Федеральная целевая программа

Федеральная целевая программа
«Исследования и разработки по приоритетным
направлениям развития научно-технологического
комплекса России на 2014—2020 годы»
Соглашение
14.607.21.0063 от 23.09.2014
на период 2014 - 2016 гг.
Тема: Создание адресных бифункциональных агентов на
основе цитотоксического белка лактаптина и опухольадресованных пептидов для направленной элиминации
раковых клеток
Руководитель проекта:
Зам. Директора ИХБФМ СО РАН, В.А. Рихтер
Науки о жизни
Участники проекта
Получатель субсидии: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения
Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН)
Основные направления деятельности: Геномика, протеомика, биоинженерия,
биотехнология; Клиническая и трансляционная медицина, молекулярные основы
иммунитета и онкогенеза; Экология организмов и сообществ.
Коллектив исполнителей ПНИ обладает высокой научной и методической квалификацией,
имеет успешный опыт выполнения аналогичных по тематике и масштабу проектов. В
состав исполнителей ПНИ входят высококвалифицированные специалисты в области
молекулярной биологии, биотехнологии и биоинженерии.
Индустриальный партнёр: Общество с ограниченной ответственностью «ИРВИН 2»
(ООО «ИРВИН 2»)- российская высокотехнологичная компания отрасли здравоохранения.
Обеспечивает 100% внебюджетного финансирования работ по проекту.
Основные направления деятельности: Поставка лекарственных средств, производство
и поставка диагностического оборудования и комплексов лабораторной диагностики,
научно-исследовательская деятельность в области создания адресных систем доставки
лекарственных средств, разработка инновационных лекарственных средств.
Соисполнитель: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского
отделения Российской академии наук« (ИЦиГ СО РАН). На базе ИЦиГ СО РАН действует
ЦКП «SPF-виварий».
В рамках выполнения проекта на базе ЦКП «SPF-виварий» будут проводиться работы по
исследованию адресности, противоопухолевой активности и острой токсичности
разработанных слитых белков «адресный пептид-лактаптин»
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
2
Цели и задачи проекта
Цель проекта: Разработка и получение бифункциональных агентов белковой природы для
направленной элиминации раковых клеток - рекомбинантных слитых белков, состоящих из
апоптоз-индуцирующего
белка
лактаптина
и
опухоль-адресованных
пептидов,
обеспечивающих доставку лактаптина к опухоли.
Задачи проекта:
1. Разработать технологический процесс получения рекомбинантных слитых белков
«адресный пептид-лактаптин», обладающих цитотоксической и противоопухолевой
активностью и состоящих из апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и опухольадресованных пептидов.
2. Провести испытания цитотоксической активности слитых белков «адресный пептидлактаптин» на культурах клеток мыши и человека in vitro.
3. Провести испытания адресных свойств полученных слитых белков «адресный пептидлактаптин» на лабораторных животных с трансплантированными опухолями.
4. Провести испытания противоопухолевой активности полученных слитых белков
«адресный пептид-лактаптин» на моделях алло- и ксенотрансплантатов in vivo.
5. Провести испытания острой токсичности слитых белков «адресный пептид-лактаптин» с
наибольшим терапевтическим потенциалом на лабораторных животных согласно
«Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств».
В настоящем проекте для усиления противоопухолевого эффекта лактаптина впервые
использованы опухоль-адресованные пептиды, отобранные с помощью пептидной фаговой
библиотеки и обеспечивающие доставку противоопухолевого средства в опухоль, что
позволит снизить дозу лактаптина, необходимую для получения терапевтического эффекта
и увеличить эффективность противоопухолевой терапии.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
3
Ожидаемые результаты проекта
Разработанные методики:
1. Методика отбора опухоль-адресованных пептидов из фаговой пептидной библиотеки методом
аффинной селекции.
2. Методика получения генетических конструкций со встроенными генами лактаптина и опухольадресованных пептидов, обеспечивающих продукцию рекомбинантных слитых белков клетками
штаммов-продуцентов E. coli.
3. Методика выделения и очистки рекомбинантных слитых белков.
4. Методика оценки количественных параметров, характеризующих специфическую активность
рекомбинантных слитых белков.
Экспериментальные результаты:
1. Опухоль-адресованные пептиды, отобранные из пептидной фаговой библиотеки на культурах
раковых клеток и опухолевых моделях.
2. Генетические конструкции со встроенными генами лактаптина и опухоль-адресованных
пептидов, обеспечивающие продукцию рекомбинантных слитых белков.
3. Штаммы-продуценты E. coli, обеспечивающие наработку рекомбинантных слитых белков.
4. Экспериментальные образцы рекомбинантных слитых белков.
Разработанные документы:
1. Промежуточные и заключительный отчеты о ПНИ.
2. Отчеты о патентных исследованиях и о дополнительных патентных исследованиях.
3. Лабораторный технологический регламент наработки и очистки рекомбинантных слитых белков
с наибольшим терапевтическим потенциалом.
4. Программа и методики испытаний экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков
с наибольшим терапевтическим потенциалом. Протоколы исследований и испытаний.
5. Технические требования и предложения по разработке, производству и эксплуатации
продукции с учетом технологических возможностей и особенностей индустриального партнера организации реального сектора экономики.
6. Проект ТЗ на проведение ОТР по теме: «Создание опытно-промышленной технологии получения
противоопухолевой субстанции на основе рекомбинантных слитых белков «адресный пептидлактаптин».
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
4
Перспективы практического использования
Результаты
проекта
будут
востребованы
исследовательскими
организациями,
биотехнологическими компаниями, разрабатывающими новые противоопухолевые
препараты, фармацевтическими компаниями, которые занимаются производством
противоопухолевых
терапевтических
средств,
и
организациями
практического
здравоохранения для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества
жизни онкологических больных.
Основным потребителем результатов проекта будет являться Индустриальный партнер
проекта ООО «ИРВИН 2», обеспечивающий 100% внебюджетного финансирования работ
по проекту. ООО «ИРВИН 2» - российская высокотехнологичная компания отрасли
здравоохранения,
входящая
в
фармацевтический
холдинг
«ФармЭко»
(http://www.pharmeko.ru/).
ООО «ИРВИН 2» является одним из учредителей ООО «Фабрика биополимеров», на
опытном участке которого исполнители проекта будут проводить разработку и
апробацию Лабораторного технологического регламента получения рекомбинантных
слитых белков «адресный пептид-лактаптин». На этом же участке планируется
производство разработанного лекарственного средства для проведения доклинических и
клинических исследований.
Создание новых противоопухолевых лекарственных средств, обладающих направленным
воздействием на опухолевые клетки и не оказывающих токсического действия на
здоровые клетки организма, является в настоящее время приоритетным направлением
фундаментальных и прикладных исследований во всем мире. Результаты проекта малотоксичные и высокоспецифичные адресные бифункциональные противоопухолевые
агенты, будут востребованы международным научным сообществом, в том числе при
представлении на международных конференциях, и могут являться основой для
международных фундаментальных исследований и прикладных проектов.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
5
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Отбор опухолеспецифических пептидов in vitro и in vivo
-
показана специфичность
Анализ
специфичности
клонов №1-5 и контрольного
бактериофага
(№0)
к
раковым клеткам человека
линий MDA-MB-231 и MCF-7
и к первичной культуре
нетрансформированных
клеток
молочной
железы
человека BN-2
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
6
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Изучение специфичности отобранных экспонированных пептидов
in vitro и in vivo
а
лёгкое
опухоль
б
8
7
№ клона
6
5
4
3
0
0.01
0.1
1
10
100
1000
10000
Нормированное значение относительного
связывания
а) Относительная связываемость экспонированных пептидов in vivo (модель
ксенографтов MDA-MB-231);
б) Иммуноцитохимия клеток MDA-MB-231 (мышиные anti-М13, Alexa Fluor 555 goat antimouse IgG (H+L) антитела, ядра окрашены Dapi). Клетки инкубировали с клоном № 3,
либо с контрольным бактериофагом № 0 при 4оС.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
7
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Получение генетических конструкций, обеспечивающих продукцию
рекомбинантных слитых белков, клетками штаммов-продуцентов
Получены генетические конструкции
на основе отобранных пептидов:
1. pET-15b_T1_RL (GLHTSATNLYLH)
2. pET-15b_T2_RL (SGVYKVAYDWQH)
3. pET-15b_T3_RL (YTYDPWLIFPAN)
4. pET-15b_T4_RL (FIPFDPMSMRWE)
Получены генетические конструкции
на основе RGD-пептида:
5. pET-15b_RL_RGD_H (A)
6. pET-15b_RL_H_RGD (Б)
Получены штаммы-продуценты E.coli
Анализ колоний E. сoli BL21(DE3)/pET15b_Т1_RL на содержание в них целевого
белка; Дорожки: М – набор маркерных
белков, 0 – лизат клеток E. coli до проведения
индукции, 1, 2, 3, 4– лизат клеток E.сoli через
1, 2, 3, 4 ч. с момента проведения индукции.
Указано содержание целевого белка (%) от
общего белкового пула.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
8
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Отработка методов выделения и очистки рекомбинантных слитых белков
1. Аффинная хроматография на IMAC Sepharose 6 Fast Flow;
2. Гель-фильтрация на DEAE Sephadex A-25;
3. Катионообменная хроматография (1) на SP Sepharose Fast Flow;
4. Катионообменная хроматография (2) на SP Sepharose Fast Flow;
5. Анионообменная хроматография на сорбенте Q Sepharose Fast Flow.
1
примеси
белок
примеси
2
белок
3
примеси
белок
примеси
белок
4
примеси
Соглашение №<номер>
5
примеси
белок
ФЦП ИР
2014-2020
9
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Отработка методов контроля качества рекомбинантных слитых белков
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Секвенирование ДНК генетических конструкций со встроенными генами
опухоль-адресованного пептида и лактаптина;
Электрофорез в ПААГ;
Вестерн-блот анализ;
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ);
MALDI TOF масс-спектрометрия;
ЛАЛ-тест (тест на содержание эндотоксинов).
1.79 AU
Насос В
2
1
220nm
260nm
280nm
360nm
1
2
Соглашение №<номер>
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
мин
ФЦП ИР
2014-2020
10
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Разработка методики оценки количественных параметров,
характеризующих специфическую активность
рекомбинантных слитых белков
Разработана
методика
оценки
количественных
параметров,
характеризующих специфическую активность рекомбинантных слитых
белков, включающая:
- Оценку цитотоксической активности (ИК50) рекомбинантных слитых
белков методом MTT-теста на культурах раковых клеток мыши (ГА-1, АЛ) и
человека (MDA-MB-231, MCF-7, A549);
- Оценку адресных свойств рекомбинантных слитых белков путем
определения тропности к опухоли (визуализация флуоресцентно меченых
слитых белков);
- Оценку противоопухолевой активности рекомбинантных слитых белков
путем определения индекса торможения роста опухоли in vivo на моделях
алло- (гепатома, аденокарцинома легких) и ксенотрансплантантов (рак
молочной железы);
- Оценку аномальной токсичности рекомбинантных слитых белков при
внутривенном введении экспериментальных образцов белым беспородным
мышам.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
11
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Разработка методики оценки количественных параметров,
характеризующих специфическую активность рекомбинантных слитых
белков
Изменение
жизнеспособности
раковых клеток человека
линий MDA-MB-231 и
MCF-7 под влиянием
рекомбинантных белков
RL2, T1_RL и T2_RL
(МТТ-тест).
Накопление
рекомбинантных
слитых
белков RL2, T1_RL и T2_RL, меченных
флуоресцентным красителем Су5,
в
опухолевой ткани (опухоль ГА-1) после
внутривенного введения конъюгатов RL2Cy5, T1_RL-Cy5 и T2_RL-Cy5 мышамопухоленосителям.
Интенсивность флуоресценции опухолей
измеряли на приборе KODAK In Vivo FX
Professional Imaging System.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
12
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Разработанные документы
1. Методика получения рекомбинантных слитых белков.
Методика включает наработку биомассы клеток-продуцентов слитых белков, выделение
целевых рекомбинантных белков из биомассы клеток-продуцентов, очистку целевых
белков и анализ качества полученных экспериментальных образцов рекомбинантных
слитых белков.
2. Методика оценки количественных параметров, характеризующих специфическую
активность рекомбинантных слитых белков, включающую оценку цитотоксической
активности, адресности и противоопухолевой активности слитых белков.
3. Программа и методики испытаний экспериментальных образцов рекомбинантных
слитых белков, включающие разработку спецификации на экспериментальные образцы с
обоснованием используемых при испытаниях методов контроля и определением
нормативных показателей качества испытуемых препаратов.
Экспериментальные образцы:
Проведена наработка пяти экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков,
содержащих
опухоль-адресованный
пептид,
обеспечивающий
специфичное
взаимодействие с поверхностными маркерами раковых клеток, и апоптоз-индуцирующий
белок лактаптин, способствующий элиминации раковых клеток.
Качество полученных экспериментальных образцов рекомбинантных слитых белков
подтверждены современными методами генетического и биохимического анализа.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
13
Состояние выполнения запланированных индикаторов
№
п/п
Наименование
Индикаторы
1
Число публикаций по результатам проекта в научных
журналах, индексируемых в базе данных Scopus или в
базе данных "Сеть науки" (WEB of Science)
Единица
измерения
единиц
2
Число патентных заявок, поданных по результатам
проекта
единиц
3
Объем привлеченных внебюджетных средств
млн.руб
4
Доля исследователей в возрасте до 39 лет в общей
численности исследователей-участников проекта
Показатели
1
Количество центров коллективного пользования
научным оборудованием, научное оборудование
которых использовалось при проведении
исследований и разработок в рамках проекта
2
3
Количество мероприятий по демонстрации и
популяризации результатов и достижений науки, в
которых приняла участие и представила результаты
проекта организация - исполнитель проекта
Средний возраст исследователей – участников
проекта (не более)
Соглашение №<номер>
Значения на текущий год
Запланировано на
Достигнуто за
текущий 2015 год отчетный период
процентов
3
2
1
1
6,67
3,335
32,4
56
4
4
1
1
46
38,2
единиц
единиц
лет
ФЦП ИР
2014-2020
14
Результаты исследовательской работы, полученные в 2015 г.
Журнал “Journal of Cancer Research
and Therapeutics” 2015, V. 11 (2),
p. 345-351.
Заявка на патент
№ 2015132522
«Опухоль-специфический
пептид
для
адресной
химиотерапии
опухолей
молочной железы человека», приоритет
от 04.08.2015
Журнал “Biology and Medicine”,
Biol Med J 2015, S2
http://dx.doi.org/10.4172/09748369.S2-004
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
15
Спасибо за внимание!
Докладчик:
Заместитель директора ИХБФМ СО РАН
К.б.н. Рихтер В.А.
Соглашение №<номер>
ФЦП ИР
2014-2020
16