Т. Кременчугская Научные руководители: М.В.Головизнин Н.С.Лахонина

Московская на Юго-Западе Гимназия №1543
Т. Кременчугская
Научные руководители:
М.В.Головизнин
Н.С.Лахонина
Москва, 2011 г.



Ревматоидный артрит – это хроническое системное
воспалительное аутоиммунное заболевание, при котором
главным образом поражаются суставы.
Ревматоидный артрит – самое широко распространненое
аутоиммунное заболевание, им страдает по разным оценкам
от 0,5% до 2% всего населения планеты.
Патогенез многих аутоиммунных заболеваний, в т.ч.
ревматоидного артрита в настоящее время до конца не ясен,
но многие исследователи сходятся на том, что важную роль в
развитии заболевания играют Т-лимфоциты.





CD3 – основной маркер Т-клеток, связанный с Тклеточным рецептором(TCR).
CD4 – в основном, маркер Т-хелперных клеток.
СD8 – маркер Т-киллерных и Т-супрессорных
клеток.
СD31 – маркер «недавних тимических мигрантов»
(предшественников всех субпопуляций).
HLA-DR – белок комплекса гистосовместимости II
класса, присутствует на мембранах активированных
клеток.
О дисфункции тимуса может свидетельствовать «незрелый», аномальный
рецепторный фенотип Т-клеток. Нарушение количественного соотношения
между популяциями также может быть связано с развитием заболевания.
Рис.1 Созревание Т-лимфоцитов.(Marilyn Thoman, SDSU BioScience Center)
Метод лазерной проточной цитометрии
использует моноклональные антитела, которые
связываются с клеточным маркером и помечены
флуоресцентным красителем. В
цитофлуорометре клетки проходят через
капилляр, пересекаемый лучом лазера. Датчики
фиксируют рассеяние света, по характеру
которого можно судить о количестве
окрашенных клеток, т.е. клеток с искомым
маркером.
Рис. 2. Метод магнитной сепарции.(www.invirogen.com)


Магнитная сепарация позволяет разделять
субпопуляции клеток благодаря магнитным
частицам (бусам), нагруженным антителами.
Это повышает эффективность анализа,
поскольку антитела добавляют к более узкой
группе клеток.
Нюансы этой методики в экспериментальной
работе и клинических исследованиях изучены
недостаточно.
Цель работы – изучить рецепторный фенотип основных субпопуляций Тлимфоцитов периферической крови больных ревматоидном артрите в сравнении со
здоровыми донорами и исследовать возможности сепарации CD3- и CD3+лимфоцитов с помощь. ферромагнитных бус с оценкой субпопуляционного состава
до и после сепарации.
Задачи:
1) Изучить имеющиеся в литературе данные о фенотипическом составе Тлимфоцитов при ревматоидном артрите.
2) Ознакомиться с методикой подготовки лимфоцитов к проточной цитометрии и
основами самой этой методики.
3) Освоить методику выделения мононуклеарных клеток из крови, инкубацию их с
моноклонакльными антителами перед целевой цитометрией.
4) Ознакомиться с методикой сепарации CD3- и CD3+-лимфоцитов с помощьюе
ферромагнитных бус и освоить метод подготовки лимфоцитов к магнитной
сепарации.
5) Исследовать выборку доноров и больных ревматоидным артритом на наличие
маркеров CD3, CD4, CD8, CD31, HLA-DR.



Работа была выполнена в лаборатории отдела
клеточного иммунитета Государственного научного
центра "Институт иммунологии" Федерального
медико-биологического агентства России.
В ходе работы методом лазерной проточной
цитометрии были обследованы 11 доноров(63±13,6
лет) и 20 больных ревматоидным артритом(58±8,6
лет), являвшиеся пациентами ЦКБ ГА и Первой
Городской клинической больницы.
Методом магнитной сепарации с использованием
ферромагнитных бус были обследованы 3 больных и
1 донор.



Первым этапом эксперимента было выделение
путем центрифугирования с раствором фиколлверографина суспензии мононуклеарных клеток.
Затем опционально проводилась магнитная
сепарация CD3- и CD3+-клеток(с использованием
ферромагнитных бус Dynabeads).
К образцам целевой суспензии добавлялись
антитела для создания одинарной или двойной
метки(пр-ва ООО «Сорбент»), например, CD3+ и
CD4+.
Окрашенные клетки исследовались на цитофлоурометре
BD FACSCalibur, далее анализировались получаемые
диаграммы рассеяния.
Рис.1 Первичная диаграмма светорассеяния
Рис.2 Гистограмма процентного содержания CD3+
иCD4+-клеток
Уровень CD3+CD4+-клеток и у доноров, и у
больных не различается значительно между
собой.
Рис.3 Процент CD3+CD4+-клеток от общего
числа CD3+ клеток у доноров.
Рис.4 Процент CD3+CD4+-клеток от общего
числа CD3+ клеток у больных ревматоидным артритом.
У больных наблюдается тенденция к снижению числа
CD3+CD8+-клеток по сравнению с донорами, но это
необходимо изучать далее(предварительный вывод).
Рис.5 Процент CD3+CD8+-клеток от общего
числа CD3+ клеток у доноров.
Рис.6 Процент CD3+C8+-клеток от общего
числа CD3+ клеток у больных ревматоидным артритом.
Число атипичных CD3-CD4+-клеток и у
доноров, и у больных крайне мало.
Рис.7 Процент CD3-CD4+-клеток от общего
числа клеток мононуклеарной суспензии у доноров.
Рис.8 Процент CD3-CD4+-клеток от общего
числа клеток мононуклеарной суспензии у больных
ревматоидным артритом.



Иммунорегуляторный индекс CD4+/CD8+ у больных ревматоидны артритом
повышен(3,94±2,98%), что связано с гиперактивностью иммунной системы.
По нашим данным, число активированных клеток(HLA-DR+) в крови больных
оказалось мало – 6,78±3,92%. Это объясняется тем, что активированные к-ки
находятся в синовиальной жидкости.
Незрелых Т-хелперных клеток(CD31+CD4+) также обнаруживается очень мало – от
0% до 2,09%. Это очень важная популяция и исследования в этой области надо
продолжать.
Рис.9 Процент CDHLA-DR+-клеток от общего
числа клеток мононуклеарной суспензии у больных.
Рис.10 Процент CD31+CD4+-клеток от общего
числа клеток мононуклеарной суспензии у больных.
Наиболее интересными оказались данные, полученные
в случае разделения клеток магнитной сепарацией.
После процедуры в суспензии и у больных, и у донора
обнаруживалось большое число(до 31,41%)CD3-CD4+клеток при том, что исходно их не было.
CD3-CD4+,%
0,89
0,29
0,27
0,65
CD3-CD4+ п.м.с.,%
5,07
29,2
29,92
31,41
Пациент
Больной 1
Больной 2
Больной 3
Донор
Таблица№1. Процентное содержание CD3-CD4+-клеток до и после магнитной сепарации.
Такое количество атипичных клеток после сепарации, скорее всего,
связано не с нарушением созревания Т-лимфоцитов, а с т.н. "модуляцией"
CD3 внутрь клетки после контакта с бусами. Т-хелперы, вероятнее,
делают это в большей степени чем Т-супрессорных клеток. Возможно, такой
эффект модуляции имеет место и в живом организме при контакте клеток
с внеклеточными структурами.
Рисунок№11. Появление псевдонезрелых клеток.
На диаграмме А) до сепарации CD3-CD4+-клеток 0,27%,
а после сепарации(диаграмма Б)) CD3-CD4+-клеток 29,92%.



Освоены методики подготовки клеток к лазерной
проточной цитометрии и магнитной сепарации.
Выявлены некоторые тенденции в изменении
фенотипа Т-лимфоцитов, которые в дальнейшем
предстоит проверить.
Обнаружен ранее не описанный феномен
модуляции CD3 при контакте клеток с магнитными
бусами.
Данное исследование было выполнено в лаборатории
отдела клеточной иммунологии Государственного
научного центра «Институт иммунологии»
Федерального медико-биологического агенства России, и
я выражаю благодарность руководителю отдела,
Александру Александровичу Ярилину за возможность
проведения этой работы, сотрудников лаборатории за
помощь в получении данных, моих научных
руководителей – Марка Васильевича Головизнина и
Наталью Сергеевну Лахонину за чуткое руководство,
моего рецензента Евгения Яковлевича Парнеса за
ценные конструктивные замечания и Сергея
Менделевича Глаголева за организацию практики.