Корреляционная ЯМР спектроскопия

Импульсная Фурье ЯМР спектроскопия
Два типа приборов в ЯМР:
1) Постоянное возбуждение с меняющейся частотой
2) Импульсное возбуждение с последующим Фурье преобразованием
1
Как выбирается длина импульса в ЯМР спектроскопии?
1. Короткому импульсу монохроматического излучения с
частотой ν0 и длиной τ в частотной области соответствует
определенная полоса частот Δν , центрированная на частоте ν0
2. С уменьшением длины импульса ширина полосы частот
увеличивается и наоборот.
3. Для типичного импульса длительностью 10 мксек
центральная «плоская» часть полосы, где амплитуда разнится
в пике не более чем на 1%, имеет ширину 16 кГц
4. Стандартная ширина протонных химических сдвигов у
белков 15 ppm.
Amide protons
(7 -11 ppm)
Aromatic
ring
(6 -7.5 ppm)
 - protons
(4 - 5 ppm)
Methylene
Methyl protons
protons
( ~ 1 ppm)
(2 - 3 ppm)
HDO
ν0
5. В магнитном поле с напряженностью 7.05 Т (ν0
=300 МHz для 1H) интервал 15 ppm соответствует
полосе частот 4.5 KHz для 1H.
В магнитном поле 14.1 Т эта полоса составит 9 KHz.
2
Математическое Фурье преобразование
Временной спектр ЯМР этанола
Частотный спектр ЯМР этанола
→
←
Время
Частота
3
Экспериментальные схемы с применением одиночного импульса
1) Система спинов в равновесии
Импульс
2) Короткий прямоугольный
импульс.
Отклик системы
на импульс
Время
релаксации
3) Отклик системы спинов на
импульс и его регистрация
4) Временная задержка,
необходимая, чтобы система пришла
в равновесие (обычно 2-3 Т1)
5) Многократное накопление
Мертвое время
Последовательность событий:

Длина импульса определяет угол
поворота
вектора магнетизации
Угол поворота вектора магнетизации α, (в
радианах) равен
α = γ B1tp
Длина типичного 90о импульса около 10-5 c.
(a)
(b)
Для 180о импульса эта величина в 2 раза 4
больше.
S
I
Эффект Оверхаузера
Схематическое представление эффекта Оверхаузера
Молекула содержит два спина I и S, которые не
перекрываются, так что каждый из них может быть
представлен как синглет (а).
После насыщения спина S величина сигнала спина I может
увеличиться (b), уменьшиться (c), стать отрицательной (d)
NOE = (I –I0)/I0
NOE ~ f(rIS) × f(τc)
f(rIS) = 1/(2 + A r6IS)
Уравнения, описывающие эффект Оверхаузера, показывают, что
1) Эффект проявляется в изменении интенсивности линий в спектре ЯМР
2) Величина эффекта зависит от двух вкладов, один из которых связан с расстоянием между
спинами, а второй
от вращательного корреляционного времени молекулы τc.
3) Эффект проявляется только для близких соседних спинов, расстояние между которыми
меньше 5-6 Å.
5
Двумерная ЯМР спектроскопия
Двумерная корреляционная ЯМР спектроскопия – метод, который коррелирует (сравнивает
между собой) два сигнала, объединенные некоторым общим взаимодействием.
Четыре временных периода
Подготовка
подг.
Эволюция
Смешение
смеш.
Детектирование
1) приготовление
2) развитие или эволюция(время t1)
3) смешение
4) детектирование (время t2)
Двумерный ЯМР на практике означает, что измеряемый на выходе сигнал
является функцией двух времен, а после Фурье-преобразования – двух частот
Общая схема двумерного ЯМР очень гибкая и на сегодня известны сотни разных
последовательностей, предназначенных для решения тех или иных конкретных
задач.
Например, HMQS-HOHAHA есть система импульсов состоящая из Heteronuclear multiple-quantum
correlation experiment +Homonuclear Hartman-Hahn spectroscopy
Важными и относительно простыми схемами в ЯМР являются:
1) Корреляционная спектроскопия (COSY), которая идентифицирует пары
протонов, связанные скалярным спин-спиновым расщеплением
2) Корреляционная спектроскопия (NOESY), которая идентифицирует близость
6
пар протонов, связанные эффектом Оверхаузера
Корреляционная ЯМР спектроскопия (COSY)
B
A
A
F
Одномерный спектр ЯМР для двух 1H-1H спинов
B
Контурная
карта
(смотри
1
1
следующий слайд) H- H COSY
спектра двух связанных спинов.
Картина всегда симметрична
относительно
диагонали.
Черные кружки представляют
диагональные пики; открытые
кружки кросс-пики. Появление
последних означает, что два
спина сближены.
Заметим,
однако, что расстояния между
7
ними в COSY не определяется.
1D и 2D ЯМР спектры небольшого белка, протеазного ингибитора K (57 аминокислот) в
0.01 M, pD 3.4, 25oC, 360 MHz.
1D
1H
спектр
Контурное
представление
COSY
спектра. Третья
координата - интенсивность.
Этажерочное
представление
COSY спектра
Контурное представление COSY спектра наглядно показывает способность к взаимодействию
различных групп протонных пиков. Укажем лишь на один пример. Так, имеется
взаимодействие высокопольных метилов (ω1 = -0.9 ppm, ω2 = -0.9 ppm).
симметрична относительно диагонали.
Картинка всегда
8
Nuclear Overhauser Enhanced Spectroscopy (NOESY).
90°
9 0°
90°
9 0°
Ра з ви ти е
Evolution
90°
9 0°
С м е ше н и е
Mixing
Д ет ек ти р о ва н и е
Detection
m
t1
t2
m
t1
t2
E
D
E
C
1
D
1
C
B
A
B
A
2
2
Вверху: последовательность
импульсов в NOESY. Внизу:
схематическая контурная карта
спектра, состоящего из пяти
резонансных линий (А, B, C, D и E).
Появление трех кросс-пиков
свидетельствует, что резонансы,
соответствующие этим пикам
сближены в пространстве (А и C, B и
D, B и Е).
Контурная карта протонного двумермого NOE спектра бычьего
трипсинового панкреатического ингибитора (360 MHz,
концентрация белка 0.02 М, pH 3.8). На карте выявляется
множество кросс-резонансных пиков, отражающих сближенность в
пространстве некоторых аминокислот. Аминокислоты обозначены
(A=alanine, T=threonine, C=cysteine, Q=glutamine, F=phenylalanine).
Aмидный протон Glu 31 (на карте Q31NH) контактирует с αпротоном Cys 30 (на карте C30 α-H), aмидный протон Phe 33 (на
карте F33NH) контактирует с α-протоном Тhr 32 (на карте Т32 α-H)
9
Многомерный, гомо- и гетероядерныый ЯМР
2D-ЯМР: два времени
3D-ЯМР: три времени
4D-ЯМР: четыре времени
2D NMR: Pa→Ea(t1)→Ma→Da(t2)
3D NMR: Pa→Ea(t1)→Ma→Eb(t2)→Mb→Db(t3)
4D NMR: Pa→Ea(t1)→Ma→Eb(t2)→Mb→Ec(t3)→Mc→Dc(t4)
0
A
(A) 3D гетероядерный ЯМР
окисленного глютеродоксина из
Е.Coli. Белок обогащен 15N
B
3
(B) Двумерный спектр (b), как
функция еще одной частоты (а).
1
1 ( H )
6
(a)
9
110
9
1
3 ( H )
7
120
15
2 ( N )
Соотношения между
последовательностями
импульсов для записи 2D, 3D,
4D ЯМР. Сокращения: Pподготовка; Е-эволюция; Mсмешение; D-детектирование
(b)
Многомерный спектр –
Большая Советская
Энциклопедия
(от одной строчки
до 60 томов)
10
11
ЯМР макромолекул в твердом состоянии
Со спектроскопической точки зрения основное различие между ЯМР в растворе и ЯМР в твердом теле лежит
в подвижности образца. В растворе линии ЯМР узкие (изотропное усреднение), тогда как в твердом состоянии
линии широкие и как следствие этого сильно перекрываются (анизотропное усреднение). Эффекты
усреднения содержат фактор (3cos2θ – 1), где θ угол между направлением магнитного поля Bo и осью вращения
образца.
Поэтому если же твердый образец физически вращать с высокой
скоростью под углом 54.74о (при этом фактор усреднения
обращаются в ноль, cos2θ = 1/3), то усреднение становится как бы
изотропным и линии сильно сужаются
13C
ЯМР спектр аминокислоты (глицин) в статическом состоянии.
Тот же спектр при вращении образца под так называемым
'магическим углом' с частотой 2.0 kHz.
Тот же спектр при вращении образца под так называемым 'магическим
углом' с частотой 7.2 kHz.
В настоящее время метод находится в стадии интенсивного развития и есть все основания ожидать
определения в ближайшем будущем трехмерных структур белков с хорошим пространственным
12
разрешением.