C–U

Лекция 8. РНК-редактирование
Понятие о РНК-редактировании
Редактирование митохондриальной мРНК
кинетопластных простейших
Эдитинг митохондриальной мРНК плесневого
гриба Physarum polycephalum
Эдитинг митохондриальных мРНК растений
Редактирование структурных РНК
Эдитинг хлоропластных мРНК растений
Происхождение и эволюция РНК-редактирования
Этапы крушения центральной догмы
молекулярной генетики
ДНК
иРНК
ДНК
БЕЛОК
иРНК
БЕЛОК
50-60-ые гг
70-ые гг
Обратная
транскрипция
ДНК
Сплайсинг,
процессинг
пре иРНК
РНК
РНКэдитинг
80-ые гг.
БЕЛОК
90-ые гг.
(1986)
В 1986 году изменения последовательностей
информационной РНК (мРНК), ведущие к модификации
ДНК-кодируемой информации, были обнаружены в
митохондриях паразитических простейших –
трипаносом
В мРНК наблюдались вставки или (реже) делеции
уридиновых нуклеотидов
Эти вставки приводили к изменению
информационного контекста по сравнению с
закодированным в ДНК-молекуле
Такая "правка" ДНК матриц на уровне мРНК
получила название РНК-редактирование
(RNA-editing)
Митохондриальная ДНК трипаносом и других
кинетопластных простейших, называемая
кинетопластной ДНК, состоит из комплекса больших и
малых колец
Приблизительно 50 сцепленных максиколец размером
23-36 тпн содержат структурные и рРНК гены и
несколько специальных генов РНК-проводников
(guide-РНК)
От 5 до 10000 сцепленных миниколец кодируют все
остальные guide-РНК. Количество различных генов
РНК-проводников в клетках видоспецифично, их
бывает до 300.
Из 20 генов мтДНК трипаносом 12 редактируются
РНК-проводники являются комплементарными –
"антисмысловыми" к участкам редактируемых мРНК
Они способны образовывать короткие
"якорные" дуплексы с пре-редактируемой РНК
вблизи участка эдитинга
Вставки и делеции
уридиновых (U)
нуклеотидов,
обычно в
кодирующие
районы mRNA
транскриптов
митохондриального
генома трипаносом
мРНК перед эдитингом
5'
4
321
AAA (N) 3'
GCGGAGAAAAAAGAAAGGGUCUUUUAAUG
: : :
3‘ UUUUUUUUUU
CAGAAAAUUAC 5'
РНКOH
U
A
проводник
U
C
(quide R NA)
A
A
Поли-U
C
U
Якорь
конец
U
A
U U
ЭДИТИНГ
Отредактированная мРНК
5'
4
3
2
1
GCGGAGAAAAAAUGAAAUGUGUUGUCUUUUAAUG
:
3' UUUUUUUUUUUUUACUUUAUACAACAGAAAAUUAC 5'
AAA 3'
Guide RNA
OH
Предполагаемая структура РНК-проводника (guide RNA),
гибридизирующегося с пре-редактированной и
редактированной мРНК
Последовательность gRNA между двумя дуплексами определяет эдитинг в
сайтах с 1 по 4. Эдитинг закончен, когда достигается полная гибридизация
между молекулами
Редактирование митохондриальных транскриптов
миксомицета Physarum polycephalum
Myxomycota – древние
эукариоты, одни из
первых «обладателей»
митохондрий
Всего в митохондриальных РНК Physarum обнаружено около
1000 точек эдитинга, причем они располагаются не только в белоккодирующих матрицах, но и в рРНК, и в тРНК.
Редактирование Physarum происходит в
основном путем инсерций цитидина. В одной
молекуле мРНК α-АТФазы было обнаружено
54 некодированных цитидинов.
Обнаружены также инсерции динуклеотидов:
GC, GU, CU, AU , AA
Вставки наблюдаются в среднем через
каждые 15-35 нуклеотидов, в рРНК –
через ~45 нуклеотидов
От 9 до 64 нуклеотидов встраиваются в мРНК
матрицы Physarum
Редактирование у миксомицетов каким-то образом связано с
транскрипцией
Инсерции мРНК происходят по позициям, находящимся
на расстоянии не далее 14-22 нуклеотидов от сайта,
который в это время транскрибируется (а возможно и
гораздо ближе)
???
Механизмы узнавания сайтов и биохимические
процессы эдитинга у Physarum пока неясны.
В плазмидах, содержащихся в митохондриях Physarum,
сайты эдитинга не обнаруживаются, что свидетельствует
об ином происхождении плазмид
Редактирование митохондриальных мРНК растений
было обнаружено одновременно в трех лабораториях
CGG в универсальном генетическом коде определяет аргинин
В митохондриальных генах растений CGG
Почему?
триптофан
Неуниверсальность
генетического кода
в митохондриях
растений?
Загадка разрешилась после секвенирования кДНК этих генов:
во многих сайтах мРНК были обнаружены C – U замены
Ген
Сайты эдитинга
белок-кодирующих
областей
митохондриальных
транскриптов
пшеницы
Оказалось, что
эдитингу
подвергаются все
гены, кодируемые
митохондриальной
ДНК растений,
причем по
множеству сайтов
С-U
замены
К-во
сайтов эд. /
Модифи
%
модифицир.
цировано
1000п.н. аминокислот аминокислот
nad1
17
17,4
14
4,3
nad2
36
24,5
28
6,5
nad3
21
59,3
22
13,5
nad4
23
15,5
22
4,5
nad5
11
5,5
10
1,5
nad6
15
23,4
9
3,6
nad7
32
27,1
27
6,9
nad9
14
24,3
12
6,2
atp9
8
33,3
5
6,8
cob
18
41,3
17
4,3
cox2
17
21,8
15
5,8
cox3
12
15,1
12
4,5
rps1
4
7,8
4
2,3
rps2
7
6,4
7
1,9
rps12
6
16
6
4,8
orf 156
4
8,5
3
1,9
orf206
42
67,9
32
15,5
orf240
43
59,7
33
13,8
Распределение сайтов эдитинга может быть весьма гетерогенным
– даже в различных экзонах одного и того же гена
Сайты эдитинга в
транскриптах
некоторых
митохондриально
кодируемых
субъединиц
Комплекса 1 у
пшеницы
nad 4
nad 5
Каждая стрелка соответствует одному сайту эдитинга
У некоторых видов выявлено более 400 точек
C – U конверсий митохондриальной мРНК
только в четырех случаях обнаружены обратные
превращения U – C: в мРНК генов cox3 пшеницы
cox2 гороха и энотеры
cob энотеры
C–U превращения, чаще всего происходящие при
эдитинге, могут значительно изменить рамки считывания
Описаны случаи
•
•
•
появления новых рамок считывания: (ACG)
тре
C–U
(AUG),
мет
образования стоп-кодонов:
глу
CAA
UAA
глу
CAG
UAG
арг
CGA
UGA
Обрывание рамки
считывания
(U–C эдитинг у Ceratophyllum наоборот, аннулирует
стоп-кодоны)
•
изменение аминокислотных последовательностей белков
Идентификация точек эдитинга в какой-то ORF
указывает на то, что данная рамка считывания, скорее
всего, является функционирующим геном.
В митохондриальных транскриптах пшеницы
14 процентов нуклеотидных замен (56 сайтов)
оказываются нейтральными и не ведут к
аминокислотным изменениям в белках
Чем вызвана необходимость эдитинга в этих сайтах ???
???
Возможно, редактирование приводит к изменению
конформации молекул, что облегчает связь с
рибосомами
Чем определяется специфичность эдитинга ???
Например, в транскрипте orf206 редактируется до 68
цитидинов – это 25% всех цитидинов в мРНК orf206.
Какой механизм определяет редактирование
определенного цитидина, а не соседнего с ним?
Пока не удалось выявить ни какой-либо консенсусной
последовательности, ни какого-то мотива во вторичной
структуре, который мог бы служить "указателем" сайта эдитинга
В митохондриальных мРНК растений огромное
количество сайтов эдитинга (500 -1200 точек)
Маловероятно наличие специфических белковых
молекул, узнающих каждая свой сайт
Скорее всего, будут найдены РНК-молекулы,
которые могут действовать как трансдетерминанты (подобно gРHK у кинетопластов),
так и цис-детерминанты, образующие
специфическую вторичную структуру,
узнаваемую ферментами эдитинга
Где же «прячутся» guide РНК в
митохондриальном геноме растений?
• Информационная емкость генома митохондрий
высших растений вполне достаточна для кодирования
gРHK.
• Однако, скрининг митохондриального генома у
Arabidopsis (200000 нуклеотидов с неустановленной
функцией) не выявил антисмысловых
последовательностей, которые могли выполнять роль
gРНК.
• Интересно, что у маршанции, у которой отсутствует
мРНК эдитинг в митохондриях, "излишней" ДНК
значительно меньше – 70000 нуклеотидов
Как соотносятся процессы сплайсинга и эдитинга?
Обычно редактирование мРНК и сплайсинг
интронов – два посттранскрипционных
процесса, которые происходят параллельно и
независимо друг от друга
Если сайты эдитинга расположены в самих
интронных последовательностях –
редактирование предшествует сплайсингу
В большинстве случаев эдитинг белок-кодирующих
сайтов приводит к синтезу функционально
полноценных белков
У табака нарушение
эдитинга atp9 мРНК
препятствует
развитию пыльцы
генов пшеницы orf575 и
orf240 эдитинг приводит к
замене аргининовых кодонов на
триптофановые.
Восстанавливается консенсусная
последовательность в обоих
белках, необходимая для
связывания с гемом
У
У пшеницы эдитинг гена cox2
по 235 нуклеотиду
превращает треониновый
кодон в метиониновый.
Метионин незаменим в
структуре одного из медьсвязывающих доменов COX2
Редактирование структурных РНК
посттранскрипционным изменениям могут
подвергаться не только информационные,
но и транспортные РНК
ядерно
кодируемые
тРНКAla
A
I
митохондриально
кодируемые
дезаминируют 37-ой аденозин
антикодоновой петли эукариот
в инозин
Данный сайт редактирования обладает
поразительным филогенетическим долголетием –
он сохранился в клетках от дрожжей до человека
Митохондриальные тРНК простейшего Acanthamoeba
A
A
A
A
U U
G*U
U U
U-A
A-U
A-U
A-U
G
G
G
A
A C
U C
U C
U-A
G- C
U-A
A-U
Акцепторные
участки тРНК
A
G A C
A-U
A-U
C-G
C-G
C-G
U-A
G
A
A
AC
CU
AU
C-G
C-G
U-A
A-U
A
G AC
G UC
G-C
G-C
A-U
U-A
A-U
A
G-C
G-C
A U U
U*G
G-C
C-G
A-U
Точки тРНК
эдитинга были
предсказаны, а
затем все они
были найдены
Механизм
нахождения точек
эдитинга как-то
связан с вторичной
структурой тРНК
Наблюдаются замены: U – A , G – A, A – G, U – G и U – C
Редактирование восстанавливает комплементарность оснований
Редактирование тРНК матриц может изменять
кодон-специфичность
Ген считался аспарагиновым по
гомологии с др. млекопитающими
мт-тРНКAsp
нередактир.
Didelphis (опоссум)
редактир.
C
Антикодон GCC
глицин
мт-тРНКAsp после
эдитинга узнает 2
глициновых кодона GGС и GGU
U
Антикодон GUC
аспарагин
мт-тРНКGly обычно узнает 4
кодона - GGN, а у опоссума
только
2 - GGА и GGG
У высших растений описано 4 случая тРНК эдитинга:
тРНКPhe
бобы
тРНКHis
лиственница
тРНКPhe
картофель
тРНКCys
энотера
– первый известный случай тРНК
эдитинга у голосеменных
• У всех видов тРНК эдитинг предшествует процессингу,
• затем наблюдается быстрый процессинг
отредактированных молекул,
• не прошедшие эдитинг тРНК не связываются с
аминокислотами и деградируют
Формирование фенилаланиновой тРНК в митохондриях растений –
многоступенчатый процесс
тРНКPhe
5’
3’
ДНК
транскрипция
5’
РНК-эдитинг
5’
СА
3’
т-РНКпредшественник
“эдитосома”
U А
3’
РНКпроцессинг
U А
CCA достройка
A
C
C
U А
Зрелая
молекула
РНК-редактирование хлоропластного генома кукурузы
В рамках гены с
сайтами эдитинга,
числа в скобках –
количество сайтов
эдитинга в гене
В хлоропластном геноме значительно
меньше сайтов эдитинга, чем в
митохондриальном геноме растений
Хп кукурузы – 27 сайтов эд.
Хп табака – 31 сайт
Мт кукурузы – найдено 364 сайта,
предполагается > 1200 cайтов
Во всех случаях эдитинга хлоропластной мРНК высших
растений выявлены только C-U превращения, тогда как
у низших растений обнаружены также U – C замены
Проблема специфичности, т.е. нахождения сайтов
эдитинга не решена ни для митохондриальной, ни для
пластидной мРНК растений
Сходство пластидных и митохондриальных
систем РНК-эдитинга у растений
Основной тип превращений как в митохондриальных, так и в
хлоропластных РНК: C-U эдитинг
Крайне редко в обоих типах органелл отмечается U – C эдитинг
Наиболее часто редактируются вторые нуклеотиды кодонов,
часто наблюдаются определенные типы превращений
• эдитингу подвергаются преимущественно мРНК
• редкие случаи эдитинга описаны для митохондриальных тРНК,
ни одного такого случая до сих пор не зафиксировано в
пластидах
Эдитинг у млекопитающих
был впервые открыт при анализе экспрессии
гена аполипопротеина В (apoB)
apoB мРНК
печень
CAA
нередактиров.
тонкий кишечник
CAA
UAA (стоп-кодон)
мРНК редактирование
6666-го нуклеотида
apo B100 (512 kDa)
apo B48 (241 kDa)
Два белка, синтезирующиеся на apo B матрице,
выполняют различную роль в метаболизме липидов
apo B48 задействован
в транспорте жиров,
поступающих с пищей
и всасывающихся в
кишечнике
apo B100 вовлечен в
транспорт эндогенно
синтезированных
триглицеридов и
холестерола
Оказалось, что катализирует превращение цитидина в
уридин фермент, названный APOBECI и являющийся
цинк-содержащей цитидин дезаминазой с
молекулярным весом 27 kDa
Был клонирован ген, кодирующий APOBECI у
человека, показана его локализация на 12-ой
хромосоме
Экспериментально созданные трансгенные
кролики и мыши экспрессировали данный ген в
печени, что приводило к "гиперэдитингу" –
редактированию других цитозинов в apoB мРНК и
даже других мРНК
Это вызывало серьезные нарушения
функционирования печени вплоть до
канцерогенеза
Редактирование ядерных мРНК
Описан эдитинг гена чувствительности к опухоли Вильмса WT1
Происходит редкое превращение U–C
Leu-280 (CUC) заменяется на пролиновый (CCC)
подавляется ингибирующее действие WT1 фактора, что может
иметь значение в генезе опухоли
Поиск точек РНК-редактирования (ткани мозга человека)
Проанализировано 6768 кДНК клонов
Участки генома
Секвенировано
оснований
Точек
эдитинга
Межгенные
346,113
333
962
Экзоны (транслируемые)
541,772
0
0
Интроны
1486947
1214
816
Экзоны (5’нетранслируемые)
50,129
0
0
Экзоны (3’нетранслируемые)
310,55
9
29
Неизвестные
313,548
171
545
3,049,060
1727
566
ВСЕГО
Эдит./ т.п.н.
Все точки эдитинга были А-I заменами
Таксон
Тип эдитинга
Клеточный
компартмент
Trypanosoma
U инсерции/делеции
митохондрии
Acanthamoeba castellani
Spizellomyces punctatus
U-A, G-A, A-G, U-G, U-C
митохондрии
Physarum
polycephalum
инсерции нуклеотидов
( в основном С),
С-U конверсии
митохондрии
Дельта вирус гепатита
человека
A - I конверсия
цитоплазма хозяина
Вирусы Ebola
A инсерция
цитоплазма хозяина
Парамиксовирусы
G инсерция
цитоплазма хозяина
Высшие растения
С - U конверсии
U - С конверсии
митохондрии
Высшие растения
С - U конверсии
хлоропласты
Млекопитающие
С – U; A – I; U- C; G - A
U-A конверсии
ядро
Улитки, однопроходные,
сумчатые
Различные
нуклеотидные конверсии
митохондрии
Drosophila melanogaster
A –I конверсии
ядро
В различных генетических системах в редактировании
задействованы совершенно непохожие механизмы: вероятно,
мРНК эдитинг неоднократно возникал заново в эволюции
???
Является ли эдитинг "реликтом" пребиотического
РНК-ого мира или это позднейшее приобретение
Отсутствие эдитинга в органеллах водорослей и
некоторых других низших растений говорит в пользу
более позднего его появления
Возникновение эдитинга часто связывают с выходом
растений на сушу. Действительно, редактирование
выявлено во всех группах наземных растений
Эдитинг наблюдается только у наземных растений
эдитинг
нет
эдитинга
семенные
растения
папоротники
Fern allies
печеночники
Marchantiidae
7 видов
Jungermannidae
мхи
земля
вода
Сharales
4 вида
зеленые водоросли
Hornworts
(Anthoceros)
РНК-эдитинг – строго специфическое
посттранскрипционное изменение
информационных и структурных РНК, состоящее во
вставках, заменах и выпадениях нуклеотидов
Редактирование - необычный, сложный,
требующий координирования большого
количества факторов, энергоемкий
генетический процесс
Возникновение РНК-эдитинга в эволюции и его
разнообразные проявления во многих
генетических системах являются пока во многом
непонятным феноменом
Во многих системах роль эдитинга остается загадкой