выделение и химическая структура силенана – пектина
advertisement
Выделение и химическая структура силенана – пектина смолевки обыкновенной Silene vulgaris Бушнева О.А. Научные руководители : акад., д.х.н. Оводов Ю.С., ст.н.с., к.х.н. Оводова Р.Г. Цель работы: 1. Получение пектинового полисахарида из надземной части смолевки обыкновенной Silene vulgaris (Moench) Garke (Oberna behen (L.) Ikonn) 2. Разработка эффективного способа выделения пектиновых полисахаридов из надземной части цветковых растений на примере смолевки обыкновенной 3. Установление общих закономерностей распределения углеводных цепей и особенностей тонкой структуры пектинового полисахарида из смолевки обыкновенной Рис. 1. свежесобранная надземная часть смолевки обыкновенной обработка 0.5% р-ром формальдегида (12 ч., 20°С) и фильтрование остаток сырья фильтрат обработка подкисленной водой (рН 4.0, 3 ч., 50°С), фильтрование фильтрат слив остаток сырья экстракция 0.7%-ным оксалатом аммония (6ч. х 2, 68°С ), фильтрование слив остаток сырья отход силенан объединенный экстракт 1. концентрирование 2. осаждение спиртом 3. диализ 4. лиофилизация Рис. 2. Выход и состав образцов SV из различных образцов S. vulgaris Образцы силенана Выход, %1 Gal A2 ОМе2 Содержание, % Нейтральные моносахариды3 Rha Gal Ara Xyl Man Glc 2.7 3.5 2.6 2.9 3.3 4.0 3.8 3.4 3.2 3.6 Белок2 SV1 SV2 SV3 SV4 SV5 1.9 2.0 2.0 2.8 2.8 55 52 75 74 77 3.1 3.0 3.9 3.8 2.7 1.9 2.0 2.4 2.4 1.2 0.9 1.1 0.8 0.6 0.9 0.8 1.2 1.1 0.8 0.9 1.8 2.6 1.7 1.9 2.1 13 14 12 11 10 SV6 1.5 56 2.4 2.4 2.4 2.6 0.8 1.0 1.8 18 SV7 2.6 69 3.2 1.4 3.0 2.5 0.7 0.8 2.4 15 1- выход от сухого сырья; 2 - в весовых процентах; 3 – в мольных процентах Сбор образцов по фазам вегетации интродуцированной S. vulgaris: SV1 - появление надземной части, SV2 - бутонизация, SV3 - начало цветения, SV4 - массовое цветение, SV5 – конец цветения и начало созревания семян, SV6 - созревание семян; и SV7 - из дикорастущей S. vulgaris в фазу цветения. Рис. 3. объединенный экстракт 1. концентрирование 2. осаждение спиртом 3. диализ 4. лиофилизация 5. гельфильтрация SV 8 1. ультрафильтрация Мw 100 кДа 2. лиофилизация силенан SV выход 2.2%, 78 % D-GalpA, 3.0 % ОМе []D20 = +167.3 (с 0.08; вода) 3.7 % Ara, 3.3 % Gal, 1.8 % Rha, 9 % белок SV 9 выход 2.2%, 80 % D-GalpA, 4.2 % ОМе []D20 + 200.5 (с 0.06; вода) 3.4 % Ara, 2.2 % Gal, 1.7 % Rha, 10 % белок Рис. 4. СИЛЕНАН SV []25 = 120 г/см3, MsD = 22 кДа , 1.15% золы ионообменная хроматография на DEAE-целлюлозе 0.1 M NaСl 0.2 M NaСl 0.3 M NaСl SV-1 SV-2 SV-3 выход 7% выход 10% выход 19% 43 % D-GalpA, 5.4 % Ara, 6.4 % Gal, 2.1 % Rha 70 % D-GalpA, 4.1 % Ara, 4.4 % Gal, 2.0 % Rha 85 % D-GalpA, 2.3 % Ara, 2.1 % Gal, 1.5 % Rha Рис. 5. СИЛЕНАН SV частичный кислотный гидролиз литий-деградация распад по Смиту ферментативный гидролиз пектиназой SVH SVP и SVP-P ГЖХ ЯМР SVP-S ГЖХ - МС SVP-L СИЛЕНАН SV частичный кислотный гидролиз (0.05 М TFA, 24 ч., 50°С) гельфильтрация на S-500 SVH []D = +273.3 (с 0.1; вода) 20 Kav= 0, выход 45 % галактуронан (рамногалактуронан) Рис. 6. Схема частичного кислотного гидролиза SV ЯМР 94 % D-GalpA, 2.7 % ОМе, Rha сл. C4 -1,4- D-GalpA C2 -1,4- D-GalpA C1 -1,4- D-GalpA C6 -1,4- D-GalpA C5 -1,4- D-GalpA C3 -1,4- D-GalpA Рис. 7. Спектр 13С-ЯМР фрагмента SVH Рис.8. Главная углеводная цепь линейной области силенана SV: …4)--D-GalpA-(14)--D-GalpA-(1n4)--D-GalpA-(1… СИЛЕНАН SV ферментативный гидролиз пектиназой гельфильтрация на S-500 GalpA SVP Kav= 0, выход 13 % омыление 0.5 М NaOH ферментативный гидролиз пектиназой гельфильтрация на Р-4 Рис. 9. Схема ферментативного гидролиза SV омыление 0.5 М NaOH ферментативный гидролиз пектиназой гельфильтрация на Р-4 SVP-1 Kav= 0, выход 7% SVP-P Kav= 0.02, выход 6% Рис. 10. GalA МеО 44 % 3.1% 4.3 % SVP Ara Rha 9.3 % 7.8 % ЯМР []D20 = +54.5 (с 0.1; вода) SVP-P Gal 32 % 0% 15.1 % 25.6 % 11.9 % 35 % 0% 15.8 % 22.1 % 12.1 % []D20 = +49.2 (с 0.1; вода) SVP-1 []D20 = +42.1 (с 0.1; вода) C1 -1,4- D-GalpA Rhap CH3 C1 Rhap Рис. 11. Спектр 13С-ЯМР фрагмента SVР-P 2)--Rhap-(1 2)--Rhap-(1 4) Рис. 12. Спектр 1Н/13С HSQC фрагмента SVР-P -Galp-(14)--Galp-(1… -Araf-(15)--Araf-(1… -Galp-(13)--Galp-(1… Рис. 13. Спектр 1Н/13С HSQC фрагмента SVР Рис. 14. Линейный галактуронан: …4)--D-GalpA-(14)--D-GalpA-(1n4)--D-GalpA-(1… Линейный рамногалактуронан: …2)--Rhap-(14)--GalpA-(1n 2)--Rhap-(14)--D-GalpA… Рамногалактуроанан I: Кор: 2)--Rhap-(14)--GalpA-(1n 2)--Rhap-(14)--D-GalpA 4) 4) s.сh. s.сh. Боковые цепи (side chains): -Galp-(13)--Galp-(1… -Galp-(14)--Galp-(1… -Araf-(15)--Araf-(1… []D20 = +54.5 (с 0.1; вода) 44 % D-GalpA, 4.3 % Ara, 9.3 % Gal, 7.8 % Rha SVP распад по Смиту гельфильтрация на G-25, S-500 SVP-S Kav=0.8, выход 7 % ЯМР []D20 = +29.5 (с 0.37; вода) 28 % D-GalpA, 12.9 % Ara, 35.6 % Gal, 5.8 % Rha ГЖХ - МС Рис. 15. Схема распада по Смиту SVP … 3)--Galp-(1 3)- -Galp-(13)--Galp-(13)--Galp-(1 2) … 5)--Araf-(1 5)- -Araf-(1 C2 3)--Galp-(1 C2 2,3)--Galp-(1 Рис. 16. Спектр 1Н/13С HSQC фрагмента SVР-S Рис. 17. Результаты ГЖХ-МС гидролизата перметилированного фрагмента SVP-S Метилированные сахара Фрагменты 2,3,5-Me3-Ara Araf-(1 2,3,4,6-Me4-Gal Galp-(1 2,4,6-Me3-Gal 3)-Galp-(1 2,3,4-Me3-Gal 6)-Galp-(1 2,4-Me2-Gal 3,6)-Galp-(1 44 % D-GalpA, 4.3 % Ara, 9.3 % Gal, 7.8 % Rha SVP литий-деградация смесь олигосахаридов, выход 38 % гельфильтрация на Р-4 SVP-L-1 Kav= 0, выход 10 % ГЖХ - МС []D20 = +39.0 (с 0.06; вода) 22 % D-GalpA, 23.4 % Ara, 27.6 % Gal, 11.9 % Rha Рис. 18. Схема литий-деградации SVP SVP-L-2 Kav= 0.5, выход 12 % []D20 = +37.0 (с 0.06; вода) 32 % D-GalpA , 35.0 % Ara, 33.0 % Gal , 24.0 % Rha Рис.Результаты 19. ГЖХ-МС гидролизата перметилированных фрагментов SVP-L-1 и SVP-L-2 Метилированные сахара Фрагменты 2,3,5-Me3-Ara Araf-(1 2,3-Me2-Ara 5)-Araf-(1 3-Me-Ara 2,5)-Araf-(1 2-Me-Ara 3,5)-Araf-(1 2,3,4,6-Me4-Gal Galp-(1 2,3,6-Me3-Gal 4)-Galp-(1 2,4,6-Me3-Gal 3)-Galp-(1 2,3,4-Me3-Gal 6)-Galp-(1 2,6-Me2-Gal 3,4)-Galp-(1 2,4-Me2-Gal 3,6)-Galp-(1 3-ОMe-Rha 2,4)-Rhap-(1 Рис. 20. Линейные области силенана: …4)--D-GalpA-(14)--D-GalpA-(1n4)--D-GalpA-(1… и …2)--Rhap-(14)--GalpA-(1n 2)--Rhap-(14)--D-GalpA… Разветвленные области силенана: Кор: 2)--Rhap-(14)--GalpA-(1n 2)--Rhap-(14)--D-GalpA 4) 4) s.ch. s.ch. s.ch. - side chains (боковые цепи) Рис. 21. Боковые цепи RG-I: -Araf-(15)--Araf-(1… -Galp-(14)--Galp-(1… -Galp-(13)--Galp-(1… -Galp-(16)--Galp-(1… и Точки разветвления боковых цепей: 5)-Araf-(1 2) 3)- -Galp-(13)--Galp-(13)--Galp-(1 2) 5)- -Araf-(1 3)-Galp-(1 6) 5)-Araf-(1 3) 3)-Galp-(1 4) ВЫВОДЫ 1. Впервые из надземной части цветкового растения Silene vulgaris (Moench) Garke (Oberna behen (L.) Ikonn) выделен пектиновый полисахарид, названный силенаном. Показано, что в состав углеводной цепи силенана входят остатки галактуроновой кислоты (более 60%), арабинозы, галактозы и рамнозы в качестве основных компонентов. Остатки галактуроновой кислоты имеют низкую степень метоксилирования. 2. Разработан эффективный метод выделения силенана из свежесобранного растительного материала, который позволяет получать пектиновые полисахариды в наиболее нативном состоянии. 3. Показано, что макромолекула силенана состоит из линейных и разветвленных областей. Линейная область представлена -1,4-Dгалактопиранозилуронаном и -1,2-рамно- -1,4-Dгалактуронаном, который является углеводной цепью разветвленной области силенана – рамногалактуронана I (RG-I). Боковые цепи RG-I присоединены 1,4-связью к остаткам рамнопиранозы кора и представляют собой линейные цепи -1,5-связанной арабинофуранозы и -1,3-, -1,4- и -1,6-галактопиранозы. Точками разветвления являются остатки 2,5-, 3,5замещенной арабинофуранозы и 2,3-, 3,6-, 3,4замещенной галактопиранозы. 4. Использование классических и современных методов структурной углеводной химии, включая спектроскопию ЯМР, позволило подтвердить наличие ковалентных связей между линейной цепью рамногалактуронана и боковыми углеводными цепями разветвленных областей силенана. 5. В процессе изучения силенана получена принципиально новая дополнительная информация для базы данных по спектроскопии ЯМР пектиновых полисахаридов, которая может быть использована для структурного исследования пектинов из новых растительных источников. Данная работа поддержана грантами РФФИ (Гранты No. 00-04-48063, 01-04-96437) и «Минпромнауки РФ» (Грант No. 02-4208). Авторы выражают благодарность д.х.н., проф. А.С. Шашкову (ИОХ им. Н.Д. Зелинского, РАН) за съемку и помощь в расшифровке ЯМРспектров и к.х.н. А.О. Чижову (ИОХ им. Н.Д. Зелинского, РАН) за съемку и помощь в расшифровке хромато-массспектров. Научная новизна: Впервые установлена частичная химическая структура силенана, пектинового полисахарида из надземной части смолевки обыкновенной Silene vulgaris (Moench) Garke. С этой целью, наряду с современными методами структурной химии углеводов, широко использована двумерная гомоядерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Установлено, что отличительной структурной особенностью силенана является наличие длинных участков линейного - 1,4-D-галактопиранозилуронана. Кроме того, впервые показано, что макромолекула силенана содержит фрагменты линейного рамногалактуронана и разветвленной области, представленной рамногалактуронаном I (RG-I). Впервые доказана связь главной и боковых углеводных цепей силенана через остатки рамнопиранозы кора разветвленной области. При этом показано, что боковые цепи разветвленных областей силенана представляют собой блоки, состоящие из различных типов арабиногалактана. Установленная химическая структура силенана не только подтверждает общие закономерности распределения углеводных цепей, но и дает новую информацию об особенностях тонкой структуры пектиновых полисахаридов.
