(а) В(в)
advertisement
Лекция 9. МОДЕЛИРОВАНИЕ ГЕНОТИПА КЛЕТКИ ТРАНСФОРМАЦИЯ ОРГАНЕЛЛ Алло - и изоплазматические линии растений Соматические гибриды у растений и животных Генетическая трансформация клеточных органелл Биотехнологические задачи и трансформация пластома Внутриклеточное перераспределение генов Инвертированная генетика. Моделирование генотипа ядерно-цитоплазматических химер Все известные подходы к созданию ядерно-цитоплазматических химер можно условно разделить на три группы: Моделирование на уровне организма Моделирование на уровне отдельных гибридных клеток и регенерантов, полученных из них Моделирование на уровне геномов органелл Транспластомные томаты Моделирование на уровне организма реципрокные гибриды изоплазматические линии аллоплазматические линии А а bВ x a B b Реципрокные гибриды AB А(а) х В(в) = АВ (а) x b AB В(в) х А(а) = АВ (в) aA Реципрокные гибриды являются не самой удачной моделью для изучения эффектов цитоплазматичесих генов, так как не всегда различия в фенотипе гибридов связаны с геномами органелл Семена прямых и обратных гибридов F1 однодольных различаются геномами своих триплоидных эндоспермов – ААВ и АВВ, соответственно Генетические различия между эндоспермами могут вызывать различия в развитии растений, особенно на ранних стадиях их онтогенеза Как у растений, так и у животных яйцеклетка, несущая значительный запас различных биосинтетических компонентов (в том числе долгоживущих матричных РНК), может предопределять особенности развития организма. Этот материнский эффект обусловлен ядерными генами яйцеклетки, а не различием по органельным генам двух родителей Моделирование на уровне организма Межвидовые скрещивания А а bВ x Внутривидовые скрещивания А а a x bВ AB b В x a x bВ AB 6-10 поколений 6-10 поколений насыщающих насыщающих скрещиваний скрещиваний a B аллоплазматические линии a B изоплазматические линии Геномы аллолиний ♀ многократное беккроссирование A мт ♂ B мт х хп Белки органелл аллолиний многократное беккроссирование A ♂ ♀ B хп B А A х мт Аллолиния В(А) мт хп ♀ A(мтa хпa ) х ♂B (мтb хпb )→B(мтa хпa ) хп “B+A” B “А” - белки пластид и митохондрий, кодируемые ДНК органелл “В” - белки пластид и митохондрий, кодируемые ДНК ядра “B+A” Аллолиния В(А) ♀ A(мтA хпA ) х ♂B (мтB хпB) → B(мтB+AхпB+A) Одна из самых больших в мире коллекций аллоплазматических линий создана на пшенице В 1951 году японский генетик Kихара создал первую серию аллоплазматических линий Донор ядра, мягкая пшеница Triticum aestivum Донор цитоплазмы, дикий злак Aegilops ovata Сейчас коллекция аллоплазматической пшеницы, созданной в Японии учениками и последователями Kihara, включает линии с ядерными генотипами 12 сортов гексаплоидной мягкой пшеницы и цитоплазматическими геномами 8 различных видов пшениц (10 источников) и 24 видов эгилопсов (36 источников) – всего 552 комбинации Коллекция, сочетающая геномы 7 сортов культурного ячменя Hordeum vulgare и цитоплазматические геномы 12 форм дикого, полукультурного и культурного ячменя (H. vulgare и H. spontaneum) – всего 84 ядерно-плазменные комбинации, была создана в нашей лаборатории И.М.Голоенко под руководством О.Г.Давыденко экспрессия ядерных генов, контролирующих морфологические и количественные признаки Влияние генома органелл на процессы и свойства растений, изученные с помощью аллолиний фертильность фотосинтетические и респираторные параметры устойчивость к патогенам и другим стрессовым факторам морфогенетические потенции конъюгацию хромосом, трансмиссию и рекомбинацию отдельных компонентов ядерного генома Моделирование на уровне клетки Гибридизация неполовых клеток растений – второй способ получения ядерно-цитоплазматических химер – впервые была выполнена в 1972 г. В последующее десятилетие это направление пережило настоящий бум: были опубликованы десятки работ, сообщавшие более чем о 70 экспериментах на различных видах Solanum Nicotiana Brassica цибриды Glycine Petunia Arabidopsis Daucus Чьи органеллы обнаруживаются у цибридов ? Сегрегация пластид у цибридов может происходить в пользу как одного, так и другого родителя S. commersonii + S. tuberosum S.tuberosum+ S.commersonii 8 растений с пластидами S. commersonii Если пластиды одного вида чем-то повреждены 6 растений с пластидами S. tuberosum Не удалось обнаружить гибрид, сочетающий пластиды S. tuberosum и митохондрии S. commersonii P. hybrida N. tabacum – ядро N. tabacum митохондрии P. hybrida- пласт иды Цибрид жизнеспособный + N. tabacum N. tabacum – ядро ~ " N. tabacum " митохондрии P. hybrida- пласт иды Цибрид аномальный (митохондриальная ДНК рекомбинантная) Митохондрии P. hybrida несовместимы с ядром N.tabacum При повреждении пластид гербицидом цибриды гомопластидны S. commersonii Все растения с пластидами S. commersonii + S.tuberosum + S.commersonii S. tuberosum Гербицид SAN 9789 вызывает обесцвечивание пластид растения с пластидами S. tuberosum Как ведут себя органеллы у цибридов? Иногда сегрегация происходит очень быстро, иногда для этого нужно до 20 клеточных поколений Получены цибриды: внутривидовые, межвидовые межродовые межтрибные Nicotiana tabacum + Petunia hybrida N. tabacum (Я) +Salpiglossis sinuate (ХП)+ МТ рекомбинантного типа Попытка создать межсемейственный цибрид Solanum nigrum + N. tabacum успехом не увенчались До завершения сегрегации органелл в клетках соматических гибридов присутствуют пластиды и митохондрии обоих родителей Что происходит с их геномами в этот период? Рекомбинация хлоропластных ДНК– явление крайне редкое, либо редко обнаруживаемое у наземных растений Гораздо чаще рекомбинации хлоропластных ДНК наблюдаются у межвидовых гибридов одноклеточной зеленой водоросли Сhlamydomonas Рекомбинации митохондриальных ДНК удается выявлять значительно чаще, чем хлоропластных. Кроме родительских молекул мтДНК у соматических гибридов, как правило, обнаруживаются также новые последовательности, которые обычно являются результатом рекомбинаций между исходными типами мтДНК Соматическая гибридизация и замещение клеточных органелл у животных История гибридизации соматических клеток животных еще более длительная, чем у растений первые спонтанно слившиеся клетки обнаружены Barski и сотрудниками еще в 1960 году, а в середине 60х годов получены первые искусственные межвидовые гибриды Энуклеация ооцита микроманипуляция При клонировании животных только 1-5% реконструированных эмбрионов доживают до взрослых животных В гибридных клетках животных была обнаружена рекомбинация митохондриальных ДНК, которая в клеточных гибридах мыши и человека происходит с высокой частотой Сегрегация митохондриальной ДНК мыши в клеточных гибридах мыши и человека была показана уже в ранних работах Была найдена корреляция между утратой хромосом одного из родителей гибрида и соответствующей сегрегацией его митохондриальной ДНК При этом утрата мтДНК опережает сегрегацию хромосом одного из родителей Насыщающие скрещивания у животных – долгий и неудобный путь Bos taurus Американские коровы европейского происхождения Многократное спаривание Bos indicus Быки из Индии Ядерный геном постепенно замещался на В. indicus, тогда как митохондрии (которые передаются по материнской линии) - остались от B. taurus При экспериментальных попытках замены цитоплазмы у животных прибегают к прямой реконструкции путем переноса ядра в ооцит У широко известной овечки Долли, впервые клонированной из соматической клетки, перенесенной в ооцит другой овцы, мтДНК отличалась от таковой донора ядра и полностью соответствовала Эксперимент по созданию гибридных эмбрионов между Mus musculus L. and Rattus norvegicus L. Предварительная энуклеация Перенос ядра крысы ооцит мыши ооцит мыши Перенос ядра крысы Перенос цитоплазмы крысы ооцит мыши Развитие цибрида блокируется на стадии 1-2 клеток Развитие цибрида блокируется на стадии 5-8 клеток Развитие цибрида идет до стадии морулы Ядро крысы неспособно существовать в цитоплазме мыши Жизнеспособные «ксеномитохондриальные» цибриды Митохондрии Митохондрии гориллы гориллы Ядро человека Митохондрии шимпанзе Митохондрии Bos indicus + Bos taurus Ядро Bos indicus При дальнейших циклах деления данной цибридной клетки количество копий митохондриальной ДНК Bos indicus быстро уменьшалось, и животное-регенерант, полученное при имплантации в корову зародыша на стадии бластоциста, содержало митохондриальные ДНК исключительно от Bos taurus (разрешающая способность измерений составляла 0,05% мтДНК) Причина, по которой происходит сегрегация митохондрий B. indicus, неясна; предполагают, что это результат различий в скорости репликации органелл. В эксперименте тех же авторов на гибридной линии мышей наблюдалась стабильная гетероплазмия по мтДНК до 15-го поколения гибридных клеток. ИТАК, попытки конструирования клеточных химер в ряде случаев увенчались успехом и у животных, и у растений. Практически полезных химер немного. Но – они позволили познать ряд механизмов ядерно-цитоплазматического взаимодействия Моделирование на уровне геномов органелл (трансформация отдельных генов в геномы органелл) Вехи разработки метода генетической трансформации 60-ые годы – генетическая трансформация ядра. 1984 – перенос в Е.coli и B.subtilis пластидного rbcL гена и его экспрессия 1987 – разработка метода биолистической трансформации 1988 - трансформация пластид Chlamydomonas и митохондрий дрожжей 1990 - трансформация пластид Nicotiana tabacum (3 из 150 обстрелянных растений) Первая трансформация Chlamydomonas Обстрел частицами, несущими немутантный аналог гена Мутант по гену atpB Восстанавливается нарушенный фотосинтез Транспластомные растения – растения с трансгенами, встроенными в пластидный геном При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома Что нужно для успешной трансформации пластид? Метод переноса гена через мембрану клетки и двойную мембрану пластид Селективный пластидный маркер, обеспечивающий отбор трансформантов Система культивирования, обеспечивающая эффективную регенерацию 1987 г. - разработан метод «биолистической» трансформации включающего биологические и баллистические приемы Частицы золота или вольфрама диаметром от 0.4 до 1.7 микрона, покрытые ДНК трансформирующих плазмид Частицы проникают в клетки и клеточные органеллы Во всех экспериментах по трансформации пластид используют обычно двойные мутанты устойчивости к антибиотикам, так как частота спонтанного мутирования пластома достаточно велика Из 148 обстрелянных листьев табака было отобрано три транспластомных устойчивых клона Признак устойчивости к антибиотику был первым, перенесенным в пластиды табака Трансформационный вектор пластид pZS148 состоит из pBluescript KS+ вектора, в который встроен Sac I–EcoRV фрагмент пластидной РНК. Выделена светлым 16S рДНК. Указаны относительные позиции мутаций резистентности к антибиотикам стрептомицину (str-1) и спектиномицину (spc-2) и Pst1 линкера (*). 2.9-т.п.н. Sal 1 фрагмент включает область, связанную с репликацией (pt ori) al., При создании транспластомных растений используют их "прокариотические" A черты – чувствительность к антибиотикам, полицистронный тип устройства генома Пластидная ДНК Включение чужеродного гена (ген Т) в пластом путем генетической трансформации Плазмида встраивается в B пластидный геном в строго определенном месте, а именно туда, где находятся последовательности, гомологичные имеющимся в плазмиде Ген А ген В ген В ген С ген T aadA ген D ген С Трансформационный вектор Пластидная ДНК после трансформации Ген А ген В ген В ген Т aadA ген С ген D ген С Конструкция оказывается стабильно включенной в пластом Как удается встроить в пластом чужеродные гены? Успешной трансформации можно добиться при встраивании гетерологичных последовательностей, если фланкировать их гомологичными ДНК фрагментами Размер фланкирующих гомологичных хпДНК последовательностей с каждой стороны должен составлять не менее 1 т.п.н., размер гетерологичной последовательности при этом может изменяться от 1.3 до 3.7 т.п.н Почему транспластомные растения перспективнее трансгенных? 1. Высокий уровень экспрессии трансгена и накопления чужеродного белка. Причина - полиплоидность пластидных генетических систем и высокая стабильность чужеродных белков в пластидах. 2. Возможность экспрессировать в пластидах целые бактериальные опероны, отвечающие за какой-либо биосинтетический путь. 3. Трансгены встраиваются в пластидный геном по принципу гомологичной рекомбинации, в ядерный - хаотично. Следовательно, все трансформанты пластид возникающие из одной и той же конструкции, находятся в совершенно равноценном положении и значит не отличаются уровнем экспрессии трансгена 4. При трансформации ядерных генов у растений нередко низкий уровень экспрессии трансгенов связан с массой эпигенетических эффектов или механизмом «генного безмолвия» (gene silencing), в пластидах этого не происходит. 5. Не происходит бесконтрольного переноса пластидных трансгенов с пыльцой (почему?) Первое практическое биотехнологическое применение транспластомных растений: Встраивание гена Bt в хлоропластный геном табака Экспрессия гена токсина Bacillus thuringiensis в растениях табака: Bt токсин составлял 3-5% от общего растворимого белка клетки Растения проявляли устойчивость к личинкам травоядных насекомых !!! В дальнейшем титр токсина удалось повысить до 45% от общего растворимого белка клетки, при этом в хлоропластах образовывались кристаллы белка-токсина Наблюдалась 100%-ая гибель насекомых после дегустации трансформированных листьев Еще один пример: наработка транспластомными растениями гормона роста человека - соматотропина Количество гормона достигало до 7% от общего растворимого белка клетки Гормон в пластидах правильно укладывался во вторичную структуру Концентрация рекомбинантного белка в клетке более чем в 300 раз превышала таковую при трансформации данным геном ядерного генома Далее – предполагалось использовать протоколы трансформации пластид для основных пищевых культур Для получения транспластомных растений картофеля и томатов потребовалось еще 10 лет Получены транспластомные томаты с экспрессией трансгена в плодах (хромопласты) В перспективе: Съедобные вакцины Антитела и другие фармакопрепараты “plantibodies” Первые успехи по пластидной трансформации достигнуты у арабидопсиса, риса, видов Brassica ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕНОВ Впервые искусственная замена митохондриальной копии гена на ядерную была выполнена на мутантных клетках дрожжей без ATP8 Гены трех субъединиц ATP (6,8,9) у дрожжей находятся в митохондриях Sc wt у нейроспоры ген субъединицы 9 переместился в ядро TpN-atp9 N m atp6 atp8 atp9 atp6 atp8 m N N9/Y8 TpN-atp8art Sc mit - pLF1 Sctr atp6 atp9 N TpN-atp8art m N m atp6 atp9 Последовательность синтезирована химическим путем in vitro Reverse genetics – выяснение роли пластидного гена ycf3 Последствия инактивации гена ycf3 Области исследования и практического применения нехромосомной наследственности для улучшения растений
