Линькова=сетчатка

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии
Молекулярный механизм ретинопротекторного
действия коротких пептидов
Н.С. Линькова, В.Е. Проняева, А.В. Дудков, С.В. Трофимова
Молекулярно-клеточный механизм ретинопротекторного
действия пептидов в эмбриональных культурах клеток
сетчатки
Органотипическая культура клеток сетчатки 10дневного эмбриона цыпленка
эксплантат
зона роста
гематоксилин-эозин, х 40
гематоксилин-эозин, х 200
Влияние эпиталона на морфологию клеток
органотипической культуры сетчатки
контроль
эпиталон
гематоксилин-эозин, х 400
Молекулярный механизм дифференцировки
клеток сетчатки
D. Arendt. J. Int. Dev. Biol. 2003
Слои сетчатки и факторы дифференцировки,
участвующие в их развитии
пигментный эпителий (TTR)
палочка (Oct2, Crx)
колбочка (Oct2, Crx)
горизонтальная клетка (Pax6→Prox1)
амакринная клетка (Math1 → Prox1)
биполярный нейрон (Chx10 → Vsx1)
ганглиозная клетка (Math5 → Brn3)
нервное волокно
1.6
1.4
*
*
*
1.2
*
*
1
*
0.8
*
Площадь экспрессии, %
Влияние пептидов на дифференцировку амакринных и
горизонтальных клеток сетчатки цыплят
0.6
0.4
0.2
0
Контроль
Эпиталон
Pax6
Math1
Нормофтал
Ретиналамин
Prox1
*- р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем
Pax6, Math1 – предшественники горизонтальных и амакриновых клеток,
Prox1 – зрелые клетки
*
1.8
1.6
*
1.4
*
1.2
*
1
*
0.8
*
Площадь экспрессии, %
Влияние пептидов на дифференцировку ганглиозных и
биполярных нейронов сетчатки цыплят
0.6
0.4
0.2
0
Chx10
Контроль
Math5
Эпиталон
Brn1
Нормофтал
Vsx1
Ретиналамин
*- р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем
Chx10, Math5 – предшественники биполярных и ганглиозных клеток, Vsx1,
Brn3 – зрелые биполярные и ганглиозные клетки
Влияние эпиталона на дифференцировку биполярных
нейронов (белок Vsx1)
контроль
эпиталон
иммуноцитохимия с докраской эозином, х100
1.8
*
*
1.6
*
1.4
1.2
*
0.8
*
*
1
*
*
*
Площадь экспрессии, %
Влияние пептидов на экспрессию маркеров
фоторецепторов в сетчатке цыплят
0.6
0.4
0.2
0
Контроль
Эпиталон
Otx2
Crx
Нормофтал
Ретиналамин
рекаверин
*- р<0,05 по сравнению с соответствующим контролем
Otx2– предшественники фоторецепторов, Сrx – зрелые фоторецепторы,
рекаверин – белок, синтез которого повышается при палочковой дистрофии
Индукционное влияние ретиналамина на
полипотентные клетки эктодермы ранней
гаструлы Xenopus laevis
Сетчатка
Пигментный
эпителий
Мозг
Индукционное влияние эпиталона на полипотентные
клетки эктодермы ранней гаструлы Xenopus laevis
эпидермис
сомиты
гематоксилин-эозин, х250
флюоресцентная
иммуногистохимическая окраска
антителами к α-актину , х250
Спектр тканей, индуцированных пептидами в
полипотентных клетках эктодермы ранней гаструлы
Xenopus laevis
% индуцированной ткани
Спектр тканей, развившихся из эктодермы ранней
гаструлы Xenopus laevis под действием эпиталона в
различных концентрациях
16
14
12
10
8
6
4
2
0
2
эпидермис
10
20
50
нервная ткань
100
200
концентрация
эпиталона, нг/мл
Молекулярно-клеточный механизм ретинопротекторного
действия пептидов в модели наследственной
пигментной дегенерацией сетчатки у крыс
Влияние пептидов на биоэлектрическую активность
сетчатки крыс Campbell c наследственной пигментной
дегенерацией сетчатки
Среднее значение суммарных амплитуд волн "a", "b", "c" ЭРГ (мкВ)
Группа
Срок наблюдения, сут.
23
35
41
53
65
71
81
Контроль
90,5±11,2
80,6±9,2
38,4±7,4
0
0
0
0
Эпиталон
94,5±12,1 116,6±8,3* 117,1±7,8*
91,4±11,7
68,3±9,5
54,1±8,4
21,6±5,8
Нормофтал
92,4±11,3 112,6±7,4* 113,8±6,8*
94,4±11,8
70,4±7,6
55,2±8,0
18,3±5,9
Ретиналамин
91,6±10,3 125,5±9,4* 131,4±8,7*
96,1±9,9
65,7±8,3
57,0±5,1
20,4±6,1
* - р<0,05 по сравнению с cоотвествующим контролем
Пептиды вводили внутримышечно ежедневно в течение 30 сут
в дозе 0,05 мкг/мл начиная с 5 дня жизни
Влияние эпиталона на морфологическую структуру
слоев сетчатки крыс Campbell c наследственной
пигментной дегенерацией сетчатки
контроль
эпиталон
Сетчатка крыс на 41 сут., окраска гематоксилин-эозином, х900
6
5
4
***
3
2
*
***
** *
1
**
Площадь экспрессии, %
Влияние пептидов на экспрессию маркеров
фоторецепторов в сетчатке крыс Campbell c
наследственной пигментной дегенерацией сетчатки
0
Crx
Otx2
23 сут
Контроль
рековерин
рекаверин
Эпиталон
Crx
Нормофтал
Otx2
41 сут
Ретиналамин
* - р<0,05 по сравнению с cоотвествующим контролем
рековерин
рекаверин
Влияние пептидов на экспрессию маркера зрелых
фоторецепторов Crx в сетчатке крыс Campbell c
наследственной пигментной дегенерацией сетчатки
контроль
нормофтал
Сетчатка крыс на 41 сут., иммуноцитохимия с антителам к Crx, докраска
гематоксилин-эозином, х400
Влияние пептидов на экспрессию маркера
малодифференцированных фоторецепторов Otx2 в
сетчатке крыс Campbell c наследственной пигментной
дегенерацией сетчатки
контроль
ретиналамин
Сетчатка крыс на 41 сут., иммуноцитохимия с антителам к Otx2, докраска
гематоксилин-эозином, х400
Молекулярно-клеточный механизм ретинопротекторного
действия пептидов в модели диабетической
ретинопатии у кроликов
Диаметр сосудов, мкм
Влияние эпиталона на неоваскулогенез в модели
диабетической ретинопатии у кроликов
25
диабет
20
15
10
Диабет
+эпиталон
5
0
Интактные животные Стептозотоциновый
диабет
Стептозотоциновый
диабет + эпиталон
* - р<0,05 по сравнению с cоотвествующим контролем
Внутренняя капиллярная сеть сетчатки. Окраска гематоксилин-эозином, х 200.
3.5
*
3
*
2.5
2
1.5
1
**
Площадь экспрессии, %
Влияние пептидов на экспрессию маркеров апоптоза в
сетчатке крыс с экспериментальным сахарным
диабетом
**
0.5
0
Интактные животные
Стептозотоциновый
диабет
р53
Стептозотоциновый
диабет + эпиталон
caspase-3
*- р<0,05 по сравнению с cоотвествующим показателем у интактных животных
** - р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем у животных с сахарным
диабетом
Влияние пептидов на экспрессию маркера апоптоза р53
в сетчатке кроликов с экспериментальным сахарным
диабетом
контроль
эпиталон
Cетчатка глаза кролика со стрептозотоциновым диабетом.
Конфокальная микроскопия с антителам к р53, х100
4
*
3.5
*
3
**
2.5
2
1.5
**
1
*
площадь экспрессии, %
Влияние пептидов на экспрессию маркеров
неоваскулогенеза и пигментного эпителия сетчатки
кроликов с экспериментальным сахарным диабетом
0.5
0
СD31
Интактные животные
Стептозотоциновый диабет + эпиталон
VEGF
TTR
Стептозотоциновый диабет
*- р<0,05 по сравнению с cоотвествующим показателем у интактных животных
** - р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем у животных с сахарным
диабетом
Влияние пептидов на экспрессию маркера
неоваскулогенеза VEGF в сетчатке кроликов с
экспериментальным сахарным диабетом
контроль
эпиталон
Cетчатка глаза кролика со стрептозотоциновым диабетом.
Иммуноцитохимия с антителам к VEGF, докраска гематоксилин-эозином,
х400
Конформационный поиск наиболее энергетически
выгодного ротамера эпиталона
Наложение 25 конформаций
эпиталона, принадлежащих
оптимальному интервалу энергий
(13,00 – 16,47 ккал/моль)
Конформация эпиталона со средним
значением
энергии
минимизации
14,76±0,53 ккал/моль.
Модель связывания эпиталона с двойной спиралью ДНК:
5’-d(ATTTC)-3’•5’-d(GAAAT)-3’
Водородные связи между эпиталоном
и последовательностью ДНК ATTTC –
пунктирные серые линии.
Сеть водородных связей образована
между атомом кислорода основной
цепи в Ala и атомом азота в адение
(DA218),
атомом кислорода в
боковой цепи Glu (глутаминовой
кислоты) и атомом азота в тимине
(DT207), карбоксильной группы Asp
(аспарагиновой кислоты) и атомом
азота в аденине (DA204) и между
атомом кислорода боковой цепи в
глицине (Gly)
и атомом азота в
цитозине (DC222).
атомы кислорода
атомы азота
атомы углерода
ДНК
Энергия связывания комплекса
ДНК-пептид = 10.3 Ккал/моль
Выводы
1. Пептидные
биорегуляторы
(эпиталон,
нормофтал,
ретиналамин) активируют экспрессию сигнальных молекул –
маркеров дифференцировки клеток сетчатки (Vsx1, Prox1,
Pax6, Brn3, Chx10, Math1, Math5,
Otx2, Crx, recaverin) в
эмбриональных культурах сетчатки животных.
2. пептидные
биорегуляторы
в модели наследственной
пигментной дегенерации сетчатки у крыс
повышают
биоэлектрическую активность клеток сетчатки, способствуют
восстановлению экспрессии маркеров фоторецепторов (Otx2,
Crx)
и
снижению синтеза рекавенрина, повышение
экспрессии которого наблюдается при этой патологии.
3. Пептидные
биорегуляторы
в
модели
диабетической
ретинопатии у кроликов способствуют снижению ангиогенеза
(VEGF, CD34) и апоптоза (p53, caspase3).
Спасибо за внимание!