Лабораторная диагностика заболеваний, вызванных

Лабораторная диагностика
заболеваний, вызванных
высокопатогенными
штаммами вируса
гриппа А и ОРВИ
ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии
в Брянской области»
Зав. микробиологической лабораторией
к.м.н. Аксютина Г.В.
Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Организация и проведение лабораторной диагностики
заболеваний, вызванных высокопатогенными штаммами
вируса гриппа типа А (ВГА), у людей
Временные методические рекомендации
Издание официальное
Москва
2009
Вирусы гриппа - классификация
Семейство Orthomyxoviridae
Рода
Influenzavirus A
Influenzavirus B
Influenzavirus C
А- люди, птицы, свиньи и лошади,
морские млекопитающие
В- только люди
С- люди и свиньи
AВС
имеют антигенные различия
(по особенностям строения нуклео и матрикс - протеинов)
,
Грипп A
• Вызывает эпидемии и пандемии
• Субтипы гриппа A отличающиеся по сочетанию
двух поверхностных гликопротеинов:
–Гемагглютинин (HA) = 16 типов
–Нейраминидаза (NA) = 9 типов
• Все субтипы вируса А циркулируют среди диких
птиц
• Сезонный грипп: только субтипы H1N1, H3N2
циркулируют среди людей в настоящее время
• Грипп птиц – не характерные для человека субтипы
(все кроме H1, H3, H2)
Порядок проведения лабораторных
исследований
лабораторные исследования с целью диагностики
ВГА проводятся у пациентов с респираторными
заболеваниями тяжелого течения и неясной
этиологии при наличии как минимум двух из
перечисленных симптомов:
- фебрильная лихорадка с температурой тела
выше 380C;
- насморк или заложенность носа;
- боль в горле;
- кашель; симптомы интоксикации;
- затрудненное дыхание или дыхательная
недостаточность; боли в животе
Правила сбора клинического (секционного)
материала
• Забор материала от пациентов (или
умерших) с подозрением на грипп
проводят в ЛПУ после изоляции больного.
• Сбор клинического материала и его
упаковку осуществляет медицинский
работник ЛПУ, обученный требованиям и
правилам биологической безопасности при
работе и сборе материала, подозрительного
на зараженность ВГА.
Все процедуры по забору клинического
материала обученный медицинский
персонал осуществляет в средствах
индивидуальной защиты органов
дыхания, защитных очках или щитках
для защиты лица, резиновых перчатках.
После процедуры отбора материала
перчатки обрабатываются растворами
дезинфицирующих средств, руки после
снятия перчаток обрабатываются
антисептиками.
• Выбор времени забора клинического
материала очень важен, так как наиболее
высокое содержание вируса в дыхательных
органах человека регистрируется в течение
первых четырех дней после появления
признаков заболевания. Образцы должны
быть собраны в течение 3 суток после
появления клинических признаков.
• Для постмортальной диагностики
используют аутоптаты легких, трахеи.
Для исследования забирают следующие виды
клинического материала:
• мазки из полости носа и ротоглотки
Задняя стенка
глотки
Зонды для взятия мазков из верхних
дыхательных путей
Зонды для мазков
из носа
и ротоглотки
Не использовать зонды
на деревянной основе
Не использовать
зонды с хлопковыми
тампонами
Зонды для мазков из носоглотки
Как правильно держать зонды
НЕ правильно
Возможна травматизация
пациента !
Правильно
Мазки из ротоглотки
1. Мазки берут сухими стерильными зондами с ватными
тампонами
вращательными
движениями
с
поверхности небных дужек, миндалин и задней стенки
ротоглотки
2. Рабочую часть зонда с ватным тампоном помещают в
стерильную одноразовую пробирку с 500 мкл
стерильного 0,9 % раствора натрия хлорида
3. Конец зонда отламывают или отрезают с расчетом,
чтобы он позволил плотно закрыть крышку пробирки
4. Пробирку с раствором и рабочей частью зонда
закрывают
Мазок с задней стенки глотки
Не касаться языка !
Мазки из носа / носоглотки
1. Мазки берут сухими стерильными зондами с
ватными тампонами
2. Зонд с ватным тампоном вводят легким движением
по наружной стенке полости носа на глубину 2-3 см
до нижней носовой раковины
3. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний
носовой ход под нижнюю носовую раковину, и
удаляют вдоль наружной стенки полости носа,
производя вращательные движения
Объединенный образец
Мазок из верхнего
или нижнего носового
хода глубина 3-5 см
Мазок с задней стенки
глотки, дужек и
миндалин
СЕКЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ
• В качестве секционного материала используются
ткани легких, трахеи, сегментарных бронхов
• Секционный материал собирают в одноразовые
полипропиленовые флаконы с
завинчивающимися крышками объемом 50 мл.
Направление
Лечебное учреждение
Отделение
Ф.И.О.
Возраст
Материал
Диагноз
Дата заболевания
Дата и время забора
Эпидемиологический анамнез
Ф.И.О. забиравшего материал
Упаковка образцов
1. Все материалы, доставляемые в лабораторию,
должны быть герметично упакованы:
• 1) в транспортную емкость (плотно
закрывающиеся пластмассовые пробирки или
флаконы с завинчивающимися крышками,
проверенные на герметичность);
• 2) в плотный полиэтиленовый пакет
подходящего размера с ватой (или другим
гигроскопичным материалом) в количестве
достаточном для адсорбции всего образца в
случае его утечки; полиэтиленовый пакет
следует герметично заклеить или запаять.
2. В отдельный полиэтиленовый пакет
вкладывают бланк направления.
3. Пакеты с образцами от одного пациента
вместе с направлением упаковывают во
второй плотный полиэтиленовый пакет.
Не допускается упаковывание образцов
материалов от разных людей в один и
тот же пакет.
Условия хранения материала
• При температуре от 2 до 8 С – в течение суток.
• При температуре минус 70С или в жидком азоте
– длительно.
• Допускается только однократное замораживаниеоттаивание материала.
Условия транспортирования материала
В специальном термоконтейнере с
охлаждающими элементами или в термосе
со льдом:
• при температуре 0-4 С – не более трех
суток
ПЦР - диагностика гриппа
наборы для ПЦР-FRT/FEP (ФГУН ЦНИИЭ)
семейство Orthomyxoviridae
ВКО - FAM
«Influenza virus A/B»
Inf B - JOE
Inf A - ROX
Типирование вирусов гриппа
«Influenza virus A-тип-FL»
ВКО - FAM
ВКО - FAM
H1 - JOE
H3 - JOE
N1 - ROX
N2 - ROX
«Influenza virus A H5/N1»
«Influenza virus A/H-swine»
H5 - FAM
N1 - JOE
H5 - FAM
H7 - JOE
H9 - ROX
ВКО - FAM
Н1-swine - JOE
Алгоритм проведения ПЦР-анализа (Грипп)
Наличие эпидпоказаний для тестирование на пандемический грипп
ПЦР-FRT
«Influenza virus A/B»
Influenza virus A -
Реакция ОТ (37ºС)
45-60 мин
РНК-10 мкл - кДНК (20 мкл)
Разведение 1:2 (40 мкл)
Influenza virus A +
2-2,5 ч
«Influenza virus A/H1-swine»
Influenza virus A/H1-swine +
Influenza virus A/H1-swine -
2-2,5 ч
«Influenza virus A - тип»
Экстракция НК
(50-100 мкл)
«Рибо-преп», 20-40 мин
«Рибо-сорб», 40-60 мин
Influenza virus A/H1N1 +
Или Influenza virus A/H3N2 +
15-30 мин
Influenza virus A/H1N1 И Influenza virus A/H3N2 -
Неизвестный субтип!
Требуется изучение
референс-центрах
в
ПЦР-FEP-детекция
(качественный анализ)