наивысшая скорость тандемной масс

Жидкостная хроматография и тандемная
хромато-масс-спектрометрия как инструменты
в идентификационных исследованиях новых
сильнодействующих препаратов
Родин И.А.
Быстрая жидкостная хроматография
Сокращение времени анализа
Колонки с размером зерна неподвижной фазы 1,6 мкм - переход от
сверхбыстрой хроматографии к хроматографии сверхвысокого
разрешения
Shim-pack VP-ODS 4.6 mmID×150 mm, 5 µm
1
N for Peak 5 = 12,918
Rt for Peak 5 = 14.79 min
2
3
4
0.0
2.5
5.0
7.5
5
10.0
Shim-pack XR-ODSⅢ 2 mmID×50 mm, 1.6 µm
12.5
15.0
min
Shim-pack XR-ODSⅢ 2 mmID×200 mm, 2.2 µm
1
1
Rt for Peak 5 = 0.93 min
2
N for Peak 5 = 32,504
2
3
3
4
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
5
0.7
0.8
0.9
4
1.0
1.1
1.2 min
Сокращение времени анализа в 16 раз
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0 2.5
3.0
3.5
5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5 min
Разрешение выше в 2,5 раза
TOX.I.S. II =
TOXicological Identification System
Диагностика острых интоксикаций
 Алкалоиды
(псилоцин, скополамин,
гиоциамин, …)
 Лекарства с коротким
периодом полураспада в
крови (морфин, кодеин, …)
 Наркотики
(производные амфетамина,
опиаты, …)
TOX.I.S. II =
TOXicological Identification System
 Photodiode Array UV Spectra Library for HPLC-DAD
 2682 УФ-спектра веществ, важных для токсикологии:
наркотики; лекарственные препараты, вызывающие
зависимость; антиэпилептики; важнейшие классы
лекарств (анальгетики, стероиды, антибиотики,
антигистаминные и др.); растительные яды;
пестициды, фунгициды; гербициды; ПАУ, ПХБ и др.
экологические загрязнители
 Спектры получены в интервале 195 – 380 нм,
подвижная фаза: ацетонитрил/фосфатный буфер,
рН 2.3
TOX.I.S. II =
TOXicological Identification System
2860 соединений
Inst. Forensic Medicine, Berlin
«CoSense» для анализа биологических
жидкостей
«CoSense»: колонка-ловушка Shim-pack
MAYI-ODS
Белок
Лекарство
Иммобилизованная
метилцеллюлоза
Участки ODS
 Основа: силикагель
 Внешняя поверхность:
метилцеллюлоза
 внутренняя поверхность:
октадецилсилил
 Размер частиц: 50 мкм
 Размер пор: 12 нм
 Габариты: 10 мм x 4,6 мм
 pH: 2 - 7.5
 Maкс. давление: 20 MПa
«CoSense»: эффективная очистка от
высокомолекулярных компонентов
Условия анализа:
1. Белки плазмы
2. Изопропилантипирин
Точка переключения
потоков
А. Ввод пробы, очистка от белков
Колонка - Shim-pack MAYI-ODS (10 х 4,6 мм)
Подвижная фаза – 0.1% Фосфорная к-та/
Ацетонитрил= 95/5
Скорость потока - 2.0 мл/мин
Фактор разбавления – 8
Детектор - SPD-20A, 280 нм
Б. Разделение на аналитической колонке
Колонка - Shim-pack VP-ODS (150 х 4,6 мм)
Подвижная фаза –
А. Вода, В. Ацетонитрил
Линейный градиент - В 5% →95%
Скорость потока - 1.0 мл/мин
Температура – 40ОС
Детектор - SPD-20A, 275 нм.
«CoSense» + LCMS-2020: определение пяти препаратов
в плазме крови
1.
2.
3.
4.
5.
Носкапин
Пропранолол
Димедрол
Имипрамин
Верапамил
Концентрация каждого препарата 0,01 мкг/мл
Объем образца 50 мкл
Режим SIM (регистрация отдельных ионов)
Картриджи для отделения плазмы
(«Plasma separation cards»)
• Разработаны для отделения 108 эритроцитов
за 3 минуты
Картриджи для отделения плазмы
(«Plasma separation cards»)
Контрольное пятно
[для определения
достаточно ли крови
нанесено на картридж]
Слой фильтрации
[Связывает эритроциты за
счет фильтрации и
адсорбции. Средняя
вертикальная скорость
миграции – около 1мкм/с]
Распределяющий слой
[Быстро распределяет цельную кровь по поверхности
картриджа с одновременным добавлением
буферных растворов и антикоагулянтов. Скорость
распределения 150 мкм/с]
Изолирующий экран
[Исключает боковое
затекание вдоль
поверхности картриджа]
Собирающий слой
[Собирает аликвоту плазмы на 6,35 мм диск. Средняя
скорость сбора составляет 13 нл/с. Это соответствует
потоку 400 пл/мм2/с]
Картриджи для отделения плазмы
(«Plasma separation cards»)
 Нанести 20 – 75 мкл цельной крови и подождать 3 минуты. Дать высохнуть на
воздухе, и образец готов к транспортировке, хранению и анализу
Картриджи для отделения плазмы:
преимущества
 Быстрый сбор 2,5 мкл плазмы крови.
Вариация объема менее 3% (стандартные
методы 20 - 71%)
 Плазма может храниться существенно
дольше чем цельная кровь
 Нет мешающих компонентов для МСанализа
 Простые методы отбора крови
«Nexera Scouting System» - разработка и
оптимизация новых методов анализа
До 960 комбинаций
«NeХera Method Scouting» - сокращение времени разработки
новых методов анализа
Состав подвижной фазы
・・・ 16
Колонки
・・・ 6
Режимы градиентного элюирования ・・・ 10
Файл метода
Файл серии
ВСЕГО
Число комбинаций
16 × 6 × 10 = 960
Задание условий вручную
（UHPLC）
Method Scouting
System
32 часа
5 минут
необходимо создать 960 файлов
метода
（※1 метод / 2 минуты)
только один файл метода
8 часов
5 минут
необходимо создать все файлы серии
（※ 30 сек / 1 серия）
автоматическое создание
файлов серии
40 часов
10 минут
 «Method scouting solution» позволяет создать все файлы всего за 10
минут!
 Автоматическое создание файлов позволяет избежать ошибок оператора
Сверхбыстрые тандемные масс-спектрометры серии LCMS80….
Соотношение сигнал-шум: 1 пг резерпина
LCMS-8050
60000
Характеристики :
Скорость сканирования: 15’000 а.е.м./с
Переключение полярности: 15 мс
Макс. число MRM переходов: 555
каналов/с
• В 6 раз выше чувствительность
• Скорость сканирования: 30’000
а.е.м./с
• Шаг сканирования 0,1 а.е.м./с
• Переключение полярности: 5 мс
• Макс. число MRM переходов: 555
каналов/с
LCMS-8040
10000
• В 5 раз лучше чувствительность
2000
LCMS-8030
Комбинированные режимы измерения
Запас по быстродействию позволяет реализовать в ходе одного
анализа получение как количественных, так и качественных
результатов
 Режимы сканирования (полного диапазона масс, дочерних ионов или
ионов предшественников) могут быть задействованы одновременно с
режимом регистрации MRM
 UFscanning обеспечивает получение точных результатов в любом
режиме анализа

Порог срабатывания
MRM
Сканирование дочерних ионов
Inten.(x100,000)
7.5
700000
600000
167.10
500000
5.0
400000
300000
2.5
200000
141.15
100000
0
1.00
1.05
1.10
1.15
1.20
1.25
1.30
1.35
1.40
1.45
min
382.00
198.55
0.0
50
100
150
200
250
300
350
m/z
«Method
Packages»: наборы готовых методик
 Контроль качества воды: 80 определяемых соединений

Агрохимикаты: 167 определяемых соединений
 Ветеринария: 42 лекарственных средства
 Наркология и судебная медицина: 386 наркотических и
токсичных соединений
 Токсикологический скрининг: 106 токсичных соединений
 Метаболомика: 55 первичных метаболитов
 Липидомика: 130 медиаторов липидов
 ПО для LCMS неонатального скрининга
Лекарственный мониторинг
2] Определение опиатов, амфетаминов и кокаина в цельной крови,
плазме крови и моче при помощи УВЭЖХ-МС/МС и пробоподготовки
QuEChERS
Лекарственный мониторинг
A
Хроматограмма полученная при вводе 5 мкл
экстракта цельной крови с добавкой 200 мкг/л
B
Хроматограмма полученная при вводе 5 мкл экстракта цельной крови с добавкой 200 мкг/л
Порядок выхода - A: norephedrine и norpseudoephedrine / B: ephedrine и pseudoephedrine
Drugs of Abuse Method Package
Готовый к использованию метод, включающий:
Условия ВЭЖХ
 Параметры MRM
 Параметры сканирования дочерних
ионов
 Библиотку масс-спектров

# Category
No. Remarks
1 Hypnotics
70
2 Illicit drugs
305 Narcotics and stimulants
3 Psychotropic
105
4 Top 100
Digests
100 30: illicit drugs, 18: psychotropic, 37: hypnotics and
15: others
68 benzodiazepines and 2 other hypnotics (zopiclone
and zolpidem) and its metabolites
Rapid Tox Screening Package
Новое решение для быстрого скрининга
1.Панель целевых соединений: серийный анализ для определения 106
целевых соединений
DOA
16
Hypnotics
35
Psychotropics
23
Pharma
-ceuticals
Pesti
-cides
Natural
toxin
26
4
2
2. Полуколичественный анализ; нет необходимости использовать аутентичные
стандарты
Калибровочные кривые хранятся в метод-файле
3. Включает описание процедуры пробоподготовки на основе техники QuEChERs
Апробированная процедура подготовки образцов для определения всего спектра
целевых соединений
4. Автоматизация процесса анализа при помощи Quan Solution
Все процедуры, начиная с регистрации образцов и заканчивая печатью отчета,
автоматизированы
5. Библиотека содержит масс-спектры 106 целевых соединений
Rapid Tox Screening Package
MP включает процедуру пробоподготовки основанную
на технологии QuEChERS и оптимизированную для
использования в судебной медицине и токсикологии
Вода 0,5 мл
ACN 1,5 мл
Диазепан-d5 (IS) 100 нг
Гранулы из нержавеющей стали
Отбор супернатанта
Добавление 100 мкл
0,1% TFA
↓
Сушка
↓
Растворение в
200 мкл MeOH
↓
ЖХ-MС/MС анализ
Q-sep
QuEChERS
соль
Образец (MgSO4,NaOAc) [Встряхивание]
→[Центрифугирование]
0,5 мл
Rapid Tox Screening Package
Ввод
Кровь, плазма, моча
QuEChERS
Сбор данных
Inten.(x100,000)
(x100,000)
Zolpidem
6.0
Регистрация массспектров
5.0
4.0
CH3
2.0
1.0
H3C
N
O
3.0
200
1.0
0.0
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Хроматограмма (MRM)
5.5 min
CH3
N
CH3
263
308
221
0.0
2.0
235
N
250
300 m/z
MС/MС спектр (сканирование дочерних
ионов)
Поиск по библиотеке
LCMS-IT-TOF
Источник ионизации при
атмосферном давлении
Квадруполь для
предварительной
фокусировки
Ионная ловушка
1.Фрагментация активированная соударением (аргон)
2.Импульсная транспортировка в времяпролетный
масс-анализаотр
Подогреваемый капилляр
Октополь
Идентификация метаболитов [MetID]
Metabolite Identification [MetID]
 MetID

Solution
Используются точные
моноизотопные массы
MetID
Данные исходного образца
Список ожидаемых метаболитов
Образец после метаболизма
Пики в масс-спектре соответсвующие ожидаемым метаболитам
Спасибо за внимание!