Молекулярная биология для биоинформатиков

Молекулярная биология для
биоинформатиков
• Академический университет
• Ефимова Ольга Алексеевна
Интерференция РНК
и регуляция
экспрессии генов
Нобелевская премия
по физиологии и медицине
2006 год
"RNA interference – gene silencing by double-stranded RNA"
Andrew Z. Fire
Craig C. Mello
Предположение Fire & Mello:
Двуцепочечные РНК (dsRNA)
– запускающий механизм (триггер) системы
интерференции РНК.
Интерференция РНК
– это замолкание (сайленсинг) генов,
обеспечиваемое двуцепочечными
молекулами РНК (dsРНК).
Явление интерференции РНК открыто
в 1998 г. у Nematoda (Fire et al., 1998)
Инъекция в C.elegans РНК мышечного белка
dsРНК в 10-100 раз более эффективно активируют
систему интерференции РНК, по сравнению с ssРНК.
Fire A., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver
S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by
double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature
391, 806–811 (1998).
Эффект генетического сайленсинга
посредством интерференции РНК:
распространяется в тканях организма (!)
наследуется (!!!)
Механизм интерференции РНК
•
при исследовании интерференции РНК у растений
обнаружены короткие молекулы РНК, маркирующие ген,
подверженный сайленсингу;
•
в условиях in vitro воспроизведены биохимические
реакции интерференции РНК.
Малые интерферирующие РНК (siRNAs – short
interfering RNAs) – класс 21-22 нуклеотидных
двуцепочечных РНК, образующихся из более
длинных двуцепочечных РНК.
Общая схема регуляции генетической экспрессии за счет
интерференции РНК (по Novina, Sharp, 2004)
Функции siРНК
1. Сайленсинг мобильных генетических элементов;
2. Сайленсинг гетерохроматиновых повторов;
3. Сайленсинг генетического материала вирусного
происхождения;
4. Ограничение степени экспрессии гена в
определенных тканях.
При выделение фракций коротких РНК (19-25
нуклеотидов) из различных организмов обнаружен
еще один класс малых РНК – микроРНК.
МикроРНК (miRNAs - micro RNAs) – класс
19-25 нуклеотидных одноцепочечных РНК,
закодированных в уникальных генах
геномов многоклеточных организмов.
Схема образования miРНК
(по Novina, Sharp, 2004)
Функция miРНК
Обеспечивают сайленсинг различных генов,
обычно, за счет частично комплементарного
связывания с мРНК, в результате которого
блокируется ее трансляция.
• один тип miРНК может регулировать
трансляцию мРНК более 100 различных
генов;
• степень ингибирования зависит от
количества связывающихся miРНК (в
3’UTR мРНК содержится несколько
сайтов связывания).
Отличия miРНК и siРНК
miРНК
siРНК
• Продукт dsРНК,
закодированных в уникальных
генах геномов многоклеточных
организмов (>1% от всех генов
у человека);
• Продукт dsРНК,
образующихся в результате
транскрипции транспозонов,
гетерохроматиновых
повторов или генетического
материала вирусного
происхождения ;
• мРНК может не разрушаться;
• Один тип miРНК регулирует
разные гены.
• мРНК разрушается;
• Один тип siРНК обычно
регулирует только один тип
мРНК.
• созданы библиотеки коротких РНК и ДНК-
векторов,
кодирующих
короткие
РНК,
мишенями которых является около 8000 генов
генома человека;
• внедряется в практику терапевтическое
применение синтетических коротких РНК для
целенаправленного подавления генетической
экспрессии при некоторых заболеваниях.
Основы генетики
и
медицинской генетики
Введение в генетику
• Что такое гены?
- физические и функциональные
детерминанты признаков, которые
передаются от одного поколения к другому
• Гены были открыты в 1860 годах словацким
монахом Грегором Менделем. Он пытался
ответить на след. вопрос:
передаются ли признаки от одного из
родителей или от обоих?
Эксперименты с растениями гороха
•
Мендель открыл, что гены могут быть переданы
в одной из 2 форм (аллелей)– доминантной или
рецессивной
• Доминантная форма будет
проявляться в фенотипе
ДНК – физический носитель
генетической информации
• ДНК была открыта в 20 веке
• ДНК содержит те самые физические
гены, открытые Менделем
• У каждого организма – 1 аллель
наследуется от отца и 1 - от матери
• Гомозигота – АА или аа
• Гетерозигота – Аа
Мутации
• ДНК – это последовательность
нуклеотидов
• Что происходит когда эта
последовательность изменяется
• Мутация
• Это и приводит
к образованию различных аллелей
Хорошие, плохие и молчащие
• Мутации могут быть нескольких видов
• Хорошие:
Мутации могут улучшить выживаемость организма.
Например мутации в гене серповидно-клеточной анемии приводят к
устойчивости к малярии.
• Плохие:Мутации приводят к значительному вреду или даже гибели организма
Например, гемофилия
• Нейтральные:
Мутации не оказывают никакого влияния
Campbell, Biology, 5th edition, p. 255
Классификация мутаций
I. ГЕНОМНЫЕ
• Диплоидный набор 2n=46
• Гаплоидный 1n=23
• Полиплоидия (триплоидия 3n=69; тетраплоидия 4n=92)
• Анеуплоидия (трисомия 2n=47; моносомия 2n=45
II. ХРОМОСОМНЫЕ (делеции, дупликации, инсерции
инверсии, транслокации)
III ГЕННЫЕ
• Точечные (сайтовые) мутации (нейтральные –SNP,нонсенс,
миссенс
• Внутригенные перестройки (делеции, дупликации,
инверсии, инсерции)
• Динамические мутации
• Перемещение мобильных элементов(Alu -300-500по х100
000 Line( 6 500по х 50 000
Гены организованы в
хромосомы
• Хромосомы – нитеподобные структуры,
находящиеся в ядре клетки и содержащие 1
молекулу ДНК. Разные организмы могут иметь
разное количество хромосом (парное (2n) – у
организмов с половым размножением).
• Томас Морган (1920) – Нашел косвенное
доказательство существования хромосом путем
экспериментов с дрозофилой
Сцепленные гены и
последовательность генов.
• Различные признаки (гены) могут быть
сцеплены, т.е. расположены на одной
хромосоме.
• Морган предположил, что чем ближе
гены были расположены на одной
хромосоме, тем более часто они
наследовались совместно
Порядок генов на хромосоме?
Mutant b, mutant vg
X
Normal fly
Mutant b, mutant cn
X
Normal fly
Mutant vg, mutant cn
X
Normal fly
17% progeny
have only one
mutation
The genes vg and b are
farthest apart from each
other.
9% progeny have
only one
mutation
8% progeny have
only one
mutation
The gene cn is close to both
vg and b.
Порядок генов на хромосоме?
b
cn
vg
Основы медицинской генетики
XXI век- век генетики
Внешняя
среда
Геном
Генетика - наука о наследственности и
изменчивости
Медицинская генетика (МГ) - наука о роли
наследственности в патологии человека,
закономерностях передачи наследственных
болезней, их диагностике, лечении,
профилактике.
Клиническая генетика - прикладная МГ,
направленная на применение достижений
генетики и МГ для решения клинических
проблем пациентов и их семей.
Генеалогический анализ –метод родословных
• Установление наследственного характера
признака
• Выяснение типа передачи НБ
• Анализ пенетрантности и экспрессивности
признака
• Сцепление признака с генетическими и
молекулярными маркерами
• Медико-генетическое консультирование
Пробанд – больной или его родственник, с
которого начинается составление
родословной.
Cимволы, используемые в МГ при
составлении родословных
Аутосомно-доминантный (ахондроплазия, синдром Марфана,
нейрофиброматоз, миотоническая дистрофия, хорея
Гентингтона) – популяционная частота - 0,5-1,0%
• Прослеживается в родословных только по вертикали
• Соотношение больных и здоровых детей 1:1
• Здоровые дети от больных родителей имеют здоровое потомство
• Соотношение больных мальчиков и девочек одинаково
• Пациенты независимо от пола одинаково часто передают
болезнь
• У гомозигот болезнь нередко летальна
• Болезнь - часто результат спонтанных мутаций
Другие типы наследования
Аутосомно-рецессивный (муковисцидоз, ФКУ, СМА,
АГС, мукополисахаридозы) - популяционная частота - 0,25%
• Родители клинически здоровы
• Соотношение больных и здоровых детей 1:3
• Если больны оба супруга – дети всегда больные
• Оба пола поражаются одинаково часто
• Не исключено кровное родство супругов
• В браке больного и носителя рождается 50% больных,
больного и здорового –рождаются только здоровые
Х-сцепленные заболевания
- популяционная частота 0,25%
Доминантное наследование (витамин D резистентный
рахит)
• Поражаются мальчики в 2 раза чаще, чем девочки
• Женщины болеют менее тяжело, передают болезнь
50% сыновьям и 50% дочерям
• Больные мужчины передают болезнь всем дочерям
Х-сцепленные заболевания
- популяционная частота 0,25%
Рецессивное наследование (миодистрофия Дюшенна,
гемофилии, синдромы Мартина-Белла, Леш-Нихана,
Хантера)
• Болеют только мальчики,
• 2/3 случаев наследуются от матерей-носительниц, 1/3 спонтанных
• Сестры больных братьев в 50% - носители мутации
• Здоровые мужчины не передают заболевание
Другие типы наследования
Y-сцепленные (нарушения сперматогенеза, рост
тела, конечностей, зубов)
Митохондриальные болезни (атрофия
зрительного нерва Лебера, кардиомиопатии,
миоклоническая эпилепсия, митохондриальная
миопатия, прогрессирующая офтальмоплегия)
• Болезнь передается только по материнской линии
• Болеют мальчики и девочки
• Больные мужчины не передают болезнь потомству
Пренатальная диагностика (дородовая)
«Совокупность всех методов
диагностики состояния плода,
которая направлена на выявление
врожденных дефектов и любых
аномалий, диагностируемых при
рождении»
ВОЗ, Европейская Ассоциация
перинатальной медицины
Пренатальная диагностика научно-практическое направление
медицинской генетики
Задачи пренатальной диагностики
Практические
эффективная
диагностика,
профилактика и
лечение
наследственных и
врожденных
болезней
Научные
познание
механизмов
биологии раннего
развития человека,
включая
гаметогенез,
эмбриогенез и
фетальный период
Методы оценки состояния плода
ПРЯМЫЕ
НЕПРЯМЫЕ
(обследование плода)
(обследование беременной)
1. Клиническое
(акушерско-гинекологическое)
ИНВАЗИВНЫЕ
НЕИНВАЗИВНЫЕ
2. Бактерио- и серологическое
3. Медико-генетическое
· генеалогическое
· цитогенетическое
· молекулярно-биологическое
4. Анализ эмбрионспецифических
белков
·
·
·
·
ПОЛУЧЕНИЕ ПЛОДНОГО МАТЕРИАЛА
1. Ультразвуковое
сканирование
2. Электрокардиография
3. Рентгенография
a -фетопротеин
хорионический гонадотропин
эстриол
другие
1. Хорионбиопсия (I триместр)
2. Плацентобиопсия (II триместр)
3. Амниоцентез
· ранний (13-14 н.б.)
· обычный (15-22 н.б.)
4. Кордоцентез (II-III триместр)
5. Фетоскопия (II-III триместр)
ЛАБОРАТОРНЫЕ
1.
2.
3.
4.
Цитогенетические
Молекулярно-генетические
Биохимические
Иммуноцитохимические
6. Биопсия тканей плода
(кожа, мышцы,печень, селезенка и пр.)
(II-III триместр)
Инвазивные методы пренатальной диагностики
Доимплантационный период
Методы ЭКО
Преконцепционная диагностика (полярные тельца)
Доимплантационная диагностика (бластомеры или трофобласт)
I триместр беременности (период органогенеза)
Хорионбиопсия
Трансцервикальный способ (7-12 недели)
Трансабдоминальный способ (с 9/10 недели)
II триместр беременности (плодный период)
Плацентобиопсия (14-26 недели)
Амниоцентез (с 14 недели)
Кордоцентез (с 20 недели)
Составляющие
ПД
1.Медико-генетическое консультирование
2.УЗ-скрининг
3.Биохимический скрининг
4.Получение плодного материала
5.Лабораторная диагностика
цитогенетическая
молекулярная
биохимическая
6.Рекомендации по результатам ПД
ДОЛЯ МОНОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
В ПРЕНАТАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
НИИАГ им. Д.О.Отта, Санкт-Петербург
ПД
генных
болезней
14%
ПД
хромомсомных
болезней
86%
Синдром ломкой Болезнь Хантера
1%
Х-хромосомы
Гемофилия В 1%
1%
Гемофилия А
10%
Болезнь
Верднига Гоффмана
0,1%
Талассемия
0,3%
Хорея
Гентингтона
0,1%
Миодистрофия
Дюшенна/
Беккера
10%
Фенилкетонурия
11%
Муковисцидоз
66%
ПРЕДИКТИВНАЯ МЕДИЦИНА
(ПМ)
1.Раздел молекулярной медицины, направленный на
досимптоматическое выявление лиц с высокой
наследственной предрасположенностью к МФЗ c целью
своевременной (упреждающей) профилактики заболеваний
2. Отличительные особенности ПМ:
- индивидуальный характер
- профилактическая направленность
3. Методическая основа ПМ – тестирование генов-маркеров,
ассоциированных с МФЗ, т.н. генов «предрасположенности»
4.Генетический паспорт - индивидуальная база ДНКданных, отражающая уникальные генетические
особенности каждого человека, его наследственную
предрасположенность к тем или иным
наследственным и МФЗ