Document 2352440

 В 1990 году для того, чтобы изменить окраску цветков петунии (Petunia hybrida), в
растения были введены дополнительные копии гена халконсинтазы — фермента,
необходимого для синтеза розового и фиолетового пигментов.

Однако, повышение экспрессии гена синтазы не привело к проявлению более тёмной
окраски околоцветника, напротив, цветки стали более светлыми и даже частично белыми.
Полученные результаты свидетельствовали о том, что активность фермента не растёт, а
снижается.

Гены халконсинтазы экспрессировались на более низком уровне, чем до введения
трансгена.
Дальнейшие исследования показали, что у растений деградация мРНК приводит к
снижению активности гена по механизму посттранскрипционного ингибирования.
Данное явление получило название «косупрессии экспрессии гена», однако, механизм
данного процесса не был известен.
 Растения, экспрессирующие вирусные белки, имеют повышенную устойчивость к вирусной
инфекции.
 Устойчивость к инфицированию другими вирусами обеспечивается лишь короткими
участками некодирующих вирусных РНК, трансгенные вирусные РНК могут также
ингибировать репликацию вирусов.
 Обратный эксперимент, в ходе которого короткие последовательности генов растений были
введены в геном вируса, показал, что происходит супрессия генов-мишеней в зараженных
растениях. Данный феномен был назван «сайленсингом генов, вызванным вирусами»
 Явление РНК-интерференции (RNA interference) было открыто в ходе экспериментов по
подавлению
экспрессии
генов
при
помощи
антисмысловой
РНК
у
C.
elegans
.
Предполагалось, что антисмысловая РНК после комплементарного узнавания мРНК
препятствует ее трансляции.
антисмыслРНК + мРНК  трансляция

Однако в некоторых экспериментах было обнаружено, что инъекции контрольной смысловой
РНК
вызывают
такой
же
эффект
подавления
экспрессии гена,
как и инъекция
антисмысловой РНК.
смыслРНК + мРНК  трансляция
 Более тщательный анализ показал, что агентом, нарушающим экспрессию, является не
смысловая или антисмысловая РНК, а двухцепочечная РНК , содержащаяся в качестве
примеси в обоих препаратах.
 Крейг Мелло и Эндрю Файер в статье в журнале Nature в 1998 году описали эффект
сайленсинга генов после введения двуцепочечной РНК в организм круглого червя
Caenorhabditis elegans.

В исследованиях по регуляции синтеза мышечных белков Мелло и Файера показали, что
введение мРНК или антисмысловых РНК не влияло на синтез белка, в то время как
введение двуцепочечных РНК успешно снижало экспрессию гена-мишени.

Результатом этих работ стало появление термина РНК-интерференция. Исследования
Файера и Мелло примечательны тем, что в ходе их работы было выявлено действующее
начало системы посттранскрипционного сайленсинга генов.

В 2006 году за исследования в области РНК-интерференции Файер и Мелло получили
Нобелевскую премию в области физиологии и медицины.
Компоненты механизма РНК-интерференции
Белковый
компонент
Рибонуклеиновый
компонент
Длинные
двуцепочечные РНК
(дцРНК)
Длинные
двуцепочечные РНК
(дцРНК)
(англ. dsRNA)
(англ. dsRNA)
Малые
интерферирующие
РНК
(миРНК)
Микро РНК
(мкРНК)
(англ. miRNA)
(англ. siRNA,
small interfering RNA)
 Малые интерферирующие РНК (миРНК, siRNA) представляют собой двуцепочечные РНК
длиной 21—25 нуклеотидов с двумя неспаренными выступающими нуклеотидами на 3'концах.

Каждая цепочка нуклеотидов имеет фосфатную группу на 5'-конце и гидроксильную
группу на 3'-конце.
 Такая структура siRNA образуется в результате активности фермента Dicer, субстратом
которого являются длинные двуцепочечные РНК (дцРНК, dsRN или короткие РНК,
содержащие шпильки (shRNA)
 Малые РНК, образующие шпильки, или короткие РНК, образующие шпильки (анг. shRNA,
small hairpin RNA, short hairpin RNA) — короткие молекулы рибонуклеиновых кислот,
образующие во вторичной структуре плотные шпильки (структуры типа «стебель-петля»).

ShRNA могут быть использованы для подавления экспрессии генов путём РНКинтерференции.
 Малые РНК, образующие шпильки, транскрибируются РНК-полимеразой III. Образование
shRNA в клетках млекопитающих иногда вызывает интерфероновый ответ, для защиты
клетки, как в случае вирусной атаки. Такие процессы не наблюдаются в случае miRNA
(микроРНК), которые транскрибируются РНК-полимеразой II.
 После завершения транскрипции малые РНК, образующие шпильки, разрезаются
клеточными ферментами с образованием малых интерферирующих РНК (англ. siRNA).
 Дуплексы малых интерферирующих РНК поступают далее в каталитический комплекс
RISC, где при участии белка Argonaute происходит расплетение дуплекса и образование
комплементарного
комплекса
короткой
антисмысловой
РНК
со
специфической
последовательностью в кодирующей области мРНК, что приводит к дальнейшей
деградации последней.
ДНК
→
pri-miRNA → pre-miRNA
Экспрессия

процессинг в ядре
→
miRNA
ферментативное разрезание
Молекулы микроРНК экспрессируются в виде первичных транскриптов длинных генов,
кодирующих предшественники микроРНК (англ. pri-miRNA), и после процессинга в ядре
клетки представляют собой pre-miRNA — структуры вида стебелёк-петля длиной около 70
нуклеотидов.

МикроРНК (англ. MicroRNA, miRNA) представляют собой некодирующие РНК длиной
21—22 нуклеотида, принимающие участие в регуляции экспрессии генов.

МикроРНК
связываются
со
специфическими
последовательностями
мРНК
в
3'-
нетранслируемой области и вызывают ингибирование трансляции либо удаление поли(А)хвоста.

Комплекс процессинга pri-miRNA в pre-miRNA содержит фермент с активностью РНКазы
III, называемый Drosha, и белок, связывающий двуцепочечную РНК, — Pasha. Двуцепочечная
часть pre-miRNA связывается и разрезается белком Dicer (у Drosophila melanogaster
микроРНК и малые интерферирующие РНК процессируются разными изоформами фермента
Dicer[16]); при этом образуется зрелая молекула микроРНК, которая может далее поступать в
RISC[17][18][19]. Известен также путь образования микроРНК, независимый от Dicer.
Процессинг предшественника микроРНК в данном случае осуществляется белком Argonaute
2[20][21].
У животных микроРНК обычно имеют неполное спаривание с мРНК-мишенью и могут
ингибировать трансляцию многих мРНК со сходными последовательностями. У растений
спаривание во многих случаях может быть полным.
 Дуплексы малых интерферирующих РНК поступают далее в каталитический комплекс
RISC, где при участии белка Argonaute происходит расплетение дуплекса и образование
комплементарного
комплекса
короткой
антисмысловой
РНК
со
специфической
последовательностью в кодирующей области мРНК, что приводит к дальнейшей
деградации последней.