Лекции «Cовременные методы биотехнологии» 1.

Лекции «Cовременные методы биотехнологии»
1. Введение.
Анализ современного состояния биотехнологии. Биотехнология
является одним из научно-практических приоритетов XXI века. На основе
современных достижений в области биологических и технических наук,
генетической и клеточной инженерии можно использовать потенциальные
возможности целенаправленно созданных живых систем для повышения
жизненного уровня людей. Биотехнололгия аккумулирует в себе достижения
самых наукоемких отраслей, тем самым, стимулируя их развитие,
распространяет достигнутый результат на все остальные отрасли, позволяя
им динамично подняться на совершенно иной качественный уровень. С
помощью биотехнологической продукции решаются производственнотехнологические, экологические и социально-экономические проблемы, как
на ближайшую перспективу, так и в стратегическом плане.
Анализ состояния мирового рынка биотехнологической продукции и
тенденции развития. Во всех ведущих странах мира разработаны и действуют
национальные и международные программы по биотехнологии,
финансируемые государственным и частным капиталом.
Основные направления биотехнологии. Красная биотехнология –
применение биотехнологии в медицине. Разработка методов диагностики,
средств лечения и профилактики различных заболеваний. Зеленая
биотехнология – процессы биотехнологии, применяемые в сельском
хозяйстве. Получение животных, растений и микроорганизмов с заданными
свойствами. Использование биопестицидов, биогербицидов и биоудобрений.
Белая биотехнология промышленная биотехнология. Создание
микроорганизмов, продуцирующих искомые вещества, использование
ферментов в качестве промышленных катализаторов или для деградации
вредных отходов, загрязняющих окружающую среду. Синяя биотехнология –
процессы биотехнологии, применяемых в аквакультуре.
Основные предпосылки развития биотехнологии в Казахстане. Оценка
существующего спроса и предложения на биотехническую продукцию в
Казахстане. Актуальность развития биотехнологии в Казахстане.
Ретроспективный исторический обзор развития системы организации науки в
Казахстане
2. Методы исследования мембранных структур и применение их в
биотехнологии
Биологические мембраны – функции, структура и состав. Барьерная
функция обеспечивает регулируемый, избирательный, пассивный и
активный обмен веществ с окружающей средой. Избирательная
проницаемость. Транспортная функция - через мембрану происходит
транспорт веществ в клетку и из клетки, поддержание в клетке оптимального
pH и концентрации ионов, которые нужны для работы клеточных ферментов.
Пассивный транспорте. Активный транспорт. Матричная функция обеспечивает определенное взаиморасположение и ориентацию мембранных
белков, их оптимальное взаимодействие. Механическая функция обеспечивает автономность клетки, ее внутриклеточных структур, также
соединение с другими клетками (в тканях). Рецепторная функция - некоторые
белки, находящиеся в мембране, являются рецепторами (молекулами, при
помощи которых клетка воспринимает те или иные сигналы).
Ферментативная функция - мембранные белки нередко являются
ферментами. Мембранные органеллы. Избирательная проницаемость.
Методы выделения мембран. Методы разделения субклеточных
элементов. Электрофорез для получения субклеточных мембран и органел
высокой чистоты. Идентификация и оценка чистоты субклеточных фракций.
Методы выделения различных органел и мембранных систем.
Иммунологические методы исследования мембран. Разделение и анализ
липидных компонентов мембран. Солюбилизация и реконструкция
мембранных белков. Выделение и модификация мембранных белков и
липидов.
Оптичиская
спектроскопия
биологических
мембран.
Биофизические подходы к изучению биологических мембран. Фермены –
маркеры клеточных фракций. Использования знаний о структуре и функции
биологических мембран в биотехнологиях.
3. Методы исследований биологических полимеров
Биополимеры естественные и искусственные. Биологические
полимеры – белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды. Несколько
направления в технологии биополимеров:
- использование существующих организмов как источник биополимеров;
- использование продуктов жизнедеятельности существующих и новых
организмов для производства мономеров – сырья для производства
биополимеров;
- создание новых организмов, способных производить новые биополимеры с
заданными свойствами.
Органические пластмассы находят всё более широкое применение в
различных областях. Предприятия химической промышленности и заводы по
производству пластмасс вложили миллиарды евро в новые технологии и
ожидают, что новые органические пластмассы будут уверенно
конкурировать
с
традиционными
синтетическими
материалами,
получаемыми из нефти.
Из биополимеров изготавливаются фасонные детали, полуфабрикаты
или пленки. Свойства биополимеров позволяют использовать их, помимо
прочего, для производства упаковок, тары для пищевой промышленности,
товаров для садоводства и ландшафтного строительства, медицинских
материалов и прочих товаров недлительного использования. Биополимеры,
улучшенные с помощью волокон и гидроокисей металлов, обладают
хорошей способностью к формообразованию и устойчивы с воспламенению.
На основе целлюлозы (CA) изготавливаются ручки зонтов, клавиатуры, рули
для автомобилей, игрушки, шариковые ручки и т. д.
Из продуктов на основе полимолочных кислот (ПМК)
изготавливаются, например, пленки и фасонные детали, коробки, стаканы,
бутылки и другие товары широкого потребления. Кроме того, этот материал
используется
в
строительной,
оптической
и
автомобильной
промышленности, а также для изготовления специальных изделий в области
медицины и фармацевтики. Продукты из полигидроксидных масляных
кислот (PHB) или соединения PHB имеют широкий диапазон применения —
от клеев до твердых резин. Помимо перечисленных основных групп, имеется
ряд исходных смесей для другого воспроизводимого сырья, включая лигнин,
хитин, казеин, желатин и т. д.
4. Методы анализа и синтеза нуклеиновых кислот
Разработка методов амплификации нуклеиновых кислот на
биологических микрочипах: Мультиплексная ПЦР. Аллель-специфичная
ПЦР. Количественная ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
Оптимизация метода гибридизации нуклеиновых кислот на
биологических микрочипах с целью повышения специфичности и
чувствительности, а также уменьшения времени проведения анализа
Разработка универсальной процедуры выделения нуклеиновых кислот из
различных биологических образцов
Молекулярный анализ нуклеиновых кислот позволяет обнаруживать
специфические нарушения в генах, оценивать их влияние на экспрессию
генов и, в конечном итоге, на физиологию клетки. Аномальную (измененную
или экзогенную) нуклеотидную последовательность выявляют с помощью
блот-гибридизации, затем выделяют ее методами молекулярного
клонирования и получают в препаративных количествах. Далее такую
последовательность можно использовать для изучения белок-кодирующих
участков и регуляторных областей. Изменения в регуляторных областях
могут приводить к изменению уровня экспрессии соответствующих генов, а
в кодирующих последовательностях — к изменению биологических свойств
кодируемых ими белков. Кроме того, клонированные последовательности
могут использоваться как матрицы для синтеза белков в прокариотических и
эукариотических системах экспрессии.
Синтез олигонуклеотидов - это химический синтез относительно
коротких фрагментов нуклеиновых кислот с заданной химической
структурой (последовательностью). Метод применяется в современной
лабораторной практике для получения олигонуклеотидов нужной
последовательности быстрым и недорогим способом.
Наиболее распространённый способ синтеза олигонуклеотидов основан
на использовании амидофосфитов - строительных блоков, которые являются
реакционноспособными производными дезоксирибонуклеозидов (dA, dC, dG,
T) или рибонуклеозидов (A, C, G, U) и позволяют синтезировать короткие
фрагменты ДНК и РНК соответственно . Применяются также и другие
амидофосфиты, позволяющие вводить в цепь продукта модифицированные
нуклеозиды, различные метки и функциональные группы. В ходе синтеза эти
реагенты поочерёдно, в порядке, задаваемом последовательностью целевого
продукта, присоединяют к растущей на твердофазном носителе цепи . Этот
процесс был полностью автоматизирован в конце 1970-х годов и в настоящее
время
выполняется
в
специальных
синтезаторах,
управляемых
компьютерами.
5. Методы генетической инженерии, используемые в биотехнологии
Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:
специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами,
ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами; быстрое
секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет
определить границы гена и аминокислотную последовательность,
кодируемую им; конструирование рекомбинантной ДНК; гибридизация
нуклеиновых
кислот,
позволяющая
выявлять
специфические
последовательности РНК или ДНК с большей точностью и
чувствительностью,
основанную
на
их
способности
связывать
комплементарные последовательности нуклеиновых кислот; клонирование
ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или
введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой
трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий; введение
рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
Прямое введение гена в клетку осуществляют несколькими способами:
Трансфекция. Микроинъекция. Электропорация. Метод «мини-клеток».
Упаковка в липосомы. Электронная пушка.
Вклад генетической инженерии в микробную биотехнологию.
Генетическая инженерия видоизменила структуру и содержание современной
промышленной микробиологии. Во-первых, существенно повысилась
продуктивность
промышленных
микроорганизмов
продуцентов
классических продуктов путем введения дополнительных генов, увеличения
их количества или активности. Во-вторых, вводя в микробную клетку новые
гены, удалось изменить питательные потребности микроорганизма. Далее
микроорганизмы "научили" синтезировать несвойственные им вещества и
таким образом увеличили разнообразие биотехнологической продукции.
Некоторые белки человека, клонированные в микробной клетке, в том числе
инсулин, интерфероны, интерлейкины, находят в настоящее время
терапевтическое применение.
6. Иммунобиотехнология.
методы
Иммунологические
биотехнологические
Одним из важнейших направлений иммунологии является
иммунобиотехнология, изучающая способы и методы конструирования,
биотехнологию
получения,
стандартизацию
и
оценку
свойств
иммунобиологических препаратов. Эти препараты играют существенную
роль в снижении инфекционной заболеваемости и находят все более широкое
применение в неинфекционной патологии - в онкологии, иммунопатологии,
трансплантологии, в решении проблем репродукции и др.
Иммунобиотехнология
объединяет
производства
вакцин,
иммуноглобулинов крови, иммуномодуляторов, иммуно-медиаторов,
моноклональных
антител
и
некоторых
других.
На
основе
иммунобиотехнологических процессов создаются также профилактические и
лечебные средства, объединяемые под эгидой медицинской биотехнологии
Иммунобиотехнологические процессы по целевым продуктам вышли за
пределы медицинского назначения (например, в иммуноферментном анализе,
иммуноблотинге). В равной мере большинство ферментов (как и
аминокислот или некоторых других продуктов) производится не для целей
здравоохранения.
Вычленение
иммунобиотехнологии
в
качестве
самостоятельной научной субдисциплины является обоснованным, и
производственные процессы здесь четко ограничены использованием
иммунной системы того или иного макроорганизма или отдельных
компонентов ее (макрофаги, лимфоциты, различные иммуноглобулины).
Условно все методы тестирования иммунного состояния организма
можно разделить на две большие группы: прямые методы выявления
патогена, когда лаборатория стремится выделить фрагмент возбудителя
(наследственный материал или антигены) или с помощью культурального
посева обнаружить патогены на искусственных питательных средах, и
непрямые.
К
прямым
методам
диагностики
следует
отнести
бактериологический анализ, микроскопию и иммунофлуоресценцию и
различные
методы
ДНК-диагностики
(в
первую
очередь
—
амплификационные и гибридизационные технологии). К непрямым методам
относятся гистология, инструментальный анализ и, конечно, серологический
анализ, то есть анализ гуморального ответа организма на присутствие
патогена.
7. Информационные технологии в биотехнологии.
Информационные технологии - это класс областей деятельности,
относящихся к технологиям управления и обработкой огромного потока
информации с применением вычислительной техники.
Информационные Технологии - это комплекс взаимосвязанных
научных, технологических, инженерных наук, изучающих методы
эффективной организации труда людей, занятых обработкой и хранением
информации с помощью вычислительной техники и методы организации и
взаимодействия с людьми и производственным оборудованием, их
практические применение, а также связанные со всем этим социальные,
экономические и культурные проблемы. Основные черты современных ИТ:
-компьютерная обработка информации;
-хранение больших объёмов информации на машинных носителях;
-передача информации на любые расстояния в кротчайшие сроки.
Современное материальное производство и другие сферы деятельности все
больше нуждаются в информационном обслуживании, переработке
огромного количества информации. Универсальным техническим средством
обработки любой информации является компьютер, который играет роль
усилителя интеллектуальных возможностей человека и общества в целом, а
коммуникационные средства, использующие компьютеры, служат для связи
и передачи информации. Появление и развитие компьютеров — это
необходимая составляющая процесса информатизации общества.
Информатизация
на
базе
внедрения
компьютерных
и
телекоммуникационных технологий является реакцией общества на
потребность в существенном увеличении производительности труда в
информационном секторе общественного производства, где сосредоточено
более половины трудоспособного населения.
Приложение
базовых
положений
теории
информации
к
исследованиям биологических объектов и процессов. Информационное
обеспечение биологических исследований.Применение информационных
технологий в исследованиях биологических объектов и процессов.
Разработка оптимальных схем анализа данных биологических исследований
и представления их результатов с использованием информационных
технологий.
8. Биотехнология стволовых клеток
Стволовые клетки – это предшественники всех без исключения типов
клеток в организме. Они способны к самообновлению. В определенных
условиях они способны превращаться в специализированные клетки
различных тканей и органов: клетки крови, сердечно-сосудистой системы,
печени, костной и хрящевой тканей. Стволовая клетка может стать
практически любой клеткой в человеческом организме.
На самых ранних стадиях своего развития зародыш полностью состоит
из стволовых недифференцированных клеток, затем начинаются этапы
дифференцировки и из них образуются органы и ткани организма. Во
взрослом организме стволовые клетки содержатся в небольших количествах
в крови и костном мозге и в еще меньших количествах во всех органах и
тканях. Поскольку эти клетки могут преобразовываться в клетки любых
органов и тканей, они играют роль своего рода экстренной помощи: если гдето в организме неполадка, стволовые клетки направляются туда и,
преобразуясь в клетки поврежденного органа, способствуют восстановлению
его функции.
С возрастом количество стволовых клеток становится все меньше, и,
соответственно, восстановительные возможности организма снижаются,
замедляются процессы регенерации. В результате страдает способность
ткани к физиологической регенерации и к восстановлению после болезни или
травмы.
Источники стволовых клеток: бластоциста (бластодермический
пузырёк, стадия развития зародыша, возникающая в результате дробления
оплодотворённого яйца); пуповинная кровь; ткани взрослого организма
(костный мозг, периферическая кровь, жировая ткань). Большинство
стволовых клеток из этих источников гемопоэтические, т.е. способны
превращаться в различные клетки крови и иммунной системы.
Метод возвращения зрелых клеток в "младенческое состояние" стал
одним из главных научных прорывов.
9. Технологии клонирования
Клонирование в растениеводстве и животноводстве. Естественное
клонирование животных и растений часто происходит в результате
бесполого и вегетативного размножения, а также в результате
амейотического партеногенеза.
Термины «клон», «клонирование» первоначально использовались в
микробиологии и селекции, после - в генетике, в связи с успехами которой и
вошли в общее употребление.
Точное воспроизведение животного или растения как при
естественном, так и при искусственном клонировании невозможно. Новый
организм в любом случае будет отличаться от материнского за счет
соматических мутаций, эпигенетических изменений наследственного
материала, влияния окружающей среды на фенотип и случайных отклонений,
возникающих в ходе онтогенеза.
В настоящее время существует два вида клонирования:
репродуктивное и терапевтическое. В результате репродуктивного
клонирования образуется новый целостный организм, который является
генетической копией другого организма – клон.
Терапевтическое клонирование – это технология клонирования с
целью получения эмбриональных стволовых клеток для научных
исследований и, потенциально, использования в терапии различных
заболеваний человека. В процессе терапевтического клонирования эмбрион
не переносится для дальнейшего развития в полость матки женщины, а
используется в качестве объекта научных исследований и экспериментов и
получения стволовых клеток. Зигота является отипотентной, т.е. из любой ее
клетки может при соответствующих условиях развиться зародыш. На стадии
бластоцисты образуются плюрипотентные клетки, из которых в дальнейшем
формируются все органы и ткани организма. В процессе терапевтического
клонирования эмбрион неизбежно уничтожается после образования
первичной «полоски» («ствола») клеток, т.к. их дальнейшее развитие
происходит в различных условиях искусственной среды в соответствии с
тем, какую ткань предполагается получить.
Технология репродуктивного клонирования широко применяется в
исследовательских целях на животных. К настоящему времени накоплен
обширный опыт по клонированию животных разных видов (грызуны, кошки,
кролики, свиньи, телята и др.), в том числе макака-резус (США),
позволяющий делать определенные выводы о влиянии рождения при помощи
данной технологии на генетический аппарат, анатомическое строение,
течение физиологических процессов, продолжительность жизни и другие
особенности живых организмов.
10.Методы технологии криоконсервации
Криозбереження буквально означает сохранение в замороженном
состоянии. Это сложный многоэтапный процесс, целью которого является
неограниченное длительное хранение жизнеспособных клеток, меристем или
органов растений в состоянии холодового анабиоза. Однако на практике
обычно это хранение при очень низких температурах: при температуре
сухого льда (- 74 ° С), в морозильниках с ультранизким температурой (- 80 °
С и ниже), в жидком азоте (- 196 ° С) или его парах (« - 140 ° С).
Главное преимущество хранения при очень низких температурах
заключается в способности значительно замедлять или даже останавливать
метаболические процессы и биологическое разрушение. Кроме того,
материал, который сохраняется при низких температурах, остается
генетически стабильным, и в этом случае, можно избежать генетических
изменений, которые присущи организмам, поддерживаются обычными
способами.
Для большинства соматических клеток и спермиев ряда видов
криоконсервация стала обычной процедурой. В то время как для
растительных клеток все еще нет универсального метода, который был бы
пригоден для их криозбереження. Более того, как правило, даже штаммы,
производные от одного исходного, требуют различных условий на некоторых
важных этапах этой экстремальной процедуры. И все же в мире достигли
криозбереження (при - 196 ° С) культур клеток почти для 40 видов растений
и культур апикальных меристем еще 25 видов.
Повреждения клеток при замораживании и последующем оттаивания
зависят от образования льда внутри клеток и от их дегидратации. Опасно
рост центров кристаллизации в крупные кристаллы (более 0,1 мкм), чьи
грани разрушают ендомембраны. Скорость роста кристаллов сильно
возрастает при увеличении степени переохлаждения воды. Полностью рост и
перестройка кристаллов льда останавливаются в чистой воде только при 140 ° С.
Точка замерзания цитоплазмы ~ - 1 ° С, криопротекторы снижают ее
до - 3,5 ° С, но клетки, как правило, не замерзают до - И0-15 ° С, так как при
этих температур плазмалемме еще предотвращает проникновение внутрь
кристаллов льда, которые растут во внешнем растворе. Так что на момент
инициации кристаллизации в клетке уже существует значительное
переохлаждение, весьма неблагоприятно. Но если температура снижается
достаточно медленно, то свободная вода успевает выйти из клетки.
Происходит значительная дегидратация и сжатия протопласта, т.е.
плазмолиз. Повреждения, возникающие могут иметь различные механизмы,
но ведущую роль для клеток растений, если в середине них не образуются
крупные кристаллы льда, при понижении температуры до - 25 ° С играет
избыточный плазмолиз и последовавшая полная потеря осмотической
реактивности в результате нарушения целостности плазмалемме.
11.Бионанотехнология. Новые биоматериалы и методы получения и
применения наноматериалов
Прикладные нанотехнологии в биологических системах развиваются в двух
крупных направлениях – технологии доставки лекарств (более широко –
создания новых лекарственных препаратов) и технологии, в которых
биологические
системы
используются
в
качестве
структурного
наноматериала. К первому направлению можно отнести разработки по
созданию комбинированных наночастиц, поверхность которых покрыта
биологическими лигандами, т.е. молекулами, специфически распознающими
определенные мишени в организме, например, поверхность раковых клеток.
Внутренняя часть наночастицы составлена биологически инертным
полимером, который связывает действующее вещество, например,
доцетаксел, который традиционно используют для химиотерапии рака. Такие
частицы могут долгое время циркулировать в крови и задерживаются, а
значит, скапливаются, только вокруг клеток опухоли. В результате,
концентрация токсичного вещества в опухоли может увеличиваться в десять
тысяч раз по сравнению с традиционными методами химиотерапии. На
основе этой технологии, в частности, созданы препараты для лечения
опухолей мозга, которые с трудом поддаются традиционным методам
лечения.
Разработана технология биосенсоров на основе наночастиц золота с
пришитыми к ним фрагментами нуклеиновых кислот (так называемые
«сферические нуклеиновые кислоты»). Такие биосенсоры работают для
диагностики целого ряда заболеваний – там, где необходимо обнаруживать в
растворе молекулы ДНК или РНК (например, при распознавании вирусных
инфекций). Однако, наиболее впечатляющий успех достигнут в методиках
обнаружения
определенных
последовательностей
нуклеотидов
непосредственно в живой клетке. Наночастицы золота с фрагментами НУ,
несущие последовательность, комплементарную к искомой, легко проникают
в клетку (для организма они не токсичны и не иммуногенны, то есть не
вызывают иммунного ответа или аллергии). Интересующая исследователя
последовательность нуклеотидов «закрыта» коротким комплементарным
фрагментом с флуоресцентной меткой. При этом метка подобрана таким
образом, что в связанном состоянии флуоресценция гасится, и метку не
видно. Однако в присутствии искомой последовательности РНК в
цитоплазме клетки, фрагмент с меткой конкурентно вытесняется с
наночастицы, метка попадает в раствор и начинает светиться. В результате
описанная методика позволяет идентифицировать определенные мРНК в
живой клетке, т.е. фактически видеть процесс считывания определенных
генов. Довольно быстро со временем и светящаяся метка, и наночастицы
выходят из клетки, а клетка остается живой и функциональной.
12.Перспективы развития биологии и биотехнологии
Направления развития биотехнологии, решение которых актуально для
Республики Казахстан
В медицине:
создание и производство новых биологически активных веществ и
лекарств на основе природных соединений;
создание рекомбинантных вакцин нового поколения против различных
инфекционных заболеваний. В отличие от многих применяемых сейчас
вакцин, они нетоксичны и не имеют побочных эффектов;
создание методов лечения с принципиально новыми механизмами
действия (генная терапия, анти-смысловые РНК, и тому подобное);
изучение вопросов наследственности, генетической
предрасположенности организма к различным заболеваниям. Создание
генетических баз данных и генетических паспортов населения имеют
огромное значение, учитывая рост онкологических, инфекционных и
наследственных заболеваний в мире;
разработка методов ранней диагностики заболеваний.
В агропромышленном комплексе:
создание новых сортов растений и домашних животных с улучшенными
свойствами: прирост биомассы, сопротивляемость болезням и стрессам, в
том числе приспособленных к аридным и резко-континентальным условиям,
засоленным почвам и так далее;
создание новых экологически чистых методов борьбы с вредными для
сельского хозяйства видами микроорганизмов, растений и животных.
В добывающей промышленности:
внедрение биотехнологических методов в процессы добычи и
переработки минерального сырья, нефти и газа.
В экологии и охране окружающей среды от загрязнений и отходов
человеческой деятельности в природе биологическими методами
(биоремедиация), в том числе по:
ликвидации последствий нефтяного загрязнения, как на суше, так и в
гидросфере;
нейтрализации радиоактивного излучения и токсичности промышленных
отходов в отвалах и водоемах, сельхозугодий Семипалатинского полигона,
территорий, подверженных ракетно-космической деятельности;
очистка воздуха смога в крупных городах (город Алматы) и
промышленных зонах, от выбросов выхлопных газов и выбросов,
возникающих при сгорании попутного газа в факелах при нефтедобыче.
В биологической безопасности:
определение критериев, показателей и методов оценки биологической
безопасности, генетически модифицированных организмов и получаемых из
них продуктов;
организация системы государственного контроля и регулирования
генноинженерной деятельности.