ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ развития ВОЗРАСТНЫХ

Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН
ФУРСОВА АНЖЕЛЛА ЖАНОВНА
Хориоретинальная дистрофия: особенности
развития при преждевременном старении и
коррекция митохондриальным
антиоксидантом SkQ1
14.00.16 – патологическая физиология
Научный консультант – д.б.н. Н.Г.Колосова
В мире 161000000 человек слепых и
слабовидящих, среди них слепых – 47000000.
Причины:
- 47% – катаракта,
- 9% – макулодистрофия.
Возрастная макулодистрофия:
Европа и США – 1-е место,
Азия – 2-е место.
В России макулодистрофия становится причиной
слепоты в 22% случаев (Е.С.Либман, 2006).
14 - 46% россиян в возрасте старше 65 лет
страдают этим заболеванием.
Проявления преждевременного старения крыс OXYS:
Продолжительность жизни снижена.
Ранняя инволюция тимуса, снижение реактивности
клеточного звена иммунной системы.
Ранний остеопороз.
Изменения в когнитивной и эмоциональной сферах,
свойственные стареющим людям и животным.
Повышено артериальное давление.
Ранняя спонтанная катаракта
Цель работы:
 исследование особенностей развития
хориоретинальной дистрофии у
преждевременно стареющих крыс OXYS
и оценка терапевтического потенциала
митохондриально направленного
антиоксиданта SkQ1.
Задачи:
1.
Охарактеризовать клинические особенности развития
патологических изменений сетчатки и хрусталиков у крыс OXYS.
2.
Провести морфологическое исследование тканей хориоретинального
комплекса и изучить особенности развития ХРД у крыс OXYS.
3.
Оценить уровень экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов
VEGF в тканях внутренней оболочки глаз крыс OXYS на разных
стадиях развития ХРД.
4.
Установить связь развития катаракты и ХРД у крыс OXYS с
окислительным стрессом и оценить возможность воздействия на их
течение методами стандартной терапии с использованием препаратов
со свойствами антиоксидантов.
5.
Изучить влияние митохондриально направленного антиоксиданта
SkQ1 на развитие хориоретинальной дистрофии и катаракты у крыс
OXYS и связь его эффектов с влиянием на экспрессию гена VEGF
хориоретинальном комплексе и альфа-кристаллинов в хрусталиках.
Методы исследования
Животные: 1710 крыс OXYS и Вистар, возр
от 20 дней до 24 мес.
Офтальмологические методы:
 осмотры с помощью прямого
офтальмоскопа "Betta" с насадкой
щелевой лампы.
 Биомикроскопическое исследование
щелевой лампой SL-45 “Shin Nippon”.
 Исследование глазного дна с помощью
Фундус-камеры «Оpton».
 Электроретинография.
Морфологические методы:
Световая и электронная микроскопия
Молекулярно-биохимические методы:
ПЦР в реальном времени, стандартные
биохимические методы
Распределение крыс Вистар и OXYS разного возраста
по стадиям развития катаракты
Крысы Вистар
60
1 стадия
2 стадия
40
3 стадия
Крысы OXYS
20
0
80
1
0,7
2
4
33
65
4,5
1,5
Возраст, месяцев
126
247
% от общего числа животных
% от общего числа животных
80
1 стадия
2 стадия
60
3 стадия
40
20
0
0
0,7
1
1,5
2
6
3
4,5
Возраст, месяцев
3
4
5
12
6
24
7
Ядерная катаракта,
крыса OXYS
Электронно-микроскопическая картина
изменений хрусталиков крыс OXYS
Вистар
OXYS
OXYS
Вистар
Вистар
OXYS
Эпителиоциты экваториальной зоны
OXYS
В 98% случаев катаракта у крыс OXYS развивается на
фоне дистрофических изменений сетчатки.
1 стадия
2 стадия
3 стадия
% от общего количества животных
80
60
40
20
0
0,71
1,5 2
33
64
95
Возраст животных, месяцев
6
12
7
24
Зависимость распределения по ХРД стадиям от возраста
Основные клинические проявления дистрофии
сетчатки аналогичны у людей
…и крыс OXYS:
а
б
в
Флуоресцентная ангиография глазного дна крыс OXYS.
а - зоны атрофии пигментного эпителия;
б – субретинальная транссудация, отслойка РПЕ,
в - отслойка нейроэпителия с участками субретинальной новообразованной мембраны
а
б
в
г
д
ЭРГ крыс OXYS разного возраста:
а - супернормальная ЭРГ, возраст 3 мес.; б – негативная ЭРГ,
возраст 6 мес.; в- нормальная ЭРГ, возраст 3 нед. ;
г - субнормальная ЭРГ, возраст 7 мес.; д – нерегистрируемая ЭРГ, возраст 12 мес.
Хориоретинальный комплекс крыс OXYS разного возраста
(×400, гематоксилин-эозин).
3 мес., отек в слое ганглиозных
клеток сетчатки. Ядра отодвинуты от
внутренней пограничной мембраны.
24 мес., тотальный фиброз хориоидеи,
просветы сосудов не определяются.
Крыса Wistar, 24 мес.: нормальное строение
сетчатки глаза. (×400, окраска гематоксилинэозин).
Возраст животных – 5 месяцев
40
35
Wistar
OXYS
%
30
Стаз форменных элементов в
сосудах хориоидеи крыс OXYS.
*
НЯС
25
20
ФС
*
15
10
5
0
Площадь открытых Площадь сосудов со
сладжем эритроцитов
cосудов
и тромбозом
1
2
Х
ПЭ
Пикноз ядер нейросенсорных клеток в наружном ядерном слое сетчатки крыс OXYS
ВЯС
ФС
НЯС
ПЭ
ФС
ФС
Расслоение и фрагментация наружных сегментов
фоторецепторов сетчатки крыс OXYS
ПЭ
Х
Ультраструктура пигментного эпителия
Крыса Wistar в возрасте 11 мес.
Линия
крыс
Вистар
OXYS
Удельная площадь
пигментного
эпителия сетчатки (%)
5,43±0,1
3,56±0,21*
Крыса OXYS в возрасте 11 мес.
1-е положение, выносимое на защиту:
Развитие у крыс OXYS хориоретинальной
дистрофии по клиническим и морфологическим
проявлениям соответствует возрастной
макулодистрофии людей, развивается
параллельно с формированием катаракты и
является одним из проявлений преждевременного
старения.
У крыс OXYS (70-80 поколения) манифестация хориоретинальной
дистрофии и катаракты по времени опережает появление признаков
окислительного стресса.
Содержание продуктов ПОЛ
в сыворотке крови
Содержание продуктов ПОЛ в сетчатке и хрусталиках глаз крыс
Wistar и OXYS в возрасте 3 месяцев (Mm).
Хрусталик
Сетчатка
Диеновые
конъюгаты,
Е232 нм на мг
липидов
Основания Шиффа,
отн ед на мг
липидов
Диеновые
конъюгаты, Е232
нм на мг липидов
Основания Шиффа,
отн ед на мг
липидов
Wistar
3,63  0,37
17,56  1,00
1,88 ± 0,11
12,48 ± 0,99
OXYS
2,63  0,61
16,64  1,40
2,05 ± 0,08
15,02 ± 0,83
Линия
Относительный уровень мРНК,
ед. флуоресценции
Экспрессия гена VEGF в хориоретинальном
комплексе крыс OXYS при развитии ХРД
Вистар
OXYS
1.5
1.0
*
0.5
0
2
4
6
8
10
12
14
Возраст, мес.
Выраженность патологических изменений сетчатки зависит от уровня
экспрессии гена VEGF:
в возрасте 3 мес. связь отрицательная (r = -0,61, p=0,028);
при развитых стадиях заболевания связь положительная (r=0,69, p<0,03).
2-е положение, выносимое на защиту:
В основе патогенеза ХРД у крыс OXYS лежат склеротические
повреждения сосудов хориоидеи, нарушение кровотока в них,
деструкция пигментного эпителия, изменение уровня
экспрессии гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF в
хориоретинальном комплексе: снижение экспрессии на ранних
стадиях заболевания и повышение по мере его
прогрессирования.
0
Лютеин комплекс
20
Мирттасол
40
Витамин Е
60
Окулист
80
Селен-актив
Миртасол
100
Контроль
0
Окулист
20
Витамин Е
40
Селен-актив
60
Лютеин комплекс
80
Контроль
% глаз с катарактой
100
% глаз с изменениями сетчатки
На развитие катаракты и ХРД у крыс OXYS влияют стандартные
препараты с антиоксидантной активностью.
Результаты свидетельствуют в пользу адекватности
модели, а также о связи патогенеза катаракты и ХРД у
крыс OXYS с окислительным стрессом.
7
SkQ1 – «ионы Скулачёва» митохондриальный антиоксидант
SkQ1
Антиоксидант
«Локомотив»
Влияние 45-дневного курса SkQ1 (50 нмоль/кг) и витамина
Е (20 мг/кг) на развитие катаракты у крыс OXYS
Влияние препаратов на
заболеваемость
40
20
SkQ
Интактные
60
40
0
1
1,5 мес.
2
3
SkQ
20
4
5
3 мес.
Витамин Е
0
1
2
3
4
5
Влияние препаратов
на заболеваемость
крыс
1,5 мес.
OXYS катарактой
3 мес.
60
6
Витамин Е
80
Интактные
% глаз со 2-й стадией катаракты
% глаз с катарактой
100
6
Влияние препаратов на тяжесть
течения катаракты
Влияние 45-дневного курса SkQ1 (50 нмоль/кг) и витамина
Е (20 мг/кг) на развитие ХРД у крыс OXYS (n=15)
Выраженность
патологических изменений
0
1
1,5 мес.
2
3
4
5
3 мес.
6
5
0
1
1,5 мес.
2
3
4
3 мес.
5
Витамин Е
10
SkQ
20
SkQ1
40
15
Интактные
60
Витамин Е
80
% глаз со 2-й стадией макулодистрофии
100
Интактные
% глаз с изменениями сетчатки
Заболеваемость животных
6
Подбор оптимальной профилактической дозы SkQ1
(количество животных в группе - 30)
Состояние хрусталиков
1,2
*
1,0
*
*
0,8
0,6
0,4
*
0,2
0,0
1,5
3
8
Возраст, месяцев
12
Изменения сетчатки, баллов
1,4
баллов
Катаракта, баллов
*
Контроль
10 нмоль/кг
50 нмоль/кг
250 нмоль/кг
1,6
Состояние сетчатки
*
Контроль
10 нмоль/кг
50 нмоль/кг
250 нмоль/кг
1,6
1,4
1,2
1,0
*
0,8
*
*
0,6
*
0,4
0,2
0,0
0
1,5
3
8
Возраст, месяцев
12
Контроль
10 нмоль/кг
50 нмоль/кг
250 нмоль/кг
1,0
Процент глаз с изменениями
сетчатки в возрасте 20 мес.
*
*
*
*
0,0
0
0
1,5 3
5
*
7
*
*
*
*
10
15
12
*
*
20
*
17 20 24
Возраст, месяцев
Влияние SkQ1 на выраженность
патологических изменений сетчатки.
Приём препарата с 1,5 мес.
100
25
80
60
40
20
0
1,5 мес.
20 мес.
Возраст
250 нмоль SkQ1
0,5
*
50 нмоль SkQ1
*
*
10 нмоль SkQ1
1,5
Контроль
2,0
% глаз с изменениями сетчатки
Изменения сетчатки, баллов
Подтверждение - эксперимент № 2: дистрофия сетчатки на
фоне приёма SkQ1 у крыс OXYS не развивается.
Электроретинография: SkQ1 (250 нмоль/кг с кормом)
препятствует развитию нарушений функций сетчатки у
крыс OXYS.
ЭРГ контрольных крыс OXYS в
возрасте 3 и 24 мес. и 24-месячных
крыс OXYS, получавших с возраста
1,5 мес. 250 нмоль/кг SkQ1.
Амплитуда b-волны, μV
Амплитуда b волны ЭРГ контрольных крыс
OXYS в возрасте 3 и 24 мес. и 24-мес.,
получавших с 1,5 мес. 250 нмоль/кг SkQ1.
*- достоверные отличия по сравнению с
3-мес. крысами, # - значимый эффект SkQ1
80
60
*#
40
*
20
0
3 мес.
24 мес.
24 мес.
+ SkQ1
SkQ1 (250 нмоль/кг с кормом) предупреждает у крыс
OXYS развитие деструктивных изменений сетчатки
Крыса OXYS, 24 мес., приём SkQ1 с
возраста 1, 5 мес.:
хорошо выражен наружный ядерный слой,
определяющий расположение тел
фоторецепторных клеток.
Окраска ГЭ. х 400.
Крыса OXYS, 24 мес., контроль:
наружный
ядерный
слой
редуцирован до 2-х, 3-х рядов. В
некоторых
ядрах
признаки
апоптоза.
Слой
палочек
и
колбочек разрушен.
Зависимые парные сравнения: катаракта на фоне приёма
SkQ1 в дозах 50 и 250 нмоль на кг у крыс OXYS не развивалась.
Контроль
10 нмоль/кг
50 нмоль/кг
250 нмоль/кг
Изменения хрусталиков, баллов
2,2
2,0
1,8
1,6
*
1,4
1,2
1,0
0,8
*
0,6
0,4
0,2
0,0
*
*
*
*
*
*
*
0 1,5
3
7
*
*
10
5
0
*
*
*
*
*
25
20
15
12
17
Возраст, месяцев
*
20
24
Состояние хрусталиков контрольных и получавших SkQ1
крыс OXYS. Начало приёма препарата – 1,5 мес.,
SkQ1 позитивно влиял на общее
состояние крыс OXYS,
предупреждал развитие признаков
преждевременного старения.
Контроли
SkQ1
Крысы OXYS в возрасте 23 мес.
Опытные принимали SkQ1с 1,5 мес.
по 250 нмоль/кг с кормом.
Выявлен профилактический эффект капель SkQ1 – их
способность задерживать развитие катаракты и дистрофии
сетчатки у крыс OXYS
0.50
#
*#
*
*
*
0.25
0.00
1
1,5
2
3
5
3
Возраст животных, месяцев
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
Предварительный осмотр
0.75
Физраствор
Изменения сетчатки, баллов
1.00
Состояние сетчатки
#
Предварительный осмотр
Изменения хрусталиков, баллов
Состояние хрусталиков
1,5
250 нмоль
10 нмоль
#
OXYS
#
*#
*
*
1
3
Возраст, месяцев
2
*- достоверный эффект препарата,
# - достоверные различия по сравнению с предыдущим обследованием.
5
3
*#
На этой группе животных впервые получен лечебный
эффект SkQ1 - его способность снижать выраженность
патологических изменений сетчатки и хрусталиков
После лечения
Контроль
1.5
1.0
0.5
0.0
10,5
1
12
SkQ1
*
2
12
Возраст животных, месяцев
До лечения
После лечения
1.5
Контроль
Изменения сетчатки, баллов
До лечения
Состояние хрусталиков
Изменения хрусталиков, баллов
Состояние сетчатки
1.0
0.5
0.0
10,5
1
12
SkQ1
*
2
12
Возраст животных, месяцев
Состояние хрусталиков и сетчатки крыс OXYS до и после приема
SkQ1 (50 нмоль/кг с кормом в течение 45 дней).
Лечебный эффект приёма SkQ1 с кормом (250 нмоль/кг) и в
каплях (250нМ) сопоставим
Состояние сетчатки
Интактный контроль
Физ. р-р в каплях
*
1.2
*
*
*
0.8
Контроль
0.6
*
0.4
0.2
0.0
До лечения,
8 мес.
*
*
1,5 мес.
*
*
2,5 мес.
0.6
Продолжительность лечения
% глаз c изменениями сетчатки
Изменения сетчатки, баллов
1.4
1.0
Распределение глаз по
выраженности патологических
изменений сетчатки до и после
лечения крыс OXYS
SkQ1 с кормом
SkQ1 в каплях
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
SkQ1, капли
0
1 балл
2 балла
3 балла
1
2
3
4
До
До
После
После
лечения
лечения
5
Ретинальный пигментный эпителий контрольных крыс Wistar, OXYS и крыс
OXYS, получавших капли SkQ1 (250 nM 2,5 мес.).
Эффект SkQ1 связан с изменением
состояния митохондрий:
увеличением их количества и
размеров.
SkQ1 в 4 раз увеличил количество полноценных капилляров в хориоидее,
количество клеток пигментного эпителия, восстановил их функциональную
активность.
мембрана Бруха
Вистар,
без SkQ1
OXYS,
без SkQ1
капилляр
мембрана Бруха
капилляр
капилляр
OXYS,
SkQ1
мембрана Бруха
14
Вистар
OXYS
OXYS SkQ1
12
*#
10
*
8
6
*
*
4
#
2
0
Отсутствует
Частичная
Полная
Капилляры разной степени деградации
Количество капилляров (M±SD) с разной
степенью деградации на участке длиной
450 мкм (данные В.Б.Сапруновой).
.
Относительный уровень экспрессии
Количество капилляров на 450 мкм
Влияние капель SkQ1 (250 нМ) на состояние капилляров в хориоидее
и экспрессию гена VEGF в хориоретинальном комплексе крыс OXYS.
Контроль
Капли SkQ1
1.4
1.2
#
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Вистар
OXYS
Уровень экспрессии гена VEGF
* - достоверные межлинейные различия, # - достоверный эффект препарата
Контроль
SkQ1
0.5
SkQ1
1.0
0.0
Предварительный
осмотр в 1,5 мес.
В возрасте 3 мес.
Относительный уровень мРНК,
ед. флуоресценции
1.5
Контроль
Изменения сетчатки, баллов
Профилактический приём SkQ1 с кормом (250 нмоль/кг) в
критический период развития ВМД с 1,5 до 3 мес.
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
*
#
Вистар
OXYS
# - достоверные отличия с Вистар (p<0,016),
* - достоверное отличие с контролем (р<0,044).
В хрусталиках крыс OXYS экспрессия генов основных белков
α-кристаллинов снижена. Капли SkQ1 повысили их экспрессию.
Контроль
Капли SkQ1
Контроль
КаплиSkQ1
* p=0,0002
1,6
0,8
0,6
0,4
# p=0,004
0,2
0,0
Экспрессия гена αВ-кристаллина
Вистар
OXYS
Относительный уровень мРНК,
ед. флуоресценции
Относительный уровень экспрессии
Экспрессия гена αА-кристаллина
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
* p=0,002
# p=0,000
0,2
0,0
Вистар
OXYS
Выраженность патологических изменений хрусталиков зависит
от уровня экспрессии генов αА-( r = -0,53, p<0,012) и
(αВ кристаллинов (r=- 0,60, p<0,003).
3-е положение, выносимое на защиту:
Митохондриальный антиоксидант SkQ1 обладает
высоким профилактическим и лечебным
потенциалом в отношении катаракты и
возрастной макулодистрофии, его эффекты
связаны с нормализацией кровотока,
восстановлением пигментного эпителия и
экспрессии генов: VEGF в хориоретинальном
комплексе и α-кристаллинов в хрусталиках.
4-е положение, выносимое на защиту:
Использование линии преждевременно
стареющих крыс OXYS позволяет получать
объективную оценку эффективности новых
способов лечения и профилактики катаракты и
возрастной макулодистрофии.
Выводы:
1. У крыс OXYS параллельно развиваются катаракта и хориоретинальная дистрофия,
которые по клиническим проявлениям биомикроскопической и офтальмоскопической
картины соответствуют изменениям хрусталика и сетчатки у пациентов с сенильной
катарактой и возрастной макулярной дистрофией.
2. Установлены критические периоды развития катаракты и возрастной макулярной
дистрофии у крыс OXYS: первые признаки этих заболеваний зарегистрированы в 5-6
недель, активно прогрессирует с возраста 12 месяцев и достигают выраженных
стадий, предполагающих потерю или существенное ухудшение остроты зрения к
14–18 месяцам.
3. У крыс OXYS развитие хориоретинальной дистрофии связано с нарушениями
кровообращения и транскапиллярного обмена в хориокапиллярах и вызванной этим
хронической ишемией, ведущей к структурно-функциональным изменениям
пигментного эпителия, дистрофическим изменениям мембраны Бруха и, как
следствие, гибели клеток фоторецепторного слоя.
4. Развитие дистрофии сетчатки у крыс OXYS связано с изменениями экспрессии гена
VEGF в клетках пигментного эпителия:
а) первичные признаки заболевания формируются на фоне его двукратного снижения по
сравнению с контролем, когда между тяжестью заболевания и уровнем
экспрессией гена VEGF формируется отрицательная связь;
б) в период формирования выраженных патологических изменений средние значения
уровня экспрессии гена VEGF не отличается от контрольных, но между ним и
выраженностью патологических изменений связь становится положительной.
Выводы:
5. Развитие катаракты и хориоретинальной дистрофии у крыс OXYS с различной
эффективностью предупреждают стандартные препараты с антиоксидантной
активностью, что свидетельствует в пользу адекватности модели, а также о связи
патогенеза катаракты и ХРД у крыс OXYS с окислительным стрессом.
6. Митохондриально направленный антиоксидант SkQ1 при его приеме с кормом и в
виде капель предупреждает развитие катаракты и дистрофии сетчатки и снижает
тяжесть течения этих заболеваний у крыс OXYS. Лечебный эффект SkQ1 наиболее
существенно выражен при начальных, не имеющих грубых органических изменений
стадиях заболевания.
7. Терапевтический эффект митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1 при
ХРД у крыс OXYS связан с нормализацией уровня экспрессии гена VEGF,
восстановлением микроциркуляции на фоне снижения признаков склероза и
облитерации сосудов, которые обеспечивают трофику и в результате – сохранность
фоторецепторов сетчатки.
8. Терапевтический эффект митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1 при
лечении катаракты связан с увеличением уровня экспрессии генов α-кристаллинов.
9. Линия преждевременно стареющих крыс OXYS – адекватная модель для исследования
этиологии и патогенеза катаракты и ВМД, для оценки эффективности новых
способов лечения и профилактики этих заболеваний.
Благодарю за внимание !