Методы ЛАЛ-теста Часть 3 1
advertisement
Методы ЛАЛ-теста Часть 3 1 Признанные методы ЛАЛтеста • • • • • • Гель-тромб Полуколичественный гель-тромб Хромогенный Турбидиметрический Кинетический хромогенный Кинетический турбидиметрический 2 Какой метод лучше? • У каждого метода есть свои преимущества • Выбор метода зависит от: – Требуемого результата • количественный • полуколичественный – Имеющегося в наличии оборудования – Типа образца 3 Выбор метода • У каждого метода свое назначение • Для выбора метода необходимо оценить тип и объемы тестирования • В некоторых случаях имеет смысл применять более одного метода, например, для тестирования воды – кинетический хромогенный и кинетический турбидиметрический 4 Механизм реакции Образование геля и турбидиметриче ский тип ИЛИ Хромогенный тип 5 Гель-тромб метод Механизм и суть метода 6 Лизат амебоцитов Limulus Гель-тромб метод Эндотоксин Активный фермент Профермент Активный фермент Коагулянт Свертывающийся Электростатические связи белок Свертывающийся белок + (фрагмент) Образование геля 7 Постановка гель-тромб теста Шаг за шагом 8 Подготовка образцов и правильное разведение, дозирование в пробирки 9 Приготовьте стандарт или серии стандартов и дозируйте в пробирки 10 Добавьте положительные контроли 11 Восстановите ЛАЛ-реактив ЛАЛреагентной водой 12 Добавьте лизат в пробирки для постановки реакции 13 Поместите в инкубатор на 60 минут 14 Медленно переверните пробирку Гель-тромб (Положительный) 15 Интерпретация результатов гельтромб теста • Очень простой тест • Результат интерпретируется субъективно Следовательно, результат зависит от лаборанта • Метод считается недорогим, однако все зависит от количества образцов • Наиболее доступный метод по начальным инвестициям 16 Возможные проблемы гельтромб метода • Результаты считываются на-глаз после переворачивания пробирки вручную • На образование геля влияют различные факторы • • • • вибрация pH температура другие белки • Трудоемкий метод для средних и больших партий • Трудоемкий для валидации продукта метод 17 Пример гель-тромб метода для подтверждения заявленной чувствительности лизата Заявленная чувствительность лизата=0.125 ЕЭ/мл Допуск 0.25 ЕЭ/мл до 0.06 ЕЭ/мл Образец 0.5 0.25 0.125 0.062 0.031 1 + + + 2 + + + + 3 + + + + 4 + + + + Ср. геометрическое =Antilog ( 1 x Log (0.125) + 3 x Log (0.062)) /4 18 Виды гель-тромб метода • Два вида гель-тромб метода – предел – Полуколичественный • Предел – Дает ответ ДА/НЕТ при определенной чувствительности реактива • Полуколичественный – Можно определить концентрацию эндотоксина в образце путем серии разведений 19 Методы конечной точки Механизм и суть метода 20 Методы конечной точки • Теоретически существует два метода – Хромогенный метод конечной точки – Турбидиметрический метод конечной точки • На практике применяется только хромогенный метод конечной точки 21 Хромогенный метод конечной точки • Первый разработанный количественный метод • Диапазон чувствительности зависит от времени инкубирования – Типичный диапазон: 1.0 ЕЭ/мл до 0.1 ЕЭ/мл – Расширенный диапазон:0.1 ЕЭ/мл до 0.01 ЕЭ/мл • Линейная зависимость от уровня эндотоксинов • Пониженная чувствительность к интерферентным факторам благодаря применению хромогенного субстрата 22 Замещение хромогенным субстратом коагулянта 23 Постановка хромогенного теста конечной точки Шаг за шагом 24 Дозируйте стандарт и образец 25 Добавьте 50 л лизата и инкубируйте 26 Добавьте 100л субстрата и инкубируйте 27 Добавьте 100 л реактива для остановки реакции 28 Результаты считываются через 405 нм фильтр 29 Характеристики хромогенного метода конечной точки • Требует многоразового добавления реактивов – Добавить лизат в стандарт и образец и инкубировать – Добавить субстрат и инкубировать – Добавить реактив для остановки реакции (10% уксусная кислота или 10% SDS) – Считывание результатов на волне 405 нм • Соответствие температуры инкубации (37oC) является критичным фактором 30 ЛАЛ тест хромогенный конечной точки Эндотоксин Активный фермент Профермент Активный фермент Хромогенный субстрат Концентрация PNA (Желтый цвет) Высвобождение PNA + (фрагмент) Прямая зависимость от Концентрации эндотоксина 31 Хромогенный тест конечной точки Коэффициент корреляции (R2) = 0.9987 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 OD Linear (OD ) 32 Оценка хромогенного теста конечной точки • Дает количественный результат, интерпретация результатов объективная, результаты стабильны в течение 30 мин • Хромогенный субстрат снижает влияние интерферентных факторов • Трудоемкий процесс, в ходе которого возможны ошибки оператора • Процесс можно автоматизировать 33 Возможные проблемы хромогенного метода конечной точки • Короткое время инкубирования обусловливает сложность поддержания равномерности поддержания температуры микропланшет • Узкий диапазон может требовать дополнительных разведений для получения результатов • Трудоемкий метод • Реагент для остановки реакции может вызвать выпадение осадка 34 Кинетические методы Механизм и суть методов 35 Кинетические методы • Наиболее недавние методы • Наиболее объективные методы • Два вида кинетических методов – Кинетический турбидиметрический – Кинетический хромогенный 36 Кинетический турбидиметрический метод • Первый из разработанных кинетических методов • Широкий стандартный диапазон – 10.0-0.01 ЕЭ/мл • Первые методики были неточными на всем диапазоне измерений • Современные реактивы дают меньшую погрешность 37 Кинетический турбидиметрический метод • Добавление реактива только один раз – Добавить реактив в стандарт – Добавить положительные контроли продукта (обычно по 10 л) – Подогрейте планшет – Добавьте лизат и начните тест – Определите результаты • Микропланшеты также требуют обработки в шейкере 38 Кинетический турбидиметрический ЛАЛ-метод Эндотоксин Активный фермент Профермент Активный фермент Коагулянт Свертывающийся Электростатические связи белок Свертывающийся белок + (фрагмент) Образование мутности 39 Кинетический турбидиметрический метод • Более быстрый метод, чем количественный конечной точки • Широкий диапазон • Очень хорошо подходит для тестирования воды, но могут быть сложности с концентрированными сложными продуктами • Менее дорогостоящие реагенты, чем для кинетического хромогенного метода • Менее стабильный в процессе исполнения метод, чем кинетический хромогенный метод 40 Кинетический турбидиметрический метод – возможные трудности • Слабое отношение сигнал-шум, наличие пузырьков могут затруднять анализ • Влияние таких же интерферентных факторов как и для гель-тромб теста: • • • • вибрация pH температура другие белки • Наличие пузырьков может затруднить анализ • Не подходит для вязких и мутных продуктов 41 Кинетический хромогенный метод • Наиболее поздний из кинетических методов вследствие трудности создания комбинированного реактива – Лизат и синтетический субстрат • Отличное отношение сигнал-шум по сравнению с турбидиметрическим методом – Кинетический хромогенный - Delta OD 200 milliOD – Кинетический турбидиметрический - Delta OD 30 milliOD • Менее подвержен влиянию интерферентных факторов 42 Кинетический хромогенный метод • Широкий стандартный диапазон – До 4 log диапазона (50-0.005 ЕЭ/мл) • Реактив добавляется один раз, что минимизирует вероятность ошибки оператора • Применение синтетического субстрата облегчает валидацию комплексных продуктов • Позволяет анализировать мутные и вязкие образцы 43 Проведение кинетического хромогенного метода Шаг за шагом 44 Дозируйте стандарты и образцы 45 Добавьте положительный контроль продукта (ПКП) Pre-warm the Plate in the incubating reader for 10 minutes 46 Добавьте лизат и начните анализ 47 Планшет инкубируется, показания считываются каждые 150 секунд 48 Готовый анализ Примечание: KQCL легко справляется с сильно окрашенными образцами, например, метиленовый синий 49 Кинетический хромогенный метод • Реагент добавляется только один раз – Дозируйте стандарты и образцы – Добавьте положительный контроль продукта (как правило по 10 л) – Подогрейте планшет – Добавьте лизат и начните анализ – Collect Results • Микропланшеты также требуют обработки в шейкере 50 Кинетический хромогенный метод ЛАЛ Эндотоксин Активный фермент Профермент Активный фермент Хромогенный субстрат Высвобождение PNA + (фрагмент) Концентрация PNA Прямо пропорциональна Концентрация Эндотоксина (желтый цвет) 51 Суть кинетического хромогенного метода • В начале теста считывается оптическая плотность • Результаты первого считывания принимаются за базовую линию – цвет, прозрачность, др. • Прибор измеряет оптическую плотность через фиксированные промежутки времени и определяет изменение оптической плотности на OD 30 для кинетического турбидиметрического и OD 200 для кинетического хромогенного метода • Анализ считается завершенным когда достигается нижняя стандартная точка 52 Кинетическая ЛАЛ реакция 53 Кинетическая хромогенная реакция • Время затраченное на достижение точки 200 mOD зависит от концентрации эндотоксина • Для создания стандартной кривой используется стандарт • Т.к. результаты теста носят нелинейный характер, для создания стандартной кривой необходимо производить log-log преобразования 54 Зависимость времени реакции от концентрации эндотоксина Slope = -0.204 Y-Int = 3.058 R = -0.998 55 Кинетические методы • Нестандартная кинетика ферментов дает нелинейные результаты • Первоначальные методы не принимали в расчет данную особенность • Новые методы вносят соответствующие коррективы 56 Кинетика реакции • Классическая кинетика Michaelis Menton – При определенных условиях скорость ферментной реакции линейно зависит от исходной концентрации фермента – Изменение абсорбции в течение времени находится в линейной зависимости от концентрации эндотоксина 57 Кинетика реакции • Но не все ферментные реакции носят линейный характер • Кинетические ЛАЛ методы: – В начале анализа отсутствует активный фермент – Фермент образуется в результате присутствия эндотоксина и его реакции на первой стадии каскадной реакции 58 Что измеряется? • Реальные измерения учитывают время задержки до появления фермента • Зависимость этой задержки или времени реакции и концентрацией эндотоксина нелинейная 59 Типичные данные кинетического ЛАЛ анализа (линейный вид) Reaction Times vs Endotoxin Concentrations Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 5 Conc 0.005 0.05 0.5 5 50 Time 3460 2138 1242 808 535 60 Линейные кинетические результаты • Такие данные не могут применяться для анализа неизвестных, в особенности с применением линейной регрессии • Как можно линеаризировать данные? • По предыдущим данным можно сократить диапазон 61 Кинетический ЛАЛ-анализ Reaction Times vs Endotoxin Concentrations 62 Кинетические данные • Сокращение диапазона не улучшает форму кривой • Шаг 1: Log ось эндотоксина – Расширение интервала малых значений – Сокращение интервала высоких значений 63 Кинетический ЛАЛ - 1 Log Reaction Times vs Endotoxin Concentrations 64 Кинетические результаты • Одноразовое логарифмирование недостаточно для улучшения стандартной кривой • Следующий шаг: – Log ось времени (ось Y) • По-новому нанесите кривую 65 Кинетический ЛАЛ, Log-Log преобразование Reaction Times vs Endotoxin Concentrations 66 Кинетические результаты • Практически линейные • Но не совсем – На примере видно корреляционный коэффициент 0.997 – Тем не менее, наблюдается отклонение – Это может привести к неточностям при определении неизвестных 67 Линейная регрессия метод наименьших квадратов Стандарт 0.005 0.05 0.5 5 50 Время реакции 3460 2138 1242 808 535 Log X -2.301 -1.301 -0.301 0.699 1.699 -2.3582 -1.3334 -0.1771 0.7382 1.6159 Back % Prediction отклонения 0.004 -20 % 0.046 -8 % 0.66 32 % 5.472 9% 41.296 -17 % 68 Линейная регрессия – Восстановление исходных значений Method of Least Squares Standards Reaction Time 0.005 0.05 0.5 5 50 3460 2138 1242 808 535 Log Stds -2.301 -1.301 -0.301 0.699 1.699 X Back % Prediction Deviatio n -2.3582 0.004 -20 % -1.3334 0.046 -8 % -0.1771 0.66 32 % 0.7382 5.472 9% 1.6159 41.296 -17 % 69 Источник неточностей • Самое большое отклонение зачастую находится в середине линии регрессии – В этой точке как правило проявляется положительный контроль • Влияет на расчет ЕЭ для различных разведений одного образца 70 Альтернативные методы расчетов • В идеале нужно придать кривой форму регрессионной линии • Формула линейной регрессии – Y=A+BX • Определения уравнения – Расширенный анализ включает 4 определения……….. 71 PowercurveTM • PowercurveTM is a patented controlled fit method which prevents ‘wrapping’ – Y=A+B(X)+C(X2)+D(X3)E(X4) Powercurve Reaction Time (secs) 10000 1000 100 0.001 0.01 0.1 1 10 100 Endotoxin Concentration (EU/ml) 72 Аппроксимация полиномной кривой • Аппроксимация полиномной кривой широко применяется в клинических исследованиях • В данном методе есть потенциальная проблема – если не достаточно жестко контролировать расчеты, то кривую можно «подогнать» под любые результаты!! 73 Неконтролируемая полиномная аппроксимация 74 Сравнение показателей точности Power кривая Стандартная концентрация Back Prediction 0,005 0,05 0,5 5 50 0,0049 0,05 0,5 4,999 50 % отклонения 2,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% Линейная регрессия Стандартная концентрация Back Prediction 0,005 0,05 0,5 5 50 0,004 0,046 0,661 5,472 41,296 % отклонения -20,00% -8,00% -32,00% 9,00% -17,00% 75 Power Curve • Power Curve признана контролирующими органами • Улучшает точность результатов • Сниженное количество повторений теста • Устраняет проблему плавающих значений при разведении образца 76 Обзор методов • Выбор метода зависит от: – Количества образцов – Типа образцов – Доступного оборудования • или – Бюджет – Необходимость количественных результатов 77 …………… • Как будут развиваться методики? • Человеческий фактор будет присутствовать и в дальнейшем • Данную проблему могут решить только роботы • В 1998 BioWhittaker представил на рынок автоматический AutoLAL 78 AutoLAL • Сочетание системы дозирования жидкостей Beckman Biomek и ридера Biotek и программного обеспечения BioWhittaker • Автоматическое приготовление стандарта и образца • Автоматическое дозирование образцов, стандартов и положительных контролей • Автоматическое добавление лизата, инкубирование и чтение результатов 79 Преимущества AutoLAL • • • • • Сниженное количество ручного труда Сниженное количество повторений Улучшенная воспроизводимость Отсутствие отклонений при Работе разных операторов 80
