P.aeruginosa, K.pneumoniae - Центральный НИИ эпидемиологии

РАЗРАБОТКА ТЕСТОВ ДЛЯ
ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ КАРБАПЕНЕМАЗ
ТИПОВ VIM, IMP, NDM, KPC, OXA-48
МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР
В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Савочкина Ю.А. 1 Сухорукова М.В. 2, Эйдельштейн М.В. 2,
Гущин А.Е. 1, Шипулин Г.А.1
1
2
ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора
НИИ антимикробной химиотерапии
Проблема резистентности, обусловленной
приобретенными карбапенемазами
 Продукция приобретенных карбапенемаз –
– самый эффективный механизм резистентности
к карбапенемам
 Данный механизм АБ-резистентности имеет особое
клиническое и эпидемиологическое значение
• Возможности терапии инфекций, вызванных карбапенемрезистентными возбудителями, критически ограничены
• Опасность широкого распространения:
гены приобретенных карбапенемаз ассоциированы
с мобильными генетическими элементами,
некоторые выявлены у эпидемических клонов
Продуценты приобретенных карбапенемаз −
основные проблемные Грам(-) возбудители




Pseudomonas aeruginosa
Acinetobacter baumanii
Klebsiella pneumoniae
др. энтеробактерии
- сепсис;
- пневмония;
- ИМП;
- интраабдоминальные
инфекции;
- раневые инфекции
Резистентность к бета-лактамам,
включая карбапенемы
Виды приобретенных карбапенемаз
 MBL - металло-β-лактамазы (мол.класс B):
группы VIM (23 типа), IMP (26 типов), NDM-1,-2,
продуценты - P.aeruginosa, K.pneumoniae,
др. Enterobacteriaceae, Aсinetobacter baumannii
 KPC (мол.класс А, 10 типов)
продуценты – K.pneumoniae, др. Enterobacteriaceae
 OXA (мол.класс D):
- OXA-48-подобные – продуцент - K.pneumoniae;
- OXA-23-like, -58, -40-like – Acinetobacter spp.
Некоторые другие типы карбапенемаз
имеют локальное распространение
Цель данной работы:
Разработка тестов для выявления генов
карбапенемаз типов VIM, IMP, NDM, KPC и OXA-48
методом мультиплексной ПЦР в реальном времени
Тесты для выявления генов карбапенемаз
методом мультиплексной ПЦР в реальном
времени
VIM
Тест MBL:
выявление генов карбапенемаз
типов VIM, IMP, NDM
IMP
ВК
NDM
ВК - внутренний контроль
1 ПЦР, используются
4 канала детекции
Амплификатор
с системой
оптической детекции
Мультиплексные ПЦР-тесты
для выявления генов карбапенемаз
Тест MBL:
• VIM -группа
• IMP -группа
• NDM-1,2
• ВК (внутренний контроль)


Тест KPC / OXA-48:
• KPC -группа
• OXA-48 -like
• ВК
Результаты за 1,5-3 часа
Анализ различных образцов:
чистая культура; гемокультура;
клинический материал (при скрининге,
эпидемиологич. исследованиях)
Тест MBL: результаты анализа
контрольных штаммов и изолятов
0.8
0.7
VIM
Норм. Флуоресц.
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
Порог
0.0
5
10
15
20
25
30
35
Cycle
0.6
IMP
• У всех продуцирующих VIM-2 изолятов
P. aeruginosa выявлен ген группы VIM
Норм. Флуоресц.
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
Порог
0.0
5
10
15
20
25
30
35
Cycle
0.50
0.45
0.40
NDM
Норм. Флуоресц.
0.35
0.30
K+
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
Порог
0.00
5
10
• У всех штаммов-продуцентов
карбапенемаз типов VIM-1, -2, -4, -10,
IMP-1, -2, -12, -13 идентифицированы
соответствующие группы генов
(VIM и IMP)
15
20
Цикл
25
30
35
• Для всех MBL-отрицательных
по данным фенотипического теста
изолятов - отрицательный результат
ПЦР-теста
Тест KPC/OXA-48: результаты анализа
контрольных штаммов и изолятов
• У штамма-продуцента KPC-3
выявлен ген группы KPC
• У штаммов-продуцентов OXA-48
выявлен ген группы OXA-48-like
0.7
KPC
0.6
Норм. Флуоресц.
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
Порог
0.0
5
10
15
20
25
30
35
Cycle
• Отрицательный результат ПЦР –
для всех изолятов энтеробактерий,
у которых фенотипически отсутствует
продукция карбапенемаз (MHT-тест)
0.4
OXA-48
Норм. Флуоресц.
0.3
0.2
0.1
Порог
0.0
5
10
15
20
Cycle
25
30
35
ПЦР-тесты MBL и KPC/OXA-48:
оценка специфичности
Специфичность подтверждают отрицательные
результаты ПЦР по всем группам генов
для всех изолятов, у которых отсутствуют
фенотипические признаки продукции карбапенемаз:
• изоляты K.pneumoniae (N=20), не продуцирующие
карбапенемазы по результатам Ходж-теста (MHT)
• карбапенем-чувствительные изоляты K. pneumoniae,
E. coli, P. aeruginosa (N=60)
Заключение
• Разработаны тесты для выявления генов
приобретенных карбапенемаз групп VIM, IMP, NDM,
KPC и OXA-48 методом мультиплексной ПЦР
в режиме реального времени
• Данные ПЦР-тесты могут служить эффективным
инструментом для выявления штаммов,
обладающих АБ-резистентностью, обусловленной
приобретенными карбапенемазами