no7_reparaciya_dnk

Молекулярная биология для
биоинформатиков
• Академический университет
• Ефимова Ольга Алексеевна
В презентации выборочно использованы слайды из курса
«Мутационный процесс» СПбГУ
Лекция №7 Репарация ДНК
Как ДНК сохраняет стабильность?
Причины ошибок:
•Химические агенты
•Излучение
•Ошибки репликации
Системы репарации в клетке (исправление ошибок в
ДНК)
Восстановление поврежденной цепи по неповрежденной
матрице
системы репарации
Повреждения ДНК приводят к нарушению УотсонКриковской структуры, локальной денатурации,
блокированию репликации
Контрольные точки check-points
Сигналы для репарации ДНК:
Непосредственно повреждение ДНК
События в цитоплазме, например окислительный стресс
Репарация поврежденной ДНК – часть общей адаптивной
реакции клетки на повреждающие воздействия
Системы репарации
– Прямая репарация (фотореактивация)
– Эксцизионная репарация
Mismatch repair
Base excision repair (BER)
Nucleotide excision repair (NER)
– Пострепликативная (рекомбинационная)
репарация
– SOS-репарация
Фотореактивация
UV-A
UV-B
UV-C
(320–400 nm)
(290–320 nm)
(100–290 nm)
6
УФ излучение
7
8
Фотореактивация (прямая репарация)
Повреждения ДНК из-за УФ
75%
Изгиб ДНК 7-9 °
25%
44°
10
Где чаще всего возникают фотопродукты?
Последовательности ДНК, которые облегчают изгиб и
раскручивание ДНК: ssDNA, ТАТАА бокс.
Если CPD возник?
Влияние на транскрипцию
• CPD и 6-4PP блокируют РНК- полимеразу II млекопитающих
РНК полимераза II остается связанной с точкой препятствия, в
результате снижается как уровень РНК полимеразы, так и
блокируется транскрипция соответствующего гена.
•
В основном CPD и 6-4PPs блокируют транскрипцию, и только
небольшая часть приводит к мутациям.
11
Фотореактивация (1963г)
• Гены PHR/PRE
• Кодируют фермент фотолиазу, мономерный флавинзависимый фермент
• Кофакторы : FADH- и 5,10-метенилтетрагидрофолат
(5,10-MTHF)
• Связывается в темноте с димерами ТТ
• На свету кофактор абсорбирует фотон
• Используя эту энергию фотолиаза расщепляет ТТ
димер
• Фотолиаза освобождает ДНК
12
Фотореактивация
13
Direct repair by photoreactivation.
14
Фотолиазы
• Принадлежат большому семейству фотолиазкриптохромов.
• Представители этого семейства широко
распространены во всех царствах
• В соответствии с их функцией:
– CPD-фотолиазы - репарируют CPDs,
– (6-4)PP- фотолиазы – репарируют (6-4) фотопродукты
– Криптохромы. Не участвуют в репарации ДНК,
происходят от фотолиаз. У растений криптохромы
регулируют рост, регулируемый синим светом, а у
животных – циркадные ритмы.
15
Фотолиазы имеют два типа
хромофоров
• FADH (флавинадениндинуклеотид) и MTHF
(метенилтетрагидрофолат) .
• Каталитический кофактор FADH –
непосредственно взаимодействует с субстратом –
(ТТ димером) в фоторепарирующей реакции.
• Светоуловитель MTHF– действует как антенна,
улавливает энергию и передает ее
каталитическому ко-фактору.
16
PLAY
17
Системы репарации
– Фотореактивация (прямая репарация)
– Эксцизионная репарация
Mismatch repair
Base excision repair (BER)
Nucleotide excision repair (NER)
– Пострепликативная (рекомбинационная)
репарация
– SOS-репарация
Mismatch
repair
(MMR)
20
Последствия появления ММ
21
If the tautomeric shift is
slow, DNA polymerase
moves on and a mismatch
is incorporated into the
DNA
22
Deamination of Cytosine creates a G-U mismatch
Easy to tell that U is wrong
Deamination of 5-methyl cytosine creates a G-T mismatch
Not easy to tell which base is the mutation.
В 50% случаев G “исправляется” на A, что
приводит к мутации
23
Пути коррекции ошибочно
спаренных оснований (ММ)
1. Коррекция с помощью 3’5’
экзонуклеазной активности полимераз
2. Мисмэтч репарация: выявляет
некомплементарную пару только на
дочерней цепи ДНК и производит
замену неправильного основания
только на дочерней цепи.
24
Основные белки метилнаправляемой MMR в E. coli
• Mut S и Mut L
узнают ММ
• Mut H -
– Узнает
полуметилированный
сайт GATC и делает
надрез
• MutU (UvrD) –
геликаза II
раскручивает
дуплекс и
освобождает
надрезанную область
25
A closer look at mismatch repair
26
Mismatch
mechanism
PLAY
Гомологи генов MutS, MutL у эукариот
E.coli
S.cerevisiae
S.pombe
C.elegans
D.melanogaster
A.Thaliana
Human
MutS
MSH2
MSH3
MSH6
-
MSH2
SWI4
MSH6
-
MSH2
MSH6
-
SPEL1
MSH6
-
MSH2
MSH3
MSH6 MSH7
MSH2
MSH3
MSH6
-
MutL
MLH1
PMS1
MLH2
MLH3
-
MutH
Гомологов у
эукариот нет
Возникли за
счет
эндосимбиоти
ческих
событий
EXO1
MLH1
PMS1
-
EXO1
MLH1
PMS1
-
-
MLH1
PMS2
-
TOSCA
MLH1
PMS1
MLH3
-
Q9C7N8
AAK91436
MLH1
PMS2
MLH3
PMS1
EXO1
28
MMR у человека
PCNA
29
30
Эксцизионная репарация оснований (BER) и нуклеотидов (NER)
Нуклеозид
Нуклеотид (монофосфат)
основание
нуклеозид
нуклеотид
НК
Аденин
Аденозин
(А)
Адениловая кислота
(АMP)
ДНК,
РНК
Гуанин
Гуанозин
(G)
Цитидин
(С)
Гуаниловая кислота
(GMP)
ДНК,
РНК
Цитидиловая кислота
(CMP)
ДНК,
РНК
Цитозин
Тимин
Дезокситимидин
(Т)
Дезокситимидиловая
кислота
(TMP)
ДНК
Урацил
Уридин
(U)
Уридиловая кислота
(UMP)
РНК
Base excision
repair
Repairing
apurinic and
apyrimidinic
sites
Nucleotide
excision
repair
У всех живых организмах NER состоит из
следующих этапов:
• Узнавание повреждений
• Связывание мультисубъединичного комплекса с
поврежденным сайтом
• Двойное надрезание поврежденной цепи на
несколько нуклеотидов от поврежденного сайта
в обоих направлениях 5' и 3'
• Освобождение олигонуклеотида, содержащего
повреждение между двумя надрезами
• Заполнение образовавшейся бреши ДНК
полимеразой
• Лигирование
36
Mechanism of Incision by the NER Pathway
E. coli
5’ incision is 8 nuc. from lesion
3’ incision is 4 nuc. from lesion
Mammals
5’ incision is 22 nuc. from lesion
3’ incision is 6 nuc. from lesion
PLAY
37
Genetics of NER in Humans
Xeroderma Pigmentosum (classical)
• Occurrence: 1-4 per million population
• Sensitivity: ultraviolet radiation (sunlight)
• Disorder: multiple skin disorders; malignancies of the skin;
neurological and ocular abnormalities
• Biochemical: defect in early step of NER
• Genetic: autosomal recessive, seven genes (A-G)
Xeroderma Pigmentosum (variant)
• Occurrence: same as classical
• Sensitivity: same as classical
• Disorder: same as classical
• Biochemical: defect in translesion bypass
38
Xeroderma Pigmentosum
39
Genetics of NER in Humans
Cockayne’s Syndrome
• Occurrence: 1 per million population
• Sensitivity: ultraviolet radiation (sunlight)
• Disorder: arrested development, mental retardation,
dwarfism, deafness, optic atrophy, intracranial
calcifications; (no increased risk of cancer)
• Biochemical: defect in NER
• Genetic: autosomal recessive, five genes (A, B and XPB, D & G)
40
Cockayne’s Syndrome
41
Genetics of NER in Humans
Trichothiodystrophy
• Occurrence: 1-2 per million population
• Sensitivity: ultraviolet radiation (sunlight) in subset of patients
• Disorder: sulfur deficient brittle hair, mental and growth
retardation, peculiar face with receding chin, ichthyosis;
(no increased cancer risk)
• Biochemical: defect in NER
• Genetic: autosomal recessive, three genes (TTDA, XPB, XPD)
42
Trichothiodystrophy
43
Системы репарации
– Фотореактивация (прямая репарация)
– Эксцизионная репарация
Mismatch repair
Base excision repair (BER)
Nucleotide excision repair (NER)
– Пострепликативная (рекомбинационная)
репарация
– SOS-репарация
Пострепликативная
(рекомбинационная)
репарация
SOS system
SOS
system
Репарация двуцепочечных разрывов