Транскрипция у прокариот (презентация №2)

Строение и транскрипция генов
эукариот
План
1.
2.
3.
4.
Введение.
Интроны и экзоны.
Транскрипция генов эукариот
Регуляция транскрипции у
эукариот
1. Введение
В конце 50-х годов ХХ века для гена утвердилось следующее
определение: ген – это участок молекулы ДНК, в котором
закодирована последовательность аминокислот одного
белка. Потом выяснилось, что многие белки (гемоглобин, РНКполимераза и др.) состоят из нескольких полипептидных цепей.
Поэтому определение было модифицировано: ген – это линейный участок ДНК, в котором закодирована одна полипептидная цепь молекулы белка. Многие белки закодированы
несколькими генами. Считалось, что гены всех организмов
устроены так же, как и гены бактерий.
Коренные изменения в представлении о строении генов
эукариот произошли в конце 70-х годов, в результате развития
молекулярно-генетических методов исследований нуклеиновых
кислот.
2. Интроны и экзоны
У эукариот многие гены содержат некодирующие участки
ДНК. Такие участки были обнаружены с путём гибридизации
одноцепочеченой ДНК отдельных генов с иРНК, выделенной
из полисом цитоплазмы.
ДНК гена куриного овальбумина была выделена с помощью
радиоактивного ДНК-зонда из общей ДНК ядра, разрезанной
ферментами рестриктазами. Выделенную ДНК гена клонировали для получения количества, достаточного для исследований.
В этой ДНК путём плавления разрывали водородные связи и
получали одноцепочечные нити, которые затем гибридизировали с иРНК, выделенной из полисом. Ожидалось, что одноцепочечная ДНК и иРНК, транскрибированная с этого же гена,
соединяться друг с другом коплементарно по всей длине. Но
был получен иной результат: нить ДНК гена оказалась
намного длиннее соответствующей иРНК.
Рис.1. 1 - Электронная
фотография
гибридных иРНК и ДНК гена
овальбумина;
2 - графическая схема
того же изображения.
На фотографиях, полученных с помощью электронного микроскопа, были видны отдельные участки плотно прилегающих
ДНК и РНК, а между ними - большие петли, образованные
нитью ДНК (рис.1). В ДНК гена овальбумина было 7 таких
петель. Когда же провели подобную гибридизацию ДНК и
мРНК, выделенной из ядра, то петель не образовалось.
Полученные результаты указывают на то, что ДНК гена
содержит не только кодирующие участки, но и такие, в
которых не закодирован полипептид.
Аналогичные исследования других генов разных эукариотических организмов показали, что большинство из них
имеют такое же мозаичное строение – состоят из чередующихся кодирующих и некодирующих участков. Например,
структурный ген фактора свёртываемости крови VIII человека,
дефект которого вызывает гемофилию, имеет длину 186 тысяч
пар нуклеотидов. В его составе имеется 26 экзонов и 27
интронов, причём длина «смысловой» экзонной части
составляет всего около 7 тысяч пар (3,8% длины всего гена).
У бактерий все исследованные структурные гены состоят
только из кодирующей ДНК.
Экзоны могут находиться в промоторной и терминаторной
частях, т.е. вне структурного гена. Такие экзоны называются
некодирующими. Они считываются РНК-полимеразами и
остаются в матричной РНК, переходящей из ядра в цитоплазму.
В этих РНК-экзонах содержатся участки, необходимые для
связывания с рибосомами.
3. Транскрипция генов эукариот
Транскрипция генов эукариот отличается от транскрипции прокариотических генов (рис. 2). В клетках
эукариот имеются три различные РНК-полимеразы А, В и С, которые управляют синтезом соответственно
рРНК, мРНК и тРНК. Транскрипция у эукариот происходит в ядрах, что приводит к образованию мРНКпредшественников (ядерных мРНК). Роль матриц для
трансляции мРНК выполняют только в цитоплазме.
При перемещении из ядра в цитоплазму через ядерную
мембрану мРНК-предшественники укорачиваются и
превращаются в цитоплазматические мРНК.
Оба вида мРНК на 5'-концах несут необычное основание - 7-метилгуанозин, соединенное с первым
нуклеотидом через связь 5'-5' (рис. 3).
Рис. 2. Экспрессия гена эукариот: а — принципиальная структура
мозаичного гена (1, 3, 7, 9 -некодирующие экзоны; 2, 5, 8 — интроны; 4,6 — кодирующие экзоны; Е — энхансер; р—промотор; t—
терминатор транскрипции);
б—ядерная мРНК (7 мГ - 7-метилгуанозин; Аn — полиадениловая
цепочка из n звеньев) ; в — цитоплазматическая мРНК;
г - белок-предшественник; д — активный белок
Кроме того, в мРНК эукариот
на 3'-концах находятся полиадениловые цепочки, состоящие
приблизительно из 200 нуклеотидов. Синтез этих цепочек
обусловлен наличием в 3'-концевых частях мРНК последовательности 5'ААУААЗ'.
Обе отмеченные особенности мРНК посттранскрипционного происхождения. Разница в
длинах ядерной и цитоплазматической мРНК является следствием процессинга пре-РНК.
Рис. 3. 7–метилгуанин (А),
соединённый 5'-5'–связью
с первым нуклеотидом
мРНК (Б)
В ходе процессинга из РНК-транскрипта удаляются
с помощью специфичных рестриктаз участки,
соответствующие интронам; участки,
соответствующие экзонам, соединяются друг с другом.
Процесс соединения экзонных участков называется
сплайсингом. Его механизм до конца неизвестен.
Экзоны в цитоплазма-тической мРНК объединяются в
результате сплайсинга так, что в сохраняется
правильная последовательность кодонов. Это достигается благодаря наличию на 5'- и 3'-концах
интронов спе-цифических последовательностей
нуклеотидов. Эти последовательности
высококонсервативны для генов любого происхождения - все интроны на 5'-концах несут ГУ нуклеотиды,
а на 3'-концах - АГ нуклеотиды.
Точность сплайсинга зависит и от видоспецифических
последовательностей нуклеотидов, расположенных в интронах
на расстоянии 20-60 п.н. от 3'-концов. В генах человека, мыши,
крысы это последовательность 5'ЦТГАЦЗ', дрозофилы 5'ЦТААТ3', дрожжей - 5'ТАЦТААЦ3'. Эти последовательности определяют выбор динуклеотида АГ на 3'-конце интрона.
Если динуклеотид АГ удалить, то сплайсинг происходит по
следующему такому же динуклеотиду.
Сайт связывания рибосом у эукариотической мРНК не имеет
фиксированной химической структуры, но активную роль в нем
играет 7-метилгуанозин (рис. 3). При экспериментах in vitro
обнаружено, что присоединение этого необычного нуклеотида
к 5'-концу прокариотических мРНК обеспечивает их
трансляцию с помощью эукариотических рибосом.
4. Регуляция транскрипции у эукариот
Гены эукариот не группируются в опероны, поэтому каждый
ген имеет собственные промотор и терминатор.
В эукариотических промоторах различают ГЦ и AT богатые
области. Первая располагается на участке с координатами
-100...- 40 и служит, вероятно, для первичного контакта РНКполимеразы В с промотором. Вторая находится на отметке
около -30 и служит для точной ориентации РНК-полимеразы
относительно первого транскрибируемого нуклеотида. Вторая
область имеет характерную последовательность нуклеотидов
5'ТАТА(А/Т)А(Т/А)3’. Наличие в ней АТ-пар облегчает
плавление ДНК, необходимое для инициации транскрипции. В
первой области и в других частях промоторов консервативные
последовательности нуклеотидов отсутствуют.
Это объясняется тем, что у эукариотических генов функции
регуляторных участков зависят не от порядка нуклеотидов в
цепи, а от коллективных физических свойств пар нуклеотидов,
составляющих эти участки. Для промоторов одним из таких
свойств является, по-видимому, профиль их стабильности, т.е.
характерное распределение ГЦ- и АТ-пар вдоль промоторов
при случайном порядке пуринов и пиримидинов.
С промоторами эукариотических генов функционально
связаны их специфические локусы — энхансеры (enhancer—
усилитель) и регуляторные элементы. Энхансер увеличивает
число посадок РНК-полимеразы на промотор ближайшего гена
в десятки и сотни раз. Энхансер может находиться в любой
ориентации по отношению к гену, располагаться с любой его
стороны, внутри него (в интроне) и даже на расстоянии в
несколько тысяч пар нуклеотидов. Данные свойства энхансера
проявляются лишь в определенных тканях, т.е. энхансеры
тканеспецифичны.
Энхансеры способгы действовать и на "чужие" гены. Например, энхансер вируса SV40, располагаясь слева или справа от
него на расстоянии до 3 т.п.н., увеличивает эффективность
транскрипции гена β-глобина кролика в 200 раз.
Регуляторные элементы присутствуют у так называемых
индуцибельных генов (гены интерферонов, металлотионеина и
др.), транскрибирующихся только при поступлении в клетку
определенных биохимических веществ. В отличие от энхансеров, они тесно сцеплены с промоторами и располагаются непосредственно слева от них, или перекрываются с ними.
Таким образом, механизм регуляции транскрипции у эукариот гораздо более гибкий, чем у прокариот.
Фиксированная химическая структура прокариотических промоторов обусловливает регуляцию только по принципу "все
или ничего", в то время как коллективные физические свойства
эукариотических промоторов совместно со свойствами энхансеров или регуляторных элементов позволяют осуществлять
нюансированную регуляцию — от полной экспрессии до
полной репрессии, что достигается путем локальной модификации ДНК, изменением внутриклеточных условий и т.д.
В терминаторах транскрипции генов эукариот, как и в промоторах, имеются две характерные области. На расстоянии
приблизительно 100 п.н. до сайта, где обрывается транскрипция, располагается последовательность, состоящая из 30—40
тимидиновых остатков. Ее роль, по-видимому, заключается.в
торможении движения РНК-полимеразы по ДНК в конце гена.
На расстоянии.около 20 п.н. до указанного сайга находится
последовательность 5'ААТАА3'. Участие ее в терминации
транскрипции не доказано, но выяснено, что она определяет
полиаденилирование мРНК на 3'-конце транскрипта.
Вопросы и задания
1.1. Опишите эксперимент, в котором было впервые
обнаружено мозаичное строение генов эукариот.
2.2. Нарисуйте схему транскрипции гена эукариот.
3.3. Чем некодирующие экзоны отличаются от
интронов?
4.4. Какое значение в мРНК играет 7-метилгуанозин?
5.5. Выпишите названия и определения регуляторных
элементов генов эукариот.
6. Что такое процессинг и сплайсинг? Где происходят
эти процессы?