Малышева Татьяна Юрьевна Ведущий специалист отделения Биотехнологии ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Нормативные документы, регламентирующие ввоз на территорию РФ и применение продукции, содержащей ДНК тканей животных Указание Департамента ветеринарии №13-8-01/2350 от 11.03.02 г. о запрете на ввоз на территорию РФ любых видов животных белков для кормления животных из стран, в которых регистрировалась губкообразная энцефалопатия КРС; Указание №13-3-6/1825 от 24.09.04 г. о порядке импорта в РФ кормов, кормовых добавок и сырья для их производства; Дополнение к указанию от 24.09.04 г. №13-3-6/1825 от 22.10.04 г. Приказ №425 от 10.09.08 г. «Об утверждении правил организации государственного ветеринарного надзора за ввозом кормов» Государственный контроль и мониторинг сырья и кормов на ДНК жвачных животных Всего на наличие ДНК жвачных животных в 2012 году проведено 674 исследования ДНК жвачных животных обнаружена в 13 образцах, из них: ДНК крупного рогатого скота обнаружена в 11 образцах (1,63%) ДНК мелкого рогатого скота обнаружена в 2 образцах (0,29%) 3 Государственный контроль и мониторинг сырья и кормов на ДНК жвачных животных Разработан метод сканирующей электронной микроскопии (в качестве арбитражного, письмо Руководителя Россельхознадзора от 16.01.2013 г. № ФС-НВ-2/304 и письмо ФГБУ «ВГНКИ» от 24.01.2013 г. № 61/4) для системы государственного контроля и мониторинга кормов, позволяющий подтверждать молочные ингредиенты в рецептуре и проверять корма с положительным ПЦР-результатом на наличие ДНК жвачных животных. ЗЦМ Пшеничная мука Кукурузная мука Мясокостная мука Соевая мука Рыбная мука Определение видовой принадлежности продукции животного происхождения В последнее время участились случаи ввоза в РФ контрафактного мяса и продуктов его переработки, что подвергает опасности здоровье потребителей. Так же определение видовой принадлежности используется при проведении биологической судебной экспертизы в случаях браконьерства. случаи фальсификации мясной продукции, в том числе подвергавшейся термической обработке ; Случаи фальсификации рыбной продукции более дешевыми видами; попытки ввоза в Россию мяса индийского водяного буйвола Bubalus bubalis под видом говядины Попытки ввоза в Россию мяса зебу Bos Taurus indicus под видом говядины Видовое определение принадлежности мяса, изъятого у охотников, подозреваемых в браконьерстве Риск заражения животных и человека прионными заболеваниями, относящихся к группе трансмиссивных губкообразных энцефалопатий Методы дифференциации мяса изоэлектрическое фокусирование • используются для видовой идентификации сырого мяса, малопригодны для определения видовой принадлежности животных белков в составе кормов и продуктов, подвергнутых термической обработке реакция иммунодиффузии (РИД) • не позволяет определять видовую принадлежность белка уже после термической обработки при температуре 80С в течение 30минут ИФА • низкая чувствительность, выявляет примесь мясокостной муки в рыбной и куриной муке в концентрации не менее 50% Традиционными методами идентификации сырого мяса (органолептические, физикохимические и др.) не всегда возможно дифференцировать мясо близкородственных видов животных, однако эту проблему позволяет решить применение молекулярногенетических методов, основными достоинствами которых являются высокая чувствительность и специфичность, время исследования 3–4 часа, высокая воспроизводимость и низкая себестоимость. Этапы видовой идентификации продукции Правильный отбор и подготовка проб Выделение ДНК Постановка реакции ПЦР со специфическими праймерами на участок гена цитохрома В митохондриальной ДНК Определение последовательности фрагмента гена цитохрома В Сравнение полученной последовательности с находящимися в базе данных NCBI Построение филогенетического дерева с помощью специальных программ (Mega, Vector NTI и др.) Заключение о видовой принадлежности образца Видовая идентификация мясной продукции в рамках государственного задания и на договорной основе В соответствии с Приказом Россельхознадзора № 17 от 18.01.2013 г. подведомственный Россельхознадзору лабораторный центр ФГБУ «ВГНКИ» провел мониторинг готовых мясных продуктов: сосиски «Франкфуртские» (производитель: LANDHOF GmbH&Co KG, Австрия; импортер: ООО «МИТТРЕЙД», Россия). В результате испытаний в данной продукции выявлена ДНК лошадей, кур, крупного рогатого скота и сои, что не соответствует составу, заявленному на этикетке. Сосиски Хельсинкивурст АУРА/Helsinkiwurst Aura (производитель Pajunlemi Oy, Финляндия). В результате испытаний в данной продукции выявлена ДНК лошадей. 8 При проведении мониторинга готовых мясных продуктов в результате молекулярно-генетических исследований образцов сосисок ИКЕА (ТУ 9213001-51069329-07, дата изготовления 06.01.2013) и сосисок Бистро (ТУ 9213-202-01597945-06, дата изготовления 07.02.2013) производства ООО «МПЗ Ремит» (юридический адрес: 129221, г. Москва, Полярная улица, д. 14), а так же в колбасах производства ООО «Мортадель» и ОАО «Мясокомбинат Клинский» обнаружена ДНК лошадей. Видовая идентификация рыбной продукции в рамках государственного задания и на договорной основе В ходе мониторинга пищевой продукции, проводимого по указанию Россельхознадзора, при исследовании поступивших 6-ти образцов рыбного филе от разных производителей в образце трески филе б/к производства ООО «Талдом-рыба» ТУ 9258-001-48811305-03, изготовленного 20.02.2013 г., вместо атлантической трески (Gadus morhua) и тихоокеанской трески (Gadus macrocephalus) обнаружена рыба рода минтай (Theragra) семейства тресковых. 9 Разработаны и унифицированы качественные и количественные методы по идентификации ГМО и ДНК животных в кормах и сельскохозяйственной продукции, которые гармонизированы с методиками, рекомендованными международными организациями (ФАО/ВОЗ) и применяются во всех странах, где осуществляется регулирование данной продукции; Разработан метод для установления видовой принадлежности мяса близкородственных видов животных с помощью полимеразной цепной реакции и секвенирования ПЦР-продукта. Данный метод позволяет исследовать образцы, содержащие однокомпонентное мясо, но непригоден для дифференциации образцов, содержащих два и более вида мяса; Установление пищевой и кормовой безопасности, являются гарантией уверенности потребителя в их безвредности для здоровья человека и животных. Малышева Татьяна Юрьевна Ведущий специалист отделения Биотехнологии ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Организационная работа по подготовке межлабораторных сличительных испытаний для подразделений Россельхознадзора В соответствии с распоряжением Россельхознадзора № ФС-ЕН- 2/14387 от 30.10.2012 года организованы межлабораторные сравнительные испытания (МСИ) по определению генетическимодифицированных организмов (ГМО) и ДНК жвачных животных, в рамках государственного задания в период с 06.11.2012 по 12.01.2013 г. Всего подготовлено 760 контрольных проб для прохождения МСИ по определению генетически-модифицированных организмов для 38 лабораторий; Всего подготовлено 520 контрольных проб для прохождения МСИ по определению ДНК жвачных животных для 26 лабораторий. 12 Подготовка стандартизированных панелей для МСИ по определению ГМО и ДНК жвачных животных При подготовке стандартизированной панели для определения ДНК жвачных животных используются образцы контрафактной продукции из архива отделения Биотехнологии, а так же смоделированные пробы, полученные путем лиофилизации мясных продуктов; Для подготовки панелей по определению ГМО используются стандарты , предоставленные фирмамипроизводителями генетических линий, на конфиденциальной основе, а так же образцы, содержащие ГМО, выявленные при проведении государственного мониторинга. Каждый образец стандартизированной панели перед отправкой участнику МСИ проверяется в 3-х параллелях. Сводная таблица эффективности исследований лабораторий по результатам межлабораторных сличительных испытаний на содержание ДНК жвачных в кормах, кормовых добавках и сельскохозяйственной продукции за 2008-2013 гг. 2008 г. Федеральные государственные бюджетные и другие ФС-НВ-2/9178 от государственные учреждения 10.09.08 (23образца/46 позиций) №п п 1Калининградская МВЛ 2Брянская МВЛ 3Краснодарская МВЛ 4Ленинградская МВЛ 5Челябинская МВЛ 6Приморская МВЛ 7Московская ГВЛ 8Новосибирская МВЛ 9Камчатская МВЛ 10Магаданская МВЛ 11Татарская МВЛ 12Иркутская МВЛ 13Саратовская МВЛ 14Ставропольская МВЛ 15Белгородская МВЛ 16Тверская МВЛ 17Сахалинская МВЛ 18Тульская МВЛ 19Белветцентр 20Кемеровская МВЛ 21ГНУ Уральский НИВИ 22Томская ОВЛ 23Орловский РЦ 24ЦНМВЛ 25ВНИИЗЖ 26ГНУ ВНИИ мясной пром. им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии 27Мурманская ОВЛ 28Хабаровский РЦ 29Башкирский РЦ 30Забайкальский РЦ 31Ростовский РЦ 32Оренбургский РЦ 33Красноярский РЦ 34ЦНПВРЛ 14 Д ЛП 41 4 45 1 31 15 41 5 45 1 29 17 ЛО 1 0 0 0 0 0 43 3 45 1 42 4 32 13 44 2 46 0 16 7 45 1 43 3 26 20 45 1 37 9 36 10 0 0 0 1 0 0 23 0 0 0 0 0 0 2012 г. 2013 г. 2009 г. 2010 г. 2011 г. 2-03/40;2-03/39 от 2-03/549 от 2-03/361 от БК-16-2/169 от 01.03.11 письмо б/н от ФС-ЕН-2/14387 от 03.02.09 14/10/09$2-03/600 от 16.03.10(20образцов/4 (20образцов/40 05.03.12(20образцов/4 30.10.2012 г (20образцов/40 30.10.09 0 позиций) позиций) 0 позиций) позиций) (20образцов/40 позиций) Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) 20 0 0 100 89 29 5 6 72,5 30 4 6 75 31 5 4 77,5 38 2 0 95 20 0 0 100 98 37 3 0 92,5 40 0 0 100 40 0 0 100 20 0 0 100 67 35 5 0 87,5 36 4 0 90 36 4 0 90 40 0 0 100 20 0 0 100 89 39 0 1 97,5 36 4 0 90 35 5 0 88 20 0 0 100 98 36 4 0 90 38 0 2 95 40 0 0 100 63 38 0 2 95 39 1 0 97,5 36 4 0 90 35 4 1 88 38 2 0 95 20 0 0 100 93 38 2 0 95 19 1 0 95 98 26 2 12 65 36 4 0 90 91 26 0 14 65 26 2 12 65 70 36 0 4 90 33 0 7 82,5 40 0 0 100 20 0 0 100 96 36 4 0 90 20 0 0 100 100 38 2 0 95 38 1 1 95 20 0 0 100 35 39 1 0 97,5 20 0 0 100 98 37 3 0 92,5 40 0 0 100 32 6 2 80 20 0 0 100 93 38 2 0 95 40 0 0 100 56 38 1 1 95 20 0 0 100 98 36 3 1 90 40 0 0 100 80 78 31 6 3 77,5 36 4 0 90 20 0 0 100 36 2 2 90 39 1 0 97,5 39 1 0 97,5 20 0 0 100 36 4 0 90 40 0 0 100 19 1 0 95 35 5 0 87,5 36 1 3 90 18 1 1 90 38 1 1 95 37 0 3 92,5 32 7 1 80 40 0 Д-количество достоверных результатов ЛО - количество ложноотрицательных результатов ЛП - количество ложноположительных результатов Э - эффективность 0 100 19 16 17 20 20 16 19 1 4 2 0 0 2 0 0 0 1 0 0 2 1 95 80 85 100 100 80 95 Сводная таблица эффективности исследований лабораторий по результатам межлабораторных сличительных испытаний на содержание ГМО в кормах, кормовых добавках и сельскохозяйственной продукции за 2008-2013 гг. Федеральные государственные бюджетные и другие государственные учреждения №пп 1Брянская МВЛ 2Краснодарская МВЛ 3Ленинградская МВЛ 4Челябинская МВЛ 5Приморская МВЛ 6Московская ГВЛ 7Новосибирская МВЛ 8Камчатская МВЛ 9Магаданская МВЛ 10Татарская МВЛ 11Иркутская МВЛ 12Саратовская МВЛ 13Ставропольская МВЛ 14Белгородская МВЛ 15Тверская МВЛ 16Сахалинская МВЛ 17Калининградская МВЛ 18Тульская МВЛ 19Белветцентр 20Оренбургский РЦ 21Кемеровская МВЛ 22ГНУ Уральский НИВИ 23Томская ОВЛ 24Орловский РЦ 25Центр оценки качества зерна 26ЦНПВРЛ 27ЦНМВЛ 28ВНИИЗЖ ГНУ ВНИИ мясной пром. Им. В.М. 29 Горбатова Россельхозакадемии 30Нижегородский РЦ 31Мурманская ОВЛ 32ЦОКЗ Ростовский филиал 33 ЦОКЗ Новороссийский филиал 34 ЦОКЗ Ставропольский филиал 35ЦОКЗ Воронежский филиал 36Башкирский РЦ 37ЦОКЗ Курский филиал 38ЦОКЗ Приморский филиал 39Хабаровский РЦ 40Забайкальский РЦ 41Самарский РЦ 42Ростовский РЦ 43Красноярский РЦ 15 2008 г. ФС-НВ-2/9178 от 10.09.08(23 образца) Д 19 20 19 20 19 20 19 17 18 20 20 20 19 19 13 20 18 19 20 ЛП 1 2 4 3 1 3 4 5 3 3 1 0 2 2 4 1 1 2 0 ЛО 3 1 0 0 3 0 0 1 2 0 2 3 2 2 6 2 4 2 3 20 0 3 2009 г. 2-03/40;2-03/39 от 03.02.09 2-03/549 от 14/10/09$2(20 образцов) 03/600 от 30.10.09 (20 образцов) Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) Д ЛП ЛО Э (%) 83 19 1 0 95 87 17 3 0 85 83 87 18 2 0 90 83 18 2 0 90 87 18 0 2 90 20 0 0 100 83 17 3 0 85 20 0 0 100 74 18 2 0 90 18 2 0 90 78 18 2 0 90 87 20 0 0 100 19 1 0 95 87 14 6 70 87 83 83 56 87 78 83 87 15 0 5 75 87 19 0 1 95 20 0 0 100 17 3 0 85 2010 г. 2011 г. 2012 г. 2-03/361 от 16.03.10 (20 БК-16-2/169 от 01.03.11 (20 письмо б/н от 05.03.12 (20 образцов) образцов) образцов) Д 20 20 20 20 20 20 19 20 ЛП 0 0 0 0 0 0 1 0 ЛО 0 0 0 0 0 0 0 0 Э (%) 100 100 100 100 100 100 95 100 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 100 100 100 100 20 20 20 20 20 20 20 20 16 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 100 100 100 100 100 100 100 100 80 100 20 0 0 100 Д 20 18 20 20 20 ЛП 0 2 0 0 0 ЛО 0 0 0 0 0 Э (%) 100 90 100 100 100 20 0 0 100 20 0 0 100 Д 15 19 20 1 0 0 0 95 100 20 0 0 100 20 20 20 19 0 0 0 1 0 0 0 0 100 100 100 95 19 20 20 1 0 0 0 0 0 95 100 100 20 0 0 100 10 20 5 0 5 0 50 100 13 ЛП 0 0 Д-количество достоверных результатов ЛО - количество ложноотрицательных результатов ЛП - количество ложноположительных результатов Э - эффективность ЛО 5 7 Э (%) 75 65 2013 г. ФС-ЕН-2/14387 от 30.10.2012 г Д 20 20 20 20 20 ЛП 0 0 0 0 0 ЛО 0 0 0 0 0 Э (%) 100 100 100 100 100 20 20 0 0 0 0 100 100 20 18 20 20 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 1 90 100 100 100 100 100 100 100 20 20 20 0 0 0 0 0 0 100 100 100 20 20 20 20 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 100 100 100 100 20 0 0 100 20 20 0 0 0 0 100 100 20 0 0 100 20 20 20 20 20 20 20 20 18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100 2 90 1 0 Спасибо за внимание!