Взаимодействие церулоплазмина, лактоферрина и миелопероксидазы

Обзор функций и исследование
защитных факторов грудного молока у
женщин Санкт-Петербурга
Соколов Алексей Викторович
канд. биол. наук, стар. науч. сотр.
План лекции
Отдел молекулярной генетики
1. Молозиво и молоко - обзор состава и секреции,
НИИ Экспериментальной Медицины
2. Функции белков грудного молока,
Северо-Западного Отделения РАМН
3. Защитные факторы грудного молока: лизоцим, лактоферрин,
лактоальбумин, лактопероксидаза, липаза, иммуноглобулины, казеины.
Доклад на конференции консультантов
4. Исследование защитных факторов грудного молока у женщин Санктпо грудному вскармливанию
Петербурга.
22 ноября 2009 года
Гистология и цитология молочной железы
Особенности секреции молока
Гемато-молочный
барьер:
- непроницаем для
сахарозы и инсулина
- избирательно
проницаем для
лейкоцитов, sIgA,
альбумина
Клеточный состав грудного молока
Молозиво содержит 0,1-10 млн. клеток в мл
из низ около 50% - макрофагов, 40-45% - нейтрофильных лейкоцитов, 5-10%
- лимфоцитов
Зрелое молоко – 10 000-200 000 клеток в мл
из них около 85% - макрофагов, 10% - лифоцитов, 5% - нейтрофильных
лейкоцитов
Клетки молока способны закрепится на эпителии кишечника, находится
там до 60 ч и проникать в кровеносную систему ребенка
Химический (неклеточный) состав грудного молока
Компонент
Содержание, мг/мл
Липиды (жиры)
42
Полиненасыщенные
жирные кислоты
6
Общий белок
11
Углеводы (лактоза)
70
Нуклеиновые кислоты
0,1
Минеральные компоненты 0,5
(K, Ca, Na, P)
Основные белки молозива
и зрелого молока
Молозиво (=colostrum) до 5-7 дня
Минорные компоненты: гормоны
(кортизол, инсулин, тироксин) и
факторы роста (эпидермальный,
трансформирующий и фактор
роста нервной ткани)
Концентрация иммуноглобулинов (мг/мл) в
Среда
IgG
Молозиво
slgA
IgM
IgE
IgD
0.05-0.07
(0.13-0.3) х 10~6
(2.2-410) х 10~7
6.4-9.0
Молоко
0.03-0.05
Плазма крови
4.1-10.5
* IgA.
молозиве, молоке и плазме крови
0.5-1.8
1.0-1.8*
0.4-1.1
(0.4-1.0) х 10~6
(7.2-410) х 10~6
Защитные функции компонентов молока
Белок
M, kDa
Конц., мг%
Функция
Лактоферрин
78
100-700
Бактерицидная, антивирусная,
бактериостатическая, антиадгезивная,
фактор роста, иммуномодулятор
Лизоцим
14
5-25
Гидролиз связей 1-4-N-ацетилглюкозамина и
мураминовой кислоты стенки грам+
бактерий
k-Казеин
30-40
<100
Ингибирует адгезию H. pylori, S. pneumoniae
и H. influenzae
Липаза (зависимая
от желчных
кислот)
100-125
10
Гидролизует ТГ молока, ЖК в кишечнике
младенца обладают
противопаразитическим, антивирусным и
бактерицидным действием
Иммуноглобулины
150-900
до 1000
Антиген-специфическая защита
Лактопероксидаза
80-90
следы
Образование безопасного для организма
бактерицидного агента: OSCN-
a-лактальбумин
14
до 1000
Индукция избирательного апоптоза раковых
клеток в олигомерной форме
Лизоцим (муромидаза)
14 кДа
открыт А. Флемингом 1922
a-Лактальбумин и HAMLET
HAMLET = Human Alfa-lactalbumin
Made LEthal to Tumor cells
Лактоферрин
Высокоаффинные
N-доля: ДНКаза,
железо-связывающие
РНКаза
сайты
Цистатиновый пептид
С-доля: АТФаза
Сайт связывания
Активный полианионов
центр сериновой протеиназы
А. Пространственная структура молекулы ЛФ, насыщенного железом (обозначены
слева N-доля: N1-домен темно-синий, N2-домен малахитовый, а справа С-доля: С1домен темно-синий, С2-домен малахитовый, верхняя фиолетовая спираль соединяет
N- и C-доли, а нижняя С-концевая спираль участвует в нековалентной связи долей,
красный – ион железа; зеленый и оранжевый – положение карбонат-аниона);
Б. Строение Fe3+-связывающего сайта в N-доле ЛФ человека
Защитные свойства лактоферрина
и лактоферрицина
Полифункциональность лактоферрина
Иммуномодулятор
Комплексы с полианионами
(ДНК, ЛПС, гепарин)
Противовоспалительная
Антибактериальная
Связывание металлов
переходной группы
Транскрипционный
фактор
Противовирусная
ЛАКТОФЕРРИН
Противогрибковая
Антипаразитическая
Ростовой фактор
Апоптоз
Ингибитор протеиназ
Прокоагулянт
Амидолиаза
Протеиназа
Фосфатаза
Рибонуклеаза
Дезоксирибонуклеаза
Антипаразитический эффект лактоферрина, IgA и лизоцима
Лактопероксидаза: каталитический цикл
Лактопероксидаза
Казеины молока
Муцины
Муцин-1 жировой глобулы
Клетка молочной железы (а) и жировая глобула (b)
1 – сильногликозилированный внеклеточный регион, 2 – трансмембранный сегмент,
3 – липидный бислой, 4 – цитоплазматический регион, 5 – пространство между
липидным бислоем и жировой глобулой, 6 – ксантин-оксидаза,
7 – триглицериды жировой глобулы
Лактадгезин и бутирофилин жировой глобулы
- Лактадгезин M ~ 46 kDa
- RGD – мотив для адгезии с
интегринами
- защита от инфекции ротавирусами
в комплексе с муцином-1 и
бутирофилином
Исследование защитных факторов грудного
молока у женщин Санкт-Петербурга
Результаты собственных исследований:
1. Исследование комплекса лактоферринцерулоплазмин и его защитных свойств
2. Получение трансгенных животных
секретирующих лактоферрин человека в
молоко
3. Изучение содержание лактоферрина и его
насыщенности железом у женщин СанктПетербурга
Серия работ по изучению взаимодействия
лактоферрина и церулоплазмина
1. Pulina M.O., Zakharova E.T., Sokolov A.V., Solovyov K.V., Kokryakov V.N.,
Vasilyev V.B. Studies of the ceruloplasmin-lactoferrin complex. Biochem. Cell Biol.,
2002, V. 80 (1), P. 35-39.
2. Соколов А.В., Пулина М.О., Захарова Е.Т., Шавловский М.М., Васильев В.Б.
Влияние лактоферрина на ферроксидазную активность церулоплазмина.
Биохимия, 2005, Т. 70 (9), С. 1231-1236.
3. Соколов А.В., Пулина, М.О., Захарова, Е.Т., Сусорова, А.С., Рунова, О.Л.,
Колодкин, Н.И., Васильев, В.Б. Обнаружение и выделение комплекса
церулоплазмин-лактоферрин из грудного молока. Биохимия, 2006, Т. 71 (2), С.
208-215.
4. Sabatucci A., Vachette P., Vasilyev V.B., Beltramini M., Sokolov A., Pulina M.,
Salvato B., Angelucci C.B., Maccarrone M., Cozzani I., Dainese E. Structural
characterization of the ceruloplasmin: lactoferrin complex in solution. J. Mol. Biol.,
2007, 371 (4), P. 1038-1046.
5. Pulina M.O., Zakharova E.T., Sokolov A.V., Vasilyev V.B. Lactoferrinceruloplasmin complex in breast milk and tears. Тезисы. VIIIth International
Conference on Lactoferrin “Structure, Function & Applications” October 21-25th
2007, Nice, France, P. 10.
6. Sokolov A.V., Ageeva K.V., Pulina M.O., Zakharova E.T., Vasilyev V.B. Effect of
lactoferrin on oxidative features of ceruloplasmin. Biometals, 2009, V. 22 (3), P.
521-529.
• Получение трансгенных животных
секретирующих лактоферрин человека
Латоферрин человека
Лактоферрин мыши
Смесь 1 и 2
Грудное молокл
Молоко мыши
Молоко трансгенных мышей
Очищенный рекомбинантный
лактоферрин
Лактоферрин в нашей лаборатории
Исследование лактоферрина грудного молока
у женщин Санкт-Петербурга
Дизайн-исследования:
1. Накоплена база данных о содержании
лактоферрина в молоке 15 женщин на
протяжении 1 года - 2 лет лактации
(ежедневные пробы молока – более 7000
точек)
2. Проводится скрининг содержания
лактоферрина и его насыщенности железом
на добровольной основе
Данные о доноре:
1. Возраст
2. Срок лактации
3. Частота
кормления
4. Комментарии о
состоянии
здоровья ребенка
Исследование лактоферрина грудного молока
у женщин Санкт-Петербурга
Образец грудного молока – 100 мл:
1. Иммунологическое определение
содержания лактоферрина –
радиальная диффузия по Манчини,
иммуноэлектрофорез
2. Проба на фальсификацию молока –
казеиновый тест (4 случая из 292)
3. Препаративное выделение
лактоферрина и оценка его
насыщения железом
Предварительные результаты
1.
За 9 месяцев проанализировано 296 образцов
2. Сроки лактации от 1 дня до 4 лет
3. У 12% кормящих матерей обнаружено пониженное
содержание ЛФ (среди них у 31 из 35 вскармливаемых
отмечены частые инфекции)
4. Практически не отмечено жалоб на здоровье ребенка от
доноров с нормальным содержанием ЛФ (2 из 257)
5. В среднем содержание ЛФ в 1,5-2 раза выше чем за рубежом
6. Рекордные показатели для ряда образцов
(на 4 году кормления содержание ЛФ 4,5 мг/мл и его насыщение
9% в пределах нормы)