Слайд 1 - MedExpo.kz
advertisement
Российский национальный исследовательский медицинский университет Кафедра клинической лабораторной диагностики ФДПО Щербо Сергей Николаевич СОВРЕМЕННЫЕ БИОМАРКЕРЫ ЛАБОРАТОРНОЙ И ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ. Грядет эра персонализированной медицины и готовиться к ней нужно уже сегодня. Джордж Черч. 2007 Медицина 4 «П» Медицина XXI века Предиктивная (предсказательная) Предупредительная (профилактическая) Партисипаторная (participatory) – пациент участник процесса, его информируют и обучают. Ему помогают в выборе, о нем заботятся. Персонализированная (индивидуальная) Лерой Гуд (Leroy Hood) США, 2008) ВРАЧ-КОНСУЛЬТАНТ И ПАЦИЕНТ МЕДИЦИНА ВО ВСЕ ВРЕМЕНА ОСНОВНОЕ ВНИМАНИЕ УДЕЛЯЛА УЖЕ ЗАБОЛЕВШЕМУ ЧЕЛОВЕКУ. ВОПРОС «ЧЕМ БОЛЕН ПАЦИЕНТ?» В БУДУЩЕМ МОЖЕТ ПРЕВРАТИТЬСЯ В ЗАДАЧУ «ЧЕМ МОЖЕТ ЗАБОЛЕТЬ ЭТОТ ЧЕЛОВЕК И ЧТО СЛЕДУЕТ ПРЕДПРИНЯТЬ СЕГОДНЯ, ЧТОБЫ ЭТОГО НЕ ДОПУСТИТЬ» В Nature Medicine опубликована статья, в которой крупные мировые стратеги здравоохранения задались вопросом определения главных ресурсов здравоохранения с точки зрения эффективности работы. Проведено специальное исследование: к тысяче пациентов с определенной патологией применили современное стандартное лечение, некий средний уровень возможный на сегодня терапии, и эффективность оказалась 30%. К другой тысяче больных применили подходы ПМ и эффективность составила до 70%. Таким образом, уже сегодня, опираясь на современные лекарственные и инструментальные ресурсы, эффективность лечения можно повысить на 40%! Персонализированная медицина (персонифицированная медицина) Термин «personalized medicine» впервые появился в качестве названия монографии, изданной в 1998 году: Jain R.R. Perzonalized Medicine, Decision Resources Inc. Waltham, MA, USA, 1998. ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ МЕДИЦИНА ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ МЕДИЦИНА ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ ИНТЕГРАЛЬНУЮ МЕДИЦИНУ, КОТОРАЯ ВКЛЮЧАЕТ РАЗРАБОТКУ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННЫХ СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ ИЛЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ ГЕНОМИКИ, ПРОТЕОМИКИ И ДРУГИХ «ОМИК», ТЕСТИРОВАНИЯ НА ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К ЗАБОЛЕВАНИЯМ, ПРОФИЛАКТИКУ, ОБЪЕДИНЕНИЕ ДИАГНОСТИКИ С ЛЕЧЕНИЕМ И МОНИТОРИНГОМ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ И ДОКАЗАТЕЛЬНАЯ МЕДИЦИНА ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ И ДОКАЗАТЕЛЬНАЯ МЕДИЦИНА ДОЛЖНЫ СТАТЬ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ПОЛИТИКОЙ В ОБЛАСТИ МЕДИЦИНЫ, ТАК КАК ОБЕСПЕЧИВАЮТ КЛИНИЧЕСКУЮ И ЭКОНОМИЧЕСКУЮ ЭФФЕКТИВНОСТЬ, БЕЗОПАСНОСТЬ ЛЕЧЕНИЯ. ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННАЯ И ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МЕДИЦИНА ТРАНСЛЯЦИОННАЯ МЕДИЦИНА ЗАНИМАЕТСЯ ВОПРОСАМИ ВНЕДРЕНИЯ НОВЕЙШИХ ДОСТИЖЕНИЙ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК И БИОИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В МЕДИЦИНСКУЮ, В ЧАСТНОСТИ ЛАБОРАТОРНУЮ ПРАКТИКУ. ПРИМЕР: ПРОЕКТ ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА И ТЕХНОЛОГИЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ. ЛАБОРАТОРНАЯ И ПЕСОНАЛИЗИРОВАННАЯ МЕДИЦИНА В настоящее время сложились новые предпосылки для переоценки роли лабораторной медицины в общей системе клинических дисциплин, что обусловлено требованиями, которые выдвигаются в связи со стремительным развитием современных подходов и принципов доказательной и персонализированной медицины, более глубоким пониманием характера междисциплинарных отношений. ЗАДАЧИ ПЕРСОНАЛИЗИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ: 1. ПОНЯТЬ МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ЗАБОЛЕВАНИЯ И НАЙТИ НАИБОЛЕЕ ВАЖНЫЕ БИОМАРКЕРЫ 2. СОЗДАНИЕ ЛЕКАРСТВННЫХ СРЕДСТВ, НАИБОЛЕЕ ЭФФЕКТИВНО ДЕЙСТВУЮЩИХ НА НУЖНЫЕ МИШЕНИ, СВЯЗАННЫЕ С ПАТОЛОГИЕЙ 3. БОЛЕЕ ГЛУБОКОЕ ПОНИМАНИЕ ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ ПОДПОПУЛЯЦИЙ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ , РАЗДЕЛЕНИЯ ИХ НА ТИПЫ И ПОДТИПЫ ФИЛОСОФСКИЕ ПРОТИВОРЕЧИЯ И КОНФЛИКТЫ ПМ 1. ИДЕЯ ПМ ДЛЯ КАЖДОГО КОНКРЕТНОГО ЧЕЛОВЕКА НЕВЫПОЛНИМА, Т.К. ДЛЯ ТОГО, ЧТОБЫ МЕДИЦИНСКОЕ ВМЕШАТЕЛЬСТВО БЫЛО БЕЗОПАСНЫМ, НЕОБХОДИМО ПРОВОДИТЬ КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НА ГРУППЕ ПАЦИЕНТОВ. 2. МЕДИЦИНА СТРЕМИТСЯ К СИСТЕМАТИЗАЦИИ И КЛАССИФИКАЦИИ, КОТОРЫЕ ИМЕЮТ НЕДОСТАТКИ (СЛОЖНОСТЬ ОРГАНИЗМА, ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПАТОЛОГИЙ И ДР.). СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПОЗВОЛЯЕТ ГОСУДАРСТВУ РЕШАТЬ НРАВСТВЕННОЮРИДИЧЕСКИЕ И ЭКОНОМИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ. Гален К. Наша эра Идея Мудров М.Я. Пирогов Н.И. Боткин С.П. Флоринский В.М. Ослер У. 1850-1900 г. Клиническая практика 2000 г. Уотсон Д Вентер Крейг 2007-2010 г.г. Персональные геномы ПОИСК НАИБОЛЕЕ ЗНАЧИМЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ БИОМАРКЕРОВ И Омы. ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАТИЧЕСКИХ И ДИНАМИЧЕСКИХ ОМИКов ГЕНОМИКА – ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВСЕХ ГЕНОВ И МУТАЦИЙ, ПРИВОДЯЩИХ К НАСЛЕДСТВЕННЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ ИЛИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ ТРАНСКРИПТОМИКА –ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВСЕХ МАТРИЧНЫХ РНК, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА мРНК И ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ЭКСПРЕССИИ ВСЕХ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БЕЛКИ У ДАННОГО ЧЕЛОВЕКА В ДАННЫХ УСЛОВИЯХ РНомика – ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВСЕХ НЕКОДИРУЮЩИХ РНК И ИЗМЕРЕНИЕ ИХ ИЗМЕНЕНИЙ У ДАННОГО ЧЕЛОВЕКА В КОНКРЕТНЫХ УСЛОВИЯХ МЕТАБОЛОМИКА –ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВСЕХ МЕТАБОЛИТОВ В КЛЕТКАХ, ТКАНЯХ, ОРГАНАХ, БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ У ДАННОГО ЧЕЛОВЕКА В КОНКРЕТНЫХ УСЛОВИЯХ Genomics (DNA- 25,000 genes) Геномика Transcriptomics (RNA - 100,000 mRNA’s) Транскриптомика микроРНК Proteomics (Proteins - 1,000,000 proteins) Протеомика Metabolomics (molecules) Метаболомика ТЕХНОЛОГИИ ПОЛОЖИВШИЕ НАЧАЛО ЭРЫ ОМИКСНОЙ БИОЛОГИИ В 1986 г. Лерой Худ (Калифорнийский технологический институт) изобрел первый автоматический секвенатор ДНК В 1989 г. Стив Фодор ( компания Affimax) создал первый ДНК-чип (microarray). В течение последующих лет омиксный инструментарий обогатился многопараллельными методами для определения концентрации и активности белков (протеомика), метаболитов (матаболомика) регуляции экспрессии генов (транскриптомика) и др. В науке более 70% заявок на исследовательские гранты в США, Европе предполагают использование хотя бы одной омиксной технологии. Фармацевтические компании применяют омиксные технологии на всех этапах от токсикогеномики до мониторинга пациентов в клинических испытаниях ( до 10 различных омиксных тестов для каждого пациента в фазе II). ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ БИОМАРКЕРЫ Исследования геномов: • Полное повторное секвенирование геномов • Направленное секвенирование участков геномов; • de novo секвенирование небольших геномов Эпигенетические исследования: • ДНК-белковые взаимодействия (ChIP-Seq) • Анализ метилирования ДНК Анализ РНК (RNA-Seq): • Изучение малых РНК (miRNA, siRNA, piRNA, esiRNA); • Измерение уровней мРНК, анализ изоформ мРНК, изучение некодирующих • РНК, обнаружение новых транскриптов; • Экспрессия генов в отдельной клетке; • Исследование вторичной структуры РНК; • РНК-белковые взаимодействия. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ВАРИАЦИИ ЧИСЛА ПОВТОРОВ (CNVs) В 2006 г. в журнале Nature были опубликованы результаты работы R. Redon и соавт, которые обнаружили новый тип вариаций в геноме человека – CNVs - copy number variations Было обнаружено около 150 участков, в которых присутствовали значительные по длине (от нескольких тысяч до нескольких миллионов пар нуклеотидов) дупликации (удвоение) и делеции фрагментов ДНК. Протяженность этих участков довольно велика – в целом, по оценке авторов работы, она составляет до 12% всего генома, т.е. вклад CNVs в вариативность генома сопоставим с вкладом ОНП или даже превышает его. ГАПЛОГРУППЫ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК ВЛИЯНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ГАПЛОТИПОВ НА ОРГАНИЗМ Гаплогруппа J J J Т D Н Н (nt 4336) J, U U U К N (G10398A) Повышенная вероятность наследственной оптической невропатии Лебера долгожительства у европейцев диабета биполярные аффективные расстройства долгожительства у азиатов болезни Паркинсона болезни Альцгеймера заболеваний сетчатки повышения уровня сывороточных IgE рака простаты и почек у белых американцев рака груди рака груди и пищевода ВЛИЯНИЕ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ГАПЛОТИПОВ НА ОРГАНИЗМ Гаплогруппа Пониженная вероятность J, Uk болезни Паркинсона U, T болезни Альцгеймера T рака груди Н возрастной дегенерации сетчатки Н сепсиса N9a диабета, метаболического синдрома и инфаркта миокарда у азиатов Выявление «генов предрасположенности» к заболеванию проводится путем сопоставлений частот генотипов у больных и здоровых Группа больных Рбольные Контроль (здоровые) >> - генотип, указывающий на предрасположенность к заболеванию. Рконтроль OR – количественная мера предрасположенности (Odd Ratio), показывает во сколько раз повышена вероятность заболеть для носителя «плохого» генотипа Рбольные (1- Рконтроль) OR = ______________________ Рконтроль (1- Рбольные) Распространенные аллели с большим эффектом, обнаруженные в GWAS (по Ch.S. Ku, 2010) Болезнь Наименован ие гена rs OR OMIM Регион CFH 380390-C 4.60 134370 1q31 Эксфолиативная глаукома LOXL1 382942-G 20.10 153456 15q24.1 Болезнь Крона JL23R 10889677 2.13 607562 1p31.3 Рак яичка KILTG 3782179 3.08 184745 12q22 4474514 3.07 Возрастзависимая дегенерация сетчатки ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ (ГТ) в США, 2010г. Всего ГТ наследственной предрасположенности применяется для 213 заболеваний Особенно часто оно проводится для таких заболеваний: рак толстого кишечника, диабет тип 2, глаукома, инфаркт миокарда, рак легких, рассеянный склероз, целиакия , рак молочной железы, ожирение, рак простаты, фибрилляция предсердий, диабет тип1, болезнь Крона, гемохроматоз, волчанка, дегенерация сетчатки, остеоартриты, псориаз, рестеноз коронарных сосудов , болезнь «беспокойных» ног, тромбофилия ГЕННЫЕ СЕТИ – ОСНОВА ПРЕДИКТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ ГЕННАЯ СЕТЬ – ЭТО ГРУППА КООРДИНИРОВАННО ФУНКЦИОНИРУЮЩИХ ГЕНОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ФОРМИРОВАНИЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ ОРГАНИЗМА (МОЛЕКУЛЯРНЫХ, БИОХИМИЧЕСКИХ, ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ) Составление генной сети для каждого мультифакториального заболевания, идентификация в ней центральных генов и генов-модификаторов, анализ ассоциации их полиморфизма с конкретным заболеванием, разработка на этой основе комплекса профилактических мероприятий для конкретного пациента составляют основу предиктивной медицины. СЕТЬ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ БОЛЕЗНЕЙ ЧЕЛОВЕКА (Goh et al., 2007) КРУГИ – болезни; РАЗМЕРЫ КРУГА – число генов-кандидатов МФЗ (шкала - справа); ЛИНИИ - гены общие для нескольких МФЗ (толщина линий - соответствует числу генов) ГИПОТЕЗА CV/CD «часто встречающиеся генные варианты / распространенные заболевания» Гипотеза, что наличие в геноме данного индивида набора широко распространенных измененных генов (генных вариантов) коррелирует с подверженностью его определенному заболеванию (common variants / common disorder, CV/CD) и что это поможет понять механизм наследования таких сложных заболеваний, как диабет II типа или атеросклероз. Означает ли отсутствие ощутимого вклада часто встречающихся генных вариантов в развитие той или иной патологии, что упомянутая гипотеза неверна? Этот вопрос положил начало расколу в медико–биологическом сообществе. МИР РНК Определяющая роль РНК в синтезе белков была предсказана ещё в 1939 г. в работе Т. Касперссон, Ж. Брачета и Дж Шульца. В 1956–57 гг. в Советском Союзе А.Н. Белозерский и А.С. Спирин независимо доказали существование мРНК, а также выяснили, что основную массу РНК в клетке составляет рибосомальная РНК (рРНК), которая служит основой для рибосом (сложных нуклеопротеиновых комплексов, основная функция которых – сборка белка из отдельных аминокислот на основе мРНК). тРНК: доставляют аминокислоты к месту сборки белков – в активный центр рибосомы, «ползущей» по мРНК. Этапы экспрессии генов Гены-домохозяйки и тканеопецифичные гены Разная экспрессия одинакового генотипа в разных клетках 1, 2, 3 - гены, одинаковые во всех клетках. Вертикальными столбиками показано количество РНК (или белка), синтезированного в разных генах МОЛЕКУЛЫ РНК Типов и, соответственно, функций у различных РНК значительно больше, так как существует значительное количество участков ДНК, кодирующих только РНК. Так как РНК значительно более гидрофильна по сравнению с ДНК (за счет замены дезоксирибозы на рибозу), она более лабильна и может относительно свободно перемещаться в клетке. Однако, с гидрофильностью связано и то, что РНК очень нестабильна: намного хуже, чем ДНК, хранится (даже внутри клетки) и деградирует при малейшей перемене условий (температура, рН). Кроме указанной нестабильности, большой вклад принадлежит рибонуклеазам (или РНКазам) — классу расщепляющих РНК ферментов, очень стабильных и вездесущих. Из-за этого работать с РНК намного сложнее, чем с белками или ДНК. НЕ КОДИРУЮЩИЕ РНК В 1993 г. В. Амбромс, Р. Ли и Р. Фейнбраум при изучении гена lin-14, задействованного в развитии у нематоды Caenorhabdiis elegans обнаружили, что количество белка LIN-14 регулировалось коротким РНК-продуктом гена lin-4. В результате последующих исследований оказалось, что существует и достаточно многочисленный класс так называемых малых, не кодирующих РНК. pi-РНК, ответственна за развитие половых клеток и ни одно млекопитающее мужского пола не может размножаться без них. МикроРНК МикроРНК (miRNA) – это класс малых некодирующих молекул РНК, которые имеют длину около 22 нуклеотидов (18-25), обнаруженные у животных, растений и некоторых вирусов, принимающие участие в транскрипционной и посттранскипционной регуляции экспрессии генов. МикроРНК кодируются ядерной ДНК растений и животных и вирусной ДНК у некоторых ДНКсодержащих вирусов. К 2014 г. известно более 1800 микроРНК человека и цифра продолжает расти. По разным оценкам, мишенями микроРНК являются от 30 до 60 % белоккодирующих генов человека. Количество различных микроРНК у человека может достигать 37 тыс. РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФУНКЦИИ микроРНК МикроРНК – негативный регулятор экспрессии генов на посттранкрипционном уровне. Один белок кодирующий ген может регулироваться десятками разных микроРНК. Одна микроРНК может регулировать работу более сотни разных генов. При опухолевом процессе микроРНК выступают как онкогены и супрессоры опухолей. ВЕЗИКУЛЫ Считалось, что РНК за пределы клетки не выходят, а за межклеточные информационные связи отвечают гормоны. Выяснилось, что клетки адресуют друг другу крошечные пузырьки, везикулы (за открытие которых присуждена Нобелевская премия 2013 года). А в везикулах заключена генетическая информация в форме тех же микроРНК. Микроорганизмы также могут воздействовать на экспрессию генов посредством своих микро-РНК. МЕТОДЫ АНАЛИЗА микроРНК: Гибридизационный анализ Микробиочипы Амплификационные методы Секвенирование ВЫДЕЛЕНИЕ микроРНК МикроРНК обычно выделяют из клеточных линий и тканей, которые охлаждаются и фиксируются формалином в парафине. МикроРНК устойчивы к деградации эндогенными рибонуклеазами и, следовательно, стабильны что выявлено при количественных измерениях в плазме и крови. Важное свойство микроРНК - их способность мигрировать в кровь. В отличие от мРНК микроРНК обладают очень высокой стабильностью, что, скорее всего, обусловлено их инкапсулированием в эндосомоподобные частицы, где они защищены от деградации нуклеазами. Уровень микроРНК в крови или плазме можно оценить с помощью количественной ПЦР и некоторых других методов. ГИБРИДИЗАЦИОНННЫЙ АНАЛИЗ БЛОТТИНГ РНК МИКРОБИОЧИПЫ Микробиочипы обладают тем преимуществом, что можно получить профиль микроРНК в данном образце, а также определить те из них, которые представляют интерес для дальнейших исследований. Первые микробиочипы не могли дифференцировать премикроРНК, при-микроРНК и микроРНК, однако после усовершенствования мечения и выбора зондов значительно улучшило спeцифичность. Небольшая длина микроРНК создает определенные трудности не только при подборе праймеров для ОТ-ПЦР, но и количественной оценки при применении технологии микробиочипов. При этом большой проблемой является кроссгибридизация, так как многие микроРНК химически очень похожи. Введение химически модифицированных зондов (LNAзонды, Morpholino олигонуклеотид или 2'-O-метил РНК олигонуклеотид ) позволило ужесточить условия и привело к большей специфичности гибридизации микроРНК. Firefly™ микроРНК анализ ТЕХНОЛОГИЯ НАНОСТРИНГ Методический подход определения уровня экспрессии микроРНК в раковых клетках vs прилежащих нормальных клеток у одного пациента. Условная норма Схема детекции миРНК с помощью обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени miR-155 miR-205 опухоль miR-21 miR-221 miR-222 U6 Глубокое секвенирование микроРНК . Метод позволяет уверенно идентифицировать новые неизвестные последовательности микроРНК и может быть использована и для количественной оценки РНК, так как многие короткие РНК могут быть прочитаны сотни раз. Для сопоставления данных по мРНК и микроРНК используются специальные базы данных, которые предсказывают мРНК-мишень для данной микроРНК, основываясь на данных по её последовательности. Разработан также ряд методов для определения мишени для данной микроРНК. Данные по парам мРНК и микроРНК могут использоваться для анализа и предсказания информации по взаимодействию микроРНК-целевой ген и результатов сиквенса. МикроРНК и болезни РЕГУЛИРОВАНИЕ микроРНК каскадов генов Каждая отдельная микроРНК регулирует отдельный каскад генов, активируя экспрессию одних генов каскада и подавляя экспрессию других. Некоторые группы микроРНК могут участвовать в регуляции нескольких процессов на клеточном уровне. Например, микроРНК-21 участвует как в блокировании апоптоза, ангиогенеза, так и в развитии фиброза. Сети микроРНК ДИАБЕТ, ОЖИРЕНИЕ Группой микроРНК, регулирующих инсулинорезистентность и вовлечённых в развитие ожирения и диабета, является семейство let-7. Let-7 накапливается в тканях по мере старения. Подавление let-7 может не только предотвращать развитие диабета и ожирения, но и использоваться для лечения этих заболеваний. Поэтому подавление let-7 может стать новым средством лечения ожирения и диабета 2 типа. Концентрация miR-133b в различных отделах мозга у больных паркинсонизмом и у здоровых людей (control): СХ — кора больших полушарий, МВ — средний мозг, СВ — мозжечок,. Хорошо видно, насколько содержание этой специфической микроРНК в среднем мозге у больных людей. Рис. из Kim J., Inoue K., Ishii J. et al.// Science. – 2007. – 317. – P. 1220-1224. СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ Две микроРНК-1 и 21 могут рассматривать как причинные при нескольких патологических состояниях сердечно-сосудистой системы, в том числе при сердечной недостаточности и гипертрофии сердца (наряду с микроРНК 23а, 133а, 195, 208, 208а). Показана ассоциация микроРНК-155 при гипертонии, микроРНК-145 и 21 при заболевании сосудов, микроРНК-17-5р, 20а при легочной гипертензии. Пять микроРНК-18b, 221, 222, 424 и let-7f-2 локализованы на Х-хромосоме, поэтому число копий таких микроРНК различается у мужчин и женщин, что определяет гендерные различия в возникновении и развитии ССЗ. Сердечная недостаточность При сердечной недостаточности происходит подавление гена SERCA2a, который регулирует поступление кальция в клетки сердечной мышцы и важен для сократительной функции сердца. Способность сердца сокращаться регулируется поступлением кальция, а при сердечной недостаточности активность кальциевого насоса SERCA2a снижается. Используя высокопроизводительную систему скрининга, проведен скрининг 875 микроРНК и нашли одну, микроРНК-25, которая мощно подавляла поглощение кальция клетками сердца. У пациентов с сердечной недостаточностью активируется микроРНК25 и введение агента, блокирующего микроРНК-25, улучшает функцию и повышает выживаемость. Активность гена SERCA2a была повышена с помощью технологии, позволяющей инактивировать микроРНК-25 антисмысловой РНК. Молекула антисмысловой РНК – последовательность, комплементарная конкретной молекуле РНК, называемой в этом случае «смысловой», которую она инактивирует. микроРНК в диагностике онкологических заболеваний • Дифференцировать доброкачественные опухоли от злокачественных новообразований • Контролировать эффект терапевтического воздействия (лучевая и химиотерапия) • Выявлять различные патоморфологические типы опухолей • Ранняя диагностика • Определение гистотипа опухоли, стадии развития, потенциала к метастазированию • Прогностическое значение выживаемости • Потенциальная терапия микроРНК и ОНКОЛОГИЯ МикроРНК-21–хронологически первая идентифицированная микроРНК. Является сильным онкогеном, экспрессия которой увеличивается в большинстве солидных опухолей. Увеличивает пролиферативную и инвазивную активность опухолевых клеток. МикроРНК-221, 222 – онкогенные микроРНК, индуцирующие ангиогенез и пролиферацию раковых клеток. МикроРНК-155 – продемонстрировано участие этой микроРНК в инициации как врожденного, так и адаптивного иммунных ответов, а также в развитии иммунной системы в целом. Некоторые работы свидетельствуют об участии микроРНК155 в онкогенезе различной этиологии. микроРНК и ОНКОЛОГИЯ МикроРНК-205 – супрессор опухолевого роста, показано, что в случае некоторых видов опухолей микроРНК-205 индуцирует апоптоз и тормозит рост опухоли. Семейство микроРНК-183 предлагается в качестве многообещающего биомаркера для ранней диагностики и точного прогноза онкологических заболеваний, а также для более эффективного лечения. МикроРНК и рак молочной железы (РМЖ) Для РМЖ значительно изменятся паттерн микроРНК. Для 13 микроРНК наблюдается повышение экспрессии, а для 49 уровень экспрессии снижен. Специфичность в этом случае составляет 78,8%, а чувствительность 92,5%. Выявление и оценка уровня экспрессии определенных микроРНК в крови становится важным направлением в диагностике ранних стадий РМЖ. Экспрессия микроРНК-195 повышена в опухолях, а в крови ее уровень превышает нормальный в десятки раз. Экспрессия этой микроРНК коррелирует с уровенем экстрагеновых рецепторов. Содержание микроРНК-195 снижается после оперативного вмешательства. Оценка уровня циркулирующих в крови микроРНК-10b, 34а и 155 позволяет дискриминировать больных с метастазирующими опухолями от здоровых людей. Прогноз и метастазирование. Другое применение микроРНК в диагностике и лечении раковых заболеваний может заключаться в их использовании для составления прогноза. При немелкоклеточном раке легкого низкая концентрация микроРНК-324a может служить индикатором плохой выживаемости. Высокая концентрация микроРНК-185 или низкая микроРНК-133b свидетельствуют о наличии метастазов и, следовательно, плохой выживаемости при раке толстой и прямой кишки. ЭКЗОСОМЫ Термин «экзосомы» используется для обозначения специфических везикулярных структур эндосомального происхождения, которые продуцируются большинством типов эукариотических клеток. В 2007 г. показано присутствие в составе экзосом мРНК и микроРНК , а также некодирующую РНК, что показало их участие в регуляторно-коммуникативных процессах внутри организма и возможность их использования в качестве потенциальных биомаркеров. Перенос интактных мРНК в составе экзосом может служить для обмена фенотипическими признаками между клетками, так как в реципиентные клетки попадают мРНК белков, которые исходно в них не были экспрессированы и мРНК способна принимать участие в синтезе новых белков. ( Valadi H., Ekstrom K., Bossios A. et al.// Nat. Cell. Biol. – 2007. – 9. – P. 654-659.) Авторы показали возможность переноса информации между клетками разных организмов (мыши человека) in vitro. СВОЙСТВА ЭКЗОСОМ Экзосомы представляют собой небольшие везикулярные тела размером 50-90 нм (по другим данным от 30-100 нм), которые формируются из поздних эндосом. (Lotvall J., Valadi H.// Cell Adh. Migr. – 2007. – 1. – P. 156-158.) Полость экзосом имеет цитоплазматическое происхождение , а мембрана образуется в результате впячивания внутрь эндосомальной мембраны. Экзосомы могут продуцироваться in vitro большинством типов клеток: В- и Т-клетками, гранулоцитами, дендритными клетками, тромбоцитами, нейронами, эпителиальными клетками и др. Первое научное описание экзосом представлено в 1983 г., в котором исследована судьба рецепторов трансферрина при созревании ретикулоцитов овец. (Pan B.T., Johnstone R.M.//Cell. - 1983. – 33. – P. 967-978.) НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ ЭКЗОСОМ – БИОМАРКЕРЫ Экзосомы несут в своем составе белки, липиды, нуклеиновые кислоты, которые могут быть использованы как биомаркеры продуцирующих их нормальных или патологических клеток. Присутствие экзосом в клинических жидкостях (плазма крови, моча, слюна, грудное молоко и др.) позволяет использовать неинвазивные или малоинвазивные методы взятия пробы. Показана высокая стабильность нуклеиновых кислот в клинических жидкостях, причем уровни присутствующих РНК можно оценить с применением метода ПЦР. Считается также, что большая часть межклеточных РНК могут переноситься вне везикулярных образований. (Turchinovich A., Weitz L., Langheinz A. et al.// Nucl. Acids Res. – 2011. – 39. – P. 7223-7233.) ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РНК ЭКЗОСОМ В ДИАГНОСТИКЕ НЕКОТОРЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. - диагностика травм головного мозга по наличию специфических везикулярных микроРНК в спинномозговой жидкости. - ранняя диагностика сосудистых заболеваний. - диагностика асимптотического течения сахарного диабета по специфическим профилям микроРНК крови. - диагностика на основе выделения экзосомальных микроРНК из слюны пациентов с аутоиммунным системным заболеванием (Синдрома Шегрена). Данный неинвазивный метод может стать альтернативой биопсии). (Michael A., Bajracharya S.D., Yuen P.S. et al.// Oral Dis. – 2010. – 16. – P. 34-38.) ПРОФИЛИ микроРНК в диагностике раков До открытия экзосомальных РНК анализ микроРНК – профилей опухоли предполагал непременное проведение биопсии, которая не всегда желательна или возможна при некоторых видах рака. Анализ профилей микроРНК эффективен в диагностике, следующих видов рака: Для диагностики пациентов с глиобластомой, а также определения стадии заболевания. (Skog J., Wurdinger T., Van Rijn S. et al.// Nat. Cell Biol.- 2008. – 10. – P. 1470-1476.) Исследуя экзосомы сыворотки крови пациентов с раком яичников, показано, что их уровень коррелировал со стадией течения заболевания и общее количество экзосом в крови больных было повышено относительно контрольной группы. При этом профили микроРНК в образцах экзосом сходны с наборами микроРНК опухолей. (Taylor D.D., Gercel-Taylor C.//Gynecologic Oncology. – 2008. – 110. – P. 13-21.) ГЕНЕТИЧЕСКОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ NGS В МЕДИЦИНЕ ТРУДНОСТИ: СОЗДАНИЕ ПРОСТЫХ ТЕХНОЛОГИЙ, ДОСТУПНЫХ ДЛЯ ЛАБОРАТОРИЙ. ПОЛУЧЕНИЕ РАЗРЕШЕНИЙ НА ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕННЕТИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ И ОБОРУДОВАНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ. В 2012-2014 гг. в США появились первые рутинные диагностические технологии, основанные на технологиях высокопроизводительного секвенирования, а секвeнатор MiSeqDx получил одобрение FDA по применению в медицинской практике. НАПРАВЛЕНИЯ: РАЗЛИЧНЫЕ ВАРИАНТЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ (ГТ): ДИАГНОСТИЧСКИМ ИЛИ ПРОГНОСТИЧЕСКИМ. ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБИОЦЕНОЗА ЧЕЛОВЕКА. ПОЛНОГЕНОМНЫЙ И ЭКЗОМНЫЙ СИКВЕНС Для проведения полногеномного сиквенса генома человека необходимы 3-4 дня начиная с пробоподготовки, 303-403 кратного прочтения с размерами фрагментов 250 п.н. Экзом составляет 1,5% генома при более чем 1003 кратном прочтении. ( Topol E.J. Individualized medicine from prewomb to tomb.//Cell. – 2014. – 27.) Cравнение проводится с референсным геномом по ОНП, делеции-инсерции, CNV и другим полиморфизмам. ( Frazer K.A. et al. Human genetic variation and its contribution to complex traits.//Nat. Rev. Genet. – 2009. – 10. – P. 241-251. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ NGS ПРЕИМПЛАТАЦИОННОЕ – если у будущих родителей высок риск передачи наследственного заболевания ребенку, врач (обычно в рамках экстракорпорального оплодотворения – ЭКО) может быть назначена преимплантационную генетическую диагностику эмбриона. ПРЕНАТАЛЬНОЕ – выявление риска развития определенного заболевания НЕОНАТАЛЬНОЕ – новорожденный ребенок может быть подвержен генетическому исследованию ДЕТСКОЕ, ПЕДИАТРИЧЕСКОЕ – ребенок с отставанием в развитии может быть подвергнут генетическому исследованию в целях постановки диагноза ВЗРОСЛОЕ, ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ – пациент, имеющий в истории семьи родственников, страдающих определенным заболеванием, хочет выяснить имеет ли он генетическую предрасположенность к развитию данного вида заболевания (онкология, ССЗ, эндокринология и др.) РЕЗУЛЬТАТ: применение оптимальных методов диагностики и лечения. Например, в результате колоноскопии и удалении полипов во избежание развития наследственного неполипозного рака толстой кишки или превентивной мастэктомии для снижения риска развития РМЖ. Использование в ГТ циркулирующей в кровотоке матери внеклеточной ДНК плода (celf-free fenal DNA, cffDNA) Весьма перспективной технологией пренатального ГТ является использование циркулирующей в кровотоке матери внеклеточной ДНК плода, начиная уже с пятой недели беременности. По числу прочтений, которые относятся к исследуемой хромосоме относительно референсной, можно определить случаи анеуплодии, выявить пол будущего ребенка, хромосомные перестройки. Указанный метод в 2012 г. одобрен как дополнение к существующим протоколам в США, но назначается либо при высоком риске наследственных заболеваний, или по желанию. Генеральный директор компании Illumina, Джей Флэтли, заявил, что полное считывание ДНК для каждого новорожденного будет технически возможным и доступным менее чем за пять лет, что обещает революцию в здравоохранении и к 2019 году оно будет обычным делом. Проведение полногеномного генетического тестирования всех новорожденных в Великобритании позволит, по мнению специалистов выявить у 17% обследованных наследственные заболевания на самой ранней стадии. СЛОЖНЫЙ ГЕНОМНЫЙ ЛАНДШАФТ ОПУХОЛИ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДОВ NGS ПОКАЗАЛО ЧТО ОПУХОЛЬ ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ СОВОКУПНОСТЬ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ С РАЗЛИЧНЫМИ ПРОФИЛЯМИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ. МОДЕЛЬ «ВЕТВЯЩЕЙСЯ ЭВОЛЮЦИИ»: ОПУХОЛЬ ИНИЦИИРОВАНА КЛЕТКАМИ, НЕСУЩИМИ ПЕРВИЧНУЮ МУТАЦИЮ, ЧЕРЕЗ НЕКОТОРОЕ ВРЕМЯ ДАЕТ НАЧАЛО ЦЕЛОМУ РЯДУ КЛОНАЛЬНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ (ЛОМАЕТСЯ СИСТЕМА ЗАЩИТЫ ДНК) ТЕХНОЛОГИИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ЕДЕНИЧНЫХ КЛЕТОК ПОЗВОЛЯЮТ ВЫЯВЛЯТЬ РАЗНООБРАЗИЕ ИХ ГЕНОМНЫХ НАРУШЕНИЙ И ИЗМЕНЕНИЙ ТРАНСКРИПТОМОВ. ГТ онкологических заболеваний С появлением ГТ онкологические заболевания рассматриваются как генетические, поэтому в диагностическом и терапевтическом плане весьма актуальным является использование рассматриваемых технологий секвенирования. К настоящему времени известно большое число онкогенов (более 400) и супрессоров опухолей. Сложность анализа генома при раке заключается в том, что 80-90% мутаций не наследственного характера, однако достаточно мутации в одной копии гена для того, чтобы клетка стала раковой. Такие доминантные онкогены обуславливают до 90% всех раковых заболеваний. Остальная часть приходится на мутации в генах-супрессорах, однако в этом случае мутировать должны обе копии гена-супрессора и такие мутации могут передаваться по наследству. Онкогены и гены супрессоры Онкогены контролируют в нормальной клетке клеточный цикл и апоптоз и связаны с факторами роста и апоптоза, трансдукторами и транскрипционными факторами и мутации способствуют раковому перерождению. С другой стороны гены супрессоры опухолей ответственны за блокировку неконтролируемого клеточного роста и деления, запускают апоптоз или защищают геном от повреждений. Указанные гены-супрессоры в результате либо мутаций, либо эпигенетических изменений (например, метилирование) могут терять свои функции. ГТ онкологических заболеваний По оценкам для злокачественной трансформации клетки в зависимости от типа рака необходимо от 3 до 12 мутаций. Некоторые мутации (TP53, KRAS и ряд других) выявляются в ряде опухолей, а некоторые тканеспецифичны (RB1). Технология высокопроизводительного секвенирования позволяет проанализировать все мутации генома опухолевой клетки в одном секвенировании экзома. Хотя опухоли часто генетически гетерогенны благодаря многократному прочтению генома даже редкие варианты могут быть идентифицированы. Отметим некоторые особенности и ограничения при анализе раковых геномов: ограниченное количество ДНК в биоптате, некротизация опухолей и примеси нормальных клеток, различные клоны опухоли, а также необходимость одновременного секвенирования генома пациента, опухоли и референсного. Проекты в онкологии НОРВЕГИЯ: ЦЕЛЬ ПРОЕКТА СЕКВЕНИРОВАНИЕ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЕЙ КАЖДОГО ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ПАЦИЕНТА В СТРАНЕ. ПОЛУЧИЛ ПОДДЕРЖКУ ПРАВИТЕЛЬСТВА. НАЧАЛО: 2000 ПАЦИЕНТОВ ВОСЕМЬ ТИПОВ РАКОВ. ПРОЕКТ ЕС IT-FUTURE OF MEDICINE ОБЪЕДИНЕНИЕ ГЕНОМИКИ ТРАНСКРИПТОМИКИ, ПРОТЕОМИКИ, МЕТАБОЛОМИКИ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ОБЩИХ ПРЕДСКАЩАТЕЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ВСЕХ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ПАЦИЕНТОВ В ЕВРОПЕ ПЕРСПЕКТИВЫ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ Наблюдается тенденция к отказу владения оборудованием в отдельных лабораторий к использованию услуг в специализированных сервисных центрах. Уже сегодня центры секвенирования по всему миру владеют более 50% секвенаторов и производят до 80% всех генных данных. Можно предполагать, что в течение ближайших 3-5 лет возникнут более производительные технологии секвенирования и будет взята отметка в 1000$, затем 100 $. Благодарю за внимание
