РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ И ВЫПУСК ОПЫТНЫХ ПАРТИЙ

ИБХ
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЙ
И ВЫПУСК ОПЫТНЫХ ПАРТИЙ
СИНТЕТИЧЕСКИХ И РЕКОМБИНАНТНЫХ
БЕЛКОВО-ПЕПТИДНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ
КОРРЕКЦИИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ
ПРОЦЕССОВ И ЛЕЧЕНИЯ СОЦИАЛЬНО
ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОНТРАКТ
№ 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г.
Институт биоорганической химии
им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
2
ЦЕЛЬ ПРОЕКТА
Разработка технологий получения
регуляторных белков с улучшенными
свойствами и новых синтетических пептидов
для внедрения в практику здравоохранения
как оригинальных отечественных
лекарственных средств или
импортозамещающих рекомбинантных
лекарственных препаратов
пролонгированного действия.
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
3
ЦЕЛЬ ЭТАПА
Масштабирование процедур синтеза и очистки
конъюгатов интерферона альфа, интерферона
бета и Г-КСФ с полисиаловой кислотой и
низкомолекулярными модификаторами.
Проведение испытаний полученных
конъюгатов.
Проведение испытаний антидепрессантного
пептида.
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
4
Синтез конъюгатов Г-КСФ с низкомолекулярными
модификаторами
Cys17
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
5
Ограничения технологии синтеза конъюгатов Г-КСФ с
низкомолекулярными модификаторами
Недостаточно высокий выход модифицированных
дисахаридов (не более 35 - 40 %).
Низкий выход конъюгатов, дополнительно
снижающийся при масштабировании.
Нестабильность полученных конъюгатов в растворе,
приводящая к олигомеризации и потере активности
белка.
ВЫВОД : дальнейшая технологическая разработка
данного решения экономически НЕЦЕЛЕСООБРАЗНА.
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
6
ИННОВАЦИОННАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПРОЕКТА
НЕКОВАЛЕНТНОЕ ПОЛИСИАЛИРОВАНИЕ – новый подход к
решению проблем генно-инженерных технологий и внедрения
отечественных рекомбинантных препаратов на
фармацевтический рынок.
Спиральные участки молекулы полисиаловой кислоты
могут взаимодействовать с белкаи
АСМ высокого разрешения
нанокомплексов
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
7
ПРЕИМУЩЕСТВА НЕКОВАЛЕНТНОГО
ПОЛИСИАЛИРОВАНИЯ
Использование только природных полимеров
Отсутствие нарушений первичной структуры белка
Минимальные обратимые изменения вторичной структуры белка
при сохранении его третичной структуры
Сохранение специфической биологической активности белка
Увеличение стабильности растворов субстанции
Увеличение продолжительности действия полисиалированных
белков
Высокий выход продукта нековалентного полисиалирования
Простота технологии получения нанокомплексов
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
8
Технология получения полисиалированных белков
1
Ферментация
(тельца включения)
2 Восстановление
дисульфидных
связей
Хроматографическая
очистка белка
4
3 Реокисление
Ренатурация
Характеристика
препарата
5 Активация
полисиаловой
кислоты
6 Синтез
комплекса
7 Стерильная
фильтрация
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
9
Характеристика белковых препаратов
Изменение электрофоретической подвижности
1.46 AU
IFN
PSA
1
2
13180010
1 2 3
4 5 6 7
1
Полиакриламидный гель, неденатурирующие
условия, без концентрирующего геля, рН 8.8,
8%Т. 1 – нативный интерферон β, 2 – комплекс
с полисиаловой кислотой 22 кДа, 3 – нативный
гранулоцитарный колонестимулирующий
фактор, 4 – комплекс с полисиаловой кислотой
22 кДа, 5 - карбангидраза, 6 – α-лактоглобулин,
7 – БСА.
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 мин
Суперпозиция хроматограмм
немодифицированного интерферона альфа 1б (1)
и его комплекса с полисиаловой кислотой 22 кДа
(2). IFN – белок, PSA – полисиаловая кислота.
Отсутствие ковалентной модификации
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
10
При нековалентном полисиалировании вторичная структура
белка изменяется незначительно
Спектр кругового дихроизма полисиалированного Г-КСФ в
сравнении с нативным белком
100000
80000
mdeg*cm2/dmol
60000
40000
G-CSF
20000
0
190
R196-CA 3.8 mg/ml
200
210
220
230
240
250
-20000
-40000
-60000
nm
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
11
Пептидное картирование – подтверждение нативности
первичной структуры белка
1.5 AU
PSA-IFNa13100010
13490010
IFNa
Усл. ед.
1.2
Inf a2b
1
PSA-Inf
a2b
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Номер
пептида.
Профиль пептидов после гидролиза рИФН α2b (inf a2b) и его комплекса с
полисиаловой
(PSA-inf)
2
4
6 кислотой
8
10
12 трипсином.
14
16 ВЭЖХ
18 на
20обращённой
22
24 фазе.мин
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
12
Стабильность полисиалированных белков при лиофилизации
Раствор субстанции
1 2
3 4
5 6
7
8 9 10 11 12 13
Г-КСФ
ИФНα2b
Лиофилизация
Растворение в воде
1, 2 – стандарты Г-КСФ, 3, 5 – комплексы ПСК-Г-КСФ до
лиофилизации, 4, 6 – комплексы ПСК-Г-КСФ после
лиофилизации, 7 – комплекс ПСК- рИФНα2b до
лиофилизации, 8, 10 стандарты рИФНα2b, 9 – комплекс
ПСК- рИФНα2b после лиофилизации, 11 – α-лактоглобулин,
12 – карбангидраза, 13 – БСА
Электрофоретическое разделение в неденатурирующих
условиях без концентрирующего геля, общая концентрация
акриламида 7%, рН 8,8. Окрашивание EZBlue.
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
13
Наработка опытных партий белковых препаратов
Полисиалированный белок
Количество, Чистота, %
г
Биологическая активность
(активность стандарта)
EC50, нг/мл
Интерферон
альфа 2б
10
98.1
13±1.5
(11±1.5 )
антипролиферативная
Г -КСФ
10.2
95.2
12±1.5
(14±1.5 )
пролиферативная
Интерферон
бета 1б
9.8
92.3
20±3
(20±3)
антипролиферативная
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
14
Биологическая активность белковых препаратов in vivo
Препараты
полисиалированных
белков
Степень пролонгации
биологического эффекта
Интерферон
альфа 2б
34.4
Г -КСФ
2.8
Интерферон
бета 1б
4.5
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
15
Испытания эффективности и безопасности пептидного
препарата ИБХ-05OH
Наименование испытаний
Результаты
Изучение специфической активности
препарата
Антистрессорное и антидепрессивное
действие (доза 10 – 100 мкг/кг)
Изучение острой токсичности и
переносимости при однократном введении и
токсичности при многократном применении
Низкотоксичен (LD50 > 1440 мг/кг). Не
вызывает никаких клинических и
функциональных нарушений при длительном
применении.
Изучение влияния на репродуктивную
функцию и развитие потомства и мутагенной
активности
Не обладает эмбриотоксическим и
тератогенным действием, не имеет
мутагенной активности
Изучение влияния на иммунную систему и
аллергенной опасности препарата
Не проявляет аллергенных свойств, обладает
слабо выраженной иммуномодулирующей
активностью.
Изучение общих фармакологических и
фармакокинетических свойств препарата
Основное количество радиоактивности (около
90%) выводилось в течение 24 час после
введения меченого пептида.
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
16
Результаты 4 этапа
1. Разработаны опытно-промышленные регламенты получения рИФНα-2b и рГ-КСФ.
2. Разработан лабораторный регламент получения полисиалированного рИФНβ-1b
3. Проведена наработка опытных партий полисиалированных белков в количестве
9.8 – 10.2 г субстанции каждого препарата.
4. Проведен анализ качества белковых препаратов.
5. Проведены испытания полученных полисиалированных белков в системах in vivo
и показано, что время полужизни таких препаратов существенно больше времени
полужизни немодифицированных белков.
6. Проведено тестирование эффективности и безопасности полученных
препаратов.
7. Наработана опытная партия синтетического пептида ИБХ-05ОН в количестве 50г.
8. Проведены испытания антидепрессивных и противотревожных свойств
пептидного препарата ИБХ-05ОН, а также его эффективности и безопасности.
Показано, пептид ИБХ-05ОН является препаратом средней токсичности, относится
к классу психотропных веществ, с выраженным действием на ЦНС, обладающих
анксиолитическим, психоседативным, и противотревожным действием.
9. Разработан проект Фармакопейной статьи предприятия на препарат ИБХ-05ОН.
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
17
Медицинское применение белковых препаратов
Активная
субстанция
Показания к
применению
Цена
упаковки
(дозы),
руб
Перспективы применения
Интерферон
альфа 2б
Вирусные,
онкологические
заболевания, нарушение
функций иммунной
системы
6500
Выявлено более 100
направлений клинического
использования препарата.
Перспективны комбинации с
другими препаратами.
Г -КСФ
Нейтропении,
онкологические больные
после химиотерапии
9000
Годовая потребность в препарате
рГ-КСФ в России (РОНЦ РАМН)
составляет 45-60 кг субстанции
препарата и 450-600 тыс.
флаконов готовой лекарственной
формы.
Интерферон
бета 1б
Вирусные инфекции
(гепатит С, везикулярный
стоматит), рассеянный
склероз
40000
Потребность в современном
препарате для лечения
рассеянного склероза
оценивается миллионами доз, (15 кг субстанции)
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
18
Перспективы пептидных препаратов
ИБХ-07ME – противоалкогольный препарат
В случае успешного завершения клинических испытаний и начала
промышленного выпуска препарата ИБХ-07ОМЕ планируется в первый год 11,5% проникновения препарата на рынок России, что составит не менее 1 млн.
долларов поступлений от реализации препарата.
ИБХ-05OH – антидепрессантный препарат
После завершения клинических испытаний препарат планируется применять
при следующих заболеваниях:
- пограничные состояния с симптомами страха и тревоги,
- острые тревожные состояния,
- эмоциональное напряжение и беспокойство,
- профилактика стрессовых состояний в клинической практике, в военной
медицине и медицине катастроф.
При организации современного производства пептидных препаратов
рентабельность может составлять до 50% при производстве субстанций, а
общая рентабельность производства может составлять до 40%.
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
19
Результаты работы. Патенты.
Название патента
Авторы
Регистрационн
ый номер
Способ очистки
рекомбинантного
интерферона бета-1b
Воробьев И.И.
Пономаренко Н.А.
Мирошников А.И.
Смирнов И.В.
2008139497
Комплекс биологически
активного рекомбинантного
белка с полисиаловой
кислотой
Безуглов В.В.
Грецкая Н.М.
Бобров М.Ю.
Акимов М.Г.
Баирамашвили Д.И.
Шибанова Е.Д.
Клинов Д.В.
Мирошников А.И.
2008140687
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
20
Результаты работы. Регламенты.
Наименование
Количество
Лабораторные регламенты получения рекомбинантных белков:
интерферона альфа 2б, гранулоцитарного
колониестимулирующего фактора, интерферона бета 1б
3
Опытно-промышленные регламенты получения рекомбинантных
белков: интерферона альфа 2б, гранулоцитарного
колониестимулирующего фактора
2
Лабораторные регламенты получения субстанций
полисиалированных рекомбинантных белков: интерферона
альфа 2б, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора,
интерферона бета 1б
3
Лабораторные регламенты получения субстанций пептидных
препаратов ИБХ-05OH, ИБХ-07ME
2
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.
21
Достижение заданных значений программных
индикаторов
Параметр
Значение
Количество разработанных новых
технологий
2
Количество молодых специалистов
28
Количество защищённых диссертаций
2
Количество публикаций
5
Госконтракт № 02.522.11.2007 от 11 мая 2007 г. Этап 4.