Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М. ЗАО «НПП ИММУНОТЕХ»

реклама
Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М.
Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова
ЗАО «НПП ИММУНОТЕХ»
 Проблема:
Устойчивость
микроорганизмов к действию бета-лактамных
антибиотиков
 Причина :
Продукция бактериальных ферментов –
бета-лактамаз
Бета-лактамазы представляют собой группу
бактериальных ферментов, способных гидролизовать
бета-лактамные антибиотики
S
S
H2O
HN
N
O
OH
COOH
COOH
 1940 – E. Abraham E. Chain описали инактивацию
пенициллина в бесклеточном экстракте культуры E. coli
 1965 – описана бета-лактамаза ТЕМ-1
 Наст. время – описано более 700 бета-лактамаз
Классификация семейства бета-лактамаз
TEM
SHV
CTX-M
KPC
OXA
VIM
IMP
SPM
GIM SIM
• Бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС)
• Ингибитор-устойчивые бета-лактамазы
• Карбапенемазы
Задача:
одновременная идентифицикация
нескольких типов бета-лактамаз,
определение мутаций в них
Возможное решение:
• использование молекулярногенетических методов
• использование мультипараметрических
методов исследований
5
Биологические микрочипы
Биологические микрочипы – это организованное
размещение биологически активных молекул
в виде миниатюризированных матриц
на специальном носителе
Микрочип
Метод ДНК-зондов
6
Особенности технологии микрочипов
 Одновременное определение
множества параметров
 Миниатюризация
 Автоматизация
 Высокая производительность
7
SNP capture probe design
TEM-1
TEM-X
-------------- A--------------------------- G--------------
probe 1A
1G
1C
1T
clinical sampl
extraction of D
from blood, urin
----------- A --------------------- G --------------------- C --------------------- T -----------
1h
selective amplif
and labeling
bacterial resistan
by PCR
2h
30 min
Выделение
ДНК
• Амплификацияhybridization
Гибридизация
of labeled target
on fixed capture probes
гена (ПЦР)
• Введение метки
identification
Детекция
bacterial resista
результатов
гибридизации
по активности
метки
Детекция результатов
гибридизационного анализа
Микрочипы
с флуоресцентной
детекцией
Cy3
Микрочипы
с колориметрической
детекцией
Фермент
Бт
Окрашенный
продукт
Субстрат
9
Идентификация типа гена
C
A
U
C
G
A
G
T
A
G
C
T
Прямая цепь
G
U
A
G
C
U
C
A
T
C
G
A
Обратная цепь
10
Выявление точечных мутаций в генах
151
TEM-1
...GSGHYGT...
TEM-21
...GSGRYGT...
TEM-1 CCGCTTTTTTGCACAACATGGGGG
TEM-21 CCGCTTTTTTGCGCAACATGGGGG
CCGCTTTTTTGCCCAACATGGGGG
CCGCTTTTTTGCTCAACATGGGGG
A
G
C
T
Анализ нуклеотидных последовательностей генов
11
ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и
ингибитор-устойчивых бета-лактамаз
Носитель: найлон
Размер чипа: 8 мм х 14 мм
Диаметр точки: ~ 350 µm
Количество точек: 246
Количество зондов: 78
Идентификация:
• 3 типа генов βлактамаз: TEM, SHV и
СТХ-М
• 25 мутаций в них для
определения БЛРС и
ингибитор-уст. БЛ
Контроль иммобилизации
Отр. контроль гибр.
Полож. контроль гибр.
Идентификация типа гена
Мутации в blaTEM
Мутации в blaSHV
Мутации в blaСТХ-М
Интенсивность, отн. ед.
TEM-1 + SHV-1 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I поколения)
TEM-1 + SHV-1 + SHV-12 + CTX-M-15 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV покИнтенсивность, отн. ед.
ний)
13
Результаты тестирования штамма K. pneumonia,
продуцирующего три β-лактамазы:
TEM-1, SHV-1 и СTX-M-9
SHV-1
CTX-M-9
Интенсивность, отн. ед.
TEM-1
14
Апробация ДНК-микрочипа на клинических
штаммах Enterobacteriaceae (n=100)
БЛРC – (n = 10):
Не обн.
ТЕМ-1
SHV-1
(TEM-1+
SHV-1)
20%
20%
10%
50%
БЛРС+ (n = 90):
SHV-5-like
CTX-M-1-like
CTX-M-2-like
CTX-M-9-like
TEM-1-like + SHV-2-like
TEM-1-like + SHV-5-like
TEM-1-like + CTX-M-1-like
TEM-1-like + CTX-M-9-like
SHV-1-like + SHV-5-like
SHV-1-like + CTX-M-1-like
TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like
TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like
TEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-1-like
TEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-9-like
SHV-2-like + CTX-M-1-like
SHV-5-like + CTX-M-9-like
TEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-like
TEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-2-like
TEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-like
TEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-like
SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-like
SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-like
SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-like
TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-like
TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-9-like
TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-like
TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-2-like
24,6% штаммов
продуцировали 2 БЛРС
ДНК-микрочип для определения генов
карбапенемаз
Носитель: найлон
Размер микрочипа: 11мм×15мм
Диаметр одной точки: 350 мкм
Количество точек: 132
Идентификация карбапенемаз:
VIM, IMP, SPM, GIM, SIM (класс B)
OXA ( класс D)
KPC (класс A)
Id_IMP
Id_VIM
Id_OXA
IMP-1
VIM-1
OXA-23
IMP-2
VIM-2
OXA-40
IMP-5
VIM-7
OXA-51
IMP-11
Id_SPM
OXA-58
IMP-14
Id_SIM
Id_KPC
Id_GIM
Контроль иммобилизации
Положительный контроль гибридизации
Отрицательный контроль гибридизации
Идентификация для металло-β-лактамаз
Идентификация OXA-β-лактамаз
Идентификация KPC-β-лактамаз
Апробация ДНК-микрочипа для определения
генов карбапенемаз на клинических
штаммах
Типы обнаруженных карбапенемаз
Микроорганизм
Число
штаммов
OXA-23like
OXA-40like
OXA-51like
OXA-58like
VIM-2like
Acinetobacter
baumanii
n=15
1
5
15
4
-
Pseudomonas
aeruginosa
n=15
-
-
-
-
11
Интегрированный ДНК-микрочип
для идентификации β-лактамаз
Скрининг клинических образцов на наличие
БЛРС, ингибитор-устойчивых бета-лактамаз
класса А и карбапенемаз классов A, B, D
Благодарности:
• Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова
Уляшова М.М.
Халилова Ю.И.
Григоренко В.Г.
Игнатенко О.В.
• НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленская гос. мед. академия
Эдельштейн М.В.
• Институт нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко
Александрова И.А.
Финансовая поддержка:
ФЦП "Национальная технологическая база" на 2007-2011 годы
(Контракт ГП/07/442/НТБ/К)
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !
Скачать