ЛЕКЦИЯ 3 ГЕНОМ МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ Организация

ЛЕКЦИЯ 3
ГЕНОМ МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ
1. Организация молекул митохондриальной ДНК растений
разных систематических групп
2.Изменчивость структуры молекул митохондриальной ДНК
3.Митохондриальные плазмиды
4.Гены митохондрий
5.Интроны митохондриальных генов. Гены интронов
6.Ядерные и пластидные ДНК-последовательности в
митохондриальном геноме растений
7.Репликация митохондриального генома растений
Обнаружение
митохондриальной
ДНК в клетках
• Электронно-микроскопический метод:
нити, дающие окрашивание с ДНК-красителями
которые разрушались нуклеазами, увидеть в
митохондриях удалось в начале 60-х годов
Оказалось, что мтДНК основных систематических групп
эукариот:
простейших,
растений,
грибов
животных
значительно отличаются друг от друга по структуре
Параметры мтДНК растений
• Мт ДНК высших растений – менее 1% от
всей ДНК клетки, очень редко достигает 1015% (гипокотиль дыни).
• Плавучая плотность ДНК мт растений
колеблется незначительно: 1,705-1,707, что
соответствует 48% ГЦ-пар.
• Размеры мт геномов колеблются очень
сильно: 180-2500 тпн.
В семействе тыквенных (Сucurbitaceae)
330 тпн
арбуз
2500 тпн
дыня
Виды молекул митохондриальной ДНК:
•
•
•
•
•
большие «геномные» кольца (крайне
редко)
система меньших колец разных длин
линейные молекулы
катенированные кольца
розеткообразные молекулы: до 50
петель с одним ДНК центром (подобие
нуклеоидов пластид)
10 сигма-подобных
структур мтДНК
Chenopodium album
Стрелки
указывают места
соединения
кольца и хвоста
(a) кольцо 3 kb, хвост 28 kb; (b) кольцо 4.4 kb, хвост 9 kb; (c) кольцо 6.5 kb, хвост 0.2 kb;
(d) кольцо 7.4 kb, хвост 6.2 kb; (e) кольцо 8.9 kb, хвост 0.5 kb; (f) кольцо 11.6 kb, хвост 7.9
kb; (g) кольцо 20 kb, хвост 65.5 kb; (h) кольцо 51 kb, хвост 26.9 kb; (i) кольцо 61.1 kb, хвост
6.1 kb; (j) кольцо 128 kb, хвост 36.5 kb.
Сигма-подобные
структуры мтДНК
Chenopodium album
х10
Размерные классы,
обнаруженные при
анализе 8,000 молекул
мтДНК Chenopodium album
Проанализирована 291
сигма-подобная молекула
Большие рекомбинационные повторы
- особенность митохондриальной ДНК растений
Модель структуры митохондриального генома
Brassica campestris
218 kb
полный геном –
большое кольцо
135 kb
83 kb
два малых кольца –
результат рекомбинации
по двум повторам
основного кольца
Recombination in mtDNA of Arabidopsis thaliana.
The mtDNA contains a direct repeat (I) and an inverse repeat (II).
Рекомбинационные повторы
обнаружены почти во всех изученных
митохондриальных геномах
У пшеницы их 10 (!),
у кукурузы - 5 прямых и
1 инвертированный
При таком количестве повторов
число субгеномных колец может быть огромным.
Рекомбинация молекул
мтДНК пшеницы
[A]: образование изомера –
рекомбинация по
инвертированному повтору
( IR ) copy-1 и соpy -2.
[B] и [C]: образование двух
комплементарных
субгеномных молекул при
рекомбинации по прямому
повтору ( DR ) Copy-2 и -3,
and и две копии R5
[D]: образование
аберрантной молекулы MC,
имеющей лишнюю
копию кластера Copy-3/2
и R5 повтора при
рекомбинации по повтору
R6
B
C
A
D
Не все повторяющиеся
последовательности способны
рекомбинировать
??? Чем отличаются
рекомбинирующие повторы от
нерекомбинирующих, неясно
Собственных ферментов-рекомбиназ
эти последовательности не кодируют
Размеры больших повторов
Для большинства повторов:
– от 1000 пн до 10000пн.
Наименьший из известных больших повторов - 266 пн.
Необычно большие повторы:
– у ЦМС- формы петунии
у F- ревертанта ЦМС-Т кукурузы
пн.
-
252 000 пн
165 000
Малые повторы в митохондриальных ДНК
растений
•Размер – от 6-7 до нескольких сот нуклеотидов
??? Происхождение малых повторов неясно
Малые повторы участвуют в редких рекомбинациях,
что иногда приводит к образованию больших повторов
Показано, что при изменении внешних условий и при культивировании
в пробирке, митохондрии могут дестабилизироваться, часть генома при
этом утрачивается или преобразуется, что может иметь адаптационный
смысл
Модель образования большого повтора
с помощью малых повторов в мтДНК растений
А
R1
I
Исходная
основная
кольцевая
молекула
R2
R1
R2
В
R2
R1
R1
R2
R1, R2 – малые повторы
III
II
R2
R1
R1
R1
С
D
R2
R2
R2
большие
повторы
Новая молекула с
большим рекомб.
повтором и
большой делецией
Модель рекомбинации мтДНК
табака
Две субгеномные молекулы, C и D,
образуются в результате
рекомбинации по повторам
(в черных участках P кольца).
SacI фрагменты:
P:
19- и 5.4-kb
rec1
C и D: 11.8- и 12.6-kb.
Светло-серые фрагменты –
3 повторяющиеся
последовательности
CMSII мт геном содержит только C молекулы
Митохондриальные плазмиды –
малые линейные и кольцевые ДНК- и РНКмолекулы, не гомологичные геномной мтДНК.
Размер мт плазмид колеблется от 1000 до 30000пн.
.
Митохондриальная плазмида mp1 of Chenopodium album
– разные структурные модификации
Электронные фото различных молекул митохондриальных
плазмид ( mp1 ) Chenopodium album
(a - g) Типичные сигма-подобные структуры mp1.
(a) Двунитчатый кольцевой мономер (1.3 kb) с однонитевым хвостом
(170 пн); (b) Двунитчатый кольцевой мономер с однонитевым хвостом
400 п.о.; (c - g) двунитчатые кольца 1.3 kb с двунитевым хвостом
длиной 0.1 kb (c), 0.6 kb (d), 0.9 kb (e), 1.2 kb (f), and 3.4 kb (g).
Плазмиды в митохондриях
найдены у многих культурных растений –
кукурузы, сорго, бобов и др.
плазмиды, скорее всего, произошли
из других клеточных геномов и, возможно,
из других организмов
???
Три основные категории плазмид
в митохондриях растений :
кольцевые ДНК-плазмиды
свекла
фасоль
сорго
ДНК
рис
кукуруза
подсолнечник
линейные ДНК- плазмиды,
РНК-плазмиды.
Плазмид у одного вида может быть
несколько типов – у риса их четыре
Плазмиды могут утрачиваться без каких-то
видимых последствий для растений
Кольцевые плазмидоподобные молекулы в
митохондриальном геноме риса
Линейные ДНК-плазмиды
– уникальная группа репликонов
Имеют высокий процентАТ-пар
и терминальные инвертированные повторы
У кукурузы – два типа линейных плазмид (S, R)
Линейные плазмиды способны интегрироваться
митохондриальный геном
в
! Некоторые последовательности линейных плазмид
гомологичны вирусным РНК-полимеразам.
РНК-плазмиды - наименее изученная группа
Обнаружены у риса, кукурузы, Brassica, сахарной свеклы.
Самые крупные
(18 тпн)
Четыре типа РНК-плазмид найдено у кукурузы
– два типа двунитчатых и два типа однонитчатых.
Репликация РНК-плазмид не подавлялась
актиномицином Д, что указывает на участие в процессе
РНК-полимеразы вирусного типа
??? Происхождение РНК-плазмид неясно.
Возможно, они являются реликтами прошлых
инфекций, в результате чего сохранился геном патогена
Размеры секвенированных
митохондриальных геномов растений
• Marchantia polymorpha
•
•
•
•
•
Beta vulgaris
Arabidopsis thaliana
Oryza sativa
Brassica napus
Zea mays
186609 п.н.
368801 «»
366924 «»
490520 «»
221 853 «»
569630 «»
66 генов
(94 ORF)
59 генов
57 генов
54 гена
58 генов
(121 ORF)
• Triticum aestivum
• Nicotiana tabacum
452528 «»
430597 «»
55 генов
60 генов
Самые большие ДНК молекулы - не самые
генетически насыщенные
Митохондриальные геномы низших растений
имеют меньшие размеры, чем у покрытосеменных
105340 п.н
67737 п.н.
42424 п.н
мох Physcomitrella patens
харовые водоросли Chara vulgaris
пресноводные жгутиковые Mesostigma viride
Streptophyta
Chlorophyta
Все зеленые растения принадлежат к одной из
двух ветвей: Streptophyta (наземные растения и
харовые водоросли) и Chlorophyta (зеленые
водоросли)
С выходом растений на сушу произошло увеличение
размера митохондриальных геномов, в основном за
счет межгенных участков
ОРС
>100 п.н.
рРНК
белоккодирующие
гены
16.1%
тРНК
10.2%
0.4%
1.3%
не
установлена
функция
49%
рекомбинационные
повторы
2.9%
ядерно-мт
гомологичн
последоват.
2.2%
4%
ядерная
ДНК
Интроны
1.2%
пластидная
ДНК
3.9%
другие
повторы
9%
Митохондриальный геном Arabidopsis
Неустановленные последовательности не имеют явного сходства
ни с одной
идентифицированной последовательностью в базах
данных. Интроны - исключительно группы II.
Гены митохондрий составляют меньшую часть мтДНК
молекулы, они консервативны между родственными
Митохондриальная
ДНК рапса
Большая часть генома
изменчива, не
кодирует белков и
часто уникальна для
определенного вида
растений
К началу 2009 года в базе GOBASE
http://megasun.bch.umontreal.ca/ogmp/projects/other/mtcomp.html
представлены полные сиквенсы 13-ти
митохондриальных геномов высших растений,
относящихся к 8 видам
Всего полных сиквенсов органельных ДНК на
начало 2009 года - 1898
Общее число видов, для которых эти сиквенсы
получены - 1283
Классификация последовательностей мтДНК пшеницы
Категория
Кол-во
Общий
размер
(bp)
Пропорция(%)
Полный геном
—
452 528
100.0
Гены, включая интроны
76
71 848
15.9
ORFs (более 300 bp), включая входящие
в повторы
179
75 465
16.7
Повторяющиеся пос-ти размером более
100 bp
26
68 960
15.2
Хлоропластные последовательности
47
13 455
3.0
Ретро элементы
5
805
0.2
Уникальные (более 100 bp), которых нет у
риса и кукурузы
277
257 762
57.0
Практически все уникальные последовательности мтДНК
пшеницы относятся к некодирующим областям
Рибосомы митохондрий крупнее рибосом пластид:
78S (60S + 44S)
70S (50S + 30S)
Рибосомальные РНК гены: 26S, 18S и 5S, у кукурузы еще
4,5S. 18-5S сцеплены в один кластер и удалены от 26S.
Ген 5s у грибов и животных в митохондриальном геноме
отсутствует
Набор тРНК, кодируемых митохондриальным геномом,
значительно различается у разных видов растений
Источник
Marchantia polymorpha
Arabidopsis
thaliana
29
12
25
Хлоропласт
0
6
Ядро
2
13
Митохондрии
Solanum
tuberosum
Vicia
faba
Helianthus
annuus
Petunia
hybrida
Triticum
aestivum
Zea
mays
н.о.
11
12
9
10
5
н.о.
6
5
6
6
11
>8
н.о.
н.о.
>3
н.о.
Около трети митохондриально кодируемых тРНК генов в
действительности произошли из хлоропластных генов,
интегрированных в митохондриальный геном. н.о.= не определялось.
???
Каков механизм импорта тРНК молекул через мембрану?
Почему одни молекулы проходят, другие нет?
Кто выполняет роль переносчиков?
Трансляционный аппарат
рибосомальная РНК
Гены
rrn5, rrn18, rrn26
рибосомальные белки
малая субъединица
rps1, rps3, rps4, rps7, rps8,
rps12, rps13, rps14, rps19
большая субъединица
rpl2, rpl5, rpl6, rp116
транспортные РНК
не менее 16
Субъединицы комплекса
дыхательной цепи
NADH-дегидрогеназа (компл. I)
cукцинатдегидрогеназа (компл. II)
цитохром b
(компл. III)
цитохром c оксидаза (компл. IV)
nad1, nad2, nad3, nad4,
nad4l, nad5, nad6, nad7,
nad9
sdh2b, sdh3c, sdh4
cytb
cox1, cox2, cox3
ATФ синтаза
atp1, atp6, atp 8, atp9
биогенез цитохрома с
ccb206,ccb256 , ссb453, ccb
382, ccb203
постоянные по составу
открытые рамки считывания
Генов рибосомальных
белков в
митохондриальной ДНК
намного меньше, чем в
хлоропластной
В мтДНК маршанции их 16,
у арабидопсиса – 8.
Гены субъединиц
комплекса дыхат. цепи:
и 25 у маршанции, 18 у
арабидопсиса
orf25, mat-rd
Выделенные жирным шрифтом гены найдены и у маршанции, и у арабидопсиса
В митохондриальном геноме арабидопсиса обнаружено
более 150 ORF, состоящих из 100 и более пар нуклеотидов
Часть из них – «обломки» генов,
другая часть – гены, функция которых пока не установлена
Псевдогены
2 типа:
1 Дегенерировавшие копии генов,
не имеющие интактной копии в мт
геноме – например ген ФЕН тРНК.
2 Дегенерировавшие копии генов,
имеющие полноценные копии в мт
геноме (химерные гены при ЦМС)
Интроны митохондриальных генов растений
К 2000 году в мтДНК разных растений
найдено 100 интронов
Интроны составляют от 9% до 20% геномной
последовательности мтДНК
В мт ДНК арабидопсиса их 23
Длина их колеблется от 485 до 4000 пн
Самый маленький интрон в
митохондриальной ДНК – 389 пн.
Вторичная структура интрона coxII у пшеницы
Интроны группы II осуществляют
самосплайсинг (рибозимы)
они вероятно могут выполнять роль
мобильных генетических элементов
Новые интроны появляются скорее всего дупликацией
существующих
и их внедрением в новые участки генома
Поэтому столь велико сходство между интронами в разных генах
Некоторым интронам более 400млн лет!
Они сформировались еще до разделения растений на высшие и низшие
25% всех интронов содержит ОRF ( ген mat-r)
Он отличается неканоническим инициирующим кодоном – GGG.
Функция матураз - вырезание интрона из пре-мРНК.
Ядерные и пластидные последовательности в
митохондриальном геноме
У арабидопсиса 15 тпн (5% от всего генома мт) - ядерные
Большая часть этих последовательностей – мобильные
генетические элементы, в основном ретротранспозоны.
Также имеются последовательности, сходные с транспозонами
бактерий и животных
(межвидовой перенос генетических элементов??? ).
Мало данных, так нет полных сиквенсов ядерных геномов растений.
Арабидопсис: 1,2% мтДНК – пластидные последовательности
Пшеница
– 3% мтДНК -пластидные последовательности
У кукурузы в мтДНК интегрирован фрагмент пластидной ДНК
размером 12тпн. В митохондриях растений функционируют
перенесенные из пластид гены тРНК
Вирусные последовательности в
митохондриальном геноме
арабидопсис – две ORF весьма похожи
на РНКзависимые
РНК-полимеразы,
типичные
для
РНК- вирусов.
Особенно они похожи на РНК полимеразы грибов,
патогенных для растений.
По-видимому, именно таков был путь переноса:
вирусы
грибы
растения –хозяева.
Механизм интеграции: ???
Cкорее всего, через обратную транскрипцию образуется
ДНК-копия
Итак, митохондриальный геном растений:
ОРС
>100 п.н.
• содержит 50-60 генов
• крайне изменчив по структуре,
9%
• белок-кодирующие гены и РНК гены составляют менее 20%
• имеет много не идентифицированных ORF
•
функция половины мтДНК молекулы не выяснена
• необычно большие молекулы мтДНК за счет интронов,
повторяющихся последовательностей, ядерных,
пластидных и вирусных фрагментов
• некодирующие участки достигают длины 57 тпн.
• гены, обеспечивающие транскрипцию, процессинг и
трансляцию мт генома, локализованы в ядре