Mycobacterium avium - Институт биоорганической химии

Институт биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Лаборатория структуры и функций генов человека
Использование NGS в анализе транскриптомов
бактерий на примере микобактерий
Тимофей Скворцов
Москва
2013
I.
Бактериальный транскриптом и NGS
Бактериальный транскриптом
Содержание основных классов РНК в транскриптоме
Размер генома типичной бактерии:
Масса РНК в одной бактериальной клетке:
≈5 млн п.о.
≈0.1-0.2 пг
Сложность бактериального транскриптома
транс-малые РНК
цис-малые РНК
(Toledo-Arana and Solana, 2010, Bioessays)
Сложность бактериального транскриптома
Рибопереключатели
Длинные НТО
Перекрывающиеся НТО
Безлидерные РНК
(Guell et al., 2011, Nat Rev Microbiol)
(Toledo-Arana and Solana, 2010, Bioessays)
Сложность бактериального транскриптома
Альтернативная транскрипция
Влияние хроматина и структуры
нуклеоидов на регуляцию транскрипции
Эпигенетические модификации
Локализованная трансляция
Сплайсинг РНК Полиаденилирование РНК
(Guell et al., 2011, Nat Rev Microbiol)
Редактирование РНК
Процессинг РНК
Упрощенная схема анализа транксриптома бактерий
Выделение РНК
Синтез кДНК
Пробоподготовка
и секвенирование
@read1
GCATGATCGTA
+
9:;<=>?@ABC
РНК
Бактерии
•
•
•
Культура
In vivo/in planta
Некультивированные
образцы
•
•
•
•
Обогащение
Фракционирование
Фрагментирование
Модификации
Данные NGS
кДНК
•
•
•
Амплификация
Модификации
Фракционирование
•
•
•
Платформа
Мультиплексирование
Paired end/Single end
sequencing
Схема анализа данных NGS
FASTQ file(s)
Контроль качества
FASTQC
Фильтрация ридов
Удаление адаптерных
последовательностей
FASTX toolkit
IGV, Artemis
Картирование ридов
Bowtie, BWA,
SOAP, Tophat etc.
Визуализация
SAM/BAM file(s)
Качественный анализ
Фильтрация
Дедупликация
Различные
программы
GTF/GFF/BED file(s)
reference
genome
FASTA file
SAMtools, Picard tools
Количественный анализ
edgeR, DESeq,
bayseq etc.
Gene set enrichment анализ
GOSeq, GSEA,
DAVID etc.
Бактериальный транскриптом
Выявление функциональных особенностей генома
(Sorek and Cossart, 2010, Nat Rev Genet)
Бактериальный транскриптом
Поиск дифференциально экспрессирующихся генов
Нормализация: RPKM/FPKM, TMM etc.
Сравнение: edgeR, DESeq, DEGSeq, bayseq, NOISeq etc.
Условие 1
Условие 2
Ген 1
Ген 2
Ген 3
II.
Качественное описание бактериального
транскриптома на примере Mycobacterium avium
Mycobacterium avium
Согласно современной таксономической классификации, род Mycobacterium
включает более 60 видов и более 100 подвидов.
Mycobacterium avium
Условно-патогенные микобактерии.
Вызывают диссеминированные инфекции
у людей с иммунодефицитами. Возможно
вызывает болезнь Крона.
Mycobacterium avium paratuberculosis
вызывают болезнь Джонса у жвачных
животных.
Mycobacterium avium внутри макрофагов
Новые малые РНК Mycobacterium avium
Положение sRNA-кандидатов в геноме
Нами были обнаружены 4 кандидатных малых РНК Mycobacterium avium, 3 из них
были гомологичны уже известным малым РНК M. tuberculosis. MAV_1034-1035 не
имеет гомологии в геноме M.tuberculosis и обладает стабильной вторичной
структурой (RNAfold).
(Ignatov et al. 2010)
Mycobacterium avium – транскриптом in vitro
Мы провели RNA-seq (Illumina) транскриптома M. avium subsp. avium TMC724 из
культуральной среды в mid-log фазе клеточного роста. Было получено ≈42 млн ридов,
28.2 млн ридов было картировано на геном M. avium.
0.2 млн
1%
Representation of functional classes among the genes
with the highest expression
(top 10% of genes ranked by their RPKM values)
4.4 млн
16%
3.6 млн
13%
Transport and binding proteins
Unknown function
Central intermediary metabolism
Mobile and extrachromosomal element…
Fatty acid and phospholipid metabolism
Amino acid biosynthesis
Cell envelope
DNA metabolism
Cellular processes
Energy metabolism
Purines, pyrimidines, nucleosides, and…
Biosynthesis of cofactors, prosthetic groups,…
Signal transduction
Regulatory functions
Protein fate
Transcription
Protein synthesis
18.8
млн
70%
reads mapped to rRNA operon
reads mapped to CDS
reads mapped to CDS (antisense orientation)
reads mapped to IGR
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
(Ignatov et al., unpublished results)
Mycobacterium avium – транскриптом in vitro
Точки старта транскрипции (TSS)
 Для 844 генов были определены точки старта
транскрипции (TSS), для 652 из них в 5-8 п.о.
upstream от TSS были найдены консенсусные
промотерные последовательности.
 33% из предполагаемых TSS были
картированы в ±3 п.о. от старт-кодонов
соответствующих генов, что говорит в пользу
того, что их мРНК являются безлидерными.
Визуализация картирования ридов
на геном (Artemis)
 Для остальных генов 5’-НТО были от 3 до 728
п.о. в длину, среднее значение – 83 п.о.
6 из этих генов имели в составе 5’-НТО
рибопереключатели, из них 3 – лидерные
последовательности ykok, Mg2+-сенсоров,
контролирующих экспрессию белковтранспортеров ионов магния.
(Ignatov et al., unpublished results)
Mycobacterium avium – транскриптом in vitro
Антисмысловая транскрипция
 Нами было выявлено 86 кандидатных
антисмысловых РНК, протяженностью от
одного до нескольких генов.
 Также было обнаружено 10 кандидатных
транс-малых РНК, 4 из которых не имели
гомологии с геномом M. tuberculosis.
Малая РНК MAV_1034-1035 представляет
особый интерес для дальнейшего изучения,
т.к. обладает высоким уровнем экспрессии и
не имеет гомологии с геномом M.tuberculosis.
(Ignatov et al., unpublished results)
III.
Сравнительный анализ транскриптомов
бактерий на примере Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis
Патогенные микобактерии, возбудители
туберкулеза.
Примерно 30% населения Земли
инфицировано M. tuberculosis.
Туберкулез уносит каждый год около 1.5
млн человеческих жизней (больше, чем
рак легкого).
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis – дормантное состояние
Активные MTB
Овоидные формы MTB
(По Chao and Rubin, 2010, Annu Rev Microbiol)
(Shleeva et al., 2011, Tuberculosis)
Поиск дифференциально экспрессирующихся генов
Мы провели сравнение транскриптомов M. tuberculosis H37Rv в
дормантном состоянии (Dorm) и логарифмической фазе роста (Log).
Секвенирование проводилось на платформе Illumina, в биологических
трипликатах.
Репликат
Число
Число прочтений, картированных
прочтений
на геном 1 раз
Dorm 1
27 913 346
9 019 444 (32%)
Dorm 2
7 352 103
6 007 569 (82%)
Dorm 3
13 973 841
11 803 273 (85%)
Log 1
18 798 208
10 422 051 (55%)
Log 2
17 736 079
15 828 832 (89%)
Log 3
11 046 464
9 914 746 (90%)
(Ignatov et al., unpublished results)
Поиск дифференциально экспрессирующихся генов
Вычисление корреляции между репликатами.
D1
Dorm 1
Dorm 2
Dorm 3
Log 1
Log 2
Log 3
D2
D3
L1
L2
L3
1
0,85
1
0,86
0,88
1
0,77
0,6
0,61
1
0,74
0,63
0,64
0,95
1
0,71
0,6
0,62
0,93
0,99
D1_AS D2_AS
D3_AS
L1_AS
L2_AS
L3_AS
Dorm 1_AS
1
Dorm 2_AS
0,74
1
Dorm 3_AS
0,77
0,74
1
Log 1_AS
0,65
0,5
0,53
1
Log 2_AS
0,65
0,54
0,57
0,93
1
Log 3_AS
0,61
0,52
0,54
0,91
0,97
1
1
Мы вычислили корреляционный коэффициент Спирмена для выявления
сходимости репликатов. Сходимость результатов внутри групп была высокой
(до 0,99) и превышала межгрупповую. Для антисмысловых транскриптов (AS)
сходимость была ниже, тем не менее оставаясь значимой.
(Ignatov et al., unpublished results)
Поиск дифференциально экспрессирующихся генов
Top 30 генов с повышенной экспрессией при переходе в Dorm
Gene
PE_PGRS17
PE_PGRS10
Rv0789c
Rv3424c
Rv2662
Rv1405c
Rv2013
Rv3428c
Description
PE-PGRS family protein PE_PGRS17
PE-PGRS family protein PE_PGRS10
Hypothetical protein
Hypothetical protein
Hypothetical protein
Putative methyltransferase
Transposase
Possible transposase
fadD18
cut1
PE_PGRS18
PPE39
bpoA
Rv0841
Rv2656c
galK
PE_PGRS49
Rv1403c
Rv0612
lpqX
PE_PGRS56
PE_PGRS27
PE_PGRS25
PE_PGRS34
PE_PGRS50
PE_PGRS3
PE_PGRS54
Probable fatty-acid-CoA ligase FadD18
Probable cutinase Cut1
PE-PGRS family protein PE_PGRS18
PPE family protein PPE39
Possible peroxidase BpoA (non-haem peroxidase)
Probable conserved transmembrane protein
Possible PhiRv2 prophage protein
Probable galactokinase GalK (galactose kinase)
PE-PGRS family protein PE_PGRS49
Putative methyltransferase
Conserved hypothetical protein
Probable lipoprotein LpqX
PE-PGRS family protein PE_PGRS56
PE-PGRS family protein PE_PGRS27
PE-PGRS family protein PE_PGRS25
PE-PGRS family protein PE_PGRS34
PE-PGRS family protein PE_PGRS50
PE-PGRS family protein PE_PGRS3
PE-PGRS family protein PE_PGRS54
Мы применили программу edgeR
для поиска генов, чья
относительная представленность
транскриптов которых внутри
каждого из транскриптомов
увеличилась/уменьшилась.
890 генов увеличает экспрессию при
переходе в дормантное состояние
(Dorm), при это снижается
экспрессия 939 генов
(Ignatov et al., unpublished results)
Поиск дифференциально экспрессирующихся генов
Анализ категорий генной онтологии (Gene Ontology, GO) и представленности
генов (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) был предпринят при помощи
программы GOseq.
Обогащено в Dorm
Обогащено в Log
Категория
Категория
PE-PGRS
F0F1-type ATP synthase
Common Pathway For Synthesis of Aromatic
Compounds (DAHP synthase to chorismate)
Respiratory Complex I
DNA repair, bacterial RecBCD pathway
Ribosome SSU bacterial
Chorismate Synthesis
Ribosome LSU bacterial
Arginine Biosynthesis extended
TCA Cycle
(Ignatov et al., unpublished results)
IV.
Перспективы транскриптомики бактерий
Перспективные направления
РНК-белковые взаимодействия
Модификации РНК
(Guell et al., 2011, Nat Rev Microbiol)
Вторичная структура РНК
Альтернативная транскрипция
Перспективные направления
Пространственная организация (локализомика)
Секвенирование транскриптома одной клетки
(Guell et al., 2011, Nat Rev Microbiol)
(Campos and Jacobs-Wagner, 2013, Curr Opin Microbiol)
(Raj and van Oudenaarden, 2008, Cell)
Наш коллектив
ИБХ РАН
• Ажикина Т.Л.
• Игнатов Д.В.
• Скворцов Т.А.
ЦНИИТ РАМН
МГУ, кафедра
биотехнологии
Институт биохимии
им. А.Н. Баха РАН
• Апт А.С.
• Майоров К.Б.
• Малахо С.Г.
• Капрельянц А.С.
• Салина Е.Г.
Спасибо за внимание
Сложность бактериального транскриптома
Сложность бактериального транскриптома
Сложность бактериального транскриптома
Малые РНК бактерий
Сложность бактериального транскриптома
Инфекционный цикл туберкулеза
Излечение
Трансмиссия
Латентная инфекция
≈2 000 000 000 человек
Смерть
≈2 000 000 случаев в год
Стерилизация инфекции
Активный туберкулез
(вероятность – 10% в течение жизни)
≈10 000 000 случаев в год
Mycobacterium avium – транскриптом in vitro
(Ignatov et al., unpublished results)
Схема анализа
Новые малые РНК Mycobacterium avium
Положение sRNA-кандидатов в геноме
Нами были обнаружены 4 кандидатных малых РНК Mycobacterium avium, 3 из них
были гомологичны уже известным малым РНК M. tuberculosis. MAV_1034-1035 не
имеет гомологии в геноме M.tuberculosis и обладает стабильной вторичной
структурой (RNAfold).
(Ignatov et al. 2010)
Поиск дифференциально экспрессирующихся генов
В Dorm клетках содержится в ≈100 раз меньше мРНК, чем в Log.
Мы применили программу edgeR для поиска генов, чья относительная
представленность внутри каждого из транскриптомов увеличилась/уменьшилась.
(Loven et al., 2012, Cell)