромбоцитов ИФА: - GPIIb/IIIa - PF4, тромбомодулин - sP-селектин, sGPV и другие Флоуцитометрия тромбоцитов: - уровень экспресси тромбоцитарных рецепторов CD41(GPIIb), CD42 (GPIb), CD61(GPIIIa), CD62P(P-селектин), CD63(гранулофизин) - определение и фенотипирование эндотелиальный, тромбоцитарных и лейкоцитарных микрочастиц Агрегатометрия тромбоцитов с различными концентр. индуктора (АДФ) ? Резистентность к антиагрегантам Методы определения: - время кровотечения - оптическая или импедансная агрегатометрия - Ultegra Rapid Platelet Function Assay - Тромбоэластография - Проточная цитометрия (экспрессия GPIIb/IIIa, P-селектина, VASP) - Тромбоксан В2 в плазме, 11-дегидротромбоксан В2 в моче и др. (VerifyNow® и др.) Неэффективность Нормальный ответ Маркеры активации/повреждения эндотелия ИФА: - эндотелин - молекулы адгезии (ECAM, sVCAM-1 и др.) - EPCR - PF4, тромбомодулин - фактор Виллебранда и другие Флоуцитометрия : - микрочастицы, эндотелиоциты, экспрессия тканевого фактора Активация тромбоцитарного звена гемостаза одновременно с коагуляционным может служить показанием для комбинированной антикоагулянтной и антиагрегантной терапии Также маркеры активации тромбоцитов могут служить критерием эффективности использования антиагрегантов (АСК, Клопидогрел) Маркеры активации : трудности определения - формат ИФА трудоемок; - сложность преаналитического этапа (необходимость быстрого выполнения исследования, холодовых условий, включая центрифугирование, сложности транспортировки и др.); - некоторые показатели не стандартизованы; - короткий период присутствия в плазме (минуты); Клиническая оценка риска тромбоза, диагностика тромбофилий, проведение глобального коагуляционного теста (теста генерации тромбина) и определение маркеров активации гемостаза дополняют друг друга, а не взаимозаменяют Повышение уровня маркера активации – это сигнал уже развивающегося неблагополучия в свертывающей системе, то есть можно не успеть предотвратить катастрофу Средства «последней надежды»: Макроуровень – УЗИ сосудов, коронарография и т.д. «Микроуровень» – маркеры активации гемостаза С другой стороны, маркеры активации гемостаза могут быть единственным признаком «надвигающегося» тромбоза,Пациент средством С., объективизации 22 года (2004г.). риска его рецидива, признаком участия системы гемостаза Выявлена лишь гетерозиг. мутация в гене ф.V Лейден в патологическом процессе Рецидив тромбоза в 2009г… (просты в понимании, информативны в динамике) Благодарю за внимание!
