Динамика циркуляции серовариантов S.pneumoniae в Приамурье Г.Н. Холодок, д.м.н., вед. научный сотрудник

Хабаровский филиал ДНЦ ФПД –
НИИ охраны материнства и детства
Динамика циркуляции
серовариантов S.pneumoniae в
Приамурье
Г.Н. Холодок, д.м.н., вед. научный сотрудник
Ученый совет ДНЦ ФПД
2 декабря 2015,
Благовещенск
Структура заболеваемости детей и подростков в
Хабаровском крае (%, 2013)
Актуальность пневмококковой инфекции
Пневмококк до настоящего времени признан ведущим этиологическим
агентом внебольничных пневмоний, синуситов, острого среднего
отита и частым возбудителем менингита и септицемии*
По данным ВОЗ пневмония до сих пор является одной из главных причин
детской смертности во всем мире. Среди причин летальности у детей
до 5 лет на ее долю приходится 15 -17%.
В 2013 году от пневмонии умерли 935 тысяч детей в возрасте до 5 лет, это
больше, чем СПИД, малярия и корь вместе взятые**.
*Холодок Г.Н., Евсеева Г.П., Ивахнишина Н.М. и соавт.// Дальн. мед. журн.-2014.-№3.-С. 29 – 33.
**ВОЗ. Информационный бюллетень № 331 (ноябрь 2014 г.). URL: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/ru/
Отечественные исследования.
• «Пневмококковая инфекция вошла в число управляемых». Таточенко В.К., 2010,
Журн микробиол,2010 (3):102-107
• «Пневмококковая инфекция и современные возможности ее профилактики –
эпидемиологический обзор ситуации в мире и в России». С.В. Сидоренко. Ю.В.
Лобзин. С. М. Харит, И.С. Королева, В.К. Таточенко, Вопросы современной
педиатрии, 2010,9(1):62-69.
• «Серологическая характеристика и чувствительность пневмококков к
антибиотикам, выделенных у детей в возрасте до 5 лет в отдельных регионах
Российской Федерации». Р.С. Козлов, А.Н. Чагарян, Л.В. Козлова, А.А. Муравьев.
Клин микробиол антимикроб химиотер, 2011, 13(2): 177-187.
и др.
Основные данные :
*в России реальные данные о частоте инвазивных пневмококковых инфекций
отсутствуют
*высокая социальная значимость пневмококковых инфекций требует
разработки и реализации профилактических мероприятий
*основные серотипы пневмококков циркулирующих в России у носителей и
больных включены в состав пневмококковых вакцин
* резистентность пневмококков к АМП связана с циркулирующими
штаммами
* Вакцинация способствует снижению заболеваемости и уменьшению
резистентности пневмококков в популяции
Источником инвазивных вирулентных штаммов пневмококков
являются носители, из которых наиболее актуальны дети в возрасте
до 5 лет, посещающие организованные коллективы.
Из более 94 известных сегодня серологических вариантов
S.pneumoniae возбудителями являются небольшой спектр (25-30)
вариантов, обладающих факторами агрессии.
Они достаточно хорошо изучены и основные включены в
полисахаридную (Пневмо 23) и конъюгированные (Превенар 13)
вакцины.
Вакцина Превенар 13, включена с 1 января 2014 года в
национальный календарь прививок России.
S. pneumoniae в качестве основного биотопа
предпочитают эпителиоциты заглоточной области и при
стандартных рутинных бактериологических
обследованиях, когда на исследование берется
материала из полости носа или зева, их выявляют не
часто.
 С помощью метода ПЦР частота детекции ДНК
пневмококка значительно возрастает.
 Так, в 2006 г. ДНК S.pneumoniae обнаружена в
носоглоточных мазках (n=69) у 87% детей, а при
высеве бактериологическим методом S.pneumoniae
выделен только в 18% у тех же детей.
 При исследовании в 2014 году носоглоточное
носительство пневмококка методом ПЦР
установлено в 94,4% случаев (n=57).
 Таким образом, уровень носительства
пневмококка сохраняется на достаточно
высоком уровне.
Носоглоточное носительство
КуличенкоТ. В. , НЦЗД, Москва. – Разброс данных по РФ от 65 до 20%.
Бактериологические посевы.
2011-12 гг. обследовано 864 ребенка в возрасте < 5 лет – носительство – 24%
2014-15 гг. 246 детей (Н/о -76, д/с - 144, д/дом – 25) – носительство 23%.
По другим регионам данные очень разнятся.
У нас регистрировали носительство от 18 до 90% в отдельных коллективах, в
зависимости от вида метода исследования.
Важным является изучение
спектра серологических
вариантов пневмококков.
Поскольку наиболее опасны с
точки зрения развития инфекции и
устойчивости к антибиотикам
только определенные варианты
пневмококка.
Бактериологический метод 2009 г.
Резистентность пневмококков
Длительное время пневмококк отличался высокой природной
чувствительностью к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам и
макролидам, но в начале 80-х годов XX века стали появляться устойчивые к
АМП штаммы и далее отмечается катастрофическое нарастание устойчивости
пневмококка во многих странах мира.*
По данным отечественных исследователей в России длительное время
сохранялась чувствительность пневмококка к амоксициллину и макролидам, на
фоне увеличения устойчивости к пенициллину, тетрациклину и сульфометакзолу
(ко-тримоксазолу). По результатам проспективного многоцентрового
исследования ПеГас I-IV резистентность к пенициллину увеличилась с 1,9 до 2,1 %**
ПеГас I -IV
в 1999-2003 гг. резистентными к пенициллину, амоксициллину, и цефтриаксону
(соответственно) были 9,7%, 0,1%, и 1,8% штаммов
в 2004-2005 гг. -8,1%, 0,3%, и 2% штаммов,
в 2007-2009 гг. – 11,2%, 0,4%, и1 % штаммов.
Для макролидов уровень устойчивости варьировал от 2,0% до 8,2%
С 1999 г. по 2009 г. сохранялся высокий уровень резистентности к тетрациклину
(24,6-29,6%).
Резистентность к ко-тримоксазолу составила и 39% - в 2006-2009 гг.
*Белошицкий Г.В. КМАХ. 2011, Т. 3, №3.С. 261-266
(Согласно трактовке по CLSI)
**Козлов Р. С. МАКМАХ, 2010; С.М. Харит С.М., 2009
Показатели резистентности пневмококка по Хабаровскому краю, по данным
наших исследований (2007 - 2010 гг.) превышали данные по РФ в 2-3 раза.
По результатам тестирования чувствительности 68 штаммов S.pneumoniae ,
изолированных у детей с внебольничной пневмонией (ВП) суммарная частота
выявления резистентных (7,4%) и умеренно резистентных (17,6%) к пенициллину
составила 25,0%, уровень резистентности к макролидам достигал 17,5%.
* Холодок Г.Н. Москва, 2012.
По результатам исследований изолятов пневмококка, полученных у больных
внебольничной пневмонией в 2010-13 гг. установлены высокие уровни
резистентности штаммов S. pneumoniae, изолированные из мокроты у детей с
внебольничной пневмонией к антимикробным препаратам .
Отмечено снижение чувствительности к амоксициллину с 94,4% (2010 г.) до 78%
(2013 г.) за счет появления резистентных штаммов в 7,4% случаев,
отсутствующих до 2010 г. и штаммов с промежуточной устойчивостью (I) в 14,17%
случаев.
Показатель MIC50 составляет 0,06 и MIC90 4 мг/мл.
Отмечен значительный рост резистентности
S. pneumoniae к макролидам,
особенно к азитромицину.
Чувствительные штаммы к нему
выявлены только в 26,5% случаев
(80,5% в 2010 г.),
а доля резистентных штаммов
увеличилась более чем в 4 раза –
с 15 до 73,5% (!) случаев.
Учет по стандарту EUCAST
Полирезистентностью, то есть устойчивостью к 3 и более классам
антибиотиков, обладали 51% исследованных нами штаммов S. pneumoniae,
частота выявления которых уже в период 2007- 2009 гг. составляла 36,8% и
превышала общероссийские данные в 2,5 раза (11,8%).
Важно отметить, что все зарегистрированные полирезистентные штаммы
чувствительны в 100% случаев к левофлоксацину, эртапенему, линезолиду и
ванкомицину.
Большинство штаммов относятся к серотипу 19F.
Серологические варианты S.pneumoniae циркулирующие в 2009-12 гг.
(n=141)
8 серотипов (1,3,4,5,8,14,25,37) и 5 серогрупп (6,9,19,15 и 23) S.pneumoniae.
Преобладала циркуляция 19 серогруппы
Клинические штаммы n=121
%
60
55
Носоглоточные штаммы n=20
α <0,005 различие достоверно для 19 серогруппы
50
α < 0,05 различие достоверно для 1 серотипа
40
31.4
26.4
30
20
15
30
14.9
5.8
10
4.9
4.1
4.1
2.5
1.6
0.8
0.8
0.8
0.8
8
14
23
4
5
9
15
25
37
0
1
19
6
3
Сероварианты
1 серотип выявляли чаще у больных
19 и 6 серогруппы – у носителей
Спектр серовариантов у носителей включает
только 1, 19 и 6 варианты
В спектре серовариантов у больных
присутствовали инвазивные сероварианты 3, 5, 23, 9
12
Вакцины перекрывали спектр
региональных вариантов
Пневмо 23 на 84%
ПКВ 7
на 46%
ПКВ 10
на 61%
ПКВ 13
на 69%
Региональный спектр серовариантов пневмококка в 2013 году
Установлено 8 серовариантов (n=57)
Также преобладает высокая частота
выявления вакцинного штамма серотипа 19F
(40,4%):
Из 25 штаммов 19 серогруппы
23 изолята принадлежат серотипу 19F и 2 –
19A.
Все эти штаммы, как и серогруппу
6АВ, ассоциируют с
резистентностью и
полирезистентностью
пневмококка*.
87,5% принадлежит вакцинным штаммам, включенным в состав конъюгированной
вакцины «Превенар 13»
73,7% - основным вариантам, имеющим клиническое значение в России –
19F, 6AB и 3.
* Ralf R. Reinert e.a.Vaccine. -2010. -Vol. 28.
Региональный спектр серовариантов пневмококка
в 2013 году ( n=57) по нозологиям и у здоровых носителей
Все установленные сероварианты присутствуют у носителей, больных
пневмонией и синуситом.
При пневмококковой инфекции чаще других выявлен серотип 19F -53% при ВП и
в 50% и синуситах.
У носителей с равной частотой (22.7%) выявляли серотипы 19F и 6 AB.
 Оценка серологических вариантов пневмококка циркулирующих в
популяции носителей в условиях вакцинации конъюгированной вакциной
Превенар 13 (PCV13) является важной частью эпидемиологического
надзора за пневмококковой инфекцией
 Согласно утвержденной МЗ ХК и Управлением Роспотребнадзора по
Хабаровскому краю программе «Оценка эффективности вакцинации против
пневмококковой инфекции», разработанной в декабре 2013 года с участием
НИИ ОМиД с февраля 2014 года начаты мониторинговые исследования по
оценке циркуляции серологических вариантов S.pneumoniae в
послепаводковом периоде.
 Протокол исследования разработан в соответствии с Национальным
стандартом РФ ГОСТ Р 52379-2005 «Надлежащая клиническая практика»,
утвержденным приказом Федерального агентства по техническому
регулированию и метрологии от 27 сентября 2005 г. №232-ст. и утвержден в
Министерстве здравоохранения Хабаровского края в декабре 2013 г..
 Обследовано 100 детей, посещающих детские дошкольные учреждения,
находившихся в зоне подтопления во время катастрофического паводка на
р. Амур в августе-ноябре 2013 года.
2015 – Проведен анализ и оценка динамики смены серотипов пневмококка у
носителей - детей в возрасте 3 – 5 лет, посещающих детский сад из зоны
подтопления во время катастрофического паводка на р. Амур в 2013 году.
Дети были вакцинированы конъюгированной вакциной Превенар 13 в декабре 2013 январе 2014 по окончании паводка в рамках программы защиты пострадавшего от
наводнения населения от инфекционных заболеваний.
Все исследования проводили после получения информированного согласия
родителей.
Обследование проведено до и через год после вакцинации.
Материал исследован бактериологическими (64 пробы) и молекулярногенетическими (ПЦР-РВ в режиме мультипрайм) (94 пробы) методами.
Метод ПЦР применяли для выявления ДНК пневмококка из образцов носоглоточных
мазков.
Серотипирование также проводили методом ПЦР-РВ в формате мультипраймерной
детекции
 До вакцинации
 Методом бактериологического исследования
носоглоточное носительство пневмококка
выявлено в 48,4% случаев и в 93,4% случаев –
методом ПЦР.
 Установлено сохранение и некоторое увеличение в
2014 году преимущественной циркуляции 19F
сероварианта S.pneumoniae - в 37,5 % случаев
(22,7% в 2013 году).
 64% штаммов серотипа 19F оказались устойчивы к
β-лактамным антибиотикам.
Носоглоточное носительство пневмококка (2014)
Установлено 12 серовариантов
 На индивидуальном уровне у части детей было выявлено
носительство 2-х или 3-х серовариантов как до, так и
после вакцинации.
 До вакцинации ассоциации серовариантов установлены в
15,1%, после вакцинации в 22,2% случаев.
 Наиболее часто выявляли ассоциации 19F, 6A/B/C/D, 4 и 5
серовариантов.
 Через год после вакцинации обследовано 36 детей из
этой группы детей.
 Основной спектр серотипов остался прежним также с
преобладанием 19F серотипа – 44,4%.
 Элиминированы были 23 и 9V серотипы
 Появилось носительство невакцинных штаммов в 22,2%
случаев
Сероварианты у вакцинированных через год после вакцинации
 Установлено снижение носительства серогрупп 14 с 19 до 8,3% и
18A/C/F c 7 до 5,6% .
 Обнаружено появление невакцинных штаммов в 22,2% случаев.
Таким образом, произошло замещение части вакцинных штаммов на
невакцинные.
 Всего сохранилось носительство прежнего (до вакцинального)
сероварианта в 61,1% случаев (у22 из 36 детей).
 Из них при сохранении прежнего варианта после вакцинации у 22,2%
детей к нему присоединилось носительство дополнительного
вакцинного варианта.
 Полная замена одного вакцинного серотипа на другой установлена в
16,7% случаев.
 Полная смена вакцинных серотипов на невакцинные – у 22,2% детей.
Таким образом, всего полная замена серовариантов установлена у
38,9% детей.
 Среди серовариантов, элиминированных после вакцинации на
индивидуальном уровне, выявляли практически все
циркулирующие варианты.
Динамика носительства серотипов после вакцинации
С целью выявления филогенетической связи штаммов
пневмококка, циркулирующих в ДВ регионе, с основными
вариантами, выявленными в популяции человека,
в 2015 г. проведен молекулярно-генетический анализ 9-ти
штаммов, изолированных у детей с внебольничной
пневмонией, 2-х с хроническим бронхитом и 2-х от носителей.
 Исследования проводили в рамках Гранта ДВО РАН № 12-I-П5-06
«Мультилокусное сиквенс-типирование дальневосточных штаммов
пневмококка» и договора о научном сотрудничестве НИИ ОМИД с
Тихоокеанским институтом биоорганической химии (Владивосток).
 Секвенирование ПЦР-фрагментов генов МЛСТ проводили на
автоматическом анализаторе PE/ABI 310 DNA с использованием набора
реактивов BigDye Terminator cycle sequencing Ready Reaction Kit (PE
Applied Biosystems). ПЦР-фрагменты очищали методом молекулярного
клонирования с использованием набора InstTAclone PCR Cloning Kit
(Fermentas). Для трансформации плазмид использовали штамм E.coli
DH5α.
Исследование сиквенс-типов пневмококков Дальнего Востока выявило
три основные филогенетические группы.
Центральная группа (кластер в середине дерева) включает изоляты серотипа 19F
нового сиквенстипа ST11157, распространенного в 2012-2013 гг. пневмококка в
Хабаровском крае, вызывающего пневмонию у детей, кластеризующегося с
известным сиквенстипом ST271.
Хр.бронхит, 3серотип , S
Носитель 19A, S
ВП 19F, S
Носитель 19A, R
ВП 19F, S
клон Taiwan 19F-14
ВП 19F, 5 штаммов, 3-полирез.
Хр.бронхит, NT, S
ВП 19F, S
ВП NT, R полирезистентность
 К сиквенстипу ST271 относятся в основном азиатские
полирезистентные штаммы, зачастую с высокой устойчивостью к
макролиду эритромицину (>128, >256), но чувствительные (МПК≤ 0,06
мг/л) или умеренно чувствительные (МПК 0,12 - 2 мг/л) к пенициллину,
выделяемые у носителей Южной Кореи и Китая с 1998 г.
 Дальневосточные изоляты ST11157 в 3-х из 5 случаев оказались также
полирезистентны: с МПК пенициллина 4 мг/л, эритромицина от 1 до
128 мг/л, тетрациклина от 4 до 8 мг/л.
 В Америке единственные изоляты ST271 были выделены в 1994, затем
в 2000 г. В Европе данный сиквенс тип начали фиксировать в 20032007 г.
 Практически все штаммы ST271 относятся к серотипу 19F и отличаются
от нового ST11157 лишь по одному самому дивергентному гену ddl
(аллели 26 и 229 соответственно).
 Считается, что родоначальный клон у ST 271 – известный
международный эпидемический клон Taiwan 19F-14, принадлежащий
к сиквенстипу ST236
 Сиквенс типы Дальневосточные, зарегистрированные в
международной Базе данных MLST
(www.mlst.net).
5 штаммов, все 19F,
3 штамма устойчивы –
MIC пен 4мг/л,
эритр -32-128мг/л
Цтк-0,5-32 мг/л
 К ST236 относятся недавно секвенированные изоляты Китая
AO26, ST566, которые отличаются от ST 271 аллелями гена aro (15
и 4 соответственно), а от ST 11157 двумя генами aro и ddl.
 В 2013 г в Великобритании был выделен еще один изолят нового
сиквенстипа ST11157 с тем же серотипом 19F у трехлетнего
ребенка, из антибиотикочувствительности которого известна
только резистентность к пенициллину (R).
 Новый Дальневосточный генотип полирезистентного
пневмококка ST11157 появился, вероятно, совсем недавно из
варианта, ассоциированного с носительством, в результате
эволюционных рекомбинационных процессов.
 Такие процессы могут быть связаны с адаптацией к повышенным
дозам и частотой употребления антибиотиков у детей*
*Stratchounski L., e.a. 2002, Italy.
*Grudinina S.V., e.a., American Society for Microbiology, 2003, .
Заключение
 На Дальнем Востоке установлено носоглоточное носительство
резистентных и полирезистентных штаммов S.pneumoniae,
ассоциированных с наиболее распространенным серотипом 19F.
 Выявлена циркуляция всех серовариантов, входящих в состав
вакцины против пневмококковой инфекции Превенар 13.
 Вакцинация конъюгированной поливалентной вакциной Превенар 13
привела к появлению носительства невакцинных штаммов у 22,2%
детей через год после вакцинации.
 Наблюдается как сохранение носительства вакцинных штаммов, так и
их элиминация.
 У части детей отмечено носительство 2-х или 3-х серовариантов
пневмококка.
 Для оценки динамики циркуляции серовариантов в популяции детей
требуется длительное мониторирование носоглоточного
носительства.
 Установлено филогенетическое родство дальневосточных штаммов с
изолятами, выделенными в разных регионах мира.
Заключение
 Филогенетический анализ всех нуклеотидных последовательностей
МЛСТ у дальневосточных изолятов показал, что распространенный в
Хабаровском крае дальневосточный сиквенстип ST11157 образует
четко выделенную генетическую линию полирезистентного
инвазивного пневмококка с пневмотропным серовариантом 19F.
 Все остальные сиквенстипы представляют из себя достаточно
близкородственные изоляты.
 Вероятность того, что сиквенстипы ST7526, 11192, 11195, 11196 имеют
общее происхождение от одного предка с сиквенстипом ST2639 и
полирезистентным пневмококком серотипа 10А (Испания,2003г.), с
ST5158 российского изолята серотипа 6А (2005г., Иркутск.) с похожим
профилем устойчивости к антибиотикам, как и дальневосточный
ST2639 составляет 98%
 ST11194 – вероятность общего происхождения с сиквенстипом ST880,
составляет 100%.
 На сегодняшний момент сиквенстип ST880 определен только у 9 изолятов
разных серотипов (23F, 6A, NT) с повышенной резистентностью к макролидам
(МПК >128 мг/л) в Южной Корее (1998-1999 гг.), Китае (2001, 2006 гг.), Турции
(2010 г.) и теперь на Дальнем Востоке России (2012 г).
Спасибо за внимание