Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М. ЗАО «НПП ИММУНОТЕХ»
advertisement
Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Халилова Ю.И., Егоров А.М. Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова ЗАО «НПП ИММУНОТЕХ» Проблема: Устойчивость микроорганизмов к действию бета-лактамных антибиотиков Причина : Продукция бактериальных ферментов – бета-лактамаз Бета-лактамазы представляют собой группу бактериальных ферментов, способных гидролизовать бета-лактамные антибиотики S S H2O HN N O OH COOH COOH 1940 – E. Abraham E. Chain описали инактивацию пенициллина в бесклеточном экстракте культуры E. coli 1965 – описана бета-лактамаза ТЕМ-1 Наст. время – описано более 700 бета-лактамаз Классификация семейства бета-лактамаз TEM SHV CTX-M KPC OXA VIM IMP SPM GIM SIM • Бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) • Ингибитор-устойчивые бета-лактамазы • Карбапенемазы Задача: одновременная идентифицикация нескольких типов бета-лактамаз, определение мутаций в них Возможное решение: • использование молекулярногенетических методов • использование мультипараметрических методов исследований 5 Биологические микрочипы Биологические микрочипы – это организованное размещение биологически активных молекул в виде миниатюризированных матриц на специальном носителе Микрочип Метод ДНК-зондов 6 Особенности технологии микрочипов Одновременное определение множества параметров Миниатюризация Автоматизация Высокая производительность 7 SNP capture probe design TEM-1 TEM-X -------------- A--------------------------- G-------------- probe 1A 1G 1C 1T clinical sampl extraction of D from blood, urin ----------- A --------------------- G --------------------- C --------------------- T ----------- 1h selective amplif and labeling bacterial resistan by PCR 2h 30 min Выделение ДНК • Амплификацияhybridization Гибридизация of labeled target on fixed capture probes гена (ПЦР) • Введение метки identification Детекция bacterial resista результатов гибридизации по активности метки Детекция результатов гибридизационного анализа Микрочипы с флуоресцентной детекцией Cy3 Микрочипы с колориметрической детекцией Фермент Бт Окрашенный продукт Субстрат 9 Идентификация типа гена C A U C G A G T A G C T Прямая цепь G U A G C U C A T C G A Обратная цепь 10 Выявление точечных мутаций в генах 151 TEM-1 ...GSGHYGT... TEM-21 ...GSGRYGT... TEM-1 CCGCTTTTTTGCACAACATGGGGG TEM-21 CCGCTTTTTTGCGCAACATGGGGG CCGCTTTTTTGCCCAACATGGGGG CCGCTTTTTTGCTCAACATGGGGG A G C T Анализ нуклеотидных последовательностей генов 11 ДНК-микрочип для идентификации генов БЛРС и ингибитор-устойчивых бета-лактамаз Носитель: найлон Размер чипа: 8 мм х 14 мм Диаметр точки: ~ 350 µm Количество точек: 246 Количество зондов: 78 Идентификация: • 3 типа генов βлактамаз: TEM, SHV и СТХ-М • 25 мутаций в них для определения БЛРС и ингибитор-уст. БЛ Контроль иммобилизации Отр. контроль гибр. Полож. контроль гибр. Идентификация типа гена Мутации в blaTEM Мутации в blaSHV Мутации в blaСТХ-М Интенсивность, отн. ед. TEM-1 + SHV-1 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I поколения) TEM-1 + SHV-1 + SHV-12 + CTX-M-15 (устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV покИнтенсивность, отн. ед. ний) 13 Результаты тестирования штамма K. pneumonia, продуцирующего три β-лактамазы: TEM-1, SHV-1 и СTX-M-9 SHV-1 CTX-M-9 Интенсивность, отн. ед. TEM-1 14 Апробация ДНК-микрочипа на клинических штаммах Enterobacteriaceae (n=100) БЛРC – (n = 10): Не обн. ТЕМ-1 SHV-1 (TEM-1+ SHV-1) 20% 20% 10% 50% БЛРС+ (n = 90): SHV-5-like CTX-M-1-like CTX-M-2-like CTX-M-9-like TEM-1-like + SHV-2-like TEM-1-like + SHV-5-like TEM-1-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + CTX-M-9-like SHV-1-like + SHV-5-like SHV-1-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like TEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like + CTX-M-9-like SHV-2-like + CTX-M-1-like SHV-5-like + CTX-M-9-like TEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-2-like + CTX-M-2-like TEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-like SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-like SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-like SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-9-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-2-like + CTX-M-9-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-1-like TEM-1-like + SHV-1-like + SHV-5-like + CTX-M-2-like 24,6% штаммов продуцировали 2 БЛРС ДНК-микрочип для определения генов карбапенемаз Носитель: найлон Размер микрочипа: 11мм×15мм Диаметр одной точки: 350 мкм Количество точек: 132 Идентификация карбапенемаз: VIM, IMP, SPM, GIM, SIM (класс B) OXA ( класс D) KPC (класс A) Id_IMP Id_VIM Id_OXA IMP-1 VIM-1 OXA-23 IMP-2 VIM-2 OXA-40 IMP-5 VIM-7 OXA-51 IMP-11 Id_SPM OXA-58 IMP-14 Id_SIM Id_KPC Id_GIM Контроль иммобилизации Положительный контроль гибридизации Отрицательный контроль гибридизации Идентификация для металло-β-лактамаз Идентификация OXA-β-лактамаз Идентификация KPC-β-лактамаз Апробация ДНК-микрочипа для определения генов карбапенемаз на клинических штаммах Типы обнаруженных карбапенемаз Микроорганизм Число штаммов OXA-23like OXA-40like OXA-51like OXA-58like VIM-2like Acinetobacter baumanii n=15 1 5 15 4 - Pseudomonas aeruginosa n=15 - - - - 11 Интегрированный ДНК-микрочип для идентификации β-лактамаз Скрининг клинических образцов на наличие БЛРС, ингибитор-устойчивых бета-лактамаз класса А и карбапенемаз классов A, B, D Благодарности: • Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова Уляшова М.М. Халилова Ю.И. Григоренко В.Г. Игнатенко О.В. • НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленская гос. мед. академия Эдельштейн М.В. • Институт нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко Александрова И.А. Финансовая поддержка: ФЦП "Национальная технологическая база" на 2007-2011 годы (Контракт ГП/07/442/НТБ/К) СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ !
