Методы ЛАЛ-теста Часть 3 1

Реклама
Методы ЛАЛ-теста
Часть 3
1
Признанные методы ЛАЛтеста
•
•
•
•
•
•
Гель-тромб
Полуколичественный гель-тромб
Хромогенный
Турбидиметрический
Кинетический хромогенный
Кинетический турбидиметрический
2
Какой метод лучше?
• У каждого метода есть свои преимущества
• Выбор метода зависит от:
– Требуемого результата
• количественный
• полуколичественный
– Имеющегося в наличии оборудования
– Типа образца
3
Выбор метода
• У каждого метода свое назначение
• Для выбора метода необходимо оценить
тип и объемы тестирования
• В некоторых случаях имеет смысл
применять более одного метода,
например, для тестирования воды –
кинетический хромогенный и
кинетический турбидиметрический
4
Механизм
реакции
Образование
геля и
турбидиметриче
ский тип
ИЛИ
Хромогенный
тип
5
Гель-тромб метод
Механизм и суть метода
6
Лизат амебоцитов Limulus
Гель-тромб метод
Эндотоксин
Активный
фермент
Профермент
Активный
фермент
Коагулянт
Свертывающийся Электростатические связи
белок
Свертывающийся
белок
+ (фрагмент)
Образование геля
7
Постановка гель-тромб теста
Шаг за шагом
8
Подготовка образцов и правильное
разведение, дозирование в пробирки
9
Приготовьте стандарт или серии
стандартов и дозируйте в пробирки
10
Добавьте положительные контроли
11
Восстановите ЛАЛ-реактив ЛАЛреагентной водой
12
Добавьте лизат в пробирки для
постановки реакции
13
Поместите в инкубатор на 60 минут
14
Медленно переверните пробирку
Гель-тромб
(Положительный)
15
Интерпретация результатов гельтромб теста
• Очень простой тест
• Результат интерпретируется субъективно
Следовательно, результат зависит от лаборанта
• Метод считается недорогим, однако все
зависит от количества образцов
• Наиболее доступный метод по начальным
инвестициям
16
Возможные проблемы гельтромб метода
• Результаты считываются на-глаз после
переворачивания пробирки вручную
• На образование геля влияют различные
факторы
•
•
•
•
вибрация
pH
температура
другие белки
• Трудоемкий метод для средних и больших
партий
• Трудоемкий для валидации продукта метод
17
Пример гель-тромб метода для подтверждения
заявленной чувствительности лизата
Заявленная чувствительность лизата=0.125 ЕЭ/мл
Допуск 0.25 ЕЭ/мл до 0.06 ЕЭ/мл
Образец
0.5
0.25 0.125 0.062 0.031
1
+
+
+
2
+
+
+
+
3
+
+
+
+
4
+
+
+
+
Ср. геометрическое =Antilog ( 1 x Log (0.125) + 3 x Log (0.062)) /4
18
Виды гель-тромб метода
• Два вида гель-тромб метода
– предел
– Полуколичественный
• Предел
– Дает ответ ДА/НЕТ при определенной
чувствительности реактива
• Полуколичественный
– Можно определить концентрацию эндотоксина в
образце путем серии разведений
19
Методы конечной точки
Механизм и суть метода
20
Методы конечной точки
• Теоретически существует два метода
– Хромогенный метод конечной точки
– Турбидиметрический метод конечной точки
• На практике применяется только
хромогенный метод конечной точки
21
Хромогенный метод конечной
точки
• Первый разработанный количественный метод
• Диапазон чувствительности зависит от времени
инкубирования
– Типичный диапазон: 1.0 ЕЭ/мл до 0.1 ЕЭ/мл
– Расширенный диапазон:0.1 ЕЭ/мл до 0.01 ЕЭ/мл
• Линейная зависимость от уровня эндотоксинов
• Пониженная чувствительность к интерферентным
факторам благодаря применению хромогенного
субстрата
22
Замещение хромогенным субстратом
коагулянта
23
Постановка хромогенного теста
конечной точки
Шаг за шагом
24
Дозируйте стандарт и образец
25
Добавьте 50 л лизата и
инкубируйте
26
Добавьте 100л субстрата и
инкубируйте
27
Добавьте 100 л реактива для
остановки реакции
28
Результаты считываются через 405
нм фильтр
29
Характеристики хромогенного
метода конечной точки
• Требует многоразового добавления реактивов
– Добавить лизат в стандарт и образец и
инкубировать
– Добавить субстрат и инкубировать
– Добавить реактив для остановки реакции (10%
уксусная кислота или 10% SDS)
– Считывание результатов на волне 405 нм
• Соответствие температуры инкубации (37oC)
является критичным фактором
30
ЛАЛ тест хромогенный конечной
точки
Эндотоксин
Активный
фермент
Профермент
Активный
фермент
Хромогенный
субстрат
Концентрация PNA
(Желтый цвет)
Высвобождение PNA
+ (фрагмент)
Прямая зависимость от Концентрации
эндотоксина
31
Хромогенный тест конечной точки
Коэффициент корреляции (R2) = 0.9987
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
OD
Linear (OD )
32
Оценка хромогенного теста
конечной точки
• Дает количественный результат, интерпретация
результатов объективная, результаты стабильны в
течение 30 мин
• Хромогенный субстрат снижает влияние
интерферентных факторов
• Трудоемкий процесс, в ходе которого возможны
ошибки оператора
• Процесс можно автоматизировать
33
Возможные проблемы хромогенного
метода конечной точки
• Короткое время инкубирования обусловливает
сложность поддержания равномерности
поддержания температуры микропланшет
• Узкий диапазон может требовать дополнительных
разведений для получения результатов
• Трудоемкий метод
• Реагент для остановки реакции может вызвать
выпадение осадка
34
Кинетические методы
Механизм и суть методов
35
Кинетические методы
• Наиболее недавние методы
• Наиболее объективные методы
• Два вида кинетических методов
– Кинетический турбидиметрический
– Кинетический хромогенный
36
Кинетический
турбидиметрический метод
• Первый из разработанных кинетических методов
• Широкий стандартный диапазон
– 10.0-0.01 ЕЭ/мл
• Первые методики были неточными на всем
диапазоне измерений
• Современные реактивы дают меньшую
погрешность
37
Кинетический
турбидиметрический метод
• Добавление реактива только один раз
– Добавить реактив в стандарт
– Добавить положительные контроли продукта (обычно
по 10 л)
– Подогрейте планшет
– Добавьте лизат и начните тест
– Определите результаты
• Микропланшеты также требуют обработки в
шейкере
38
Кинетический турбидиметрический
ЛАЛ-метод
Эндотоксин
Активный
фермент
Профермент
Активный
фермент
Коагулянт
Свертывающийся Электростатические связи
белок
Свертывающийся
белок
+ (фрагмент)
Образование
мутности
39
Кинетический
турбидиметрический метод
• Более быстрый метод, чем количественный
конечной точки
• Широкий диапазон
• Очень хорошо подходит для тестирования
воды, но могут быть сложности с
концентрированными сложными продуктами
• Менее дорогостоящие реагенты, чем для
кинетического хромогенного метода
• Менее стабильный в процессе исполнения
метод, чем кинетический хромогенный метод
40
Кинетический турбидиметрический
метод – возможные трудности
• Слабое отношение сигнал-шум, наличие
пузырьков могут затруднять анализ
• Влияние таких же интерферентных факторов
как и для гель-тромб теста:
•
•
•
•
вибрация
pH
температура
другие белки
• Наличие пузырьков может затруднить анализ
• Не подходит для вязких и мутных продуктов
41
Кинетический хромогенный метод
• Наиболее поздний из кинетических методов
вследствие трудности создания комбинированного
реактива
– Лизат и синтетический субстрат
• Отличное отношение сигнал-шум по сравнению с
турбидиметрическим методом
– Кинетический хромогенный - Delta OD 200 milliOD
– Кинетический турбидиметрический - Delta OD 30 milliOD
• Менее подвержен влиянию интерферентных факторов
42
Кинетический хромогенный метод
• Широкий стандартный диапазон
– До 4 log диапазона (50-0.005 ЕЭ/мл)
• Реактив добавляется один раз, что
минимизирует вероятность ошибки оператора
• Применение синтетического субстрата облегчает
валидацию комплексных продуктов
• Позволяет анализировать мутные и вязкие
образцы
43
Проведение кинетического
хромогенного метода
Шаг за шагом
44
Дозируйте стандарты и образцы
45
Добавьте положительный
контроль продукта (ПКП)
Pre-warm the Plate in the incubating reader for 10 minutes
46
Добавьте лизат и начните анализ
47
Планшет инкубируется, показания
считываются каждые 150 секунд
48
Готовый анализ
Примечание: KQCL легко
справляется с сильно
окрашенными образцами,
например, метиленовый
синий
49
Кинетический хромогенный
метод
• Реагент добавляется только один раз
– Дозируйте стандарты и образцы
– Добавьте положительный контроль продукта (как
правило по 10 л)
– Подогрейте планшет
– Добавьте лизат и начните анализ
– Collect Results
• Микропланшеты также требуют обработки в
шейкере
50
Кинетический хромогенный
метод ЛАЛ
Эндотоксин
Активный
фермент
Профермент
Активный
фермент
Хромогенный
субстрат
Высвобождение PNA
+ (фрагмент)
Концентрация PNA Прямо пропорциональна Концентрация
Эндотоксина
(желтый цвет)
51
Суть кинетического хромогенного
метода
• В начале теста считывается оптическая плотность
• Результаты первого считывания принимаются за
базовую линию – цвет, прозрачность, др.
• Прибор измеряет оптическую плотность через
фиксированные промежутки времени и
определяет изменение оптической плотности на
OD 30 для кинетического турбидиметрического и
OD 200 для кинетического хромогенного метода
• Анализ считается завершенным когда
достигается нижняя стандартная точка
52
Кинетическая ЛАЛ реакция
53
Кинетическая хромогенная
реакция
• Время затраченное на достижение точки 200
mOD зависит от концентрации эндотоксина
• Для создания стандартной кривой
используется стандарт
• Т.к. результаты теста носят нелинейный
характер, для создания стандартной кривой
необходимо производить log-log
преобразования
54
Зависимость времени реакции от
концентрации эндотоксина
Slope = -0.204
Y-Int = 3.058
R = -0.998
55
Кинетические методы
• Нестандартная кинетика ферментов дает
нелинейные результаты
• Первоначальные методы не принимали в
расчет данную особенность
• Новые методы вносят соответствующие
коррективы
56
Кинетика реакции
• Классическая кинетика Michaelis Menton
– При определенных условиях скорость
ферментной реакции линейно зависит от
исходной концентрации фермента
– Изменение абсорбции в течение времени
находится в линейной зависимости от
концентрации эндотоксина
57
Кинетика реакции
• Но не все ферментные реакции носят
линейный характер
• Кинетические ЛАЛ методы:
– В начале анализа отсутствует активный
фермент
– Фермент образуется в результате
присутствия эндотоксина и его реакции на
первой стадии каскадной реакции
58
Что измеряется?
• Реальные измерения учитывают время
задержки до появления фермента
• Зависимость этой задержки или времени
реакции и концентрацией эндотоксина
нелинейная
59
Типичные данные
кинетического ЛАЛ анализа
(линейный вид)
Reaction Times vs Endotoxin Concentrations
Std 1
Std 2
Std 3
Std 4
Std 5
Conc
0.005
0.05
0.5
5
50
Time
3460
2138
1242
808
535
60
Линейные кинетические
результаты
• Такие данные не могут применяться для
анализа неизвестных, в особенности с
применением линейной регрессии
• Как можно линеаризировать данные?
• По предыдущим данным можно
сократить диапазон
61
Кинетический ЛАЛ-анализ
Reaction Times vs Endotoxin Concentrations
62
Кинетические данные
• Сокращение диапазона не улучшает
форму кривой
• Шаг 1: Log ось эндотоксина
– Расширение интервала малых значений
– Сокращение интервала высоких значений
63
Кинетический ЛАЛ - 1 Log
Reaction Times vs Endotoxin Concentrations
64
Кинетические результаты
• Одноразовое логарифмирование
недостаточно для улучшения
стандартной кривой
• Следующий шаг:
– Log ось времени (ось Y)
• По-новому нанесите кривую
65
Кинетический ЛАЛ, Log-Log
преобразование
Reaction Times vs Endotoxin Concentrations
66
Кинетические результаты
• Практически линейные
• Но не совсем
– На примере видно корреляционный коэффициент 0.997
– Тем не менее, наблюдается отклонение
– Это может привести к неточностям при
определении неизвестных
67
Линейная регрессия
метод наименьших квадратов
Стандарт
0.005
0.05
0.5
5
50
Время
реакции
3460
2138
1242
808
535
Log
X
-2.301
-1.301
-0.301
0.699
1.699
-2.3582
-1.3334
-0.1771
0.7382
1.6159
Back
%
Prediction отклонения
0.004
-20 %
0.046
-8 %
0.66
32 %
5.472
9%
41.296
-17 %
68
Линейная регрессия – Восстановление
исходных значений
Method of Least Squares
Standards Reaction
Time
0.005
0.05
0.5
5
50
3460
2138
1242
808
535
Log Stds
-2.301
-1.301
-0.301
0.699
1.699
X
Back
%
Prediction Deviatio
n
-2.3582
0.004
-20 %
-1.3334
0.046
-8 %
-0.1771
0.66
32 %
0.7382
5.472
9%
1.6159
41.296
-17 %
69
Источник неточностей
• Самое большое отклонение зачастую
находится в середине линии регрессии
– В этой точке как правило проявляется
положительный контроль
• Влияет на расчет ЕЭ для различных
разведений одного образца
70
Альтернативные методы расчетов
• В идеале нужно придать кривой форму
регрессионной линии
• Формула линейной регрессии
– Y=A+BX
• Определения уравнения
– Расширенный анализ включает 4
определения………..
71
PowercurveTM
• PowercurveTM is a patented controlled fit
method which prevents ‘wrapping’
– Y=A+B(X)+C(X2)+D(X3)E(X4)
Powercurve
Reaction Time (secs)
10000
1000
100
0.001
0.01
0.1
1
10
100
Endotoxin Concentration (EU/ml)
72
Аппроксимация полиномной
кривой
• Аппроксимация полиномной кривой
широко применяется в клинических
исследованиях
• В данном методе есть потенциальная
проблема – если не достаточно жестко
контролировать расчеты, то кривую
можно «подогнать» под любые
результаты!!
73
Неконтролируемая полиномная
аппроксимация
74
Сравнение показателей точности
Power кривая
Стандартная концентрация Back Prediction
0,005
0,05
0,5
5
50
0,0049
0,05
0,5
4,999
50
% отклонения
2,00%
0,00%
0,00%
0,00%
0,00%
Линейная регрессия
Стандартная концентрация Back Prediction
0,005
0,05
0,5
5
50
0,004
0,046
0,661
5,472
41,296
% отклонения
-20,00%
-8,00%
-32,00%
9,00%
-17,00%
75
Power Curve
• Power Curve признана контролирующими
органами
• Улучшает точность результатов
• Сниженное количество повторений теста
• Устраняет проблему плавающих значений при
разведении образца
76
Обзор методов
• Выбор метода зависит от:
– Количества образцов
– Типа образцов
– Доступного оборудования
• или
– Бюджет
– Необходимость количественных результатов
77
……………
• Как будут развиваться методики?
• Человеческий фактор будет присутствовать и в
дальнейшем
• Данную проблему могут решить только роботы
• В 1998 BioWhittaker представил на рынок
автоматический AutoLAL
78
AutoLAL
• Сочетание системы дозирования жидкостей
Beckman Biomek и ридера Biotek и программного
обеспечения BioWhittaker
• Автоматическое приготовление
стандарта и образца
• Автоматическое дозирование
образцов, стандартов
и положительных контролей
• Автоматическое добавление
лизата, инкубирование и
чтение результатов
79
Преимущества AutoLAL
•
•
•
•
•
Сниженное количество ручного труда
Сниженное количество повторений
Улучшенная воспроизводимость
Отсутствие отклонений при
Работе разных операторов
80
Скачать